1 UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA DE ENGENHARIA DE LORENA (EEL–USP) O ESTUDO SOBRE ARCHAEA E APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS Lorena 2013 2 FLAVIO KIYOSHI TOMINAGA O ESTUDO SOBRE ARCHAEA E APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Departamento de Biotecnologia da Escola Estadual De Lorena – Universidade de São Paulo Orientador: Profª. Drª Maria Bernadete De Medeiros Lorena 2013 3 DEDICATÓRIA À minha família, base da minha vida. Aos meus professores orientadores. E aos verdadeiros amigos. 4 AGRADECIMENTOS À professora Drª. Maria Bernadete de Medeiros, pela atenção, paciência, dedicação e empenho nas orientações deste trabalho. Aos demais professores do curso, que muito contribuíram com sua experiência e dedicação. Aos colegas de classe, companheiros sempre presentes nos momentos de alegria e nas dificuldades encontradas neste caminho. Aos meus amigos, por ter me incentivado a cursar esta faculdade e a não desistir nos momentos difíceis. Aos meus pais, que concederam a base da minha formação. 5 RESUMO O domínio Archaea é composto por um grupo de bactérias com características extremófilos. Toleram condições ambientais extremas, que lembram o ambiente dos primórdios do aparecimento da vida. Desenvolvem-se sob condições de elevadas ou baixas temperaturas, ausência total de oxigênio, condições osmóticas e pHs extremos. As células apresentam características únicas, como as composições química da membrana citoplasmática e parede celular, além de apresentar vias metabólicas específico como as bactérias metanogênicas. Woese e Fox (1990) sugeriram que o sistema biológico fossem divididos em três dominios: Archaea, Eukarya e Bacteria. No entanto essa divisão ocorreu com base nos dados da fração 16S do RNA ribossomal (1997). Até o arquebacterias não está totalmente caracterizado. momento o Entretanto metabolismo das algumas vias metabólicas foram elucidadas (Danson 1988). A utilização de enzimas em escala industrial vem sendo ampliada anualmente. Após a descoberta das Archaea, o interesse das enzimas sintetizadas por arqueobacterias, ampliou a área de interesse das enzimas comerciais. Como no processo industrial as operações são conduzidas sob condições adversas principalmente, de temperatura e pH, as enzimas produzidas pelas Archaea, podem ser utilizadas nessas operações ou em etapas adicionais. Sempre com os objetivos de aumentar a eficiência dos processos industriais e reduzir os custos de produção. As enzimas sintetizadas por Archaea são conhecidas como extremoenzimas. Podem ser produzidas por linhagem de DNA recombinante, ou seja, a produção pode ser realizada sem a necessidade da cultura desses extremófilos. O gene, que consiste em uma parte específica do DNA, pode ser inserido no microrganismo “domesticados”, possibilitando a produção de clones para a produção de enzimas desejadas 6 ABSTRACT The Archaea domain comprises a group of bacteria with features extremophiles. They tolerate extreme environmental conditions that resemble the environment of the early appearance of life. They are able to develop under conditions of high or low temperatures, the total absence of oxygen, osmotic conditions and extreme pHs. The cells exhibit unique characteristics such as chemical composition of the cytoplasmic membrane and cell wall, in addition to presenting specific metabolic pathways as methanogenic bacteria. Woese and Fox (1990) suggested that the biological system to be divided into three domains: Archaea, Bacteria and Eukarya. However this division was based on data from the 16S ribosomal RNA (1997). By the time the metabolism of archaea is not fully characterized. However, some pathways were elucidated (Danson 1988). The application of enzymes in industrial scale has been increased every year. After the discovery of the Archaea, the interest of the enzymes synthesized by Archaea, expanded the area of interest of commercial enzymes. As in industrial processes the operations are carried out under adverse conditions especially temperature and pH, enzymes produced by Archaea can be used in these operations or additional steps. Aiming at increasing the efficiency of industrial processes and reducing production costs. The synthesized enzymes by Archaea are known as extremenzyme. They can be produced by recombinant DNA strain, in other words, the production can be performed without the need for culture of these extremophiles. The gene, which consists of a specific portion of DNA can be inserted into the organism "domesticated", allowing the production of clones for production of desired enzymes 7 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Divisão filogênica baseada da divisão do RNA ribossomal ................................................. 