Nayara Suguiura Dias

Pró-Reitoria de Graduação
Curso de Psicologia
Trabalho De Conclusão De Curso
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO HANDLING EM
WISTAR SUBMETIDOS AO LABIRINTO EM
CRUZ ELEVADO
Autor: Nayara Suguiura Dias
Orientadora:Alessandra Rocha Albuquerque
Brasília - DF
2014
NAYARA SUGUIURA DIAS
AVALIAÇÃO DO EFEITO DO HANDLING EM WISTAR SUBMETIDOS AO
LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO
Monografia apresentada ao curso de graduação em
Psicologia da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para obtenção
do título de bacharel em Psicologia.
Orientador: Prof.Dra. Alessandra Rocha de Albuquerque
Co-orientador: Prof. Dra. Graziela Furtado Scarpelli Ferreira
Brasília
2014
Monografia de autoria de Nayara Suguiura Dias, intitulada “AVALIAÇÃO DO
EFEITO DO HANDLING EM WISTAR SUBMETIDOS AO LABIRINTO EM CRUZ
ELEVADO”, apresentada como requisito parcial para a obtenção do grau de bacharel
em Psicologia da Universidade Católica de Brasília, em xx/06/2014, defendida e
aprovada pela banca examinadora abaixo assinada:
______________________________________________________________________
Prof.Dra. Alessandra Rocha de Albuquerque
Orientador
Psicologia – UCB
______________________________________________________________________
Prof. Dra. Graziela Furtado Scarpelli Ferreira
Psicologia – Centro Universitário IESB
Brasília
2014
RESUMO
DIAS, Nayara. Avaliação do efeito da separação materno-filial e do handling em
wistar submetidos ao labirinto em cruz elevado. 2014. 24. Psicologia – UCB,
Brasília, 2014.
A aproximação do desenvolvimento dos modelos animais em relação a
transtornos mentais ou alterações comportamentais em humanos tem mostrado uma
grande relevância no campo da pesquisa. A exemplo disso tem-se a manipulação tátil de
animais que, ao serem estimulados fisicamente, alteram seus comportamentos quando
expostos a ambientes aversivos ou sinalizadores de perigo . Assim o Labirinto em Cruz
Elevado (LCE) é um modelo animal que possibilita a avaliação de diferentes padrões de
respostas (exploração de novos ambientes, de respostas de medo – tais como a resposta
de esquiva de espaço aberto – e de respostas etológicas de ansiedade – tais como a
avaliação de risco diante de um espaço aberto. Esse projeto teve por objetivo avaliar se
o manuseio de animais – handling –, na fase adulta, alteraria o comportamento de ratos
submetidos ao LCE. Para tanto, 12 ratos foram divididos em 2 grupos: com handling e
sem handling (sendo 6 animais em cada grupo). Os grupos foram submetidos ao
modelo animal com uma semana de intervalo. Os dados obtidos foram analisados por
meio de estatística de teste t, realizada pelo programa Excel. Os dados indicaram que a
exposição ao handling foi eficaz para aumentar de forma estatisticamente significante a
exploração do modelo (aumento do número total de entradas nos braços onde o p <
0,042194). No entanto, essa estimulação não se mostrou eficaz para reduzir as respostas
de ansiedade. Assim, os dados obtidos sugerem que o handling pode ser utilizado como
procedimento de aumento do comportamento exploratório, mas não como variável
independente para a redução dos comportamentos de ansiedade de animais submetidos
ao LCE.
Palavra-Chave: Handling, Ansiedade e LCE.
ABSTRACT
DIAS , Nayara . Evaluation of the effect of handling branch in Wistar submitted to
the elevated plus maze. 2014. 24. Psychology - UCB , Brasilia , 2014
The approach of the development of animal models in relation to mental
disorders or behavioral changes in humans have shown a great relevance in the field of
research. The example has the tactile manipulation of animals which, when stimulated
physically alter their behavior when exposed to aversive environments or flags of
danger . Thus the elevated plus maze (EPM ) is an animal model that allows the
evaluation of different patterns of responses ( exploration of new environments , from
fear responses - such as the avoidance response of open space - and ethological anxiety
responses - . including risk assessment before an open space This project aimed to
assess the handling of animals - handling - . , in adulthood , alter the behavior of rats
submitted to the EPM Therefore, 12 rats were divided into 2 groups : handling with and
without handling ( with 6 animals in each group ) groups were submitted to an animal
model with a week interval data were analyzed using statistical t-test , performed by
Excel data indicated that exposure to handling was effective in increasing a statistically
significant manner the operation of the model ( increase in the total number of entries
into the arms where p < 0,042194). However, this stimulation was not effective in
reducing the responses anxiety. Thus, the data obtained suggest that the handling can be
used as increased exploratory behavior procedure, but not as an independent for the
reduction of anxiety behaviors of rats subjected to the ECL variable.
Keyword : Handling Anxiety and LCE .
