Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo trans

i
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
TESE DE DOUTORADO
Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de
trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina
WALDENICE DE ALENCAR MORAIS
RECIFE/2010
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de
trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina
Tese de doutorado submetida ao Programa
de Pós-graduação do Departamento de
Ciências Farmacêuticas do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade Federal
de Pernambuco, em cumprimento às
exigências para obtenção do grau de
Doutor em Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Produção e Controle
de Qualidade de Medicamentos.
Profa. Dra. Nereide Stela Santos Magalhães
ORIENTADORA
Profa. Dra. Maria Aparecida M. Maciel
CO-ORIENTADORA
Waldenice de Alencar Morais
DOUTORANDA
RECIFE/2010
iii
Morais, Waldenice de Alencar
Desenvolvimento e caracterização de microesferas
contendo trans-desidrocrotonina e complexo de
inclusão
de
trans-desidrocrotonina
com
2-hidroxipropil-β-ciclodextrina / Waldenice de Alencar
Morais. – Recife : O Autor, 2010.
133 folhas; il., graf., fig., tab.
Tese (doutorado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.
Inclui bibliografia.
1. Sistemas de liberação de fármacos. 2.
Microesferas. 3. Complexo de inclusão de fármaco
com ciclodextrina. 4. trans-Desidrocrotonina.
5.
Análise fatorial I. Título.
615.014
615.58
CDU (2.ed.)
CDD (22.ed.)
UFPE
CCS-05/2010
iv
iii
v
iv
A meus pais: à minha adorável mãe, meu exemplo de
coragem e perseverança, e à memória do meu querido pai,
meu exemplo eterno de integridade e honestidade.
vi
v
AGRADECIMENTOS
Dirijo o meu mais sincero agradecimento...
Primeiramente a Deus por toda fé, coragem e perseverança;
À minha família pelo amor, compreensão e apoio em todos os momentos felizes e difíceis e que
sempre me motivaram em meus objetivos....especialmente à memória do meu pai;
À Profª Drª Nereide Stela Santos Magalhães pela orientação, paciência e confiança que me
acolheu em seu laboratório de pesquisa, contribuindo para o meu crescimento acadêmico e
científico;
À Profª Drª Maria Aparecida Medeiros Maciel pela co-orientação, dedicação e confiança em meu
trabalho
para
desenvolver
novos
sistemas
terapêuticos
com
o
diterpeno
bioativo
trans-desidrocrotonina (t-DCTN);
Aos alunos de iniciação científica Gineide Conceição dos Anjos, Luan Silveira Alves de Moura,
Cássia Carvalho de Almeida, Gilvani Gomes de Carvalho e Aline Maria Sales Solano pelo esforço
na extração e reisolamento da t-DCTN no Laboratório de Produtos Naturais da UFRN sob
orientação da Profª Drª Maria Aparecida Medeiros Maciel;
À Profª Drª. Beate Seageser Santos, à Profª Drª Noemia Pereira da Silva Santos e ao Prof. Dr.
Antônio Rodolfo de Faria pela disponibilidade e contribuição para a avaliação deste trabalho no
Exame de Qualificação de Tese;
Ao Prof. Dr. Benício de Barros Neto, ao Prof. Dr. José Luiz C. Fonseca, à Profª Drª Noemia
Pereira da Silva Santos, à Profª Drª Maria Nelly Caetano Pisciottano e à Profª Drª. Beate Seageser
Santos pela disponibilidade e contribuição para a avaliação desta tese de doutorado;
A todos os colegas e amigos do Grupo de Pesquisa de Sistemas de Liberação Controlada (SLC),
que me receberam com toda solidariedade, atenção e carinho;
vii
vi
Ao Profo Drº. Benício Barros Neto pela disponibilização do software Statistic versão 6.0, à Profa
Dra Maria Fernanda Pimental e ao doutorando Pabyton Gadelha pela contribuição no estudo de
análise fatorial;
Às alunas de iniciação científica Rosana Silva Batista, Dina Melissa Amaya Silva e Rebeca
Cavalcanti Silveira pelo esforço, dedicação e compreensão pelo desenvolvimento deste trabalho;
Às doutorandas Milena Sales Ferraz, Mariane Cajubá de Brito Lira e Elisângela Afonso de Moura
Mendonça pelas discussões científicas e companheirismo;
Aos mestrandos Taciana Lima Salviano Lapenda e Hywre Cesar de Brito Pinto pela colaboração;
A todos os amigos e colegas do Laboratório de Bioquímica do LIKA-UFPE pela saudável
convivência em laboratório;
À minha grande amiga Mariana Paola Cabrera pela amizade e companheirismo;
Ao Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA) e ao Centro de Tecnologias Estratégicas
do Nordeste (CETENE-PE) pelo suporte dado a este trabalho;
Ao Ministério de Ciência e Tecnologia (MCT), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) e à Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade Federal de
Pernambuco (PROPESQ-UFPE) pelo suporte financeiro durante o curso deste trabalho.
viii
vii
“....estejais seguros que Deus não nos impôs uma tarefa
acima de nossas forças, e que não vos abandonou sozinhos na Terra,
sem amigos e sem sustentação.”
São Luís, Santo Agostinho
viii
ix
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS.............................................................................................
x
LISTA DE FIGURAS...........................................................................................................
xi
LISTA DE TABELAS...........................................................................................................
xii
RESUMO...............................................................................................................................
xiii
ABSTRACT...........................................................................................................................
xiv
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................
16
2 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................
20
2.1 Nanotecnologia farmacêutica - Sistemas de liberação de fármacos..............
20
2.2 Sistemas particulados poliméricos....................................................................
23
2.2.1 Polímeros utilizados na preparação de sistemas particulados..............
25
2.3 Micropartículas..................................................................................................
27
2.3.1 Métodos de preparação de micropartículas...........................................
29
2.3.2 Métodos de caracterização de micropartículas......................................
32
2.4 Cinética de liberação..........................................................................................
36
2.5 Análise fatorial...................................................................................................
39
2.6 Ciclodextrinas.....................................................................................................
40
2.6.1 Complexos de inclusão de fármacos com ciclodextrinas......................
44
2.7 trans-Desidrocrotonina (t-DCTN).....................................................................
47
3 OBJETIVOS......................................................................................................................
52
ARTIGO
Physicochemical
and
release
characteristics
of
t-dehydrocrotonin
and
t-DCTN:hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex into PCL and PLGA
microparticles........................................................................................................................
54
4 CONCLUSÕES..................................................................................................................
98
5 PERSPECTIVAS...............................................................................................................
101
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................
103
xiv
ANEXOS
ANEXO A
ARTIGO I – Abstract
Encapsulation and release characteristics of DCTN/PLGA microspheres. Journal of
Microencapsulation. Published...............................................................................................
129
ANEXO B
ARTIGO II – Abstract
Validation
of
UV
spectrophotometric
method
for
the
determination
of
dehydrocrotonin and application in inclusion complexes with hydroxypropyl-βcyclodextrin.
A ser submetido.......................................................................................................................
131
ANEXO C
CONCURSO PÚBLICO
Aprovação em Concurso Público para o Cargo de Professor Adjunto no
Departamento de Farmácia na área de Farmacotécnica na Universidade Federal do
Rio Grande do Norte. DOU, seção 2, 31 de dezembro de 2009...........................................
133
xix
LISTA DE ABREVIATURAS
BCS – Sistema de classificação biofarmacêutica
BET - Brunauer-Emmette-Teller
BJH- Barret- Joyner-Halenda
CD – Ciclodextrina
CI50 - Concentração do fármaco que inibe 50% do crescimento celular
CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência
DE50 – Dose terapêutica efetiva para 50% dos animais
DL50 – Dose letal para 50% dos animais
DNA – Ácido desoxiribonucléico
DSC – Calorimetria exploratória diferencial
dv - diâmetro volumétrico médio
FDA – Food and drug administration
GPC- Cromatografia de permeação em gel
HPβCD – 2-Hidroxipropil-β-ciclodextrina
i.p. – Via intraperitoneal
i.v. – Via intravenosa
IR - Espectroscopia na região do infravermelho
Log P – Coeficiente de partição
MET – Microscopia eletrônica de transmissão
MEV – Microscopia eletrônica de varredura
PCL – Policaprolactona
PEG – Polietilenoglicol
PGA – Polímero de ácido glicólico
pH – Potencial hidrogeniônico
PHBHV - Poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato)
pKa – Logaritmo negativo da constante de ionização
PLA – Polímero de ácido láctico
PLA-PEG – Copolímero de PLA com PEG
PLGA – Copolímero de ácido láctico e glicólico
PVA – Álcool polivinílico
RMN – Ressonância magnética nuclear
RNA - Ácido ribonucléico
s.c. – Via subcutânea
SIDA – Síndrome da imunodeficiência adquirida
t1/2 – Tempo de meia-via
t-DCTN – trans-Desidrocrotonina
TGA – Análise termogravimétrica
UV-Vis – Espectrofotometria na região do ultravioleta-visível
v.o. – Via oral
XRD – Difração de raios-X
αCD – α-Ciclodextrina
βCD – β-Ciclodextrina
γCD – γ-Ciclodextrina
xii
xi
LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
Figura 1 - Comparação do perfil farmacocinético de formas farmacêuticas convencionais e
de
sistemas
de
liberação
controlada
(adaptado
de
http://www.qmc.ufsc.br/qmcweb/exemplar15.html)................................................................. 21
Figura 2 - Representação esquemática da classificação de nanopartículas e micropartículas:
nanoesfera e microesfera (sistema matricial) (A); nanocápsula e microcápsula (sistema
reservatório) (B) (http://www.nanoparticles.org/links/Nanosphere.jpg)................................... 24
Figura 3 - Método de preparação de micropartículas por emulsificação (o/a) e evaporação
do solvente: (1) solubilização dos componentes na fase oleosa orgânica, (2) mistura da fase
orgânica com a fase contínua contendo emulsificante sob agitação (3) evaporação do
solvente (4) separação das micropartículas (adaptado de LI et al., 2008)................................. 31
Figura 4 - Estrutura química de uma ciclodextrina (A) e desenho esquemático ilustrando a
cavidade hidrofóbica, a posição das hidroxilas primárias e secundárias e suas dimensões:
altura (H), diâmetro interno (DI) e diâmetro externo (DE) (adaptado de BREWSTER;
LOFTSSON, 2007)........................................................................................................... 41
Figura 5 - Estruturas moleculares das ciclodextrinas naturais (adaptado de SONG et.,
2009).......................................................................................................................................... 42
Figura 6 - Esquema da associação entre ciclodextrina hidratada (CD) e molécula hóspede
(G): (acima) complexos de inclusão 1:1 e (abaixo) complexos de inclusão 2:1
ciclodextrina:fármaco (SONG et al., 2009)............................................................................... 46
Figura 7 - Estrutura química da trans-desidrocrotonina (t-DCTN).........................................
48
xii
xiii
LISTA DE TABELAS
INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
Tabela 1 - Exemplos de sistemas de liberação de fármacos...................................................... 22
Tabela 2 - Propriedades físico-químicas das ciclodextrinas (CONNORS, 1997)....................
43
xiv
xiii
RESUMO
Microesferas são sistemas poliméricos de liberação controlada capazes de aumentar a
biodisponibilidade e diminuir a toxicidade de uma variedade de fármacos. Complexos de inclusão
de fármacos com ciclodextrinas podem modificar as características físico-químicas e de cinética
de liberação de microesferas. A trans-desidrocrotonina (t-DCTN) é um princípio ativo extraído do
Croton cajucara Benth com várias atividades farmacológicas, tais como a hipoglicemiante.
Entretanto, a sua baixa solubilidade em água e hepatotoxicidade restrigem a sua aplicação
terapêutica. O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da presença de t-DCTN e complexo de
inclusão de t-DCTN com hidroxipropil-β-ciclodetrina (t-DCTN:HPβCD) em microesferas de
policaprolactona (PCL) e poliácido láctico e glicólico (PLGA) em suas propriedades
físico-químicas e de cinética de liberação. Três diferentes sistemas de microesferas contendo
t-DCTN, t-DCTN:HPβCD ou de t-DCTN:HPβCD e t-DCTN coencapsuladas foram preparados
pelo método de emulsão múltipla (a/o/a) segido de evaporação do solvente. O polietilenoglicol
(PEG) e o álcool polivinilico (PVA) foram usados como estabilizantes das emulsões simples e
múltipla, respectivamente. Inicialmente, foram realizados estudos de pré-formulação com
microesferas de PCL (sem fármaco) utilisando análise fatorial fracionária 24−1, variando-se as
concentrações de PEG e PVA, e os volumes das fases aquosas interna e externa. Com isso, foi
investigada a influência dos parâmetros no tamanho de partículas (dv) e polidispersão (span) das
microesferas de PCL. A análise fatorial mostrou ser uma excelente ferramenta para a otimização
de micropartículas de PCL. A variação dos volumes das fases aquosas interna e externa das
emulsões afetaram consideravelmente o dv e o span dos sistemas. O dv das micropartículas de PCL
variou de 6,68 to 28,41 μm e o span de 1,16 to 4,76 com a variação dos fatores. Considerando as
formulações mais estáveis, microesferas de PCL e PLGA contendo t-DCTN ou t-DCTN:HPβCD
foram preparadas para avaliar a influência da natureza do polímero. A t-DCTN foi encapsulada
com êxito nas microesferas de PCL e PLGA com uma quantidade de fármaco encapsulada de 4%
e 6% na razão de 1:10 de fármaco:polímero, respectivamente. As microesferas contendo
t-DCTN:HPβCD apresentaram uma superfície lisa, e uma diminuição da quantidade de fármaco
encapsulada, do tamanho de partícula e dos parâmetros de porosidade, em relação àquelas
contendo somente t-DCTN. A coencapsulação de t-DCTN:HPβCD com t-DCTN na razão 1:5 de
fármaco:polímero aumentou a quantidade de fármaco encapsulada para 14% em microesferas de
PLGA, com tamanho de partículas (dv=9,59 µm) e polidispersão (span=1,57) satisfatórios. No que
se refere a cinética de liberação in vitro, os perfis apresentaram uma boa correlação com o modelo
fickiano, indicando que a difusão está envolvida no mecanismo de liberação. O complexo de
inclusão t-DCTN:HPβCD modificou as propriedades de liberação das microesferas, produzindo
menores velocidades de difusão k2 de 0,105 (PCL) e k2 de 0,107 (PLGA), quando comparadas aos
sistemas contendo t-DCTN, k2 de 0,289 (PCL) e k2 de 0,395 (PLGA), respectivamente. A
coencapsulação também reduziu o efeito burst (1,5%) e a velocidade de difusão (k2=0,079). Os
resultados sugerem uma menor afinidade da t-DCTN pela matriz de PCL em relação ao PLGA,
devido à menor quantidade de fármaco encapsulada, maior modificação do potencial zeta, bem
como, maior efeito burst e cinética de liberação mais rápida. Portanto, a microencapsulação de tDCTN e complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD em polímeros biodegradáveis pode ser uma
alternativa terapêutica inovadora na avaliação da atividade hipoglicemiante da t-DCTN.
Palavras-Chave: Sistemas de liberação de fármacos, microesferas, complexo de inclusão de
fármaco com ciclodextrina, trans-desidrocrotonina, análise fatorial.
xv
xiv
ABSTRACT
Microspheres are drug delivery polymeric systems able to enhance the bioavailability and to
reduce the toxicity of a variety of drugs. The inclusion complexes of drugs with cyclodextrins may
modify the physicochemical and release characteristics of microspheres. The
trans-dehydrocrotonin (t-DCTN) is a drug extracted of the Croton cajucara Benth that presents
several pharmacological activities, such as hypoglycemic. However, its lower water solubility and
hepatotoxicity limit its therapeutic application. The purpose of this study was to evaluate the
influence of the presence of t-DCTN and t-DCTN:hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion
complex (t-DCTN:HPβCD) in polycaprolactone (PCL) and poly (lactic-co-glycolic)-acid (PLGA)
microparticles on their physicochemical and release properties. Three different microparticle
systems were prepared by double W/O/W emulsion-solvent evaporation method with t-DCTN,
t-DCTN:HPβCD or co-encapsulation of t-DCTN:HPβCD and t-DCTN. The polyethylene glycol
(PEG) and polyvinylalcohol (PVA) were used as stabilizing of the simple and double emulsion,
respectively. Initially, pre-formulation studies of the preparation of unloaded PCL microparticles
were performed using 24−1 fractional factorial design varying PEG and PVA concentration, and
aqueous phase volume of the simple and double emulsions. Then, the influence of the formulation
features on the particle size and polydispersity (span) of unloaded PCL microspheres was thus
evaluated using the factorial design. Factorial design showed to be an excellent tool to optimize
PCL microparticles. The variation of the inner and outer aqueous phase volumes of emulsions
considerably affected the size and the span of the resultant systems. The size of unloaded PCL
microparticles varied from 6.68 to 28.41 μm and the span changed from 1.16 to 4.76 with the
varying of the factors. Considering the most stables unloaded microparticle formulations, t-DCTN
and t-DCTN:HPβCD-loaded PCL and PLGA microparticles were prepared to evaluate the
influence of polymer nature. The t-DCTN was successfully encapsulated into PCL and PLGA
microparticles with loading drug of 4% and 6% (w/w) at 1:10 drug/polymer ratio, respectively.
The t-DCTN:HPβCD-loaded microspheres presented a smooth surface and a decreasing of the
loading, particle size and porosity parameters in relation to t-DCTN-loaded systems. The coencapsulation of t-DCTN:HPβCD inclusion complex with t-DCTN at 1:5 drug/polymer ratio
increased the drug loading to 14% (w/w) in PLGA microspheres with satisfactory particle size
(dv=9.59 µm) and polidispersity (span=1.57). The good agreement between kinetics profiles and
fickian model indicated that the diffusion is involved on release mechanism. The t-DCTN:HPβCD
inclusion complex modified the release properties with smaller diffusion rates, for PCL
(k2=0.105) and PLGA (k2=0.107), in comparison with microparticles containing only t-DCTN,
k2=0.289 (PCL) and k2=0.395 (PLGA), respectively. The co-encapsulation also reduced burst
effect (almost 1.5%) and diffusion rate (k2=0.079). The results suggest a smaller affinity of
t-DCTN by PCL matrix in relation to PLGA due its lower encapsulation, higher modification of
the zeta potential, higher effect burst and faster release. Then, the microencapsulation of t-DCTN
and t-DCTN:HPβCD inclusion complex into biodegradable polymers may be an inovate
therapeutical alternative to evaluate the hypoglycemic effect of t-DCTN.
Keywords: Drug delivery systems, microspheres, drug inclusion complex with cyclodextrin,
trans-dehydrocrotonin, factorial design.