10 Figura 2- Estrutura da Pseudomureina ................................................................................................. 12 Figura 3 - Estrutura de Lipídeos de Arqueobacteria (a) Estrutura diéter (b) Estrutura tetraéter ............ 13 Figura 4- Diferentes mecanismos de formação de acetato e síntese de ATP a partir de piruvato em Archaea e Bactérias anaeróbicas estritas. A numeração refere-se as enzimas: 1) piruvato descarboxilase; 2) ferredoxina oxidoredutase; 3) acetil-CoA sintetase; 4) fosfato acetiltransferase 6) acetato quinase. .................................................................................................................................... 15 Figura 5 – Mecanismo proposto para a produção de acetato, CO2 e H2 em Pyrococcus sfuriosu. Os números referem-se as enzimas: 1) α-glicosidase; 2) glicose: ferredoxina oxidoredutase. 3) gluconate desidratase; 4) KDG aldolase. 5) ferredoxina oxidoredutase; 6) glicerato kinase; 7) enolase; 8) piruvato quinase. 9) piruvato: ferredoxina oxidoredutase; 10) ADP-dependente acetil- CoA sintetase; 11) hidrogenase .................................................................................................................................... 16 Figura 6 - Via metabólica proposta para a formação de alanina a partir de maltose, celobiose ou piruvato por Pyrococcus furiosus, combinação de não-fosforilada via Entner-Doudoroff. As numerações correspondem as seguintes enzimas 1) alanina aminotransferase; 2) glutamato desidrogenase; 3) ferrodoxina: NADP + oxiredutase. .......................................................................... 17 Figura 7 – Via metabólica de fermentação de glicose a acetato, CO2 e H2 do hipertermofilico Themotoga marítima através do metabolismo de Embden-Meyerholf. Enzimas: 1) hexoquinase ATP dependente; 2) glicose-6-fosfato isomerase; 3) 6-fosfofrutoquinase ATP dependente; 4) frutose-1,6bisfosfato aldolase; 5) triose-fosfato isomerase; 6) gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase. 7) fosfoglicerato quinase; 8) fosfoglicerato quinase. 9) enolase; 10) piruvato quinase; 11) piruvato; ferredoxina oxidoredutase; 12) fosfate acetiltranferase; 13) acetato quinase; 14) NADH: ferrodoxina oxidoredutase; 15) desidrogenase ....................................................................................................... 18 Figura 8 Eletro-micrografia da seção do halófilo Halobacterium salinarum. (a) Longitudinal seção. (b) Alta magnificação da eletro-micrografia mostrando a estrutura regular da célula ................................ 21 Figura 9 – Enzimas envolvidas na redução do sulfato a H2S. Enzimas: 1) ATP sulfurilase; 2) pirofosfatase; 3) Adenililsulfato (APS) redutase; 4) sulfito redutase. ................................................... 24 Figura 10 .............................................................................................................................................. 26 Figura 11 - ............................................................................................................................................ 30 8 SUMÁRIO DEDICATÓRIA ......................................................................................................................................... 3 AGRADECIMENTOS ................................................................................................................................ 4 RESUMO ................................................................................................................................................. 5 ABSTRACT............................................................................................................................................... 6 LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................................. 7 SUMÁRIO ............................................................................................................................................... 8 INTRODUÇÃO ......................................................................................................................................... 9 SISTEMÁTICA ........................................................................................................................................ 10 ESTUDO METABÓLICO DE ARCHAEA .............................................................................................. 14 TERMÓFILOS E PSICRÓFICOS ............................................................................................................ 19 HALÓFILOS ....................................................................................................................................... 20 METANOGÊNICAS............................................................................................................................. 