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 7
1.1 MODELOS ANIMAIS ........................................................................................... 7
1.2 HANDLING: .......................................................................................................... 9
2 ANSIEDADE E ESTRESSE ..................................................................................... 9
2.1 LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO (LCE): ...................................................... 11
3. OBJETIVOS ............................................................................................................. 13
3.1 OBJETIVO GERAL: ............................................................................................ 13
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: .............................................................................. 13
4.MÉTODO .................................................................................................................. 14
4.1 SUJEITOS: ........................................................................................................... 14
4.2 EQUIPAMENTO: ................................................................................................ 14
4.3 PROCEDIMENTOS ............................................................................................ 14
4.3.1 Manipulação – Handling ............................................................................... 15
4.3.2 Labirinto cruz elevado (LCE) ........................................................................ 15
5 RESULTADOS .......................................................... Erro! Indicador não definido.6
6 DISCUSSÃO ............................................................................................................ 200
7 REFERENCIAS..........................................................................................................24
7
1. INTRODUÇÃO
1.1 MODELOS ANIMAIS
A aproximação dos modelos animais em relação a transtornos mentais e/ou
alterações comportamentais em humanos tem mostrado uma grande relevância no
campo da pesquisa ao abordar elementos de predisposição genética, influência do meio
ambiente, drogas psicotrópicas manipuladas, entre outros.
As primeiras tentativas realizadas para a validação de modelos animais para o
comportamento humano partiu de três critérios básicos que são: previsibilidade,
analogia e homologia.
O critério de previsibilidade pressupõe que o modelo experimental será capaz de
possibilitar a replicação dos efeitos. A manipulação de ratos – handling, no caso deste
estudo -, em um ambiente experimental no qual se controlam variáveis é um exemplo.
Ressalta-se, porém, que tal critério possui limitações no que diz respeito à
caracterização do modelo de um transtorno específico, por exemplo, de ansiedade. A
despeito da variabilidade, nos resultados de pesquisa, é viável correlacionar a resposta à
ação da droga no modelo e na clínica, mesmo que no contexto humano ocorram
alterações entre o mecanismo fisiopatológico e o efeito “determinante” da droga
(HETEM, 2004).
Já a analogia avalia similaridades entre o modelo experimental e o transtorno em
si, no qual se busca a modelação da mesma, i.e., a utilização de uma aproximação dos
comportamentos humanos aos modelos animais. (HETEM, 2004).
E, por fim, o critério de homologia, também denominado como validade teórica,
busca uma avaliação nos processos psicobiológicos, relacionados à fisiopatologia dos
transtornos atuantes no modelo animal. Sendo assim, este critério tem se apresentado
como o melhor para se qualificar um modelo representativo de uma psicopatologia.
Ressalta-se, porém que todo conhecimento é passível de mudanças, uma vez que ainda
há pouco conhecimento disponível sobre eventos neurais subjacentes a alguns
transtornos nos modelos experimentais, por exemplo, alguns tipos de ansiedade e/ou a
própria resposta de medo (HETEM, 2004).
8
Há que se considerar que apesar de serem almejados, nem todos os modelos
animais conseguem atender a esses critérios. Geralmente, os modelos pressupõe, pelo
menos, atender a um dos critérios.
Ao longo das décadas, diversos modelos animais foram padronizados para
estudo da ansiedade em humanos, pois mesmo que não seja possível assegurar que
animais não humanos possuam as mesmas sensações subjetivas de humanos, há uma
correspondência muito grande entre essas espécies e seus mecanismos neurais, funções
comportamentais subjacentes às emoções, desde o momento da percepção situacional,
até a organização das reações dentro de seu repertório comportamental (LANDEIRAFERNANDEZ; FUKUSIMA, 2012)
Alguns modelos animais têm sido amplamente estudados para avaliação dos
processos de desamparo apreendido e outros transtornos afetivos, além de transtornos
de ansiedade e alterações cognitivas. Cada modelo pressupõe atender a critérios
diferentes de validação e alguns têm permitido a investigação de alterações
neuroquímicas e comportamentais de amplo espectro. Bons exemplos disso são os
modelos de separação materno-filial, de isolamento, o Labirinto em Cruz Elevado, o
Teste do Nado Forçado e o Modelo de Reconhecimento/Novel.
Estudo conduzido por Azevedo et al. (2010) mostrou que a concomitância entre
separação materna e uma breve estimulação tátil nos filhotes, produziu, nestes animais,
um baixo comportamento fear-like (sensação de medo), quando comparados aos
adultos que não foram submetidos a esse experimento, mostrando uma variação na
reprodução e mudanças neurais. Do mesmo modo, as mães dos filhotes que foram
submetidas ao procedimento de separação materno-filial, acusaram alterações
ansiogênicas e estressoras, já os filhotes que foram manipulados no ninho por 3 horas
diárias obtiveram aumento da excreção de corticosterona, em resposta ao estresse, e
aumento da ansiedade, quando expostos a novos ambientes na fase adulta
(KALINICHEV; EASTERLING; HOLTZMAN, 2002).
Há que se considerar ainda
que essa separação, no período neonatal, pode produzir alterações neuroendócrinas, que
são explicadas pela mudança relacional de mãe-filhote e a alteração comportamental da
mãe após o retorno, ao ninho, do filhote recém-manipulado (MACRÍ; MASON;
WÜRBEL, 2004).