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
INTRODUÇÃO
REVISÃO DE LITERATURA
15
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
1 INTRODUÇÃO
Os sistemas de liberação controlada de fármacos permitem o aumento da eficácia
terapêutica através da modificação da cinética de liberação do princípio ativo, bem como, pelo
seu direcionamento ao sítio de ação, oferecendo várias vantagens em relação às formas
farmacêuticas convencionais, tais como aumento da biodisponibilidade, liberação prolongada,
manuntenção da concentração plasmática do fármaco constante dentro da faixa terapêutica,
minimização de efeitos tóxicos e subterapêuticos, diminuição da freqüência de administração
da dose e melhoria da adesão do paciente à terapêutica (BRANNON-PEPPAS, 1995;
FREIBERG; ZHU, 2004; GARBAYO et al., 2008; MAO et al., 2008).
Dentre os sistemas de liberação controlada, as micropartículas poliméricas merecem
destaque, tendo em vista a estabilidade físico-química e biológica, sendo utilizadas para a
encapsulação de diferentes substâncias, como peptídeos, proteínas, DNA/RNA e fármacos
(GARBAYO et al., 2008; WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008), destinadas principalmente
para a via oral de administração. Além disso, esses sistemas de liberação são utilizados na
preparação de produtos farmacêuticos presentes no mercado (como Lupron®, Depot®,
Zoladex®, Decapeptyl®, Eligard®, Enantone®, Trenantone®, Nutropin Depot®, e Profact®)
(HANS;
LOWMAN,
2002;
WISCHKE;
SCHWENDEMAN,
2008).
Polímeros
biocompatíveis e biodegradáveis são comumente empregados no desenvolvimento de
micropartículas, tais como os poliésteres poli-ε-caprolactona (PCL), poliácido láctico (PLA),
poliácido glicólico (PGA) e seus copolímeros (PLGA) (SANTOS-MAGALHÃES et al.,
2000; LECAROZ et al., 2006; FERNÁNDEZ-CARBALLIDO et al., 2008).
As micropartículas biodegradáveis podem ser preparadas por diferentes técnicas, como
a técnica de emulsificação com evaporação do solvente é bastante utilizada (BILATI et al.,
2005; GARBAYO et al., 2008; ZHANG et al., 2008). Vários fatores na técnica de preparação
podem influenciar as características físico-químicas dos sistemas desenvolvidos (DILLEN et
16
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
al., 2004). A análise fatorial pode ser utilizada para a avaliação dos efeitos das variáveis de
formulação e suas interações nas propriedades estudadas com uma abordagem estatística,
sendo bastante útil como uma estratégia para a otimização de formulações farmacêuticas
(DERAKHSHANDEH et al., 2007).
A trans-desidrocrotonina (t-DCTN) é a substância majoritária de natureza
clerodânica isolado das cascas do caule da espécie vegetal nativa da região amazônica
brasileira Croton cajucara Benth (popularmente conhecida como sacaca) (AGNER et al.,
1999). A t-DCTN apresenta várias atividades farmacológicas comprovadas e correlacionadas
ao uso popular da sacaca, dentre elas, hipoglicêmica (FARIAS et al., 1997; SILVA et al.,
2001a), hipolipidêmica (FARIAS et al., 1996; SILVA et al., 2001a; 2001b; 2001c;
BIGHETTI et al., 2004), antigenotóxica (AGNER et al., 1999; 2001), antiulcerogênica
(HIRUMA-LIMA et al., 1999; MELO et al., 2003; RODRÍGUEZ et al., 2004),
antiinflamatória e antinociceptiva (CARVALHO et al., 1996), antitumoral (GRYNBERG et
al., 1999; MELO et al., 2004), antiestrogênica (LUNA-COSTA et al., 1999) e cardiovascular
(SILVA et al., 2005). Entretanto, a baixa solubilidade aquosa (36,6 ± 3,16 µg/mL a 37ºC)
(MORAIS et al., 2008) e a hepatotoxicidade (MACIEL et al., 2002a; 2002b) da t-DCTN são
fatores limitantes da sua aplicação terapêutica (CORRÊA et al., 2005).
Em estudo prévio foi demonstrado que a encapsulação da t-DCTN em sistemas de
liberação controlada do tipo microesferas de PLGA melhorou o seu efeito hipoglicemiante em
ratos normoglicêmicos, reduzindo os níveis de glicose em 26,8%, enquanto foi obtida uma
redução de 14,3% para a t-DCTN em suspensão. As microesferas de PLGA contendo t-DCTN
foram obtidas pelo método de emulsão múltipla a/o/a com evaporação do solvente e
apresentaram uma forma esférica e superfície lisa em análise de microscopia eletrônica de
varredura. Além disso, as microesferas demonstraram uma eficiência de encapsulação de
85,5%, e duas populações de tamanho de partícula importantes (3,2 μm e 7,6 μm). No que se
17
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
refere à cinética de liberação in vitro, foi observado um efeito burst de 19,4% nas primeiras
2 h, uma etapa de liberação lenta e gradual com duração de 12 h (com uma constante de
difusibilidade k2=0,086) e, uma liberação máxima de 55,6% em 57 h (MORAIS et al., 2008).
As propriedades físicas, químicas e biológicas dos princípios ativos podem ser
modificadas pela formação de complexos de inclusão com ciclodextrinas, podendo ser
observados o aumento da solubilidade aquosa e da estabilidade, bem como a diminuição da
toxicidade dos fármacos associados (MARTIN DEL VALLE, 2004; BREWSTER;
LOFTSSON, 2007; SCHWINGEL et al., 2008). Esse mecanismo de complexação molecular é
possível porque as ciclodextrinas são oligossacarídeos cíclicos constituídos de uma superfície
hidrofílica e uma cavidade hidrofóbica, a qual permite o alojamento de fármacos de baixa
polaridade em seu interior (DUCHÊNE et al., 1999; LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007).
Complexos de inclusão de fármacos com ciclodextrinas vêm sendo incorporados em sistemas
de liberação controlada, como microesferas, a fim de melhorar a eficiência de encapsulação e
modular a cinética de liberação dos dispositivos terapêuticos (DUCHÊNE et al., 1999).
A β-ciclodextrina é uma das ciclodextrinas (CD) naturais mais utilizadas em âmbito
farmacêutico devido a sua habilidade de complexação com diferentes fármacos e seu baixo
custo (LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007). Complexo de inclusão de t-DCTN com
β-ciclodextrina reduziu a citotoxicidade deste composto bioativo em hepatócitos de ratos e
fibrobastos V79 (CORRÊA et al., 2005). Derivados quimicamente modificados da
β-ciclodextrina, como a 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβCD), vêm sendo bastante
utilizados devido ao aumento da solubilidade aquosa e a diminuição das restrições
toxicológicas relacionadas à β-ciclodextrina (DE ARAÚJO et al., 2008).
Nesse contexto, este estudo pretende conciliar as vantagens da nanotecnologia
farmacêutica, juntamente com os fundamentos da formação de complexos de inclusão de
fármacos com ciclodextrinas. A análise fatorial foi utilizada como estratégia para otimização
18
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
dos sistemas de liberação controlada. Essa proposta de trabalho foi desenvolvida com a
obtenção e caracterização de microesferas inovadoras dos polímeros biodegradáveis PCL e
PLGA contendo o bioativo t-DCTN e o complexo de inclusão de t-DCTN com HPβCD. Com
isso, foi avaliada a influência do complexo de inclusão nas propriedades físico-químicas e de
liberação usando diferentes matrizes poliméricas. Desta forma, o presente trabalho viabiliza a
ampliação dos estudos com o diterpeno clerodânico t-DCTN com uma abordagem
nanotecnológica, os quais podem contribuir como uma alternativa em potencial no avanço da
utilização deste princípio ativo na terapêutica.
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Nanotecnologia Farmacêutica - Sistemas de liberação de fármacos
O termo nanotecnologia foi utilizado pela primeira vez por Norio Taniguchi em 1974
para definir a técnica de produção na ordem de 1 nanômetro (SAHOO et al., 2007). De uma
forma geral, a nanotecnologia representa a ciência e engenharia que está envolvida com o
desenvolvimento, caracterização e aplicação de materiais e dipositivos funcionalizados na
escala nanométrica (a bilionésima parte do metro) (EMERICH et al., 2003; SAHOO et al.,
2007).
As primeiras aplicações práticas da nanotecnologia contemplaram diversas áreas,
como comunicações, engenharia, física, química, biologia, robótica e medicina. O uso da
nanotecnologia nas ciências médicas oferece novas oportunidades terapêuticas contribuindo
para o avanço da saúde humana com a descoberta ou aprimoramento de tratamentos para uma
variedade de doenças e melhoria da qualidade de vida do paciente (SAHOO et al., 2007;
SINGH; LILLARD, 2009).
Nesse contexto, a nanotecnologia farmacêutica é responsável pelo delineamento de
novos dispositivos de liberação de fármacos na escala nano e micrométrica com uma
abordagem multidisciplinar. Essa tecnologia de liberação de fármacos atua obtendo sistemas
terapêuticos mais eficientes através do direcionamento do princípio ativo ao sítio de ação
(célula, tecido ou órgão) ou pelo controle de sua cinética de liberação (STAMATIALIS et al.,
2008).
Os sistemas desenvolvidos por essa sofisticada tecnologia são dispositivos que liberam
o princípio ativo de uma forma controlada, mantendo uma concentração apropriada no local
de ação por um maior período de tempo. Com isso, exerce um papel fundamental na
otimização da terapia medicamentosa, já que possibilita que os princípios ativos tornem-se
20
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
mais seletivos em termos de concentração no sítio de ação, minimizando efeitos colaterais e
aumentando a duração da atividade biológica (KUMAR et al., 2001; STAMATIALIS et al.,
2008). Essa estratégia nanotecnológica é bastante útil para reintroduzir no mercado
farmacêutico fármacos de elevada potência farmacológica que apresentam uma baixa
biodisponibilidade ou elevada toxicidade, bem como para diminuir o custo e o tempo
associados à obtenção de uma nova molécula bioativa por síntese química (FENG et al.,
2004).
As vantagens dos sistemas de liberação controlada em relação às formas
farmacêuticas convencionais estão relacionadas a inúmeros fatores (Fig. 1), tais como,
proteção do princípio ativo contra oxidação, umidade e variação de pH que podem diminuir
os níveis plasmáticos do fármaco; direcionamento a alvos específicos do organismo humano
com o uso de moléculas sinalizadoras como anticorpos, peptídeos e polissacarídeos; aumento
da biodisponibilidade; redução do número de doses e da quantidade do fármaco administrado;
liberação sustentada e prolongada; diminuição das flutuações sanguíneas da concentração do
princípio ativo; manutenção da concentração terapêutica constante; minimização de efeitos
tóxicos e subterapêuticos; maior adesão do paciente à terapia medicamentosa e redução dos
custos na saúde (BRANNON-PEPPAS, 1995; PETITTI et al., 2008).
Figura 1 - Comparação do perfil farmacocinético de formas farmacêuticas convencionais e de
sistemas
de
liberação
controlada
http://www.qmc.ufsc.br/qmcweb/exemplar15.html).
(adaptado
de
21
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
22
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Tabela 1 - Exemplos de sistemas de liberação de agentes terapêuticos.
Sistema
Descrição
Fármaco
Indicação
terapêutica
Micropartículas
Partículas poliméricas sólidas
Indometacina
com tamanho de 1-1000 µm
(POLETTO et al., 2007)
(YANG; ALEXANDRIDIS,
2000)
Osteoartrite
Dexametasona
(BALMAYOR et al.,
2009)
Nanopartículas
Partículas poliméricas coloidais
Risperidona
com tamanho de 10-1000 nm
(MUTHU et al., 2009)
Esquizofrenia
(SOPPIMATH et al., 2001)
Fosfato de betametasona
Rinite alérgica
(ISHIHARA et al., 2009)
Lipossomas
Vesículas esféricas baseadas em
Vacina DNA
bicamadas lipídicas
(KHATRI et al., 2008)
Terapia gênica
Acne
(TORCHILIN et al., 2005)
Nanopartículas
Partículas submicrônicas
Tretinoína
lipídicas
baseadas em monocamadas
(SHAH et al., 2007)
sólidas
lipídicas sólidas à temperatura
Polimerssomas
ambiente ou corpórea
Paclitaxel
Carcinoma de
(FARAJI; WIPF, 2009)
(YUAN et al., 2007)
ovário
Vesículas esféricas baseadas em
Doxorubicina
Leucemias
bicamadas de polímeros
(AHMED et al., 2006)
linfoblástica
(SINGH; LILLARD, 2009)
aguda e
mieloblástica
Dendrímeros
Macromoléculas com estrutura
Doxorubicina
simétrica baseadas em polímeros
(LEE et al., 2006)
(FARAJI; WIPF, 2009)
Câncer de
bexiga
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Nesse contexto, podem ser produzidos diferentes dispositivos, tais quais as
micropartículas, nanopartículas, lipossomas, nanopartículas lipídicas sólidas, polimerssomas,
dendrímeros, contendo fármacos de aplicações terapêuticas diversas (Tab. 1), produzindo
diferentes perfis de liberação de acorco com o sistema e a via de administração utilizados
(PETITTI et al., 2008).
2.2 Sistemas particulados poliméricos
Os sistemas particulados são dispositivos poliméricos de liberação controlada de
fármacos com tamanho variando da escala nanométrica (nanopartículas) a micrométrica
(micropartículas) capazes de incorporar diferentes agentes terapêuticos (Tab. 1) desde
fármacos de baixo peso molecular a macromoléculas (BARAT et al., 2008).
Esses sistemas podem ser classificados de acordo com a sua composição e organização
estrutural em nanoesferas/microesferas e nanocápsulas/microcápsulas (Fig. 2) (BERKLAND
et al., 2001; MANDAL et al., 2001; SINGH et al., 2001; PETITTI et al., 2008).
As
nanoesferas e as microesferas são sistemas matriciais ou monolíticos em que o fármaco
encontra-se disperso e/ou solubilizado na matriz polimérica, não sendo possível identificar um
núcleo diferenciado (LIMAYEM et al., 2004). Por outro lado, as nanocápsulas e
microcápsulas são sistemas reservatórios nos quais o fármaco encontra-se contido em um
núcleo central (de natureza oleosa ou aquosa) com um revestimento polimérico disposto ao
redor deste núcleo que atua como um filme protetor (SOPPIMATH et al., 2001).
Durante as últimas décadas, os sistemas particulados poliméricos vêm sendo
apontados como uma importante alternativa em várias aplicações, dentre elas, reparação
óssea, engenharia de tecidos, desenvolvimento e aplicações biomédicas, tais como liberação
de vacinas, vários tratamentos para o câncer, SIDA, tuberculose e outras doenças,
apresentando perspectivas futuras promissoras (BARAT et al., 2008). Além disso, a
23
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
encapsulação do fármaco na matriz polimérica o protege da desativação durante o processo de
liberação e garante que a concentração liberada seja suficiente para atingir o sítio de ação (NG
et al., 2009).
Figura 2. Representação esquemática da classificação de nanopartículas e micropartículas:
nanoesfera e microesfera (sistema matricial) (A); nanocápsula e microcápsula (sistema
reservatório) (B) (http://www.nanoparticles.org/links/Nanosphere.jpg).
Os sistemas particulados poliméricos merecem destaque como dispositivos de
liberação de fármacos devido à catacterísticas, tais como, boa estabilidade físico-química e
biológica, encapsulação de uma variedade de fármacos de diversas aplicações
(antiinflamatórios,
antibióticos,
antifúngicos,
antituberculostáticos,
anticancerígenos,
anestésicos, antipsicóticos) e versatilidade de vias de administração (oral, intramuscular,
subcutânea, bioadesiva, injetável, pulmonar) (HANS; LOWMAN, 2002; BARAT et al., 2008;
BALMAYOR et al., 2009; KLOSE et al., 2009; SINGH; LILLARD, 2009). Outro fator que
despertou grande interesse no desenvolvimento destes sistemas foi a sua comercialização em
importantes produtos farmacêuticos aplicados a terapêutica, muitos deles ainda presentes no
mercado (como Lupron® Depot®, Zoladex®, Decapeptyl®, Eligard®, Enantone®, Trenantone®,
Nutropin Depot®, e Profact®) (WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008).
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
2.2.1 Polímeros utilizados na preparação de sistemas particulados
Uma das principais razões do processamento de polímeros na área farmacêutica é a
preparação de carreadores de fármacos (REVERCHON et al., 2009). Nas últimas décadas, é
observada ênfase na utilização de polímeros biodegradáveis para o desenvolvimento de
sistemas de liberação controlada. Esse fato está associado à capacidade destes dispositivos
liberarem o fármaco durante certo período de tempo e, subsequentemente, serem
metabolizados pelo organismo humano sem a necessidade de remoção cirúrgica, obtendo a
duração desejada do tratamento farmacológico (BALMAYOR et al., 2009; KLOSE et al.,
2009).
Na obtenção de nanopartículas e micropartículas podem ser utilizados tanto polímeros
naturais quanto sintéticos (BRANNON-PEPPAS, 1995). Dentre os polímeros naturais mais
empregados estão albumina, colágeno, alginato, ácido hialurônico e quitosana que oferecem
numerosas vantagens quando usados como carreadores de liberação de fármacos
(BALMAYOR et al., 2009). No entanto, problemas associados à pureza, à necessidade de
modificação química ou mesmo à incompatibilidade com outros constituintes da formulação,
justificam o uso difundido de polímeros sintéticos biodegradáveis como matérias-primas
destes sistemas de liberação (HANS; LOWMAN, 2002).
Os polímeros sintéticos comumente utilizados são poliamidas, ácidos poliamino,
poliésteres, poliortoésteres, poliuretanos e poliacrilamidas (JAIN, 2000). Os poliésteres
alifáticos com ligações hidrolizáveis são polímeros atrativos para controlar o perfil de
liberação em micropartículas e nanopartículas. Os poliésteres como poli-ε-caprolactona
(PCL), poliácido láctico (PLA), poliácido glicólico (PGA) e seus copolímeros poli(DLláctico-co-glicólico ácido) (PLGA) são frequentemente usados na obtenção de sistemas de
liberação de fármacos em virtude das suas propriedades de biocompatibilidade e
biodegradação (WANG et al., 2009), além da segurança do uso em humanos, já sendo
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
polímeros oficialmente regulamentados para uso interno pela agência de vigilância sanitária
americana, a Food and Drug Administration (FDA) (SANTOS-MAGALHÃES et al., 2000;
SOPPIMATH et al., 2001; LECAROZ et al., 2006; FERNÁNDEZ-CARBALLIDO et al.,
2008; GARBAYO et al., 2008).
Vários estudos utilizam o PLGA na preparação de sistemas particulados de liberação
controlada devido a fatores como a sua longa história de estudos de biocompatibilidade e
biodegradação, versatilidade de suas propriedades de liberação associada à modificação de
sua composição (razão de ácido láctico/glicólico), peso molecular e estrutura química,
podendo obter meia-vida in vivo com ampla faixa de variação (de 3 meses a 1 ano em média),
cinética de biodegradação previsível, baixas imunogenicidade e toxicidade, boas propriedades
mecânicas e ao uso de técnicas de preparação bem documentadas (BARAT et al., 2008;
MUTHU et al., 2009). O PLGA já foi usado na preparação de comprimidos orais,
nanopartículas inaláveis ou intravenosas e micropartículas para formulações subcutâneas de
depósito (GASPARINI et al, 2008). Entretanto, a formação de subprodutos ácidos da
degradação do PLGA pode ocasionar resposta inflamatória e limitar o uso deste polímero em
alguns casos como em aplicações envolvendo a engenharia de tecidos (LINHART et al.,
2001; HO et al., 2008; WANG et al., 2009).