22 ARQUEOBACTÉRIAS QUE OXIDAM ENXOFRE ................................................................................... 23 APLICAÇÕES ......................................................................................................................................... 24 TERMOENZIMAS............................................................................................................................... 25 Glicosil hidrolases ......................................................................................................................... 25 Amilases ....................................................................................................................................... 26 Celulases ...................................................................................................................................... 26 BIOEXTRAÇÃO DE MINÉRIOS ............................................................................................................ 27 BACTERIORHODOPSIN ...................................................................................................................... 28 TRATAMENTO DE ÁGUAS RESIDUAIS ............................................................................................... 29 CONCLUSÃO ......................................................................................................................................... 31 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................................................ 32 9 INTRODUÇÃO O domínio Archaea é composto por um grupo de bactérias com características extremófilos. Toleram condições ambientais extremas, que lembram o ambiente dos primórdios do aparecimento da vida. Desenvolvem-se sob condições de elevadas ou baixas temperaturas, ausência total de oxigênio, condições osmóticas e pHs extremos. As células apresentam características únicas, como as composições química da membrana citoplasmática e parede celular, além de apresentar vias metabólicas específico como as bactérias metanogênicas. As linhagens Archaea sintetizam produtos com propriedades diversificadas. Dentre os bioprodutos de interesse econômico estão as enzimas termoestáveis. Em especial, as polimerases do DNA que são sintetizadas por Thermus aquaticu. É uma enzima utilizada na ampliação da molécula do DNA portanto, muito utilizada nas técnicas da biologia molecular. Enquanto que, as amilases e ciclodextrina termoestáveis sintetizadas por Pyrococcus woesei possuem mercado nas industrias de alimentos e fármacos. A bactéria Pyrococcus furioses produz celulases que poderá ser utilizada nos processo de biopolpação sob condições de temperatura elevada. As bactérias metanogênicas produzem o gás natural metano. Incluem as bactérias dos grupos halofilicas e hipertermofílicas que se encontram em diferentes nichos ambientais. O processo é misto quanto a fermentação. Sob condições de anaerobiose estrita Methanococcus jannaschi, utiliza os gases hidrogênio, dióxido de carbono e o acetato e produz o metano Atualmente, as bactérias do domínio Archaea estão sendo pesquisadas no Brasil. Existem grupos pontuais nos estados de São Paulo, Rio de Janeiro e Ceará que estão desenvolvendo trabalhos nessa área da ciência. Entretanto considerando o clima tropical do pais, as inúmeras fontes com água termal e os solos das salinas, que são nichos ambientais propícios para o desenvolvimento das bactérias extremófilos, espera-se mais investimentos nessa área da microbiologia. Portanto o grande desafio para os pesquisadores será incorporar as informações decorrente do estudo das bactérias extremófilos em novas tecnologias, utilizando o seu potencial para a síntese de bioprodutos estáveis e de interesse econômico. 10 SISTEMÁTICA Woese e Fox (1990) sugeriram que o sistema biológico fossem divididos em três dominios: Archaea, Eukarya e Bacteria (Figura 1). No entanto essa divisão ocorreu com base nos dados da fração 16S do RNA ribossomal (1997). A descoberta das Archaea permitiu que a antiga divisão entre Eukarya e Bacteria fosse ampliada. Figura 1 - Divisão filogênica baseada da divisão do RNA ribossomal Segundo Forterre (1997), a classificação e identificação do RNA ribossomal permite a avaliação da evolução dos organismos. Estudos do genoma de Archaea permitiram essa comparação que possibilitaram essa divisão. Zillig e colaboradores identificaram uma estrutura típica no RNA ribossomal de Archaea. As células das Archaea não possuem a membrana nuclear e se assemelham as bactérias. Yue (1996) verificou que a enzima CCA-adicionado do tRNA, da Archaea Sulfolobus shibatae é semelhante à polyA polimerase de eucariotos enquanto que a poliA polimerase é encontrada em bactérias. Tauer (1997) e Bergeat (1997) associaram os resultados das análises bioquímica e da sequência da ribonucleases redutases (RNR) e, concordaram