9
1.2 HANDLING:
O handling consiste basicamente no contato direto do rato com o
experimentador, trata-se, de um manuseio do animal que é colocado no antebraço do
pesquisador para a realização do contato da cabeça até a ponta da cauda
ininterruptamente. Assim, o pesquisador “acaricia” o animal da cabeça à cauda por
aproximadamente 5 minutos alguns dias consecutivos antes do experimento. Esse
procedimento tem se mostrado eficaz para a redução do medo observado no modelo do
campo aberto, desde que realizada a partir do desmame até quando for alcançada a fase
adulta desse animal (AZEVEDO et al., 2010).
Ressalta-se, ainda, que ratos filhotes, no período pós-natal, que receberam handling
apresentaram redução significativa de respostas de medo e ansiedade na fase adulta,
quando submetidos ao modelo novel1 em inseridos a novos ambientes; estes animais
mostraram mudanças no comportamento e na produção neuroendócrina (MADRUGA,
2003). Sendo assim, essa forma de manuseio dos animais tem se mostrado uma prática
de estimulação física capaz de alterar padrões comportamentais de ratos submetidos a
diferentes modelos animais.
2 ANSIEDADE E ESTRESSE:
Denominar o significado de ansiedade e estresse não é uma tarefa simples, pois
são emoções/reações distintas para tipos diferentes de situações. No entanto, algumas
definições podem ajudar na compreensão desses fenômenos tão complexos.
É possível que os estímulos ambientais possam mostrar sinais de ameaça,
desenvolvendo uma série de reações cognitivas, comportamentais, sensoriais,
perceptivas entre outros. Para a compreensão do funcionamento da reação a esses
estímulos é válido entender sobre o neurotransmissor que é um dos interventores
principais desses processos neuroquímicos.
1
Modelo novel¹ - Identificação de objetos/ambientes novos ou familiares, para distinguir possíveis
variáveis intervenientes relativas às respostas de reconhecimento/memória ou da locomoção do rato
(FERREIRA, 2010).
10
Um neurotransmissor muito importante nos quadros de ansiedade é a serotonina,
também denominado de 5-HT (5-Hidroxtriptamina). Essa monoamina desempenha um
papel fundamental para relações sociais e a falta de serotonina no organismo, pode
resultar em deficiência de emoção racional, sentimentos de irritabilidade, crises de
choro, alterações do sono e uma série de outros problemas emocionais (BALLONE,
MOURA, 2008).
A soma de todos os estímulos ambientais podem indicar sinais de ameaça, no
qual podem se desencadear reações cognitivas, sensório-perceptivas e neurovegetativas.
A soma dessas reações pode designar o medo, a principal emoção envolvida nas
experiências de ansiedade. (AFONSO; REINAS; ROBERTO; CAMPOS; ENRIQUE;
ANDRADE; VIEGAS; SANTOS e RESENDE, 1997)
Sendo a 5-HT, uma substância que, quando bloqueada em sua síntese, pode produzir
efeitos ansiolíticos, a serotonina tem se mostrado dual ao que concerne as respostas de
ansiedade. Isso porque seu papel pode ser tanto de neurotransmissor ansiogênico como
ansiolítico, exerce também um papel ansiogêncio na amígdala e ansiolítico na matéria
cinzenta periaquedutal dorsal (MCPD) - (AFONSO et al. 1997).
“A despeito das inúmeras definições propostas (sic) ansiedade, entende-se, de
uma forma geral que se trata de um “medo desproporcionalmente intenso não
associado a um risco genuíno”, ou seja, a presença real do estímulo
aversivo.” (MILLAN, 2003, p.83, apud FERREIRA, 2010, p. 2).
Estudos realizados nos últimos anos têm mostrado que através do isolamento
materno-filial, há uma constante aparição ansiogênica por parte dos filhotes, mostrando
uma redução da liberação serotoninérgica e um aumento de corticosterona (FONE,
PORKESS, 2008).
Em consequência do aumento ansiogênico do filhote, foi percebido pelos
cientistas um aumento na massa corpórea do animal (FIALA; SNOW e GREENOUGH
1977, apud FONE, PORKESS, 2008) e aumento no comportamento em acumular o
alimento (HEIDBREDER; WEISS; DOMENEY; PRYCE; HOMBERG e HEDOU,
2000, apud FONE, PORKESS, 2008).
Usualmente, o conceito de ansiedade está atrelado ao de estresse. Contudo, o
estresse é um mecanismo de resposta a estímulos captados no meio ambiente que
produz alterações emocionais, alterando a homeostase no organismo e, por fim, o
aumento da liberação de adrenalina, cortisol, ACTH, entre outros. Essa reação produz
11
diversas manifestações sistêmicas, com distúrbios fisiológicos e psicológicos
(MARGIS; PICON; COSNER e SILVEIRA, 2003).
Do ponto de vista das teorias das emoções, o medo é considerado como uma
emoção básica presente em todas as idades, culturas, raças ou espécies, enquanto que a
ansiedade é uma mistura de emoções, na qual predomina o medo (BARLOW , 2002;
EKMAN, DAV IDSON, 1994 ; LEWIS, HAVILAND, JONES, 2000; PLUTCHIK,
2003, apud BAPTISTA, CARVALHO, LORY, 2014, p. 3).