O PCL é outro polímero sintético bastante utilizado na produção de sistemas
particulados devido a sua alta permeabilidade a muitos fármacos e biocompatibilidade em
meio fisológico, além de outras vantagens em relação a outros polímeros (como o PLA),
dentre elas, ser mais estável em condições ambientes, apresentar uma biodegradação mais
lenta e ser menos oneroso podendo ser utilizado em grandes quantidades (OH et al., 2006;
LUCIANI et al., 2008; WANG et al., 2009).
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
2.3 Micropartículas
A técnica de microencapsulação foi utilizada inicialmente com o objetivo de proteger
vitaminas do processo de oxidação há aproximadamente 70 anos (TAYLOR, 1938). Algumas
décadas depois o PLA e seus copolímeros (PLGA) foram avaliados como polímeros
biocompatíveis e biodegradáveis para sistemas de liberação de fármacos (KULKARNI et al.,
1971;
IGNATIUS;
CLEAS,
1996;
ANDERSON;
SHIVE,
1997;
WISCHKE;
SCHWENDEMAN, 2008). A microencapsulação moderna de substâncias bioativas continua
a ser uma importante área de estudo e esforços são concentrados no sentido de aperfeiçoar
protocolos de formulação (NG et al., 2009).
A encapsulação de princípios ativos em sistemas de liberação em escala micrométrica,
como em micropartículas de PLGA, pode ser utilizada como uma estratégia para driblar ou
favorecer mecanismos celulares e fisológicos a fim de melhorar a eficiência terapêutica
(SOPPIMATH et al., 2001; FREIBERG; ZHU, 2004). Como por exemplo, micropartículas
porosas de tamanho entre 10-15 µm vêm demonstrando uma deposição pulmonar mais efetiva
e um aumento no tempo de residência no tecido pulmonar devido ao seu maior diâmetro e
diminuição da captura fagotícita alveolar em relação às partículas de menor tamanho (1-5 µm)
(ARNOLD et al., 2007). Hirota e colaboradores (2007) observaram este efeito em
micropartículas de PLGA com tamanho de 10 µm contendo rifampicina. Outro exemplo é a
faixa de tamanho de partícula adequada para o transporte através da barreira gastrointestinal,
fato este importante quando o fármaco encapsulado destina-se a via oral de administração.
Apesar de não estar totalmente elucidado, estudos demonstram que partículas com até 10 µm
não apresentam grandes dificuldades para atravessar o epitélio gastrointestinal (GAUMET et
al., 2007).
Princípios ativos das mais diversas classes terapêuticas vêm sendo incorporados em
micropartículas como antibióticos, anticancerígenos, antituberculostáticos, antifúngicos,
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
antiinflamatórios, analgésicos, antireumáticos, antimaláricos, antivirais; bem como, enzimas,
hormônios, esteróides, peptídeos, proteínas, anticorpos, vacinas, RNA, dentre outros
(SANTOYO et al., 2002; FREITAS et al., 2005; HIROTA et al., 2007; FERNÁNDEZCARBALLIDO et al., 2008; MURATA et al., 2008; SUN et al., 2008; BARCIA et al., 2009).
Nas últimas décadas, micropartículas poliméricas são extensivamente estudadas como
sistemas de liberação de fármacos e utilizadas em preparações farmacêuticas comerciais
(DEADMAN et al., 2007), devido a inúmeras vantagens, tais como, modulação da cinética de
liberação e da eficiência de encapsulação associadas ao tamanho do dispositivo, versatilidade
das propriedades de tamanho e porosidade, possibilidade de encapsulação de substâncias
hidrofílicas e hidrofóbicas, facilidade de preparação, melhoria da estabilidade e da
biodisponibilidade oral de fármacos e proteínas, aumento da permeabilidade e/ou estabilidade
de substâncias através do trato gastrointestinal e diversidade de vias de administração (VASIR
et al., 2003; WANG et al., 2009).
Ito e colaboradores (2008) obtiveram microesferas de PLGA contendo dextrana (usada
como modelo de fármaco hidrofílico) de diferentes tamanhos (variando de 2,4-10,6 µm) e
eficiências de encapsulação (2,4–63,8%). Enquanto que, Balmayor e colaboradores (2009)
prepararam microesferas de PCL contendo o fármaco hidrofóbico dexametasona para sua
aplicação em sistemas de liberação de fármacos e engenharia de tecidos. Nesse contexto,
Klose e colaboradores (2009) prepararam microesferas de PLGA com fenofibrato para a
liberação controlada local em sistema nervoso central e obteve redução de problemas
associados à isquemia em ratos Wistar.
Micropartículas de PLGA contendo nanopartículas poliméricas com características de
porosidade e de diâmetro aerodiâmico adequadas para a liberação controlada via pulmonar do
antibiótico ciprofloxacino foram desenvolvidas por Arnold e colaboradores (2007). Outro
estudo desenvolvido por Hirota e colaboradores (2007) demonstrou o aumento da eficiência
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
da atividade antituberculostática da rifampicina em 20 vezes quando este fármaco foi
encapsulado em microesferas de PLGA em relação a sua forma em solução em estudo
desenvolvido
2.3.1 Métodos de preparação de micropartículas
As características dos sistemas de liberação dependem, dentre outros fatores, do
método de preparação (DILLEN et al., 2004). Investigações experimentais com diferentes
métodos de preparação, condições de processo e materiais são realizadas para identificar a
influência de diferentes parâmetros na encapsulação do fármaco, morfologia das
micropartículas, e consequentemente na cinética de liberação (PETITTI et al., 2008).
Vários fatores são levados em consideração no momento da escolha do método de
preparação: propriedades físico-químicas do fármaco (peso molecular, solubilidade, pKa,
coeficiente de partição octanol/água – log P, estabilidade) e do polímero (peso molecular,
composição química, hidrofobicidade); farmacocinética do fármaco; o tipo de micropartícula
desejada (microesferas ou microcápsula); rendimento do processo; eficiência de
encapsulação, dentre outros (FREITAS et al., 2005; WANG et al., 2009).
A propriedade do fármaco mais importante a ser avaliada para o estudo inicial da
microencapsulação é a sua solubilidade em água, em solventes orgânicos e em cosolventes.
Fatores que afetam a solubilidade aquosa tais como o pH e a presença de aditivos também
devem ser considerados. Estima-se que mais de 40% das moléculas microencapsuladas são
hidrofóbicas. O termo “fármacos hidrofóbicos” descreve um grupo heterogêneo de moléculas
que exibem baixa solubilidade aquosa, mas que são comumente solúveis em vários solventes
orgânicos. Os termos ligeiramente solúvel (1–10 mg/mL), fracamente solúvel (0,1–1 mg/mL),
e praticamente insolúvel (<0,1 mg/mL) são empregados para classificar estas substâncias
(WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008).
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Os métodos usados na preparação de micropartículas geralmente envolvem princípios
de evaporação e/ou difusão do solvente, coacervação, spray-drying, uso de fluidos sob
condições supercríticas sem resíduos de solventes tóxicos, etc (ITO et al., 2009). Os métodos
de emulsificação com evaporação do solvente costumam ser bastante utilizados e envolvem a
formação de emulsões com fases aquosas e oleosas orgânicas com a retirada do solvente
orgânico ao final do processo. O polímero e o fármaco são solubilizados nas fases apropriadas
e estas são emulsificadas em uma fase contínua (aquosa ou oleosa) contendo um emulsificante
adequado com um baixo poder de solubilização do fármaco. No caso de fases contínuas
aquosas, o álcool polivinílico (PVA) é o emulsificante mais usado. Ao final do processo, os
solventes voláteis podem ser removidos por evaporação ou por extração da fase externa
(WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008).
As emulsões formadas nestes métodos podem ser do tipo simples como de óleo-emágua (o/a) (Fig. 3), óleo-em-óleo (o/o) ou múltiplas como água-em-óleo-em-água (a/o/a). O
método o/o pode ser eficaz para moléculas que apresentam uma solubilidade aquosa razoável
(como a hidrocortisona com 280 µg/mL), minimizando as perdas para a fase contínua aquosa,
que pode ser evidenciada com o uso da técnica o/a. Modificações destes métodos como o de
sólido-em-óleo-água (s/o/a) podem ser úteis quando o fármaco não pode ser solubilizado em
um solvente ou mistura de solventes, ou ainda, quando a perda do fármaco para a fase
contínua não pode ser evitada com o uso de cosolventes. Como exemplo, podemos citar o
levonorgestrel (WANG et al., 2005) e o β-estradiol (BIRNBAUM et al., 2000; MOGI et al.,
2000) que já foram encapsulados usando a técnica s/o/a. Para outras moléculas hidrofóbicas
outras técnicas como s/o/o, o/o/o e s/a/o/a foram adequadas (HERRERO-VANELL et al.,
2000; JANORIA; MITRA, 2007; WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008).
As técnicas com evaporação do solvente apresentam várias vantagens, tais como:
controle da cinética de liberação e do tamanho de partícula (produzindo amostras
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
monodispersas), possibilidade do uso de polímeros insolúveis em água, excelentes eficiências
de encapsulação para fármacos hidrofóbicos (como exemplo: cisplatina, lidocaína, naltrexone
e progesterona) e hidrofílicos (insulina, proteínas, peptídeos e vacinas), e a possibilidade de
transposição para a escala industrial (técnica já utilizada em indústrias farmacêuticas) (LI et
al., 2008).
Micropartículas de SPCL, uma combinação polimérica “blend” de PCL com amido,
contendo dexametasona, foram preparadas usando técnica de emulsão com evaporação do
solvente, formando partículas de forma esférica com diferentes tamanhos (variando de
5 a 900 µm), morfologias de superfície e eficiências de encapsulação acima de 93%
(BALMAYOR et al., 2009). Zhang e colaboradores (2008) mostraram que o tamanho de
microesferas de PLGA contendo bupivacaína foi controlado pela velocidade de agitação e
concentração do polímero usando o método de emulsão o/a com evaporação do solvente.
Enquanto que Sun e colaboradores (2008) usando a mesma técnica obteve microesferas de
PLGA contendo contraceptivos hormonais com controle da cinética de liberação durante
1 mês demonstrada em ensaios in vitro e in vivo.
Figura 3 - Método de preparação de micropartículas por emulsificação (o/a) e evaporação do
solvente: (1) solubilização dos componentes na fase oleosa orgânica, (2) mistura da fase
orgânica com a fase contínua contendo emulsificante sob agitação (3) evaporação do solvente
(4) separação das micropartículas (adaptado de LI et al., 2008).
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Outros métodos empregados na preparação de micropartículas de PLA e PLGA
incluem a formação in situ, saltint-out (separação de fases), técnicas de fusão e métodos
usando fluidos supercríticos (normalmente o CO2) (WHITAKER et al., 2005).
Comercialmente encontram-se disponíveis fármacos encapsulados em micropartículas
poliméricas biodegradáveis, com o uso destas técnicas, tais como, Vivitrol® (naltrexone via
o/a extração do solvente), Consta® (risperidona via o/a extração do solvente) e Arestin®
(cloridrato de minociclina via s/o coacervação) (WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008).
2.3.2 Métodos de caracterização de micropartículas
Caracterizações físico-químicas e ensaios de cinética de liberação in vitro das
micropartículas poliméricas contendo os princípios ativos são fatores imprescindíveis no
estudo de otimização de formulações farmacêuticas. Os parâmetros físico-químicos utilizados
para a caracterização de micropartículas são aspectos microscópicos, tamanho médio e
distribuição de tamanho de partícula, eficiência de encapsulação, carga de superfície,
porosidade e interações entre os componentes da formulação (MAGENHEIM; BENITA,
1991; SANTOS-MAGALHÃES et al., 2000; BALMAYOR et al., 2009).
A análise microscópica de micropartículas pode ser realizada através de técnicas de
microscopia óptica, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de
transmissão (MET) (SANTOS et al., 2006; SCHAFFAZICK et al., 2006). A aplicação destas
técnicas permite avaliar a forma geométrica, características de superfície (lisa ou porosa) e do
interior do dispositivo, distribuição de tamanho de partícula, a presença de agregados e
cristais do fármaco, distribuição do fármaco na matriz polimérica, além de diferenciar o tipo
de micropartícula obtida (microesfera ou microcápsula) (MOSQUEIRA et al., 2000; WANG
et al., 2009). Micropartículas de PLGA contendo ovoalbumina foram caracterizadas quanto as
suas propriedades de superfície e de distribuição de tamanho de partícula por MEV, e quanto
32
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
as suas propriedades internas de distribuição de proteína e a ocorrência de poros por MET
(ZHAO; RODGERS et al., 2006). A morfologia interna e externa de micropartículas porosas
de PLGA contendo oligonucleotídeo foi caracterizada usando MEV (AHMED; BODMEIER,
2009).
O tamanho médio e a distribuição de tamanho de partícula podem ser determinados
por diferentes técnicas, tais como, microscopia, métodos cromatográficos, princípio Coulter,
difração a laser, espalhamento de luz dinâmica (espectroscopia de correlação de fóton) e
tamisação (WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008). A distribuição de tamanho de partícula é
um importante parâmetro que deve ser avaliado durante o desenvolvimento de formulações
farmacêuticas, visto que avalia o grau de uniformidade de uma amostra. Nesse contexto, o
índice span é um parâmetro que vêm sendo bastante utilizado na literatura para mensurar a
homogeneidade de micropartículas (RIBEIRO-COSTA et al., 2008; MUTHU et al., 2009;
ITO et al., 2009). O cálculo do span é feito com os valores de tamanho de partícula (neste
caso representado pelo diâmetro volumétrico médio, dv), correspondentes aos percentis de
90%, 10% e 50% da distribuição de tamanho de partícula da seguinte maneira:
span = (dv (90%) – dv (10%)) / dv (50%) (RIBEIRO-COSTA et al., 2008). Valores pequenos de span
sugerem amostras mais homogêneas, ou seja, apresentam gráficos de distribuição de tamanho
de partícula com aspecto unimodal (monomodal). Microesferas poliméricas com valores span
de 1,1 a 3,3 obtidas por Ribeiro-Costa e colaboradores (2008) apresentaram distribuição de
tamanho de partícula monomodal. Nesse contexto, Ito e colaboradores (2009) também
obtiveram microesferas de PLGA contendo dextrana (BLD) (usada como um fármaco
modelo) monodispersas com valores de span de 0,37 a 1,90.
A eficiência de encapsulação em micropartículas, a razão entre a quantidade de
fármaco encapsulado e a quantidade teórica inicialmente adicionada, pode ser determinada
pela dissolução do sistema polimérico em um solvente apropriado, no qual o fármaco é
33
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
quantificado por técnicas espectrofotométricas (UV-Vis) ou cromatográficas (CLAE)
(RIBEIRO-COSTA et al., 2004; MORAIS et al., 2008; COCERO et al., 2009). Solventes,
tais como diclorometano, acetonitrila, acetona, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido ou
1,4-dioxano são comumente utilizados, dissolvendo a matriz polimérica e o fármaco
hidrofóbico (SAH; LEE, 2006), ou solventes como etanol e metanol que podem extrair
seletivamente
o
fármaco
independente
da
dissolução
do
polímero
(WISCHKE;
SCHWENDEMAN, 2008).
O potencial zeta é um parâmetro que está relacionado à carga de superfície de
partículas em suspensão. O seu valor costuma ser bastante utilizado em estudos de
estabilidade de produtos e processos de adsorção de superfície. O potencial zeta corresponde
ao potencial elétrico entre o ambiente aquoso e uma região difusa de carga
predominantemente oposta à superfície da partícula. Este parâmetro é influenciado por
características das partículas em suspensão (como composição química e tamanho de
partícula) e do meio dispersante (como pH, força iônica e os tipos de íons)
(XU; CZERNUSZKA, 2008). Sua determinação é realizada através de técnicas de
eletroforese. O potencial zeta pode ser utilizado para avaliar se o fármaco encontra-se no
interior da matriz ou adsorvido à superfície do sistema polimérico (MAGENHEIM; BENITA,
1991; CALVO et al., 1997; WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008).
Técnicas como difração de raios-X (XRD), calorimetria exploratória diferencial
(DSC), análise termogravimétrica (TGA), ressonância magnética nuclear (RMN),
espectroscopia na região do infravermelho (IR) e cromatografia de permeação em gel (GPC)
podem evidenciar a presença e a distribuição do fármaco e aditivos na matriz polimérica, bem
como a interação entre os componentes da formulação (FAISANT et al., 2002; COCERO et
al., 2009; WANG et al., 2009). Nesse contexto, Fernández-Carballido e colaboradores (2008)
confirmaram a presença de PEG em microesferas de PLGA pela sua caracterização através
34
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
das técnicas de DSC, GPC, IR e RMN. Mundargi e colaboradores (2007) avaliaram a
estabilidade e o estado físico da doxiciclina em blend de PLGA com PCL através de DSC e
IR. Enquanto que Silva-Júnior e colaboradores (2009) usaram as técnicas de DSC, IR e
difração de raios X para estudar a estabilidade físico-química, o estado físico do fármaco na
matriz polimérica e as interações fármaco-polímero em micropartículas de PLGA contendo
triamcinolona.
A porosidade de micropartículas pode ser avaliada através de diferentes parâmetros,
tais como, densidade, tamanho de partícula, área específica, tamanho e volume de poros.
Várias técnicas foram desenvolvidas para a determinação quantitativa desses parâmetros as
quais normalmente se baseiam na determinação da quantidade adsorvida (e/ou dessorvida) de
um adsorvato (normalmente um gás) na superfície de um adsorvente em um sistema fechado à
temperatura constante. A quantidade de gás adsorvida pode ser calculada pela diminuição da
pressão por meio da aplicação das leis dos gases ou pela massa de gás adsorvida pelo sólido
(TEIXEIRA et al., 2001). A equação de Brunauer-Emmette-Teller (BET) relaciona valores
obtidos a partir das isotermas de adsorção com a área específica de um sólido (BRUNAUER
et al., 1938). A distribuição de tamanhos ou de volumes de poro em função do diâmetro de
poro pode ser calculada a partir da pressão relativa na qual os poros são preenchidos com um
líquido proveniente da condensação de um gás. O processo inverso, ou seja, a evaporação do
líquido contido no poro, também pode ser utilizado. O método de Barret, Joyner e Halenda
(BJH) é utilizado até hoje no cálculo da distribuição dos tamanhos de poro, o qual utiliza a
equação de Kelvin e assume o esvaziamento progressivo dos poros cheios de líquido com o
decréscimo da pressão (BARRET et al, 1951). Microesferas porosas com superfície rugosa
normalmente apresentem elevada área de superfície específica e velocidade de liberação
relativamente mais rápida, conforme resultados obtidos com microesferas de PLGA contrendo
o peptídeo acetato de leuprolide (RAVIVARAPU et al., 2000). A porosidade de
35
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
nanopartículas de PLA-PEG contendo propafenona foi avaliada usando os parâmetros de área
de superfície específica e distribuição de tamanho de poros (SANT et al., 2005).