com a divisão em três dominios. Tauer (1997) purificou e fez a sequência parcial da enzima ribonucleotideo redutase e B12-dependente da arqueobacteria 11 Thermoplasma acidophila. Utilizando a técnica seqüencial de sonda, o geneda enzima foi clonado, completamente sequênciado e expresso em células de Escherichia coli. Bergeat (1997) clonou e sequênciou o genes A e B das subunidades da enzima topoisomerase II, da espécie Sulfolobus shibatae. O sequênciamento dos nucleotídeos do rRNA das bactérias do domínio Archaea permitiu definir, que as arqueobactérias, apresentam, características genéticas semelhantes aos eucariotos e as bactérias, além de apresentar genomas específicos. O genoma das arqueobactérias contém muitos genes semelhantes e que expressa as vias metabólicas, os transportem dos nutrientes, os mecanismos de reparo da molécula do DNA e divisão celular. Jacobs e Grogan (1997) estudaram os níveis de mutação das arqueobactérias e verificam que apresentam pouca mutação genética. Essa variação genética pode ser explicada através dos fatores fisiológicos. A molécula de DNA apresenta ligações estáveis. As ligações ditas primárias, uma vez que a temperatura entre 75-105°C pode ocorrer a ruptura dessas ligações. Ligações secundárias e terciárias, que promovem a conformação das enzimas - no eficiente mecanismo de reparação do DNA. O domínio Archaea consiste nas divisões Crenarchaeota, que contém as arqueas redutoras de enxofre, Euryarchaeota compreende uma grande diversidade de bactérias, como as metanogênicas, halófilas extremas e algumas hipertermófilas e Korarchaeota, uma divisão mais recente que engloba os microrganismos hipertermofílicos, atualmente pouco conhecidos. Considerando as três divisões, os Crenarchaeota possuem os hipertermófilos mais conhecidos capazes de suportar as condições de temperatura mais elevadas. São quimiolitótrofos autótrofas, ou seja, são capazes de utilizar como substrato compostos orgânicos reduzidos e obtém energia através do metabolismo oxidativo. Isso ocorre devido às condições extremas de exposição das células. Não há registro que realize a fotossíntese. As Euryarchaeota apresentam diversidade quanto a fisiologia. As Metanogênicos são anaeróbios obrigatórios, enquanto que, as halófilas em sua maioria é aeróbio obrigatório. Korarchaeota é uma classe recém-descoberta de amostras coletadas em Yellowstone e através de analise genética foi classificada como Archaea. 12 PAREDE CELULAR As Archaea possuem algumas características marcantes para classificar no domínio. Em especial quanto a composição da parede e da membrana celular como também das moléculas que compõem o RNA ribossomal. Kanderl e Hong (1998) estudaram a composição química da parede celular de Archaea. A estrutura da parede não apresenta mureína e peptideoglicano. Na parede celular das Arqueas classificadas como gram-positivas são encontrados diversos tipos de polímeros. Entretanto como a maioria das Arqueas é gram-negativa, a célula contem moléculas de proteínas ou glicoproteínas conhecido como Camada S. apresentam um polímero denominado de Ao invés de peptideoglicano, pseudomureina (Figura 2- Estrutura da Pseudomureina). Composto de ácido L-talosaminurôcino ao invés de ácido murâmico que é encontrado em paredes de procariotos. A biosíntese da pseudomureína ocorre a partir de nacetilglicosamina e n-acetil-talosamimuranico, resultando na biosíntese de um dissacarídeo formado por uridina difosfato-N-acetilglicosamina-N- ácido acetiltalosaminuronico (UDPGlcNAc-NAcTalNA) e talosamimuranico UDPativado por um pentapeptídeo . O é formado a partir do N-acetilgalactosamina ácido n-acetil- pela via ácido N- acetilaltrosaminuronico . O pentapeptídeo de UDP-activado é derivado do ácido glutâmico Nα-fosforilo pela adição de resíduais em detrimento do trifosfato de adenosina (ATP). Figura 2- Estrutura da Pseudomureina quatro aminoácidos 13 MENBRANA CITOPLASMATICA. O estudo da membrana celular das arqueobacterias permitiu verificar uma divisão ao longo da evolução. Langworhty e Pond (1986) verificaram que a membrana é formada por éteres de acido graxo com cadeia lateral ligado a fitanol (C20), formando cadeias longas e ramificadas. O éter isopranil glicerol realiza a ligação hidrofóbica substituindo os gliceróis lipídeos ligados á cadeia de ácidos presentes em organismos eucariotos. As cadeias de hidrocarbonetos de glicerol são isopronois ramificados, não apresentando variabilidade na cadeia. Possuem o tamanho equivalente de 20 a 40 átomos de carbono. A maioria das arqueobacterias apresentam duas cadeias de C 20 fitanil (Figura 3 (a) . Cadeias que contém dibifitanil diglicerol tetraéteres que possuem duas cadeias de C 40 fitanil (Figura 3 (b) ligadas por ligações éter a duas moléculas de glicerol são menos comuns. Estas estruturas são encontradas em bactérias