Isso porque diante de um evento estressor o tipo de resposta varia para cada
indivíduo, não somente a frequência do evento de vida do estressor, ou seja, a
conjunção dos fatores ambientais e genéticos (mesmo que a capacidade individual de
interpretar, avaliar e elaborar estratégias de enfrentamento parecer ter alguma
predisposição genética), porém há outros componentes envolvidos como: cognitivo,
comportamental e fisiológico. Caso o rato consiga eliminar a situação estressora, irá
reduzir a cascata fisiológica, porém se a situação seguir crônica e aguda é possível um
futuro esgotamento dos recursos psicofisiológicos, havendo uma predisposição ao
aparecimento de transtornos de ansiedade entre outros transtornos (MARGIS et al.,
2003).
Há que se ressaltar que o estresse crônico pode não só gerar um estado de
desamparo aprendido, mas também o desenvolvimento de respostas típicas de ansiedade
(especialmente os aspectos somáticos de ativação do sistema simpático).
2.1 LABIRINTO EM CRUZ ELEVADO (LCE):
O Labirinto em Cruz elevado está entre os modelos de ansiedade mais utilizados
para o estudo experimental de drogas ansiolíticas, ou seja, um aparato para análise
ansiogênica do rato submetido ao instrumento. O modelo LCE explora o conflito entre a
tendência natural de ratos em explorar novos ambientes e a aversão do medo natural que
os ratos apresentam em relação à altura e espaço aberto (CRUZ, 1997)
Desenvolvido por Handley e Mithani, foram necessários cerca de 30 anos para o
uso efetivo do teste labirinto em cruz elevado para investigações dentro do universo
neurocientífico. Somente em 1987, houve o primeiro uso desse modelo de forma
sistematizada em ratos. Por se tratar de método de baixo custo, ampla divulgação no
meio científico e de simples execução, o LCE tem sido um modelo bastante utilizado
12
para
experimentos
animais,
representativos
dos
mecanismos
fisiopatogênicos
relacionados à neurociência (PINTO; MI KO; VALERO-LAPCHIK; ARIZA e
PORCIONATTO, 2011).
Esse modelo explora o conflito entre uma tendência natural de ratos ao explorar
novos ambientes e a aversão natural que ratos apresentam a altura e espaços abertos
(LANDEIRA-FERNANDEZ, FUKUSIMA, 2012).
A manifestação de um estímulo aversivo acarreta uma multiplicidade de fatores
como palpitação, sudorese, congelamento, dilatação da pupila dentre outros. Foi
observado que essas respostas podem ser associadas ou condicionadas a algum outro
estímulo que sinaliza perigo (LANDEIRA-FERNANDEZ, CRUZ, BRANDÃO, 2006;
SCHIMDT, MULLER, 2006, apud FERREIRA, 2010).
Tal informações contribuiu para a divulgação e adoção do modelo LCE em
estudos que analisam o comportamento ansiogênico do rato, quando submentido a
novos ambientes exploratórios.
Segundo Pellow, Chopin, File e Briley (1985), a relação medo/ansiedade como
resposta ao estímulo aversivo levou a um paralelo de variações do próprio modelo
animal de ansiedade, ou seja, respostas de ansiedade podem resultar de fontes
ambientais que podem representar sinais de ameaça ou então respostas de aversão,
condicionadas através do meio já vivenciado, desenvolvendo assim padrões de respostas
prévias ao estímulo aversivo. (CRUZ, LANDEIRA-FERNANDEZ, 2001, apud
FERREIRA, 2010).
O estudo atual buscou investigar os fatores relacionados à ansiedade com
alterações neuroquímicas – na área septo hipocampal2 - que podem ocorrer quando os
ratos são submetidos à estimulação tátil, para isso são também analisadas as medidas
clássicas (a frequência de entradas e saídas nos braços abertos e fechados e sua
permanência de tempo em cada um, incluindo o centro) e etológicas (esquadrinhar,
espreitar e explorações da extremidade, novamente calculando a frequência e cada e
permanência) as quais são relevantes para a avaliação do comportamento do rato.
2
Área responsável pela liberação de noradrenalina (NA) e serotonina (5-HT), que aumenta os níveis
ansiogênicos, influenciando no comportamento exploratório do rato.
13
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL:
Validar o modelo Labirinto em Cruz Elevado (LCE) a partir da estimulação tátil.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
•Verificar se a manipulação (handling) altera as medidas clássicas dos animais
submetidos ao LCE.
•Analisar se a manipulação (handling) altera as medidas etológicas dos animais
submetidos ao LCE.
•Analisar se a manipulação (handling) altera o comportamento exploratório e locomotor
dos animais submetidos ao LCE.
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4.MÉTODO:
4.1 SUJEITOS:
Foram utilizados, nesse experimento, 12 ratos albinos da espécie Rattus norvegicus da
linhagem Wistar, experimentalmente ingênuos provenientes do Biotério do Curso de
Psicologia da Universidade Católica de Brasília – UCB. Os animais, alojados em
gaiolas-viveiro (45 x 28 x 13cm), foram submetidos a um ciclo claro-escuro de 12 horas
(iniciando a fase clara às 7 horas da manhã), em ambiente com controle de temperatura
(21ºC) e umidade. Os animais tiveram água e comida livres e todos os procedimentos
foram realizados durante o ciclo claro, no período vespertino.