Nos ensaios de cinética de liberação in vitro, diferentes métodos são empregados para
a avaliação do perfil de liberação do fármaco simulando condições fisiológicas (tampão
fosfato pH 7,4 a 37ºC). O método de dissolução costuma ser o utilizado para a cinética de
liberação em micropartículas (WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008; WANG et al., 2009). O
dispositivo é submetido a condições controladas de agitação, pH e temperatura, e alíquotas do
meio são retiradas em intervalos de tempos pré-estabelecidos (com reposição do meio), sendo
filtradas ou centrifugadas para a quantificação do fármaco liberado no sobrenadante em
função do tempo. Diferentemente das formas farmacêuticas convencionais, os sistemas de
liberação controlada não apresentam métodos oficiais estabelecidos nas farmacopéias. No
entanto, fundamentos de estudos de liberação devem ser respeitados, como a manutenção das
condições sink (WISCHKE; SCHWENDEMAN, 2008).
2.4 Cinética de liberação
O perfil de liberação de micropartículas poliméricas pode ser modificado por
propriedades físico-químicas dos fármacos e polímeros utilizados (peso molecular,
cristalinidade, composição do copolímero, hidrofobicidade) (BRANNON-PEPPAS, 1995;
HANS; LOWMAN, 2002; ZOLNIK; BURGESS, 2007; GARBAYO et al., 2008), bem como
dos sistemas desenvolvidos (geometria, tamanho, porosidade, área superficial, eficiência de
encapsulação, interação fármaco-polímero, distribuição do fármaco na matriz polimérica)
(DEADMAN et al., 2007; POLETTO et al., 2007).
O controle da cinética de liberação de fármacos encapsulados em sistemas poliméricos
envolve diferentes fatores como solubilidade e difusão do fármaco no dispositivo, erosão do
polímero, dissolução do fármaco no meio circundante ou ainda uma combinação destes
36
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
processos (ZOLNIK; BURGESS, 2007; SINGH; LILLARD, 2009). A liberação do fármaco
pode ser predominantemente controlada por um desses mecanismos. Quando isto acontece o
principal processo é aquele responsável pela etapa mais rápida da cinética de liberação,
podendo variar de dispositivo para dispositivo (PETITTI et al., 2008). Por exemplo, no caso
das microesferas, nas quais o fármaco está distribuído na matriz polimérica, a liberação do
fármaco ocorre por difusão e/ou erosão. Se a difusão é mais rápida quando comparada à
erosão da matriz, o mecanismo de liberação é controlado principalmente pelo processo de
difusão (SINGH; LILLARD, 2009). Microesferas formadas por PLGA de baixo peso
molecular (em torno de 5 kDa) apresentam uma liberação frequentemente controlada apenas
pelo mecanismo de difusão, enquanto que quando o PLGA é de elevado peso molecular (em
torno de 25 kDa) a liberação é controlada pela combinação da difusão do fármaco e erosão do
polímero (ZOLNIK; BURGESS, 2007).
O processo de erosão do PLGA é iniciado com a entrada de água no dispositivo,
causando a hidrólise das ligações éster de sua estrutura química, produzindo oligômeros
ácidos (SIEPMANN et al., 2005). A concentração destes oligômeros no bulk do dispositivo
criam um microambiente acidificado, cujo pH pode variar de 1,5 a 6,4, fato este que favorece
o fenômeno de autocatálise do PLGA. A difusão dos subprodutos de degradação ácidos no
fluido bulk e das bases presentes nas proximidades do sistema de liberação ocorrem
simultaneamente com a difusão do fármaco e a degradação do polímero. Assim, o
microambiente do transporte do fármaco pode mudar significativamente durante a liberação
do fármaco. A autocatálise exerce uma importante função na liberação do fármaco, uma vez
que a degradação da matriz resulta na formação de canais através dos quais o fármaco é
liberado.
Neste contexto, a natureza do fármaco encapsulado (hidrofílico, hidrofóbico, ácido ou
básico) pode afetar a cinética de degradação do sistema e de liberação do princípio ativo. Para
37
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
fármacos solúveis em água, a penetração da água na matrix polimérica pode ser facilitada,
acelerando a degradação da matriz e criando uma estrutura relativamente mais porosa através
da qual o fármaco é mais facilmente difundido. Enquanto que para fármacos hidrofóbicos,
esse processo de difusão da água pode ser retardado, diminuindo o processo de degradação do
polímero (KLOSE et al., 2008). No caso de fármacos ácidos e básicos, a degradação do
PLGA pode ser acelerada uma vez que sua hidrólise é catalizada por ácidos e bases.
O perfil de liberação típico de fármacos hidrofóbicos consiste de uma etapa burst
inicial seguida de uma fase lag e de uma segunda etapa burst (BERKLAND et al., 2002,
2004; WANG et al., 2002; ZOLNIK et al., 2006). A primeira etapa burst resulta da liberação
rápida do fármaco associado à superfície. Por outro lado, a fase lag, do tempo requerido para
que a degradação do polímero facilite a difusão do fármaco. Enquanto que para fármacos
hidrofílicos, a fase burst inicial não é frequentemente observada uma vez que o fármaco
associado à superfície é usualmente removido durante o processo, dependendo da
hidrofilicidade e do peso molecular do fármaco (VOISINE et al., 2008).
Uma estratégia bastante utilizada para modificar o perfil de liberação de diferentes
fármacos encapsulados em micropartículas é a combinação de polímeros com diferentes
características formando blends. Micropartículas de PCL com poli (hidroxibutirato-cohidroxivalerato) (PHBHV) foram preparadas para avaliar a influência no perfil de liberação
do diclofenaco e indometacina, e determinar o mecanismo de liberação dos fármacos
(POLETTO et al., 2007). Micropartículas de PCL foram misturadas com uma solução de
PLGA contendo tetraglicol (10%) para prevenir a migração das partículas e reter o volume da
preparação no local de aplicação (OH et al., 2006). Microesferas de PLGA foram combinadas
com gelatina e poli(propileno fumarato) (PPF) para melhorar as propriedades mecânicas e
prolongar a liberação da proteína morfogenética óssea BMP-2 (KEMPEN et al., 2008).
38
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Outra forma de modificar a cinética de liberação é pela adição de excipientes
hidrofóbicos ou hidrofílicos. Dentre os excipientes utilizados em micropartículas estão o
polietilenoglicol (PEG), usado normalmente para controlar a liberação inicial, todavia não
está elucidado se o mesmo permanece dentro da matriz polimérica durante muito tempo. O
mecanismo do PEG no controle da liberação do fármaco em micropartículas não está
totalmente claro, uma vez que pode diminuir ou aumentar a taxa de liberação no caso
microesferas de PLGA (FERNÁNDEZ-CARBALLIDO et al., 2008). Ciclodextrinas também
vêm sendo usadas como excipientes farmacêuticos em sistemas como emulsões,
microcápsulas, microesferas, nanoesferas, nanocápsulas, lipossomas e niossomas para
modificar a sua cinética de liberação (TRICHARD et al., 2006; LOFTSSON; DUCHÊNE
et al., 2007).
2.5 Análise Fatorial
As características físico-químicas e de liberação dos sistemas poliméricos dependem,
por exemplo, dos parâmetros envolvidos no seu método de preparação. Dessa forma, para
controlar estas características, é essencial estabelecer o efeito de suas variáveis de formulação
e de cada etapa do seu processamento (BUDHIAN et al., 2007). Nesse contexto, a análise
fatorial representa uma ferramenta estatística eficiente para se obter um modelo matemático
multifatorial adequado para o estudo dos efeitos de parâmetros de formulação. Dessa forma, a
análise fatorial é bastante útil no estudo de otimização de sistemas de liberação de fármacos
(DILLEN et al., 2004).
Diferentemente dos experimentos tradicionais, em que a influência de cada parâmetro
é avaliada de maneira isolada, na análise fatorial é possível alterar diferentes variáveis
simultaneamente, e ainda quantificar os efeitos causados pelas variáveis independentes e a
interação entre elas em variáveis respostas (como na eficiência de encapsulação, no tamanho
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
de partícula, no potencial zeta, dentre outros). Além disso, a análise fatorial permite obter uma
maior quantidade de informações com um menor número de experimentos (GOHEL; AMIN,
1998; DILLEN et al. 2004; DAVIES et al., 2009). Neste estudo, o número de variáveis
independentes e de níveis (padronizados como +1 e -1) da análise fatorial define o número de
experimentos a serem realizados. Por exemplo, uma análise fatorial 24 significa que quatro
diferentes fatores (como concentração de polímero, fármaco, tensoativo da fase aquosa e
tensoativo da fase oleosa) serão variados em dois níveis (como na concentração de polímero,
20 e 50%), e a sua influência será avaliada em um ou mais parâmetros resposta (DILLEN et
al. 2004; BOZQUIR; SAKA, 2005).
Davies e colaboradores (2009) usaram análise fatorial para avaliar a influência da
concentração de reagentes na preparação de nanopartículas de sílica. Enquanto que
Derakhshandeh e colaboradores (2007) avaliaram como quatro variáveis modificam a
encapsulação da nitrocamptotecina em nanopartículas de PLGA usando a mesma ferramenta
estatística. E, Lee e colaboradores (2009) otimizaram as condições de preparação de
micropartículas de pectinato de cálcio com lipossomas e hidroxipropilmetilcelulose contendo
catequina usando análise fatorial.
2.6 Ciclodextrinas
A fermentação enzimática de alguns carboidratos, como celulose, amido e sacarose,
produz uma mistura de monossacarídeos, dissacarídeos e oligossacarídeos, resultando em
dextrinas lineares e cíclicas, estas útimas também sendo conhecidas como ciclodextrinas
(LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007). As ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos cíclicos com
uma estrutura rígida formados por unidades de glicopiranose unidas por ligações α (1→4).
Apresentam-se na forma de um cone truncado, onde os grupos OH secundários ligados aos
carbonos C-2 e C-3 ocupam a base de maior diâmetro do tronco, as hidroxilas primárias
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
ligadas ao carbono C-6 localizam-se na base menor do tronco (Fig. 4) (CHALLA et al.,
2005).
A disposição espacial dos grupamentos químicos nas ciclodextrinas favorece a
formação de uma cavidade central hidrofóbica e uma superfície externa hidrofílica,
permitindo desta forma, o processo de complexação molecular. Geralmente substâncias
químicas de baixa polaridade podem alojar-se no interior da cavidade das CDs formando
complexos de inclusão dinâmicos em solução (BREWSTER; LOFTSSON, 2007).
Figura 4 - Estrutura química de uma ciclodextrina (A) e desenho esquemático ilustrando a
cavidade hidrofóbica, a posição das hidroxilas primárias e secundárias e suas dimensões:
altura (H), diâmetro interno (DI) e diâmetro externo (DE) (adaptado de BREWSTER;
LOFTSSON, 2007).
As ciclodextrinas podem ser classificadas de acordo com o número de resíduos de
glicopiranose. As ciclodextrinas naturais αCDs, βCDs, e γCDs, respectivamente (Fig. 5)
contêm seis, sete e oito unidades glicosídicas (BREWSTER; LOFTSSON, 2007) e
apresentem diferentes propriedades de tamanho de cavidade, solubilidade, reatividade,
41
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
capacidade de complexação e efeito na estabilidade química das moléculas hóspedes (Tab. 2)
(CONNORS, 1997).
Figura 5 - Estruturas moleculares das ciclodextrinas naturais (adaptado de SONG et al.,
2009).
Dentre as ciclodextrinas naturais, a βCD é a mais utilizada por ser menos onerosa e
afinidade com muitas moléculas hidrofóbicas. No entanto, a sua menor solubilidade em água,
comparada às demais ciclodextrinas naturais, limita o seu uso (Tab. 2). Esse fato se deve a
ligação relativamente forte de suas moléculas em estado sólido (alta energia do cristal)
associada à diminuição da habilidade de formação de ligações de hidrogênio com a água (por
formar ligações de hidrogênio intramoleculares) (LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007). Complexo
de inclusão de DCTN com β-ciclodextrina já foi desenvolvido e reduziu a sua citotoxicidade
em hepatócitos de ratos e fibrobastos V79 (CORRÊA et al., 2005).
A ciclodextrina glicosil transferase (CGTase), um exemplo de amilase, é capaz de
abrir a cadeia de um polissacarídeo e ligar as extremidades de cada fragmento formando
ciclodextrinas. O tratamento do amido com amilase do Bacillus macerans (com CGTase)
produz uma mistura de α-ciclodextrina (60%), β-ciclodextrina (20%) and γ-ciclodextrina
(20%) juntamente com pequenas quantidades de ciclodextrinas com mais de oito resíduos de
glicose. Inovações biotecnológicas com diferentes tipos de enzimas CGTase tornaram
possível a produção mais específica e com maior grau de pureza das α-,
β- e
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
γ-ciclodextrinas, permitindo o uso destas como excipientes farmacêuticos (LOFTSSON;
DUCHÊNE, 2007).
Tabela 2 - Propriedades físico-químicas das ciclodextrinas (CONNORS, 1997).
Propriedade
Ciclodextrina
α
β
γ
n˚ de unidades de glicose
6
7
8
Fórmula empírica
C36H60O30
C42H70O35
C48H80O40
Peso molecular
972,85
1134,99
1297,14
Altura da cavidade (Ǻ)
8
8
8
Diâmetro da cavidade (Ǻ-aprox)
~ 5,2
~ 6,6
~ 8,4
Solubilidade (água, 25˚C) mol L-1
0,1211
0,0163
0,168
Vários derivados semi-sintéticos de ciclodextrinas têm sido produzidos objetivando a
otimização da solubilidade e estabilidade de ciclodextrinas ancestrais. Evidenciou-se que a
substituição de qualquer um dos grupos hidroxilas por grupamentos hidrofóbicos resulta em
um aumento significativo da solubilidade aquosa. Outros tipos de modificações estruturias
como aminação, esterificação das hidroxilas primárias e secundárias podem ainda ser
realizadas (DAVIS; BREWSTER, 2004; MARTIN DEL VALLE, 2004; CALABRÒ et al.,
2004; LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007).
A 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβCD) é um derivado obtido pelo tratamento de
uma solução de βCD com propilenoóxido, resultando em uma mistura de isômeros devido à
substituição randômica dos grupamentos hidroxílicos. Estatisticamente há aproximadamente
130.000 possibilidades de formação de derivados de HPβCD, dentre eles, inúmeros isômeros
geométricos e ópticos podem ser produzidos quando os grupamentos hidroxílicos são
43
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
inseridos em centros ópticos das moléculas. Derivados menos polares (metoxilados, aminados
ou esterificados), completamente substituídos apresentam uma menor solubilidade aquosa,
pela drástica redução de possibilidade de formação de isomerização. A habilidade dos
derivados de ciclodextrina em formar complexos solúveis em água também é dependente do
grau de substituição da ciclodextrina que pode ser otimizado objetivando-se preservar as
propriedades de solubilização. O grau de substituição da HPβCD de uso farmacêutico é de
aproximadamente 0,65 (que significa que há em média 0,65 de grupamentos hidroxipropil por
unidade de glicose) (LOFTSSON; DUCHÊNE, 2007).
Comparativamente, comprovou-se que a HPβCD apresenta maior solubilidade aquosa,
maior potencial de complexação e menores restrições toxicológicas e biológicas em relação à
βCD (GOULD; SCOTT, 2005; BREWSTER; LOFTSSON, 2007). Especificamente, a
HPβCD é bem tolerada no organismo humano, sendo metabolizada por bactérias do cólon,
onde uma parte excretada na forma intacta (aproximadamente 60%) e outra parte como
metabólitos (aproximadamente 40%) após a administração oral (DAVIS; BREWSTER,
2004). Estudos farmacocinéticos em ratos demonstraram que HPβCD apresenta t1/2 de 20 min
(i.v.), DL50 de 10 g/Kg (i.v.) e DL50 maior que 2 g/Kg (v.o.), e ainda, as doses máximas em
produtos do mercado são de 16.000 mg/dia (i.v.) e de 8.000 mg/dia (v.o.) (BREWSTER;
LOFTSSON, 2007).
2.6.1 Complexos de inclusão de fármacos com ciclodextrinas
As ciclodextrinas são alvo de interesse farmacêutico constante pela habilidade de
interagirem com fármacos hidrofóbicos melhorando a sua solubilidade aquosa. Os
mecanismos envolvidos podem estar relacionados à formação de complexos de inclusão, de
complexos de não-inclusão, de agregados e de soluções de fármacos supersaturadas estáveis
(BREWSTER; LOFTSSON, 2007). Podem ser formados complexos de inclusão múltiplos e
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
de não-inclusão de diferentes razões molares fármaco:ciclodextrina (1:1, 1:2, 1:3, 2:1)
(LOFTSSON et al., 2005; BREWSTER; LOFTSSON, 2007). Diferentes métodos são usados
na literatura para a obtenção de complexos de inclusão tais como, pasta, co-evaporação, coprecipitação, spray-dry e freeze-dry (ZINGONE; RUBESSA, 2005; DEVARAKONDA et al.,
2005).
Na formação de um complexo de inclusão 1:1 (mol/mol) (Fig. 6), é necessário que a
molécula hóspede (G) ou parte dela, associe-se em um equilíbrio dinâmico com a cavidade da
ciclodextrina e estabeleça ligações de caráter não-covalente, como forças de van der Waals,
interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio. Devido à natureza destas ligações, o
complexo de inclusão fármaco:ciclodextrina (G:CD) está continuamente sendo formado e
dissociado (MARTIN DEL VALLE, 2004; LOFTSSON et al., 2005). A habilidade de uma
ciclodextrina em formar um complexo de inclusão com uma molécula hóspede depende tanto
de fatores estéricos (relacionados ao tamanho molecular), como termodinâmicos
(relacionados a interações ciclodextrina-molécula hóspede-solvente) (MARTIN DEL VALLE
et al., 2004).
Muitas propriedades do fármaco (físico-químicas, biológicas e toxicológicas) podem
ser melhoradas com a formação de complexos com ciclodextrinas, tais como, solubilidade,
taxa de dissolução, biodisponibilidade oral de fármacos de Classe II e IV (conforme o Sistema
de Classificação Biofarmacêutico BCS), eficiência de encapsulação e perfil de liberação em
sistemas de liberação controlada, e problemas associados à toxicidade e à irritação local
(BREWSTER; LOFTSSON, 2007).
