alterações na expressão de proteínas do citoesqueleto de células

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ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DO CITOESQUELETO DE
CÉLULAS MUSCULARES LISAS INDUZIDAS POR 5-FLUOROURACIL
Nathanael de Araujo Sousa, Marcelo de Carvalho Filgueiras
Universidade Federal do Piauí – Campus Ministro Reis Velloso
INTRODUÇÃO
O câncer é uma das doenças que mais matam no mundo, estando entre as 10 principais causas
de morte. No Brasil o câncer representa a terceira mais importante causa de morte no sexo masculino,
estando o câncer de pulmão no topo e entre as mulheres está o câncer de mama (Filho; Moncau, 2002).
O tratamento quimioterápico baseado no fármaco 5- Fluorouracil (5-FU) é uma das drogas
frequentemente usadas e que se mostra eficaz na sobrevida dos doentes, porém promove mudanças
no corpo. A presença de mucosite oral e intestinal durante o tratamento com quimioterápicos são efeitos
colaterais comuns, seguido de alguns sintomas, com destaque para a diarreia que estar presente com
bastante frequência e que podem gerar uma dismotilidade. Estudos indicam que mesmo após o termino
processo inflamatório a dismotilidade persiste, indicando que existem alterações não somente na
membrana plasmática e citoesqueleto, mas também no tecido muscular liso. Assim, acredita-se em
uma relação entre o tratamento de câncer com 5-FU e a dismotilidade crônica por conta de alterações
na musculatura lisa (Filgueiras et al, 2013).
METODOLOGIA

Cultura de células de músculo liso - As células do músculo liso da cultura primaria foram
preparadas a partir de moelas de embriões de galinha com 11 dias de desenvolvimento como
descrito previamente (CHOI et al., 1990). A moela foi picotada e seus fragmentos incubados
em uma solução balanceada. Em seguida o material foi centrifugado e o sobrenadante
descartado.

Tratamento com 5-FU - Após as primeiras 24 horas de incubação, algumas células foram
tratadas com 5-fluorouracil (5-FU, Eurofarma Laboratórios, Brasil) nas seguintes concentrações
finais: 0,01 mM, 0,05 mM, 0,1 mM, 1 mM, 10 mM e 50 mM, por 24 horas.

Imunofluorescência - Após a fixação em paraformaldeído as células foram permeabilizadas
através de 3 lavagens da solução Triton-X 100 em PBS. As células foram então incubadas com
anticorpo primário e secundários intercalados por lavagens de Triton-X 100 em PBS. Em
seguida, foram incubas com a sonda específica para actina-F.

Viabilidade celular - A viabilidade celular foi medida através do ensaio de MTT. As células
foram crescidas em placas de 96 poços. Após 24 horas de cultura, as células foram tratadas
com 5-FU e mantidas por 24 horas. Em seguida foram adicionados 10 µL de MTT e então 200
µl de DMSO foram adicionados para dissolver a precipitação de formazan. A absorbância foi
medida em leitor de ELISA a 570 nm.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para investigar a viabilidade celular no tratamento com o quimioterápico 5-Fluorouracil foi usado
o ensaio de MTT em cultura de células tratadas e não tratadas com o fármaco em diferentes
concentrações. Os resultados do ensaio mostraram que ocorreu uma redução de da viabilidade celular
em todas as concentrações do quimioterápico após 24h de tratamento. Na concentração de 10 mM de
5-FU foi onde ocorreu a maior redução que foi de cerca 25% na viabilidade celular quando comparada
com o grupo controle.
Para analisar as alterações no citoesqueleto, foi feita uma análise da distribuição de
microfilamentos de actina em células tratadas com o 5-FU. As células musculares lisas foram expostas
ao quimioterápico 5-FU e marcadas com a sonda específica para actina filamentosa (actina-F),
faloidina, e compradas com células não tratadas (controle). As fibras de stress do grupo controle
marcadas por actina-F mostram-se em maior quantidade, enquanto as células do grupo tradado com o
5-FU mostram-se em menor número. Foi observado também uma alteração no núcleo das células
tratadas com o fármaco na concentração de 10mM, apresentando-se com seus núcleos mais alongados
que os núcleos do grupo controle. (Figura 1b, seta).
Figura 1.5-FU reduz o número de fibras de stress em células de músculo liso. Células não tratadas (A) e
tratadas com 10 mM de 5-FU (B) foram coradas com faloidina (vermelho) e DAPI (azul). Nota-se que no grupo
controle a maioria das células apresenta fibras de estresse contendo actina, enquanto que no grupo tratado as
células apresentam uma quantidade reduzida de fibras de stress em seu citoplasma. As células tratadas com 5FU apresentam núcleos mais alongados (seta em B). Barra de escala = 20 µm
CONCLUSÃO
Conclui-se que o tratamento com o quimioterápico 5- Fluorouracil (5-FU) leva a uma redução da
viabilidade celular após um período de 24h do tratamento e também alterações no citoesqueleto, núcleo
e citoplasma das células, assim alterando a forma da célula.
APOIO
Universidade Federal do Piauí
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Palavras-chave: Citoesqueleto. Mucosite intestinal. 5-Fluorouracil.