Todos os procedimentos estavam de acordo com a Resolução Lei 11.794 de
2008, no qual, regulamentou a realização de pesquisas em sujeitos não-humanos.
4.2 EQUIPAMENTO:
Foi utilizado um Labirinto em Cruz Elevado (LCE) que consistem no
cruzamento entre os quatro braços, formando assim, um quadrado com um tamanho
10x10cm, a uma altura de 50 cm do chão. O Labirinto em Cruz Elevado se encontra em
uma sala com isolamento acústico parcial, iluminada por uma luz incandescente de 60W, posta verticalmente a aproximadamente 150 cm acima do aparato. Foi utilizado,
durante o experimento, uma câmera de vídeo modelo Sony Handycam DCR-sr42.
4.3 PROCEDIMENTO:
O procedimento seguiu o protocolo de exposição única para cada animal, a
sequência dos grupos foi estabelecida da seguinte forma: 1o. grupo de 6 animais sem
handling exposto ao LCE em uma semana e 2o. grupo de 6 animais com handling
exposto ao LCE duas semanas após o primeiro grupo, a fim de registrar os seguintes
comportamentos de permanência nos braços abertos e fechados, avaliando pela
porcentagem de tempo gasto.
15
Será também registrada, a porcentagem de entradas nos braços (frequencia em
que o rato entra nos braços fechados e sai em direção aos braços abertos ou quando
permanece alguns segundos no centro e entra novamente no outro braço fechado),
tempo de espreita (padrões nos quais o rato avalia o risco caracterizado por saída parcial
de um braço fechado com as patas dianteiras e cabeça, espreitando com movimentos
pendulares o centro e a entrada dos braços abertos), esquadrinhar (colocação da cabeça
sobre a beirada de um braço aberto, esquadrinhando em qualquer direção) e frequência
de exploração de extremidade (definido pela parte final dos braços abertos, oposta aos
outros braços
Essas medidas etologicamente fundamentadas foram validadas previamente
como medidas de ansiedade no labirinto em cruz elevado (Cruz, Frei, Graeff, 1994,
apud CARVALHO; FERREIRA; SALVARIANO; SILVA; COUTO; ALVES; CRUZ,
2012).
4.3.1 Manipulação – Handling
O grupo nomeado por handling foi manuseado todos os dias, por 15 dias
consecutivos, exceto nos finais de semana, por 5 minutos com luvas de látex. O
manuseio consistiu na colocação do animal no braço da experimentadora e a passagem
da mão da cabeça à cauda do animal.
4.3.2 Labirinto cruz elevado (LCE)
Cada animal foi submetido a apenas um contato experimental no LCE,
colocados no centro do labirinto, Cada animal foi colocado com a cabeça direcionada
para um dos braços fechados, permitindo que ele transitasse livremente por 5 minutos.
Com a gravação dessa exposição, foram registrados o número de entradas nos
braços abertos e fechados, bem como o tempo de permanência nos braços. Após a
retirada de cada animal, o labirinto foi limpo com uma solução de 20% de álcool
(diluído na água) e seco com papel toalha para retirar possíveis odores deixados pelo
sujeito anterior (SILVA, 2014).
16
5 RESULTADOS
Os resultados dessa pesquisa foram computados por meio do Teste t de Student
que permite a comparação de 2 grupos (animais submetidos ou não ao handling) da
diferenças entre as médias das medidas clássicas e etológicas. Foi realizada então, após
coleta dos dados, a plotagem das frequências e tempo de permanência nos braços em
uma planilha do programa Excel e avaliados por meio de estatística descritiva.
Os dados obtidos a partir da exposição ao modelo do LCE indicaram redução
estatisticamente significante na porcentagem de permanência nos braços abertos para o
grupo handling (p = 0,001398). Ou seja, o grupo controle teve uma permanência maior
nos braços abertos com a média da porcentagem de tempo de 36,61(desvio padrão de
11,09). Em relação ao grupo handling, no qual, a média de porcentagem nos braços
abertos foi de 17,38 (desvio padrão de 10), mostrou uma menor permanência nos braços
abertos conforme apontado nas Figura 1.
Figura 1: Porcentagem de tempo nos braços abertos dos grupos controle (N = 6) e Handling (N =
6), onde p = 0,001398.
17
A porcentagem de tempo nos braços fechados também se mostrou diferente de
forma estatisticamente significante (p =0,001398). A média de porcentagem de tempo
nos braços fechados dos grupos foi 63,39 (desvio padrão de 11,09), para o grupo
controle, e 82,62 (desvio padrão de 10), para o grupo manuseado (Figura 2).
Figura 2: Porcentagem de tempo, em segundos, nos braços fechados entre os grupos controle (N
= 6) e handling (N = 6), p = 0,001398
Assim, não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos no
tempo total de permanência no centro (entre os braços), sendo 14,39 (desvio padrão de
6,76) para o grupo controle e 29,28 (desvio padrão de 36,14) para o grupo experimental
– handling (Figura 3).