Quando as CDs são utilizadas como excipientes farmacêuticos visando melhorar as
propriedades dos fármacos associados, é importante considerar a quantidade de ciclodextrina
necessária para proposta finalidade. Nesse sentido, são desejáveis pequenas quantidades de
ciclodextrina por questões de custo e de toxicologia, o que é perfeitamente viável quando a
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trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
eficiência de complexação é satisfatória. Entretanto, existem estratégias para aumentar a
eficiência de complexação, com o aumento da solubilidade da molécula hospedeira no meio
aquoso de complexação, através de processos de ionização, formação de sal ou de complexos
metálicos ou pela adição de co-solventes orgânicos como o etanol (DUCHÊNE et al., 1999;
BREWSTER; LOFTSSON, 2007).
Figura 6 - Esquema da associação entre ciclodextrina hidratada (CD) e molécula hóspede
(G): (acima) complexos de inclusão 1:1 e (abaixo) complexos de inclusão 2:1
ciclodextrina:fármaco (SONG et al., 2009).
Apesar das vantagens atribuídas a formação dos complexos de inclusão de fármaco
com ciclodextrinas, muitas vezes, apenas o mecanismo de complexação molecular não é
suficiente para promover a liberação controlada do agente terapêutico. Com isso, a
incorporação de complexos de inclusão em sistemas de liberação controlada poderia viabilizar
a obtenção do perfil de liberação desejado (DE ROSA et al., 2005; FERNANDES et al.,
2007).
46
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
A incorporação de complexos de inclusão fármaco:ciclodextrina em sistemas
poliméricos pode aumentar a eficiência de encapsulação e a biodisponibilidade oral dos
princípios ativos associados, bem como, modular a cinética de liberação destes dispositivos
terapêuticos (DUCHÊNE et al., 1999). Isso é possível devido a natureza do complexo de
inclusão formado, produzindo de novas espécies com diferentes solubilidades e difusividades
nas matrizes poliméricas (DE ROSA et al., 2005), capazes de melhorar a hidratação da
matriz, promover sua erosão (SONG et al., 1997) e modificar o perfil de liberação do sistema
polimérico (BIBBY et al., 2000; TRAPANI et al., 2003).
2.7 trans-Desidrocrotonina (t-DCTN)
A trans-desidrocrotonina (t-DCTN) (Fig. 7) é o diterpeno clerodânico majoritário
isolado das cascas do caule (de árvores com idade acima de 3 anos) do Croton cajucara Benth
(Euphorbiaceae). Os demais metabólitos secundários, na sua grande maioria diterpenos
clerodanos, também foram isolados das cascas do caule desta espécie. Em função dos teores
de isolamento muito limitados, o único que teve sua ação biológica extensivamente
investigada foi a trans-crotonina (t-CTN) que comparativamente se mostrou menos eficaz do
que a t-DCTN (MACIEL et al., 2000; 2002; 2006; COSTA et al., 2005).
Esta espécie vegetal é popularmente conhecida como sacaca e representa um recurso
medicinal de grande importância na região amazônica brasileira. No estado do Pará, as cascas
do seu caule são utilizadas na forma de chá ou cápsulas no combate a diarréia, malária, febre,
problemas estomacais, inflamações do fígado, rins e vesícula. Ainda pode ser utilizda no
controle do diabetes e de índices elevados de colesterol. As folhas são utilizadas para auxílio
da digestão (MACIEL et al., 2002).
47
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
O
O
O
H
O
H
Figura 7 - Estrutura química da trans-desidrocrotonina (t-DCTN).
A ação medicinal do Croton cajucara está amplamente correlacionada ao clerodano
t-DCTN (MACIEL et al., 2000; 2002; 2006; 2007; COSTA et al., 2005), o qual apresenta as
seguintes atividades farmacológicas: hipoglicêmica (FARIAS et al., 1997; SILVA et al.,
2001a),
hipolipidêmica (FARIAS et al., 1996; SILVA et al., 2001a; 2001b; 2001c;
BIGHETTI et al., 2004), antigenotóxica (AGNER et al., 1999; 2001), antiulcerogênica
(HIRUMA-LIMA et al., 1999; MELO et al., 2003; RODRÍGUEZ et al., 2004),
antiinflamatória e antinociceptiva (CARVALHO et al., 1996), antitumoral (GRYNBERG
et al., 1999; MELO et al., 2004), antiestrogênica (LUNA-COSTA et al., 1999) e
cardiovascular (SILVA et al., 2005). A partir de modificações químicas da molécula de
t-DCTN estão sendo desenvolvidos estudos que objetivam a avaliação da relação
estrutura/atividade biológica (MACIEL et al., 2007; 2006; 2000; MELO et al., 2004; 2003;
2001; ANAZETTI et al., 2004; 2003).
Dentre as atividades farmacológicas da t-DCTN, a ação hipoglicemiante merece
destaque e já foi avaliada com este biotivo encapsulado em sistemas de liberação controlada
de fármacos. A atividade hipoglicemiante da t-DCTN foi avaliada em ratos Wistar machos
portadores de diabetes induzido por aloxano (150 mg/Kg, s.c.) e por estreptozotocina
48
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
(60 mg/Kg, i.p.). No método de indução por aloxano, o melhor resultado de hipoglicemia foi
produzido com a dose de 50 mg/Kg por via oral com uma diminuição de 53% depois de 5 h,
com eficácia comparável a da glibenclamida (2 mg/Kg, v.o.) usada como fármaco padrão.
Enquanto que no método de indução por estreptozotocina foi observada uma redução de
hiperglicemia de 61% depois de 72 h. O mecanismo de ação hipoglicemiante da t-DCTN não
está totalmente elucidado (SILVA et al., 2001). Foi observada melhoria na atividade
hipoglicemiante da t-DCTN na redução da glicemia de animais normoglicêmicos quando este
fármaco foi incorporado em microesferas poliméricas de PLGA (MORAIS et al., 2008).
Aspectos referentes à citotoxicidade e toxicidade da t-DCTN também devem ser
considerados no âmbito do desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos. A
atividade citotóxica deste bioativo foi avaliada através de parâmetros como variações da
morfologia celular, medidas da viabilidade celular e da inibição do metabolismo celular,
através de valores de CI50 (concentração do fármaco que inibe 50% do crescimento celular).
Nesse contexto, diversas linhagens de células foram estudadas: células fibroblásticas
pulmonares de hamsters chineses (V79) (SOUZA-BRITO et al., 1998; RODRÍGUEZ et al.,
1999; MELO et al., 2001; FREIRE et al., 2003), hepatócitos de ratos (RODRÍGUEZ et al.,
1999; CORRÊA et al., 2005), carcinoma de Ehrlich (GRYNBERG et al., 1999; MACIEL et
al., 2002; MELO et al., 2004), e células promielocíticas leucêmicas (HL60) (GRYNBERG et
al., 1999; MACIEL et al., 2002; MELO et al., 2004).
O efeito citotóxico da t-DCTN em células fibroblásticas pulmonares de hamsters
chineses (V79) mostrou uma redução dose-dependente da viabilidade celular com uma CI50
de 240 mM, variando a concentração de 80 a 400 μM (SOUZA-BRITO et al., 1998); em
células promielocíticas leucêmicas (HL60) produziu diferenciação celular e indução de
apoptose; em células mononucleares sanguíneas humanas mostrou baixa toxicidade
(ANAZETTI et al, 2003; 2004); em células HL60 produziu inibição de fosfatase e apoptose
49
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
(CORRÊA et al., 2005); e em hepatócitos extraídos de ratos demonstrou toxicidade seletiva
após tratamento subcrônico com 8 μM (RODRÍGUEZ et al., 1999). Outro estudo observou
diminuição da citotoxicidade da t-DCTN em células de V79 e cultura de hepatócitos quando
este princípio ativo foi complexado com a β-ciclodextrina (FREIRE et al., 2003).
Quanto à toxicidade da t-DCTN, estudos de toxicidade subaguda e aguda já foram
realizados. Nos ensaios de toxicidade subaguda, a t-DCTN foi administrada diariamente por
via oral durante 35 dias (25, 50 e 100 mg/Kg). Os resultados demonstraram uma redução dos
níveis de protoplasma, fosfatase alcalina e colesterol. Além disso, foram observadas
alterações histopatológicas no fígado (tumefação turva, degeneração microvacuolar e
alterações nucleares) (RODRÍGUEZ et al., 2004), e ainda, em doses mais elevadas, um
aumento significativo no peso do fígado e nos níveis da gama-glutamil transpeptidase (ratos
fêmeas).
A toxicidade aguda da t-DCTN foi avaliada em camundongos Swiss machos após 14
dias de administração por via oral (nas doses de 125, 250, 500, 750 e 1000 mg/Kg), e por via
intraperitoneal (nas doses de 25, 31, 62,5, 125, 250 e 500 mg/Kg). Os resultados destes
ensaios demonstraram uma baixa toxicidade deste princípio ativo, com valores de DL50 de
876 mg/Kg (12 h) e 47,2 mg/Kg (14 dias) para ambas as vias de administração (SOUZABRITO et al., 1998). Estudos de toxicidade aguda realizados durante 72 h com administração
da t-DCTN por via oral não revelaram nenhum sintoma tóxico em nível de sistema nervoso
central, como estereotipia, ataxia, e convulsão. A DL50 da t-DCTN foi determinada em
camundongos por via oral, sendo de 555 mg/Kg (v.o.) (CARVALHO et al., 1996). Apesar de
a t-DCTN apresentar uma baixa toxicidade, o uso indevido da sacaca (uso de folhas em
tratamentos prolongados) vem sendo associado a casos de hepatite tóxica (aguda, crônica e
fulminante) (MACIEL et al., 2006; 2002).
50
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
OB J E T I V OS
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trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
OBJETIVOS
Objetivo Geral
Obter e caracterizar sistemas de liberação controlada inovadores contendo o
terpenóide bioativo t-DCTN e o complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD em microesferas dos
polímeros biodegradáveis PCL e PLGA.
Objetivos Específicos
• Avaliar a influência de parâmetros de formulação através de análise fatorial usando a
técnica de emulsão múltipla com evaporação do solvente para a obtenção das
microesferas;
• Otimizar formulações de microesferas através do uso de análise fatorial para a
encapsulação da t-DCTN e do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD;
• Preparar microesferas de PCL e PLGA contendo t-DCTN;
• Preparar microesferas de PCL e PLGA contendo complexo de inclusão
t-DCTN:HPβCD;
• Caracterizar as microesferas físico-quimicamente com a avaliação do percentual de
encapsulação, polidispersão (índice span), carga de superfície (potencial zeta), análise
morfológica e porosidade;
• Determinar o perfil de liberação in vitro das microesferas de PCL e PLGA contendo
t-DCTN e o complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD;
• Avaliar o perfil de liberação in vitro das microesferas através do uso de modelo teórico
de cinética de liberação;
• Avaliar a influência do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD nas propriedades
físico-químicas e de cinética de liberação das microesferas.
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
A R T I GO
Physicochemical and release characteristics of
t-dehydrocrotonin
and
t-DCTN:
hydroxypropyl-β-cyclodextrin
inclusion
complex into PCL and PLGA microparticles
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Physicochemical
and
release
characteristics
of
t-dehydrocrotonin
and
t-DCTN:hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion complex into PCL and PLGA
microparticles
Waldenice de Alencar Morais1, Rosana Silva Batista1, Maria Aparecida Medeiros Maciel2,
Nereide Stela Santos-Magalhães1*
1
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami
(LIKA), Av. Prof. Moraes Rego, 1235 Cidade Universitária, Recife, PE, Brazil, 2Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Departamento de Química, Natal, RN, Brazil
* Corresponding author
Dra. Nereide Stela Santos Magalhães
Universidade Federal de Pernambuco
Grupo de Sistemas de Liberação Controlada de Medicamentos
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA)
Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária.
50670-901, Recife-PE, Brasil.
Phone: + 55–81- 21012501; fax: +55–81- 21012508
E-mail: [email protected]; [email protected]
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trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Abstract
The purpose of this study was to evaluate the influence of the presence of t-DCTN and
t-DCTN:hydroxypropyl-β-cyclodextrin
inclusion
complex
(t-DCTN:HPβCD)
of
polycaprolactone (PCL) and poly (D,L-lactic-co-glycolic)-acid (PLGA) microparticles on
their physicochemical and release properties. Three different microparticle systems were
prepared by double W/O/W emulsion-solvent evaporation method with t-DCTN,
t-DCTN:HPβCD or co-encapsulated t-DCTN:HPβCD incorporated into the aqueous phase
and t-DCTN in the organic phase of the simple emulsion. The polyethylene glycol (PEG) and
polyvinylalcohol (PVA) were used as stabilizing agents of the simple and double emulsion,
respectively. Initially, pre-formulation studies of unloaded PCL microparticles were
performed using 24−1 fractional factorial design varying PEG and PVA concentration, and
aqueous phase volume of the simple and double emulsions. The influence of the formulation
features on the particle size and polydispersity (span) of unloaded PCL microparticles was
thus evaluated using the factorial design. Factorial design showed to be an excellent tool to
optimize PCL microparticles. The variation of the inner and outer aqueous phase volumes of
the double emulsion considerably affected the size and the span of the resultant
microparticles. The size of unloaded PCL microparticles varied from 6.68 to 28.41 μm and
the span changed from 1.16 to 4.76 with the alteration of the factors. Considering the most
stables unloaded microparticle formulations, t-DCTN and t-DCTN:HPβCD-loaded PCL and
PLGA microparticles were prepared to evaluate the influence of the polymer type. The
t-DCTN was encapsulated into PCL and PLGA microparticles with loading drug of almost
4% and 6% (w/w) at 1:10 drug/polymer ratio, respectively. The t-DCTN:HPβCD inclusion
complex changed physicochemical characteristics of the microspheres, producing smaller
particle size, better encapsulation efficiency, loading, and porosity parameters (specific
surface area and pore size distribution), as well as, a smooth surface morphology in
comparison with t-DCTN-loaded systems. The co-encapsulation of DCTN:HPβCD inclusion
complex with t-DCTN at 1:5 drug/polymer ratio increased the drug loading to almost 14%
(w/w) in PLGA microspheres with particle size of 9.59 µm and span of 1.57. The good
agreement between kinetic profiles and fickian model indicated that the diffusion is involved
on the release mechanism of t-DCTN. The t-DCTN:HPβCD inclusion complex modified the
release properties with smaller diffusion rates, for PCL (k2= 0.105) and PLGA (k2= 0.107), in
comparison with microparticles containing only t-DCTN, k2=0.289 (PCL) and k2=0.395
(PLGA), respectively. The t-DCTN-loaded PLGA microspheres presented higher burst effect
and faster drug release associated to formation of a porous network. The co-encapsulation of
t-DCTN and t-DCTN:HPβCD in PLGA microspheres reduced the burst effect (almost 1.5%)
and diffusion rate (k2=0.079). These results suggest a smaller affinity of t-DCTN by PCL
matrix in relation to PLGA due to its lower encapsulation, higher modification of the surface
charge (zeta potential), higher burst effect and faster release profiles. The physicochemical
and release characteristics of PCL or PLGA microspheres were modified with the presence of
free drug and/or complexed drug. From these findings novel formulations of PCL and PLGA
microspheres containing t-DCTN and t-DCTN:HPβCD inclusion complex were obtained to
be applied in in vivo studies.
Keywords: Drug delivery systems, microparticles, trans-dehydrocrotonin, drug inclusion
complex with cyclodextrin, factorial design.
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
1. Introduction
The diterpene 19-nor-clerodane trans-dehydrocrotonin (t-DCTN) is a bioactive
compound isolated of the stem bark of Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae), which
presents several pharmacological activities. Particularly the hypoglycemic effects of DCTN
were reported (Farias et al., 1997; Silva et al., 2001). Nevertheless, the lower water solubility
and hepatotoxicity of this compound has been associated to the limitation of its therapeutic
application (Corrêa et al., 2005; Morais et al., 2008). A promising strategy to overcome these
issues could be the encapsulation in polymeric microparticles to modulate its therapeutical
dose, bioavailability and toxic effects.
Polymeric microparticles have been commonly employed as attractive drug delivery
systems to overcome low oral bioavailability of certain drugs. Microparticles would offer
several advantages as providing a controlled drug delivery within therapeutic range, allowing
less frequent administrations and reducing toxic effects, thereby increasing patient compliance
(Freiberg and Zhu, 2004; Wischke and Schwendeman, 2008). Biocompatible and
biodegradable polymers with safety profile for human use such as poly-ε-caprolactone (PCL)
and poly (D,L-lactic-co-glycolic)-acid (PLGA) are the most widely used materials in the
preparation of drug delivery systems (Jain, 2000; Gander et al., 2001; Lecaroz et al., 2006;
Martínez-Sancho et al., 2006; Fernández-Carballido et al., 2008).
Among the different methods described to prepare microparticles (Jiang and
Schwendeman, 2001; Zhang et al., 2008), the double emulsion-solvent evaporation technique
(w/o/w) is the widely accepted to encapsulate a variety of drugs (Garbayo et al., 2008; Li et
al., 2008). The modification of variables on the formulation and preparation method allows
the control of the microparticle characteristics such as particle size and drug release
properties. The factorial design represents a theoretical model suitable to perform a
56
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
quantitative relationship between the effects of the formulation variables individually or in
association, providing a new approach to optimize pharmaceutical formulations (Dillen et al.,
2004; Derakhshandeh et al., 2007). In the present study factorial design is proposed to as a
tool in the optimization of microparticles containing t-DCTN.
Cyclodextrins (CDs), cyclic oligosaccharides, have broad pharmaceutical applications
as solubilizing agents of lipophilic drug molecules, providing alteration of their
physicochemical and biological properties. Cyclodextrins enhance aqueous solubility of drugs
and improve thereby their stability and bioavailability profiles, through the formation of noncovalent dynamic (host–guest) inclusion complexes (Del Valle, 2004; Brewster and Loftsson,
2007). Cyclodextrins have been used as pharmaceutical row material in drug delivery systems
such as microcapsules, microparticles, nanospheres, nanocapsules, liposomes and niosomes
(Trichard et al., 2006; Loftsson and Duchêne, 2007), modifying the loading and release
characteristics of drugs (Duchêne et al., 1999). Recently, a growing interest has been showed
in the use of βCD derivatives, such as the 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD), due to
its improved ability to form inclusion complexes, greater water solubility and less toxicity
than the parent cyclodextrins (Loftsson and Duchêne, 2007).
As reported, the inclusion of t-DCTN in βCD carried out to control the drug release was
able to reduce its cytotoxicity in rat hepatocytes and V79 fibroblasts (Corrêa et al., 2005).
Furthermore, t-DCTN-loaded PLGA spherical microparticles were recently developed by our
research time with mean diameters size of 3.2 ± 0.1μm and 7.6 ± 0.7 μm, and encapsulation
efficiency of 85.5 ± 3.9%. The in vitro kinetic profile of DCTN from PLGA-microspheres
was initially fast (burst effect of 19.4% at 2 h), followed by a controlled release attaining a
maximum drug released of 55.6% within sixty hours. It was also demonstrated that the
hypoglycemic effect of t-DCTN was improved by its encapsulation into drug delivery
57
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
systems. The t-DCTN-loaded PLGA microspheres reduced the glucose levels at 26.8%
comparated with 14.3% obtained to DCTN at normal glycemic animals (Morais et al., 2008).