Figura 3: Tempo, em segundos, gasto no centro entre os braços abertos e fechados dos grupos
controle (N = 6) e handling (N = 6), p = 0,347776.
18
Sobre o total de entradas nos braços, abertos e fechados, os dados analisados
indicaram que houve diferença estatisticamente significante (p = 0,042194) significativo
do grupo experimental (handling), nos braços fechados. Ou seja, enquanto os animais
do grupo controle – sem manuseio – apresentaram média de entradas 10,2 (desvio
padrão nos braços abertos de 1,788854 e nos braços fechados de 0,752773), o grupo
experimental apresentou uma média total de entradas de 6,833333 (desvio padrão nos
braços abertos de 0,983192 e fechados de 2,19089), conforme indicado na Figura 4.
Figura 4: Total bruto de entradas nos braços abertos e fechados dos grupos controle (N = 6) e
handling (N = 6), p = 0,042194.
Em relação às medidas etológicas, o comportamento de espreitar foi medido em
frequência e indicou que não houve diferença estatisticamente significativa entre os
grupos (p = 0,562312). A média do grupo controle foi de 5,2 (desvio padrão de 2,04),
enquanto o grupo experimental apresentou uma média de 5,7 (desvio padrão1,51),
conforme indicado na Figura 5:
Figura 5: Frequência de espreita dos grupos controle (N = 6) e handling (N = 6), p = 0,562312.
19
Dentre o grupo de medidas etológicas, sobre o comportamento de esquadrinhar,
a média do tempo dos grupos não apresentou diferença estatisticamente significante (p
= 0,506719) A média do grupo controle foi de 15,17 (desvio padrão de 6,88), enquanto
o grupo experimental apresentou uma média de 19 (desvio padrão 16,98), conforme
indicado na Figura 6.
Figura 6: Tempo de esquadrinhar dos grupos controle (N = 6) e handling (N = 6), p = 0,506719.
Por fim, a medida da frequência de exploração de extremidade, a média do
tempo dos grupos não apresentou diferença estatisticamente significante (p = 0,517672)
A média do grupo controle foi de 2,333333 (desvio padrão de 1,21), enquanto o grupo
experimental apresentou uma média de 1,833333 (desvio padrão 2,14), conforme
indicado na Figura 7.
Figura 7: Frequência de exploração de extremidades dos grupos controle (N = 6) e handling (N =
6), p = 0,517672.
20
6 DISCUSSÃO
Em relação aos modelos de ansiedade, o Labirinto em Cruz Elevado, atualmente,
é utilizado como principal ferramenta para os processos de desenvolvimento em
modelos experimentais animais. As vantagens desse modelo vão além da capacidade de
evidenciar os mecanismos fisiopatogênicos, dentro do universo neurocientífico, mas
especialmente por se tratar de um instrumento de baixo custo e de ampla divulgação no
meio científico. Assim, é o LCE um instrumento simples de execução e manutenção
(PINTO, 2011).
O uso frequente de modelos animais tem se mostrado de suma importância para
os avanços da medicina, os modelos são basicamente usados para responder perguntas e
estudar hipóteses, uma vez que, boa parte das técnicas utilizadas como variáveis
independentes serão inapropriadas em estudos aplicados em humanos, tornando a
investigação inviável (MAGALHÃES; FRIES, 2010).
Na ciência experimental, o modelo é qualquer representação de um fenômeno,
porém de uma forma mais simplificada; partindo dessa perspectiva, a possibilidade em
simular fenômenos, ainda desconhecidos, é uma das grandes vantagens da utilização
desses aparatos. Porém como todo equipamento, sabe-se que os modelos animais
apresentam limitações, apesar de possuir um grande valor heurístico, uma vez que é
possível testar hipóteses a partir de um conjunto de conhecimentos produzidos acerca
do fenômeno de estudo (LANDEIRA-FERNANDEZ; FUKUSIMA, 2012).
Alguns trabalhos na área da neurociência buscaram como estratégia, para a
solução dessa questão, a utilização de mais de um modelo animal em um mesmo
experimento para comparar e isolar respostas diferenciadas em equipamentos
específicos (LANDEIRA-FERNANDEZ et al., 2006 apud FERREIRA, 2010),
utilizando elementos da estatística que sejam capazes em analisar as diferenças entre as
médias e procedimentos relacionados com determinada variação da aplicação
experimental, como por exemplo, o teste t, onde são corroboradas as análises realizadas
através de itens como as medidas clássicas e etológicas do Labirinto em Cruz Elevado.
O presente estudo abordou a relevância da validação em submeter um animal em
experimentos a fim de inseri-lo em situações de nível ansiogênico. Esse critério, após
sua validação, permite investigar alterações neuroquímicas e comportamentais de amplo
espectro. Foi realizada a divisão de ratos machos, ingênuos e adultos, configurando-os
em dois grupos, o primeiro chamado, controle, com manipulação apenas para a
21
manutenção do ambiente e o grupo handling considerado pela manipulação por 15 dias,
com duração de 5 minutos diários.
Um estudo realizado a respeito da estimulação tátil com filhotes em relação ao
seu desenvolvimento mostrou que no período neonatal, possui, uma influencia decisiva
no desenvolvimento comportamental, neuroendócrino e alterações sinápticas durante a
vida desse filhote. Foi mostrado que os filhotes submetidos ao handling, e
simultaneamente ao processo de separação materno-filial (que consiste em uma breve
separação da mãe, retirando o filhote ou a própria mãe por um determinado tempo da
caixa, também chamado de ninho), até a fase adulta, acusou uma redução do medo e
ansiedade quando submetidos em novos ambientes, comparados com outros ratos
adultos, que não foram sobmetidos ao handling (AZEVEDO, 2010).
A capacidade de uma criança sentir através do tato características dos objetos
(forma, tamanho e textura),temperatura e dor entre outros. Faz com que haja a
adequação das relações com o ambiente e suas implicações contextuais, nesse processo
de reconhecimento e adaptação no seu meio, é necessário o desenvolvimento do sistema
sensorial. Uma importante ferramenta é a psicomotricidade (no qual, possibilidade por
meio de atividades específicas a estimulação do sistema sensorial) definida como
ciência que tem como objeto de estudo o ser humano, através do seu corpo em
movimento. A relevância dessa ciência trata-se pelo fato de que a criança nos seus
primeiros meses de vida começa a explorar o ambiente a sua volta, tendo como recurso
o seu tato, já como suas funções motoras e cognitivas ainda não estão completadas.
Estendendo a importância da estimulação tátil para suas primeiras fases escolares, no
qual, ela usará esse recurso para se interagir com outras crianças, usando suas mãos,
consequentemente, aumentando as variáveis dentro do seu repertório, acrescentando
então, informações recebidas pelo SNC (sistema nervoso central), havendo propoensões
para o desenvolvimento cognitivo e motor. (SILVA; SILVA; BRABOSA, 2014)
A aplicação de estudos na área experimental, no qual, buscam a compreensão da
influência do papel da serotonina, em relação à reprodução comportamental em modelos
animais, mostram a relevância desse neurotransmissor, como por exemplo, no estudo de
Mardsen a respeito das alterações que podem ocorrer no rato, com o isolamento e nas
suas funções serotoninérgica e de memória, buscando, uma relação com os modelos de
esquizofrenia e o papel do receptor 5-HT6, acusou que os ratos filhotes, submetidos ao
isolamento, comprometeu as funções dos neurotransmissores e em áreas subcorticais,
tal como a amígdala e o estriato, reduzindo a produção glutamatérgica e
22
serotoninérgica( no qual há uma atenção especial em relação a esse neurotransmissor,
pois a redução desse pode desenvolver uma disfunção na memória associada
diretamente ao isolamento social precoce), acusando uma cognição debilitada, que
poderia ser revertida caso inserisse drogas atuantes nos receptores 5-HT6.
Os resultados do grupo controle, nas medidas clássicas, apontaram uma média
de permanência, nos braços abertos de 34,61% (figura 1), já nos braços fechados uma
média de 63,38% (figura 2), no centro teve a frequência de 14,38 (figura 3) do tempo
total. Em relação aos resultados do grupo handling, nas medidas clássicas (figura 1, 2
e 3), apontaram uma média de permanência, nos braços abertos de 17,38%, já nos
braços fechados uma média de 82,61%, no centro teve a frequência de 29,77 do tempo
total.
Os resultados do grupo controle, nas medidas etológicas, apontaram a frequência
do comportamento de espreita de 5,16 (figura 5), frequencia do comportamento de
esquadrinhar foi de 14,17 (figura 6) e a frequência na exploração das extremidades de
2,33 (figura 7).
Os resultados do grupo handling, nas medidas etológicas, apontaram a
frequência do comportamento de espreita de 5,7 (figura 5), frequência do
comportamento de esquadrinhar foi de 19 (figura 6)
e a frequência na exploração
das extremidades de 1,83 (figura 7).
Nas últimas décadas, uma grande atenção tem sido dada aos modelos etológicos
de ansiedade (espreita e esquadrinhar), pois são avaliadas determinadas respostas de
defesa do animal, no qual são respostas do rato que ocorrem em situações naturalmente
aversivas, sendo assim desnecessário um treino prévio específico. (CRUZ; GRAEFF;
LANDEIRA-FERNANDEZ, 1997). As medidas de espreita são representadas como
padrões de avaliação de risco caracterizados por uma saída parcial de um braço fechado
com as patas dianteiras e cabeça, espreitando com movimentos pendulares o centro e a
entrada dos braços abertos, já esquadrinhar, trata-se do rato expor sua cabeça sobre a
beirada de um braço aberto, esquadrinhando em qualquer direção. Estas duas medidas
etologicamente fundamentadas foram validadas previamente como medidas de
ansiedade no labirinto em cruz elevado (CRUZ, FREI e GRAEFF, 1994 apud
CARVALHO et al., 2014). O número absoluto de entradas nos braços fechados refletiu
atividade locomotora.( CARVALHO et al., 2014).