Taking into account all these findings, the aim of the present study was to combine the
advantages
properties
of
the
biodegradable
microparticles
and
the
concept
of
drug-cyclodextrin inclusion complex to develop t-DCTN microparticles using fractional
factorial design. The main idea was to obtain novel PCL and PLGA microparticles containing
the free t-DCTN, DCTN:HPβCD inclusion complex and both free and complexed forms of
t-DCTN. The influence of the drug:inclusion complex on the physicochemical and release
characteristics of microparticles was investigated using different polymeric matrices for
further pharmacological purposes.
2.
Materials and methods
2.1
Materials
The t-DCTN was extracted and purified from the stem bark of Croton cajucara Benth
(Maciel et al., 2000), and its physicochemical characterization was carried out at the
Chemistry Laboratory of the Federal University of the Rio de Janeiro (Brazil). The
poly(D,L-lactic-co-glycolic)-acid (PLGA 50/50, inherent viscosity of 0.57 dl/g) was
purchased
from
Birmingham
Polymers
(Alabama,
USA)
and
polycaprolactone
(PCL, MW≈14,000 Da) was furnished by Sigma-Aldrich (St Louis, USA). The stabilizers
polyvinyl alcohol (PVA, MW of 13,000-17,000 Da) and polyethylene glycol (PEG, MW 4,000
Da),
the
cryoprotectant
trehalose
and
the
2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin
(HPβCD, MW≈1380, degree of substitution≈0.6) were obtained from Sigma-Aldrich
(St Louis, USA). Tween 80® was supplied by Labsynth (São Paulo, Brazil). Purified water
was obtained through Human UP 900 water purification system (Human Corporation, Korea)
58
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
and used in the preparation of phosphate buffer solutions (pH 7.4). Silica-alumina was
acquired from Micromeritics (Norcross, USA). All other reagents were of analytical grade.
2.2
Three
Methodology
different
microparticle
systems
were
thus
prepared
with
t-DCTN,
t-DCTN:HPβCD and co-encapsulation of t-DCTN in the organic phase of the simple
emulsion and t-DCTN:HPβCD in the aqueous phase of the double emulsion.
Initially,
pre-formulation studies of the preparation of unloaded PCL microparticles were performed
using fractional factorial design.
2.2.1 Pre-formulation studies of microparticles using fractional factorial design
The unloaded PCL microparticles were prepared using a water-in-oil-in-water (w/o/w)
emulsion solvent evaporation technique. Briefly, a simple emulsion (w/o) was prepared by
dissolving the PCL (225 mg) in dichloromethane (6 mL). The organic solution was emulsified
with a pH 7.4 phosphate buffer solution (1 – 3 mL) containing PEG (50 – 200 mg) at 8,000
rpm for 1 min (ultra-turrax T25, IKA, Germany) using an ice bath. Next, the simple emulsion
was added to the outer aqueous phase (30 – 100 mL) constituted of PVA (0.5 – 2%, w/v) and
emulsified at 8,000 rpm for 30 s, resulting in a double emulsion (w/o/w). This emulsion was
then maintained under agitation at 400 rpm for 2 h allow the solvent evaporation. The
microparticles were recovered through centrifugation (Kubota KN-70 centrifuge, Japan) at
3,000 rpm (1171 g) for 10 min and washed three times with distilled water to remove the
excess of emulsifiers. Finally, microparticles were dispersed within 1% (w/v) trehalose
aqueous solution (2 mL), frozen at –80°C and lyophilized (EZ-DRY, FTS System, USA) in
equipment operating at 200 bars during 48 h. The storage of lyophilized microparticles was
performed at 25 ± 1°C in a vacuum desiccator.
59
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
The influence of the formulation parameters on the development of unloaded PCL
microparticles prepared by multiple emulsion solvent evaporation method was carried out
using a 24−1 fractional factorial design (Barros Neto et al., 1995). The effects of four
parameters of the simple (i) and multiple (ii) emulsions were evaluated as following: (i) factor
1 (PEG A1=50, 125 or 200 mg) and factor 2 (inner aqueous phase volume, VA1=1, 2 or 3 mL);
and (ii) factor 3 (PVA
A2=0.5,
1.25 or 2%) and factor 4 (aqueous continuous phase volume,
VA2=30, 65 or 100 mL). The response variables of the factorial experiment were the volume
mean diameter (dv) and particle size distribution (span) of the microparticles. To provide an
estimate of the pure error, the design was enlarged with a central point run in triplicate. The
low and high levels of the factors were represented by -1 and +1 coded values, respectively,
and the central point by 0, as shown in Table 1. The design matrix was composed of eleven
batches of microparticles (from M1 to M11) prepared in a randomized manner. The
interpretation of the statistical model was performed by evaluating the main effects and their
interactions. The statistical analysis of the data was performed using the Statistica® software
(version 6).
Table 1. Factor levels and response variables used in the fractional factorial design (24−1) on
the development of unloaded PCL microparticles.
Factors
Simple emulsion
(1) PEG (mg), (PEG A1)
(2) Aqueous phase volume (mL), (VA1)
Multiple emulsion
(3) PVA (%), (PVA A2)
(4) Aqueous phase volume (mL), (VA2)
Response variables
PCL= 225 mg
-1
Coding
0
+1
50
1
125
2
200
3
0.5
1.25
2
30
65
100
Volume mean diameter (dv)
Particle size distribution (span)
60
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
2.2.2 Preparation of DCTN:HPβCD inclusion complex and quantification of t-DCTN into
inclusion complex
Inclusion complex of t-DCTN:HPβCD with a 1:1 molar ratio was prepared by
freeze-drying technique. Appropriate amounts of drug and HPβCD were dissolved in an
ethanol:water solution (1:1), stirred for 48 h at 25°C, cooled by immersion in liquid-nitrogen
at -80 °C and lyophilized (EZ-DRY, FTS System, US) for 48 h.
The amount of t-DCTN in the inclusion complex was determined using a
UV spectroscopic validated method (Lapenda et al., 2010). An amount of t-DCTN:HPβCD
inclusion complex (equivalent to 1 mg of t-DCTN) was weighed and mixed with 10 mL of
methanol and acetonitrile mixture (1:10) to extract the drug. An aliquot of the sample was
diluted with acetonitrile to a drug theoretical concentration of 10 µg/mL. This procedure was
performed in triplicate. The standard curve of t-DCTN was performed at concentration
varying from 1 to 20 μg/mL in acetonitrile.
2.2.3 Preparation of t-DCTN-loaded microparticles
Based on results of the factorial design, PCL or PLGA microparticles containing
t-DCTN or t-DCTN:HPβCD inclusion complex (11.3 - 22.5 mg) were prepared using the
water-in-oil-in-water (w/o/w) emulsion/solvent evaporation technique, as previously
described in section 2.2.1. Three different microparticle systems were thus prepared
containing free t-DCTN, which was dissolved in the organic phase of the simple emulsion; the
inclusion complex t-DCTN:HPβCD dissolved in the aqueous phase of the simple emulsion;
and the co-encapsulation of t-DCTN in the organic phase of the simple emulsion and
t-DCTN:HPβCD in the aqueous phase of the simple emulsion. A typical formulation of
microparticles was constituted of PCL or PLGA (225 mg) dissolved in 6 mL of
61
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
dichloromethane, PEG (125 mg) dissolved in 2 mL of water to form the simple emulsion, and
PVA (1.25%) dissolved in 45 mL of water as the continuous phase of the multiple emulsions.
2.2.4
Characterization of microparticles
2.2.4.1 Particle size analysis
The volume mean diameter (dv) and size distribution (span) of microparticles were
determined
trough
laser
diffraction
technique
using
a
particle
size
analyzer
(Microtrac® S3500, USA). Samples of lyophilized microparticles (10 mg) were dispersed in
0.04% Tween 80® (w/v), sonicated for 10 min and analysed. The dv represents the volume
mean diameter and the span was calculated by the equation: span=d(v,0.9)−d(v,0.1)/d(v,0.5), where
d(v,0.9), d(v,0.5) and d(v,0.1) are the volume mean diameters determined at 90th, 50th and 10th
percentile of particles, respectively.
2.2.4.2 Drug efficiency encapsulation and drug loading
Accurately weighed amounts of lyophilized microparticles (5 mg) were dissolved in
25 mL of dichloromethane and methanol mixture (3:2) and sonicated for 10 min. t-DCTN was
detected at 238 nm. The amount of t-DCTN in microparticles was determined using a
standard curve of t-DCTN at concentrations ranging from 3 to 20 μg/mL in methanol. The
experiments were carried out in triplicate. The drug content was thus used to calculate the
encapsulation efficiency and drug loading.
The drug encapsulation efficiency was calculated by the relation between the experimental
and theoretical t-DCTN concentrations determined in microparticles expressed as percentage.
The drug loading was calculated by the ratio between the encapsulated drug and the weight of
lyophilized microparticles expressed as percentage (w/w) (Cocero et al., 2009; Ishihara et al.,
2009).
62
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
2.2.4.3 Zeta potential measurements
The surface charge of microparticles was evaluated through electrophoretic mobility (μE )
measurements using a Zeta-Meter System 3.0+ (Zeta-Meter Inc., USA) at 25°C.
Microparticles were dispersed in 1 mM NaCl at 0.5% (w/v) and sonicated for 10 min and
analyzed. The results are reported as the average of ten runs and expressed by the zeta
potential (ζ, mV) calculated from μE by the Smoluchowski relationship: ζ=(μEη)/(ε0εr), where
ε0 is the permittivity of a vacuum, εr the relative dielectric permittivity of the medium
(dielectric constant), and η is the viscosity of the dispersing phase.
2.2.4.3 Morphological analyses
The morphology of microparticles was evaluated by scanning electron microscopy
(SEM, FEI, Quanta 200 FEG) at the Center of the Northeast Technology (CETENE, Recife,
PE, Brazil). For SEM analysis, the samples were prepared from lyophilized microparticle
redispersed in water. A sample was dropped on a piece of silicium wafer and dried in a
desiccator. After drying, the piece of silicium wafer was sealed with colloidal silver on stubs
for analysis on low vacuum at 10,00 kV and magnification of around 5,000 x.
2.2.4.4 Porosity analysis
The porosity parameters of microparticles were evaluated through the surface gas
adsorption technique. Measurements were performed using an accelerated surface area and a
porosimetry system (ASAP 2420, Micrometrics, Norcross, USA) at the CETENE. Before
analysis a sample of lyophilized microparticles (100 mg) was placed in a volumetric sample
tube and degassed under vacuum at 20°C for 48 h. The sample tube was then immersed in
liquid nitrogen and the sample exposed to inner nitrogen under precisely controlled pressures.
The pressure at which adsorption equilibrium occurred is measured and the universal gas law
63
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
applied to determine the quantity of gas adsorbed on the surface of microparticles.
Adsorption/desorption isotherms at 77 K were plotted from the volume of nitrogen (vapor)
adsorbed onto the surface of samples as a function of the relative pressure. Silica-alumina
pellets (specific surface area 215 ± 6 m2/g; mean pore diameter of 11.5 nm) were used as
standard reference. The specific surface area was calculated using the Brunauer–Emmett–
Teller (BET) method (Brunauer et al., 1938). The pore size distribution was determined by the
adsorption branch of the N2 isotherm (1.7 – 300 nm diameter range) using the Barret–Joyner–
Halenda (BJH) model (Barrett et al., 1951).
2.2.4.5 In vitro release kinetics
The release kinetics of t-DCTN from microparticles was carried out using dissolution
technique at sink conditions (Morais et al., 2008). Samples of microparticles (7 – 20 mg)
containing t-DCTN, t-DCTN:HPβCD inclusion complex or co-encapsulated free and
complexed drug were placed into 200 mL of 0.2 M phosphate buffer (pH 7.4) at 37 ± 1 °C
under magnetic agitation. At pre-determined time intervals, samples of the release medium
(1 mL) were withdrawn and replaced with fresh medium, filtered (0.22 μm membrane filter,
Millipore®, USA) and the t-DCTN content analyzed spectrophotometrically as previously
described. Kinetics experiments were conducted in triplicate. The in vitro release profiles of
t-DCTN from different microparticles were plotted as the percentage of t-DCTN released as a
function of time.
2.2.4.6 Mathematical modeling of drug release
The experimental release data were fitted by an exponential model using the
equation: M t / M ∞ = (1 − k1e − k2t ) , where M t and M ∞ are the absolute cumulative amount of
drug released at time t and initial drug content, respectively; and the constant k 2 is associated
64
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
to the drug diffusion coefficient in the polymer matrix (Siepmann and Siepmann, 2008; Klose
et al., 2008). The first hours of the kinetics were fitted with the Fickian square-root-of-time
(t1/2) model and the release rate determined by the slope of the linear regression.
3. Results
3.1 Development of unloaded PCL microparticles using factorial design
The aim of the factorial design was to obtain the adequate formulation of PCL
microparticles for further incorporation of t-DCTN and t-DCTN:HPβCD inclusion complex.
The 24−1 fractional factorial design was carried out by evaluating the effect of variables of the
emulsion/solvent evaporation technique on the size pattern of unloaded PCL microparticles.
The factors of the simple emulsion (PEGA1 and VA1) and the multiple emulsion
(PVAA2 and VA2) markedly influenced the response variables dv and span of the microparticles
as shown in Table 2. The volume mean diameter of unloaded PCL microparticles varied from
6.68 to 28.41 μm and the span from 1.56 to 4.76. Particularly, the volume mean diameter and
span of the reference formulation (M9, zero point), prepared in triplicate (M10 and M11),
varied from 19 to 23 μm (± 0.45 – 1.76 μm) and 1.35 to 1.76, respectively.
The main and interaction effects of factors of the factorial design of unloaded PCL
microparticles are summarized in Table 3. The effect value indicates the magnitude of the
impact of each factor as well as their interactions. The values showed in bold represent the
factors that present statistical significance (p<0.05). The signal effect, positive (+) or negative
(-), indicates as the response variable is modified as a function of the factor variation. A
positive effect means that the output increases with the increasing of the variable level and a
negative effect that the output increases with decreasing the variable level (Barros Neto et al.,
1995).
65
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Table 2. Size characteristics of unloaded PCL microparticles obtained by emulsion/solvent
evaporation technique using 24−1 fractional factorial design.
Microparticles
Factors
2
3
(VA1) (PVAA2)
-1
-1
M1
1
(PEGA1)
+1
M2
-1
-1
+1
M3
+1
+1
M4
-1
M5
4
(VA2)
+1
Response variables
dv ± sd (μm)
span
28.41 ± 0.32
2.02
+1
26.03 ± 0.49
1.29
+1
+1
14.10 ± 1.12
1.62
+1
-1
+1
8.11 ± 0.12
2.51
-1
+1
+1
-1
13.00 ± 0.59
4.76
M6
-1
-1
-1
-1
14.70 ± 0.87
1.79
M7
+1
-1
+1
-1
7.82 ± 0.16
3.23
M8
+1
+1
-1
-1
6.68 ± 0.43
3.61
M9
0
0
0
0
20.76 ± 1.76
1.56
M10
0
0
0
0
18.62 ± 0.45
1.35
M11
0
0
0
0
22.90 ± 1.47
1.76
PCL=225 mg.
Table 3. The main and interaction effects of fractional factorial design of unloaded PCL
microparticles.
Factors
Mean/Interaction
Effect 1
Effect 2
(dv)
(span)
16.46636
2.31818
1
-1.20750
0.03250
2
-8.19750
0.85250
3
0.19250
0.43250
4
8.61250
-1.48750
1 by 2
1.61250
-1.24250
1 by 3
-7.91750
-0.44250
1 by 4
5.39250
-0.11250
66
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
The data clearly indicate significant effects of the factors VA1 and VA2 on dv and span of
PCL microparticles, with higher importance for VA2. The internal aqueous phase volume had a
negative effect (-8.19750) and the external aqueous phase volume had a positive effect
(8.61250) in the particle size. It means that a decrease in the dv can be achieved with an
increase of VA1 and a decrease of VA2 of the reference formulation (M9). VA1 and VA2 present
positive (0.85250) and negative (-1.48750) main effects in the span, respectively. It means
that a change in one of the significant factors of the factorial design (VA1 and VA2) carry out
opposite effects on the size and span of the microparticles.
Taking into account the
formulation M8 (VA1=3 mL and VA2= 30 mL) a smaller dv (6.68 ± 0.43 µm) and an increased
span (3.61) were found.
The significant interaction effects were 1 by 3 on dv (-7.91750), and 1 by 2 on span
(-1.24250) of the PCL microparticles. The results showed that the interaction of the factors
PEGA1 and PVAA2 produced a decrease in dv (7.82 µm, M7), and that interaction of the factors
PEGA1 and VA1 produced a decrease in span of microparticles.
The fractional factorial design allowed the production of PCL microparticles with
smaller size (<19 μm) but higher span values (>1.76, except for M2 and M3) in relation to
M9, because of the opposed effects caused by the factors on the response variables.
In present study, it is desired a particle size < 10 µm and a span value < 2. That is due
to the further application of t-DCTN loaded microparticles as systems to oral route that must
have adequate particle size to pass through the intestinal barrier (Gaumet et al., 2007).
Furthermore, the span values around 2 are appropriate for drug delivery systems (RibeiroCosta et al., 2008). Based on this fact, the reference formulation (M9) was modified and a
new formulation (M12) was prepared containing PCL (225 mg) and PEG (125 mg) with a VA1
of 2 mL to form the simple emulsion, and PVA (1.25%) and VA2 of 45 mL as the continuous
67
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
phase. As expected, M12 presented the smaller dv (6.45 ± 0.53 µm) and a slightly higher span
(2.09) than M9 (Figure 1).
Figure 1. Scatterplot of volume mean diameter and span of unloaded PCL microparticles
optimized using fractional factorial design 24−1.
The variation of the inner/external aqueous phase (w1/w2) ratio had a great influence
on the size properties of the PCL microparticles. The smaller value of dv (6.45 μm) was found
for w1/w2 ratio of 1/22.5 (M12). However, small dv values were also found for w1/w2 ratio
varying from 1/10 (6.68 μm, M8) and 1/30 (7.82 μm, M7).
The increase in particle size of PCL microparticles with the increase of the volume of
the external aqueous phase can be attributed to a decrease in the mixing efficiency associated
with larger volumes during the agitation process. A reduction in mixing efficiency probably
produced an increase in the size of the simple emulsion droplets, which would result in the
formation of large microparticles. The decrease of the diameter and the increase of the
polidispersity (span) of microparticles with the increase of the volume of the internal aqueous
phase were possibly caused by the increase of the volume fraction of the dispersed to
68
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
69
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
continuous phase (Li et al., 2008). Other authors have already reported this effect (Jeyanthi et
al., 1997; André-Abrant et al., 2001). When w/o/w double emulsion technique is used, the
viscosity of the polymer phase may also be influenced by the presence of the inner water
phase (Wischke and Schwendeman, 2008). A decrease of the viscosity of the dispersed phase
of microspheres carried out a larger size distribution (Yang et al., 2000).
In the present study, PEG and PVA were used to stabilize the internal phase of the
simple emulsion and the continuous phase of the multiple emulsions, respectively, during
microsphere preparation. As previously reported, the increase of surfactant concentrations
reduced the size of microspheres (Yang et al., 2001; Li et al., 2008; Luciani et al., 2008).
3.2 t-DCTN-loaded microparticles
The formulation of PCL microparticles (M12) was used to encapsulate the t-DCTN
varying the payload from 11.3 to 22.5 and the drug/polymer ratio from 1:10 to 1:20 (Table 3).
Table 3. Size properties and encapsulation efficiency of t-DCTN in PCL microparticles.
t-DCTN
(mg)
Drug:polymer
ratio
Particle size
dv ± sd
span
(µm)
EE ± sd
(%)
Loading ± sd
(%, w/w)
22.5
1:10
49.28 ± 1.65
2.12
49.70 ± 0.21
4.06 ± 0.02
15.0
1:15
42.21 ± 3.22
1.82
34.24 ± 0.39
2.07 ± 0.02
11.3
1:20
25.81 ± 0.12
1.39
18.06 ± 0.25
0.79 ± 0.01
PCL= 225 mg.
The presence of t-DCTN influenced the particle size properties of PCL microparticles.
A remarkable increase of size and span of microparticles with the increment in the initial
amount of t-DCTN from 11.3 to 22.5 mg was found. The volume mean diameter varied from
25.81 to 49.29 μm and the span from 1.39 to 2.12. However, no significant increase of span
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
values in relation to unloaded PCL microparticles (span 2.09) was found. It should be noted
that the smaller size was found at 1:20 drug/polymer ratio (25.81 µm). The presence of the
drug can increase the viscosity of the dispersed phase, and, as a result, the size of the droplets
in the emulsification medium increased, which leads to an augmentation of the size of
microparticles (Li et al., 2008; Balmayor et al., 2009).
The t-DCTN was encapsulated into PCL-based microparticles with encapsulation
efficiency varying from 18.06 (11 mg t-DCTN) to 49.70% (22 mg t-DCTN) and the drug
loading increased from 0.79 to 4.06%. As expected, the t-DCTN loading in microparticles
was improved with the increase of the drug amount. In fact, it is well known that the drug
efficiency encapsulation generally increases with the drug/polymer ratio (Wan et al., 1992).
Further studies were carried out to investigate the influence of the polymer type on the
t-DCTN encapsulation. In this way, t-DCTN-loaded PLGA microparticles were prepared
under the same conditions as t-DCTN-loaded PCL microparticles (Table 4).
Table 4. Size properties and encapsulation efficiency of t-DCTN in PLGA microparticles.
t-DCTN
(mg)
Drug:polymer
ratio
Particle size
dv ± sd
span
(µm)
EE ± sd
(%)
Loading ± sd
(%, w/w)
22.5
1:10
14.56 ± 0.19
1.00
75.73 ± 0.40
5.90 ± 0.03
15.0
1:15
16.31 ± 0.40
1.02
62.67 ± 0.13
3.34 ± 0.01
11.3
1:20
15.82 ± 0.07
0.81
58.80 ± 0.44
2.36 ± 0.02
PLGA=225 mg.
The results showed that the mean size of PLGA microparticles were smaller
(14.56 – 16.31 µm) than that of t-DCTN-loaded PCL microparticles (<25 µm). The span
values slightly varied from 0.81 to 1.00 for t-DCTN contents varying from 11.4 to 22.5 mg.
The encapsulation efficiency and drug loading increased from 58.80 to 75.73% and
70
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
2.36 to 5.90% (w/w), respectively. The increase of the drug/polymer ratio had influence on
the particle size of PLGA microparticles probably due to the higher affinity of t-DCTN to
PLGA matrix.
The t-DCTN-loaded PLGA microparticles presented different characteristics of size
and drug encapsulation. The smaller mean diameters and narrow size range were found,
whereas the encapsulation percentages were improved in relation to t-DCTN-loaded PCL
microparticles. That was probably due to the higher affinity of t-DCTN to the PLGA matrix,
and therefore, causing an increased retention of the drug in the organic phase and improving
emulsion stability during the formation of microparticles (Mao et al., 2008).
3.3 t-DCTN:HPβCD-loaded microparticles
The HPβCD was chosen to prepare inclusion complex because it was expected to
improve the aqueous solubility of t-DCTN in comparison to βCD as previously described
(Corrêa et al., 2005). The incorporation of t-DCTN:HPβCD inclusion complex
(120 mg equivalent to 22.5 mg of t-DCTN) in PLC or PLGA microparticles (1:10
drug/polymer ratio) was carried out.
Figure 2 shows the size, span, loading and zeta potential properties of PCL and PLGA
microparticles
containing
t-DCTN
and
t-DCTN:HPβCD
inclusion
complex.
The
encapsulation of t-DCTN or t-DCTN:HPβCD in the PCL matrix caused small differences on
the volume mean diameter and span of PCL microparticles (Figure 2a,b). The t-DCTN-loaded
PCL microparticles presented dv of 49.28 ± 1.65 µm and span of 2.12, while the
t-DCTN:HPβCD-loaded PCL microparticles presented dv of 45.15 ± 1.41 µm and span of
1.95.
71
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Figure 2. Diameter (a), span (b), loading (c) and zeta potential (d) of the PCL and PLGA
microparticles containing t-DCTN (white columns) or t-DCTN:HPβCD inclusion complex
(black columns), and unloaded microparticles (sparse gray columns). *Statistically different
(p<0.05):
t-DCTN/PCL
and
t-DCTN:HPβCD/PCL
(I);
t-DCTN/PLGA
and
t-DCTN:HPβCD/PLGA (II); t-DCTN/PCL and t-DCTN/PLGA (III); t-DCTN:HPβCD/PCL
and t-DCTN:HPβCD/PLGA (IV); t-DCTN/PCL, t-DCTN:HPβCD/PCL and unloaded PCL
(V); and t-DCTN/PLGA, t-DCTN:HPβCD/PLGA and unloaded PLGA (VI).
In the PLGA matrix, significant decrease in particle size and increase in span values
were found in the presence of t-DCTN:HPβCD (dv=7.11 μm and span=1.89) in comparison
with t-DCTN (dv=14.56 μm and span=1.00) (Figure 2a,b). This can be probably due to the
cryoprotectant effect of HPβCD, which has already been described in the literature at
polymeric systems as nanocapsules. Cryoprotectants are usually added to the formulation to
protect the drug delivery systems during freezing and desiccation steps in order to convert
72
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trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
solutions of labile materials into solids of sufficient stability for distribution and storage.
(Abdelwahed et al., 2006).
The drug loading was decreased from 4.06 to 2.70% and from 5.90 to 4.84% when
t-DCTN:HPβCD inclusion complex was incorporated in PCL and PLGA matrices,
respectively (Figure 2c). This may be explained by the fact that the droplets of the internal
aqueous phase containing the soluble inclusioncomplex t-DCTN:HPβCD can diffuse to the
external
aqueous
phase
more
easily
during
the
formation
of
microparticles
(Trapani et al., 2003). It was somewhat surprising to observe that PCL microparticles with
larger size presented smaller loading compared to PLGA microparticles for both t-DCTN and
t-DCTN:HPβCD inclusion complex (Figure 2c). This shows that the encapsulation of drugs in
microparticles is affected by different factors besides particle size, including drug/polymer
interactions and emulsion stability during the preparation process of microspheres
(De Rosa et al., 2002; Trapani et al., 2003).
The zeta potential of PCL-based microparticles was changed with the incorporation of
t-DCTN (-8.36 ± 0.37 mV) or t-DCTN:HPβCD (-7.23 ± 0.36 mV) in comparison with the
unloaded microparticles (-12.68 ± 0.56 mV) (Figure 2d). The decrease on the zeta potential
in relation to unloaded microparticles can be due to a fraction of the drug adsorbed on the
particle surface that may influences the surface charge. In contrast, no changes were verified
after
the
incorporation
of
t-DCTN
(-14.27
±
0.90
mV)
or
t-DCTN:HPβCD
(-13.91 ± 0.85 mV) in PLGA microparticles (-14.03 ± 0.80 mV), confirming the higher
affinity of t-DCTN with the PLGA and its incorporation in the core of the polymeric matrix.
As previously demonstrated, PLGA microparticles are negatively charged and this surface
charge is associated to carboxylic groups of this polyester (Bodmer et al., 1992; Garbayo et
al., 2008; Manca et al., 2008).
73
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Figure 3. Diameter (a), span (b) and loading (c) of PLGA microparticles containing t-DCTN
(white columns), t-DCTN:HPβCD inclusion complex (black columns) or
t-DCTN with
t-DCTN:HPβCD inclusion complex co-encapsulated (sparse gray columns). *Statistically
different (p<0.05): t-DCTN and t-DCTN:HPβCD at 1:10 drug:polymer ratio (I);
t-DCTN
and t-DCTN with t-DCTN:HPβCD co-encapsulated at 1:5 drug:polymer ratio (II); t-DCTN
at 1:10 and 1:5 drug:polymer ratios (III); t-DCTN:HPβCD at 1:10 drug:polymer ratio and
t-DCTN with t-DCTN:HPβCD co-encapsulated at 1:5 drug:polymer ratio (IV).
The PLGA matrix provided higher drug loading, smaller particle size and narrow size
distribution. This fact suggests a higher affinity between the dug and polymer matrix
promoting higher drug incorporation into PLGA-based microparticles.
Based on these findings, a study was performed to improve the drug loading by
changing the drug:polymer ratio from 1:10 to 1:5. Figure 3c shows that the drug loading
changed from 5.90 ± 0.03 to 10.12 ± 0.01% (w/w) for microparticles containing only
74
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
t-DCTN. However, there was an increase in the particle diameter (14.56 ± 0.19 µm) and
polidispersity (1.00) for microspheres at 1:10 drug:polymer ratio to 37.10 µm ± 0.17 and span
1.42 for microspheres at 1:5 drug:polymer ratio (Figure 3a and 3b).
The drug loading increased from 4.84 ± 0.02% (w/w), containing only
t-DCTN:HPβCD at 1:10 drug:polymer ratio, to 13.93 ± 0.05% (w/w) containing
t-DCTN:HPβCD and t-DCTN co-encapsulated at 1:5 drug:polymer ratio (Figure 3c). The
particle size and span values were changed from 7.11 ± 0.11 µm and span 1.89 for
t-DCTN:HPβCD to 9.59 ± 0.11 µm and span 1.57 for co-encapsulated t-DCTN:HPβCD and
t-DCTN.
The presence of t-DCTN in the organic phase appears to have a great influence in the
increase of viscosity of the dispersed emulsion phase, because it was observed a higher
particle size for the systems containing only t-DCTN (37.10 µm) in comparison with
t-DCTN:HPβCD and t-DCTN co-encapsulated at 1:5 drug:polymer ratio (9.59 µm). It has
been reported that the increase of the viscosity of the dispersed phase can increase the size of
microspheres (Li et al., 2008).
3.4 Morphological analysis of microparticles
The morphological characteristics of the PCL and PLGA microparticles containing
t-DCTN and t-DCTN:HPβCD inclusion complex are shown in SEM micrographs (Figure 4).
SEM microscopy revealed that t-DCTN-loaded microparticles prepared with PCL are
spherical shaped with smooth surface (Figure 4a), while PLGA based-microparticles showed
porous surface and inner structure (Figure 4c). These results are in disagreement with dense
and non-porous microspheres obtained in our previous study (Morais et al., 2008). This fact
can be attributed to the modification of w/o/w parameters such as the increase of the external
aqueous phase (Mao et al., 2007) and increase of PEG amount into the inner aqueous phase.
75
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
All these increased the osmotic gradient and the flux of water from w2 into the w1/polymer
phase (Wischke and Schwendeman, 2008).
Figure 4. SEM micrographs of PCL and PLGA microparticles containing t-DCTN or
t-DCTN:HPβCD inclusion complex: t-DCTN/PCL 1:10 drug:polymer ratio (5,000 x) (a);
t-DCTN:HPβCD/PCL 1:10 drug:polymer ratio (4,042 x) (b);
DCTN/PLGA 1:10
drug:polymer ratio (5,000 x) (c); t-DCTN:HPβCD:PLGA 1:10 drug:polymer ratio (5,000 x)
(d) and, t-DCTN with t-DCTN:HPβCD/PLGA co-encapsulated at 1:5 drug:polymer ratio
(5,000 x) (e).
76
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
The encapsulation of t-DCTN:HPβCD inclusion complex in the microparticles did not
cause significant change in their morphology independent on the polymer type device (Figure
4b and 4d). The PLGA microparticles containing t-DCTN and t-DCTN:HPβCD
co-encapsulated at 1:5 drug:polymer ratio exhibited morphological characteristics analogous
to PLGA microparticles containing only t-DCTN:HPβCD at 1:10 drug:polymer ratio (Figure
4e). This indicates that the presence of the inclusion complex in the internal aqueous phase
caused an alteration of solvent evaporation rate, reducing the porosity effect found in the
incorporation of the drug alone (Yang et al., 2000; Wischke and Schwendeman, 2008).
3.5 Porosity analysis of microparticles
The integrated area under the curve (AUC) applied to incremental pore size distribution
(PSD) of adsorption/desorption branches of isotherm was performed to characterize the
porosity of the microspheres. Results showed that the increase of the specific surface area of
microparticles (ABET) is correlated to an increase of porosity parameters (specific surface area
and pore size distribution). This indicates that a higher specific surface area is associated to a
higher porosity of the microparticles (Table 5).
Table 5. BET specific surface area and pore size distribution of the microparticles.
Drug:polymer
ABET (m2/g)
AUC incremental PSD (10-3)
t-DCTN/PCL
2.874
Adsorption
61.539
Desorption
31.239
t-DCTN/PLGA
5.166
77.694
34.799
t-DCTN:HPβCD/PCL
0.956
18.553
5.063
t-DCTN:HPβCD/PLGA
0.581
20.853
5.405
t-DCTN:HPβCD:t-DCTN/PLGA*
1.680
34.027
11.784
ABET= specific surface area; PSD= pore size distributions; *1:5 drug/polymer ratio
77
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
The PLGA microparticles containing only t-DCTN at 1:10 drug:polymer ratio presented
porosity parameter values (ABET=5.166 m2/g; AUCads=77.694 and AUCdes=34.799) greater
than PCL microparticles (ABET=2.874 m2/g; AUCads=61.539 and AUCdes=31.239) (Table 5).
However, the incorporation of t-DCTN:HPβCD inclusion complex into microparticles
produced a significant decrease of porosity parameters independent of the polymeric matrix,
PCL (ABET=0.956 m2/g; AUCads=18.553 and AUCdes=5.063) or PLGA (ABET=0.581 m2/g;
AUCads=20.853 and AUCdes=5.405).
The PLGA microspheres containing t-DCTN and t-DCTN:HPβCD co-encapsulated at 1:5
drug:polymer ratio presented intermediate porosity parameter values (ABET=1.680 m2/g;
AUCads=34.027 and AUCdes=11.784) compared to ones containing only t-DCTN. This fact
emphasizes the stronger character of the influence of t-DCTN:HPβCD inclusion complex in
the porosity properties as also observed in the morphological analysis using SEM microscopy.
The higher porosity for the PLGA microparticles containing only t-DCTN can be
attributed to the higher viscosity of the polymer solution and the smaller time required for
PLGA solidification as compared to PCL (Mao et al., 2007). It had already reported that more
rapid flux of solvent across the o/w interface stresses the precipitated polymer film and can
cause an increase of the porosity of PLGA microparticles (Wischke and Schwendeman,
2008). Besides, it suggests that the presence of PEG in the inner water phase might be
favorable to stablish strong interactions between PLGA/CH2Cl2 systems. Then, the higher
porosity of the particles containing only t-DCTN can be reasonably attributed to PEG osmotic
and porogen properties (Özdemir; Sahin, 1997; Courtois et al., 2006).
As already demonstrated by the literature a high osmotic pressure in the internal aqueous
phase of the double emulsion generates an influx of water toward the inner aqueous phase.
The occurrence of this process during particle hardening generally results in the formation of
a porous surface (Ungaro et al., 2006). This effect in porosity was less importance for
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MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
microspheres containing t-DCTN:HPβCD because the presence of the inclusion complex
might have disadvantaged the interaction of PEG with polymeric matrices.
Figure 5. Pore size distribution (PZD) of microspheres determined using the BHJ method
applied to N2 adsorption isotherms: i) PCL microspheres: t-DCTN-loaded MP (white squares)
and t-DCTN:HPβCD-loaded MP at 1:10 drug:polymer ratio (black squares); ii) PLGA
microspheres: t-DCTN-loaded MP (white circles) and t-DCTN:HPβCD-loaded MP at 1:10
drug:polymer ratio (black circles) and DCTN:HPβCD/DCTN-loaded MP at 1:5 drug:polymer
ratio (white/black circles).
The analysis of the N2 adsorption isotherm profiles using the BJH model showed that
the PCL and PLGA microspheres present from meso- (2 – 50 nm) and macro-pore (> 50 nm)
ranges according to the IUPAC classification (Figure 5). The BJH curves (incremental pore
volume vs. pore size) showed higher pore volume at meso-pore range and a decrease in the
population of mesopores smaller than ca. 50 nm for micropheres containing t-DCTN:HPβCD
inclusion complex in both polymeric matrices. As previously reported for the specific surface
area, the incorporation of t-DCTN:HPβCD inclusion complex into microspheres decreased
79
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
the pore volume. This decrease in pore volume of microspheres can be ascribed to the
modification of solvent removal rate and the longer time required for t-DCTN:HPβCD to
solidify as compared to t-DCTN (Mao et al., 2007).
3.6 Release kinectics of microparticles containing t-DCTN and t-DCTN:HPβCD inclusion
complex
In this paper, drug-loaded microparticles of different polymeric matrices were
prepared to evaluate the influence of t-DCTN:HPβCD inclusion complex on the drug kinetics.
The release profiles of t-DCTN and t-DCTN:HPβCD from PCL and PLGA microparticles
during 6 days in phosphate buffer are illustrated in Figure 6. To understand which
mechanisms are decisive for the control of the drug release from these systems, an analytical
solution of Fick’s second law of diffusion was fitted to the experimental results.
The symbols represent the data experimentally measured and the curves represent the
fitting of mathematical modeling. The release during the first twelve hours with kinetics
model is shown in more detail in the insert. The calculated kinetic parameters of
loaded-microparticles are summarized in Table 6.
As it can be seen in Figure 6a and 6b a good agreement between theorethical and
experimental data was obtained. This indicates that the simple diffusion mechanism is
involved on the mass transport mechanism of the microparticulated systems. This fact is also
confirmed by the fitting of the t-DCTN release by square-root-of-time (t1/2) model (r ≥ 0.99).
The release rate (µg/mL) was calculated by the slope of the linear regression (Table 6).