Os dados clássicos de ambos os grupos, acusou as medidas de tempo em
segundos nos braços abertos, fechados e total de entradas serem estatisticamente
23
significativa, em relação aos dados etológicos de ambos os grupos, acusou tanto as
medidas de espreita como de esquadrinhar, não foram estatisticamente relevantes,
sugerindo que, o aumento na esquiva dos braços abertos do grupo handling, em relação
ao grupo controle, teve como provável hipótese, por estarem em áreas relativamente
mais seguras, no caso dos braços fechados, não foi instigado o comportamento para uma
habituação na atividade exploratória, mas sim uma redução do impulso exploratório
direcionado aos braços abertos (BERTOGLIO, 2004).
Nesse sentido, esse estudo está de acordo com a proposta do Jeffrey Gray
sobre o Sistema de Inibição Comportamental (SIC). Tal sistema indica quatro principais
fatores capazes de produzir nos animais (inclusive humanos) a habilidade de inibir o
comportamento – que denominaremos como estado de ansiedade (HETEM; GRAEFF,
2004). Ou seja, Gray designou fatores capazes de produzir ansiedade nos animais de tal
forma que eles inibiriam seus comportamentos – especialmente os comportamentos
exploratórios. Talvez possamos chamar esse processo de esquiva, desde que
compreendamos que se trata de uma esquiva não, necessariamente, treinada.
Tais fatores englobariam: situações novas, sinalizações de perigos inatos (que
variam conforme a espécie), situações punidas e frustradas (que demandam, nesse caso,
experiência prévia). Sendo assim, o LCE apresentaria para o animal pelo menos dois
desses quatro fatores: a exposição única é uma situação nova (e, por isso, ansiogênica) e
sinalização de perigos inatos (como por exemplo, a altura, o espaço aberto – nos braços
abertos – e a iluminação). Os resultados dessa pesquisa indicam que, mesmo sem a
introdução de medicação ansiolítica e sem uma evidente redução dos comportamentos
de ansiedade, houve uma diminuição da ativação do sistema septo-hipocampal que
modula o SIC. Dessa forma, sem a ativação dessas áreas cerebrais (septo-pelúcido e
hipocampo), os animais não ficaram “inibidos” e exploraram mais o LCE. Assim, o
principal resultado desse projeto está justamente no evidente aumento, estatisticamente
significante, do comportamento exploratório de animais submetidos ao handling por 15
dias, sendo possível sugerir que houve diferença entre os grupos de tal forma que o
handling não foi variável de controle sobre as respostas de ansiedade, mas de atividade
locomotora.
Vale ressaltar ainda que não houve diferença estatisticamente significante sobre
os tempos de permanência de centro, exploração de extremidades e comportamento de
espreita. Ainda de acordo com as análises, foi percebido do grupo handling uma
permanência maior nos braços fechados em relação ao grupo controle (conforme
24
demonstrado na Figura 2). Verificou-se a predominância da permanência dos braços
abertos do grupo controle em relação ao grupo handling, sem contudo representar, para
o grupo controle, menor índice de ansiedade. Isso porque também foi averiguado que a
permanência no centro junto aos comportamentos de espreita e exploração de
extremidade (figura 7) foi estatisticamente irrelevante entre os grupos. Essas duas
últimas medidas são medidas etológicas indicativas, nesse modelo, de resposta de
ansiedade, conforme apontado por Cruz, Frei e Graeff (1994), apud Carvalho et al.
(2012). Isso significa que a manipulação do handling não foi capaz de produzir
mudanças significativas para redução de ansiedade, mas foi suficiente para que o animal
manipulado explorasse mais o aparato.
Apesar de o experimento ser realizado por ratos adultos, a aplicação do handling
e submissão ao LCE mostrou dados significantes e coerentes com a proposta de Graeff,
sendo assim, podemos afirmar que o uso de ratos adultos em experimentos relacionados
a submissão do handling e validação de aparatos ansiogênicos, torna-se uma variável
que deve ser levada em consideração já que os resultados não se tão robusto em relação
a experimentos realizado desde o período neonatal com intervenção de ansiolíticos.
Tomando em conjunto, alguns pontos importantes que emergiram, no presente
estudo, como o grupo handling que foi submetido a procedimentos de manipulação,
apesar da maior permanência nos braços fechados, não foi necessariamente interpretado
como aversão e sim uma habituação em seu ambiente exploratório de acordo com as
análises registradas dos dados clássicos e etológicos, conseguimos observar que através
das analises realizadas do LCE é possível perceber este experimento projetado em um
plano mais amplo, como por exemplo, os transtornos de ansiedade.
Os transtornos de ansiedade estão entre os mais prevalentes e onerosos
transtornos psiquiátricos, derivados de: ansiedade generalizada, fobias específicas,
fobias sociais, transtorno de estresse pós-traumático depressões, psicoses, transtornos do
desenvolvimento entre outros. (CASTILLO; RECONDO; ASBAHR e MANFRO,
2000) Sendo assim, sugere-se um futuro estudo sobre essas implicações, aprofundando
nas relações de medo, estresse e ansiedade, a fim de estabelecer dados passíveis de
comparações, inclusive de manipulações táteis com intervenções farmacológicas.
25
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