All the microsphere formulations showed a biphasic drug release pattern characterized
by an initial burst effect followed by a slower release step with different k 2 (exponencial
model) and release rate (linear model) values.
80
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Figure 6. In vitro release of t-DCTN from microparticles: PCL (a) and PLGA (b).
t-DCTN-loaded microparticles (white squares); t-DCTN:HPβCD-loaded microparticles (black
squares) at 1:10 drug:polymer ratio and t-DCTN:HPβCD/DCTN-loaded microparticles at 1:5
drug:polymer ratio (white/black squares). Each point represents the mean of three different
experiments ± S.D. Lines represent the non-linear fitting of Fickian diffusion model.
81
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
82
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Table 6. Calculated release parameters from PCL and PLGA microparticles containing
t-DCTN and t-DCTN:HPβCD inclusion complex using exponential and linear models.
Drug:polymer
% Burst effect
Exponential model
Linear model
(1 h)
M t / M ∞ = (1 − k1e − k2t )
(t1/2)
k1
k2
Release rate
(µg/h)
t-DCTN/PCL
78.07 ± 3.86
0.378 ± 0.026
0.289 ± 0.061
77.62 ± 8.40
t-DCTN/PLGA
35.11 ± 3.31
0.660 ± 0.025
0.395 ± 0.074
146.69 ± 43.20
t-DCTN:HPβCD/PCL
76.10 ± 5.37
0.280 ± 0.025
0.105 ± 0.020
39.80 ± 11.66
t-DCTN:HPβCD/PLGA
17.27 ± 2.03
0.857 ± 0.012
0.107 ± 0.007
67.88 ± 10.19
t-DCTN:HPβCD:t-DCTN/
7.45 ± 0.53
0.978 ± 0.006
0.079 ± 0.009
52.79 ± 10.37
PLGA*
*1:5 drug:polymer ratio.
For PCL microparticles, an elevated initial burst effect (> 60%) of drug released was
found (Table 6). This was followed with a sustained release stage during a period of about 8 h
in the case of t-DCTN-loaded microparticles at 1:10 drug:polymer ratio ( k 2 =0.289 and
release rate=77.62 µg/h), in comparison with 10 h in the case of t-DCTN:HPβCD-loaded
microspheres ( k 2 =0.105 and release rate=39.80 µg/h). The drug release was fulfilled after
only 1 day for t-DCTN and after 3 days for t-DCTN:HPβCD.
The burst effect was probably due to the release of the drug poorly entrapped or
associated to the surface or pores of the particles that diffuse from matrix faster (Klose et al.,
2008; Ho et al., 2008; Wang et al., 2009). This significant burst effect is consistent with the
zeta potential for the drug-loaded PCL microparticles (Section 3.3), indicating the presence of
t-DCTN at the surface of microparticles modifying their surface charge. The tendency of
surface localized-drugs may be associated to its lower affinity by the polymeric matrix
(Wang et al., 2009). The elevated burst effects and fast release profiles also suggest the lower
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
affinity of t-DCTN by PCL systems, despite of a higher particle size and smaller porosity
(Table 5, Section 3.4).
In the case of PLGA matrix, the microparticles containing t-DCTN:HPβCD inclusion
complex at 1:10 drug:polymer ratio and t-DCTN with t-DCTN:HPβCD inclusion complex
co-encapsulated at 1:5 drug:polymer ratio were evaluated on release kinetics. The PLGA
microparticles containing only t-DCTN presented important burst effect and faster drug
release due to the formation of a more porous structure in relation to the other systems as
demonstrated in SEM micrographs (Section 3.3) and porosity parameters (Table 5, Section
3.4). This fact was also confirmed by a faster release ( k 2 =0.395 and release rate=146.69 µg/h)
compared to the non-porous DCTN-loaded PLGA microparticles obtained on our previous
study ( k 2 =0.086 and release rate=90.56 µg/h) (Morais et al., 2008). At present study, 60% of
t-DCTN content was released from microspheres within one day, while the same drug
percentage was released within 3 days on previous work. Similarly, Yang et al. (2000)
observed that the porosity has an important effect on drug release characteristics and a large
number of pores may greatly increase the rate of drug release.
The complexation of t-DCTN with cyclodextrin HPβCD influenced the initial release,
sustained release stage and released total drug amount. The burst effect was drastically
reduced in PLGA-based microparticles comparate to PCL systems, when t-DCTN:HPβCD
inclusion complex was incorporated into microparticles (Table 6). After the burst step, a
gradual release stage was maintained during 26 h for only t-DCTN:HPβCD ( k 2 =0.107 and
release rate=67.88 µg/h), and during 58 h for t-DCTN:HPβCD/t-DCTN ( k 2 =0.079 and
release rate=52.79 µg/h), attaining a maximum drug release at 77.0 ± 7.4% and 72.4 ± 8.1%
within about 4 days, respectively. The higher encapsulation efficiency from PLGA
microparticles can be also contributed to reduce initial burst and slow down the release rate
(Wang et al., 2009).
83
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
The t-DCTN:HPβCD controlled more efficiently the drug release comparate to
t-DCTN in previous study that it had a sustained release during only 12 h (Morais et al.,
2008). Besides, the maximum drug release was increased slightly from almost 60% (Morais et
al., 2008) to 77% as used the inclusion complex, probably due to the increased hydrophilicity
of the polymer matrix in the presence of HPβCD (De Rosa et al., 2002; Trapani et al., 2003).
It had been reported that drug–CD mixtures or their complexes when incorporated into
polymeric matrices can improve hydration of the polymer matrix, promote its erosion
(Song et al., 1997; Trapani et al., 2003).
The diffusion is known to be a dominant mechanism in this type of controlled drug
delivery systems (Klose et al., 2008). Based on calculations of mathematical modeling, the
constants k2 (associated to apparent diffusion coefficients) of t-DCTN:HPβCD inclusion
complex had smaller values in relation to that t-DCTN within of different polymeric matrices
(Table 6). It indicates a smaller mobility of t-DCTN as associated to HPβCD within the
polymeric network. This fact can be attributed to both the characteristics of prepared
microparticles, as for instance the smaller porosity, as the inclusion complex-polymer
interactions that reduce effective diffusivity of parent drug as previously described
(Quaglia et al., 2003; Fernandes et al., 2007). It had been related that the drug solubility and
diffusivity can be modified when complexes of drugs with cyclodextrines are incorporated
into polymeric matrices, changing drug release profile from the polymeric device
(Bibby et al., 2000; Trapani et al, 2003).
The higher relative porosity associated to microparticles of higher size can justify the
fact of relative drug release rates were been almost independent of the system size. Other
factor that has been associated to this is “autocatalysis effect” was found to compensate the
“increased diffusion pathway length effect” already reported to non-porous PLGA-based
microparticles (Siepmann et al., 2005).
84
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trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Several authors have reported that the release kinetic is also dependent on different
characteristics of the microparticles (e.g. type of polymer, surface morphology,
interconnected pores and channels) and the incorporation of additives (Poletto et al, 2007;
Garbayo et al., 2008). For instance, the presence of pores in PLGA-based microparticles
increased the mobility of the involved diffusing species and altered the contributions of the
involved physicochemical processes to the overall control of drug release (Klose et al., 2006).
The high internal porosity leads to much easier and deeper water penetration upon incubation
and shortens the diffusion time and path of the loaded drug, leading to higher burst release.
On the other hand, the co-encapsulation of t-DCTN and t-DCTN:HPβCD into
PLGA-based microparticles was crucial to reduce the release rate independent on porosity.
This indicates that in this case the formation of drug-cyclodextrin-polymer interactions was
most important. The interactions between polymer and drug will all potentially affect the
diffusion
rates
in
the
polymer
matrix,
and
therefore,
the
drug
release
rate
(Wischke and Schwendeman, 2008). A similar behavior could take place also to
insulin:HPβCD inclusion complex inside PLGA system (Quaglia et al., 2003). For all batches
of the microparticles studied, the association of uncomplexed and complexed DCTN into the
same PLGA device provided the best release control for the tested conditions.
Drug release from a polymeric matrix is controlled by a variety of factors, such as the
solubility of the drug within the surrounding fluid, the size of the drug molecule and its
mobility within the swollen polymeric network, and the dissolution rate of the polymer and
polymer–drug interactions. As observed from the release kinetics change in release properties
was observed with the polymeric matrix nature, the drug form (drug or drug:cyclodextrin
inclusion complex), encapsulation manner (drug or drug:cyclodextrin inclusion complex
alone or co-encapsulated), and with microparticles characteristics as porosity and loading
85
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trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
under in vitro conditions. Then, the drug release can be modulating varying these determining
factors to obtain the desired kinetic profile.
3. Conclusions
The use of factorial design provided a new approach to study the influence of
formulation parameters on size properties of unloaded PCL microspheres and to optimize
these controlled delivery systems to encapsulate t-DCTN and t-DCTN:HPβCD inclusion
complex using the double emulsion/solvent evaporation method. Microparticle size and
polidispersity (span) can thus be controlled by adapting the factors aqueous phase of simple
emulsion and aqueous phase of multiple emulsion. Lower diameter and higher span values
were obtained with the increasing of the volume of the simple emulsion and decreasing of
volume of multiple emulsion. The t-DCTN was successfully encapsulated into PCL and
PLGA microspheres with a higher encapsulation efficiency and drug loading at 1:10
drug/polymer ratio. The t-DCTN:HPβCD inclusion complex decreased encapsulation
efficiency, drug loading, particle size and porosity parameters (specific surface area and pore
size distribution) at 1:10 drug/polymer ratio in both polymeric matrices. The co-encapsulation
of t-DCTN:HPβCD inclusion complex with t-DCTN at 1:5 drug/polymer ratio increased
encapsulation efficiency and drug loading in PLGA microspheres maintaining small values of
particle size (< 10 µm) and span (< 2.00). The t-DCTN:HPβCD inclusion complex modified
physicochemical properties (encapsulation, size, zeta potential and porosity) and release
properties (burst step, sustained release stage and released total drug amount) from
microparticles. The t-DCTN:HPβCD inclusion complex modify the difusibility and release
rate (smaller values of k2 and release rate) in comparison with microparticles containing only
t-DCTN. These results suggest a smaller affinity of t-DCTN by PCL matrix in relation to
PLGA due its lower encapsulation, higher modification of the surface charge (zeta potential),
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trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
higher burst effect and faster release profiles independent on particle size and porosity
characteristics. The co-encapsulation of t-DCTN:HPβCD with t-DCTN plays a significant
role in the characteristics of PLGA microparticles such as the encapsulation and release rate.
From these findings novel oral formulations of PCL and PLGA microparticles containing
t-DCTN:HPβCD and/or t-DCTN were obtained to be applied in in vivo studies.
Acknowledgments
W.A.M. is grateful for a PhD scholarship from the Brazilian Council for Scientific and
Technological Development (CNPq) and the Pernambuco State Foundation for the
Advancement of Science (FACEPE). This research was supported by the CNPq
(Grant # 474071/2007-3).
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trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
CONCLUSÕES
97
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trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
4 CONCLUSÕES
•
A análise fatorial mostrou ser uma ferramenta eficiente no estudo da influência dos
parâmetros de formulação nas características de tamanho de partícula (dv e span),
sendo obtida uma formulação adequada para a encapsulação da t-DCTN e do
complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD;
•
As microesferas preparadas por análise fatorial obtiveram tamanho médio de partícula
(dv) e polidispersão (span) bastante distintos, sendo os volumes das fases aquosas da
emulsão simples e múltipla os fatores determinantes na modificação destas
propriedades físico-químicas;
• A t-DCTN foi encapsulada com êxito nas microesferas de PCL e PLGA em diferentes
razões fármaco:polímero, com o aumento da quantidade de fármaco encapsulada com
o aumento da massa do fármaco,
com os melhores resultados obtidos na razão
fármaco:polímero 1:10 (PCL) e 1:5 (PLGA);
• O complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD 1:1 (razão molar) foi encapsulado
satisfatoriamente nas microesferas das duas matrizes poliméricas (PCL e PLGA) na
razão fármaco:polímero de 1:10;
• A incorporação do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD nas matrizes poliméricas de
PCL e PLGA produziu microesferas homogêneas (span < 2,00), esféricas e de
superfície lisa, e ainda, com menores tamanho de partícula, percentual de fármaco
encapsulado, potencial zeta e parâmetros de porosidade (área de superfície específica e
distribuição de tamanho de poro);
•
A
modificação
da
razão
fármaco:polímero
de
1:10
para
1:5
aumentou
consideravelmente a quantidade de t-DCTN encapsulada na matriz de PLGA;
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trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
•
A coencapsulação do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD, na fase aquosa interna,
e t-DCTN, na fase orgânica da emulsão simples, na razão fármaco:polímero 1:5
(t-DCTN:PLGA) aumentou a quantidade de fármaco encapsulada, mantendo o
tamanho de partícula (9,59 ± 0,11 µm) e a polidispersão (span = 1,57) satisfatórios
para o transporte gastrointestinal, tornando-se viável para uma futura aplicação
farmacológica pela via de administração oral;
• O uso do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD, no que se refere à cinética de
liberação in vitro, modificou o perfil de liberação com o aumento do percentual de
fármaco liberado e um controle mais efetivo da velocidade de liberação (menores
valores de k2) associado ao maior caráter hidrofílico das microesferas;
•
A coencapsulação de t-DCTN com t-DCTN:HPβCD reduziu o efeito burst (1,5%) e a
velocidade de liberação (k2= 0,079);
• Os resultados sugerem uma menor afinidade da t-DCTN pela matriz polimérica de
PCL quando comparado ao PLGA, devido à menor quantidade de fármaco
encapsulada, maior modificação no potencial zeta, um maior efeito burst e um perfil
de liberação mais rápido, independente do tamanho de partícula e porosidade;
• O complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD modificou as propriedades físico-químicas e
o perfil de liberação das microesferas de PCL e PLGA, quando comparadas aos
sistemas contendo somente t-DCTN;
• As microesferas contendo t-DCTN e/ou complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD
desenvolvidas neste estudo podem viabilizar uma formulação farmacêutica inovadora
para via oral com as matrizes poliméricas biodegradáveis de PCL e PLGA e, com isso,
podendo ser avaliada a sua atividade hipoglicemiante e contribuir para o avanço na
terapêutica do diabetes mellitus.
99
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trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
PERSPECTIVAS
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trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
5 PERSPECTIVAS
Avaliar a citotoxicidade em hepatócitos de ratos e o efeito hipoglicemiante em ratos
diabéticos das formulações de microesferas de PCL e PLGA contendo o complexo de
inclusão t-DCTN:HPβCD e comparar com o estudo prévio de t-DCTN/PLGA visando a
administração oral.
101
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trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
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A N EX O A
ARTIGO I – Abstract
Encapsulation and release characteristics of
DCTN/PLGA microspheres
Journal
of
Microencapsulation,
p. 529–534, 2008
v.
26,
n°
6,
128
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trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Encapsulation and release characteristics of DCTN/PLGA microspheres
Waldenice A. Morais 1, Marcilia P. Costa 1, Ana Durce O. Paixão2, Maria Aparecida M.
Maciel3 and Nereide S. Santos-Magalhães 1
1
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami
(LIKA), Recife, PE, Brazil, 2Departamento de Farmacologia e Fisiologia, UFPE, Recife, PE,
Brazil, 3Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Departamento de Química,
Natal, RN, Brazil.
Abstract
In the present study, poly (D,L-lactic-co-glycolic)-acid microspheres containing transDehydrocrotonin (DCTN) were prepared by the double emulsion method. The
hypoglycemic activity of DCTN-loaded microspheres was monitored in normal
glycemic mice after administration of a daily dose of DCTN (50 mg/kg body weight)
for 7 days. Spherical microspheres with 3.2±0.1μm and 7.6±0.7 μm mean diameters
size were observed. The encapsulation efficiency of DCTN was 85.5±3.9 %. The in
vitro kinetic profile of DCTN from PLGA-microspheres was initially fast (burst effect
of 19.4 % at 2 h), followed by a controlled release attaining a maximum drug released
of 55.6 % within sixty hours. DCTN was able to reduce glucose levels (14.3%) of
normal glycemic animals and this effect was improved by its encapsulation into
microspheres (26.8%). DCTN-loaded microspheres are thus offered as a potential
delivery system for the treatment of metabolic diseases characterized by hyperglycemia.
Keywords:
trans-dehydrocrotonin,
hypoglycemic activity.
Croton
cajucara,
PLGA,
microspheres,
129
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
A N EX O B
ARTIGO II – Abstract
Validation of UV spectrophotometric method
for the determination of dehydrocrotonin and
application
in
inclusion
hydroxypropyl-β-cyclodextrin
submetido)
complexes
(A
with
s er
130
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Validation of UV spectrophotometric method for the determination of dehydrocrotonin
and application in inclusion complexes with hydroxypropyl-β-cyclodextrin
Taciana Lima Salviano Lapenda1,Waldenice de Alencar Morais1, Maria Aparecida Medeiros
Maciel2, Nereide Stela Santos-Magalhães1*
1
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami
(LIKA), Av. Prof. Moraes Rego, 1235 Cidade Universitária, Recife, PE, Brazil, 2Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Departamento de Química, Natal, RN, Brazil.
Abstract
A simple and rapid spectrophotometric method was developed for determining transdehydrocrotonin (t-DCTN) in bulk and pharmaceutical formulations. The method was
validated for various parameters according to ICH guidelines. The t-DCTN in acetonitrile
exhibited maximum absorption peak ( max) at 234 nm. Beer’s law correlating the absorbance
(A) with t-DCTN concentration (C) was obeyed in the range of 1 – 20 µg mL-1. The
regression equation for the standard curve was A = -0.00147 + 0.04214C with good
correlation coefficient (n = 6) ≥ 0.99987. The detection and quantitation limits were found to
be 0.16 and 0.48 µg mL-1, respectively. The precision of the method was satisfactory with
values of relative standard deviation less than 2% for all sample analyzed. The accuracy,
determined from recovery studies, was between 99.62 and 100.02%. The method showed to
have specificity since HP-β-CD did not interfere in the analysis. The method was robust with
change of solvent manufacturer and temperature. Statistical analysis by analysis of variance
(ANOVA) and Student's t-test and F-test were performed. The proposed method was
successfully applied to quantify the t-DCTN inclusion complexes with hydroxypropyl-βcyclodextrin (HP-β-CD) obtained in solid state by freeze-drying. The complexed t-DCTN
content was 99.78 ± 0.71%. The method was practical and can be suitably to be used in the
routine analysis.
Keywords: trans-Dehydrocrotonin; Hydroxypropyl-β-cyclodextrin; Inclusion complex; UV
Spectrophotometry; Validation.
131
MORAIS, W.A. Tese de doutorado (2010). Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo
trans-desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina.
A N EX O C
C ON C U R S O P Ú B L I C O
Aprovação para o cargo de Professor Adjunto
no Departamento de Farmácia na área de
Farmacotécnica na Universidade Federal do
Rio Grande do Norte
DOU, seção 2, 31 de dezembro de 2009
132