metanogênicas, termófilas, ácido-termófilios. Em Haloalcalinofílicos esta se apresenta pela composta por diéteres que contenham C 20 fitanil, além de cadeias de C25 sestertepafil. O termofilo metanogênicos, Methanococcus jannaschi, contem dieter C40 bifitanol macrociclico como componete majoritário. Há duas exceções que não contém a estrutura tetraéter que ocorrem em espécies Sulfolobis – apresentam grandes quantidades de monitoglicerol tetraéter em que nove carbonos de nonitol substituem uma de duas moléculas de glicerol, embora contenha pequenas quantidades de uma cadeia de tetraéter C40 bifitanol e duas de dieter C20 bifitanol Figura 3 - Estrutura de Lipídeos de Arqueobacteria (a) Estrutura diéter (b) Estrutura tetraéter Sprott (1992) verificou que halófilas do gênero Halobacterium apresetam ligações dieteres, formadas por ligaçoes de fosfolipideos e ligaçoes sulfato. Estas ligaçoes consistem em uma maior de fosfolipedeos (PGP), duas menores de fofoslipideos (PG e PG-sulfatado), uma maior (Gal-MAnlGLclDs-sulfatado) e outras menores de glicolipideos. 14 ESTUDO METABÓLICO DE ARCHAEA Até o momento o metabolismo das arquebacterias não está totalmente caracterizado. Entretanto algumas vias metabólicas foram elucidadas (Danson 1988). Archaea não apresentam enzimas específicas além da via glicolíticas, o que sugere ausência de rotas alternativas como o ciclo de Entner-Doudoroff. Siebers e Hensel (1993) e Kengen e colaboradores (1994) verificaram que a ausência da enzima 6-fosfofrutoquinase nas células deve-se ao fato de que estas enzimas utilizam o DDP ou PPi como co-fatores ao invés de ATP. Schafer e Schonheit (1992) observaram que hexoquinase e fosfofrutoquinase não foram encontradas em extratos de células livres de Archaea.. Kengen e colaboradores (1993) e Constantino e Kelly (1990) concluíram que a maltose e celobiose são transportadas pela membrana citoplasmática como dissacarídeos e no citoplasma são hidrolisados por α-glicosidase ou β-glicosidase, respectivamente..Produzindo duas moléculas de glicose por dissacarídeo consumido. Kengen e colaboradores (1994) conduziram uma fermentação com Pyrococcus furiosus contendo como substratos a maltose ou a celobiose e verificaram que a bactéria utiliza os dois substratos porem não produziu o CO2. Entretanto, Schafer e Schonheit (1991) e Kengen e Stams) 1994 descobriram que o acetato, a alanina, o hidrogênio e CO2 são os principais produtos da fermentação. A produção de acetato ocorre em todos os microrganismos que realizam a fermentação. Schafer e Schonheit (1991) observaram que arqueobactérias geralmente possuem as enzimas acetil-CoA sintetase, ferrodoxina oxidoredutase e hidrogenases. Que são responsáveis pela síntese de energia e também pela formação de ADP e Pi. Em uma reação reversível acetilCoA, ADP e Pi são convertidos a acetato, ATP e CoA ( Figura 4). 15 Figura 4- Diferentes mecanismos de formação de acetato e síntese de ATP a partir de piruvato em Archaea e Bactérias anaeróbicas estritas. A numeração refere-se as enzimas: 1) piruvato descarboxilase; 2) ferredoxina oxidoredutase; 3) acetil-CoA sintetase; 4) fosfato acetiltransferase 6) acetato quinase. Schafer e Schonheit (1992) propuseram uma via metabólica especifica na fermentação da maltose realizada por Pyrococcus furiosus (Figura 5). 16 Figura 5 – Mecanismo proposto para a produção de acetato, CO2 e H2 em Pyrococcus sfuriosu. Os números referemse as enzimas: 1) α-glicosidase; 2) glicose: ferredoxina oxidoredutase. 3) gluconate desidratase; 4) KDG aldolase. 5) ferredoxina oxidoredutase; 6) glicerato kinase; 7) enolase; 8) piruvato quinase. 9) piruvato: ferredoxina oxidoredutase; 10) ADP-dependente acetil- CoA sintetase; 11) hidrogenase Kengen e Stam (1993) estudaram a síntese de L-alanina durante o processo de fermentação. A produção de alanina ocorre no desvio de via para a formação de acetato. Fatores como pressão osmótica provocado por hidrogênio, concentração do íon de amônio interferem na formação dos produtos (alanina/acetato). A síntese ocorre na via alanina aminotransferase (Figura 6). 17 Figura 6 - Via metabólica proposta para a formação de alanina a partir de maltose, celobiose ou piruvato por Pyrococcus furiosus, combinação de não-fosforilada via Entner-Doudoroff. As numerações correspondem as seguintes enzimas 1) alanina aminotransferase; 2) glutamato desidrogenase; 3) ferrodoxina: NADP + oxiredutase. 18 Figura 7 – Via metabólica de fermentação de glicose a acetato, CO2 e H2 do hipertermofilico Themotoga marítima através do metabolismo de Embden-Meyerholf. Enzimas: 1) hexoquinase ATP dependente; 2) glicose-6-fosfato isomerase; 3) 6-fosfofrutoquinase ATP dependente; 4) frutose-1,6-bisfosfato aldolase; 5) triose-fosfato isomerase; 6) gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase. 7) fosfoglicerato quinase; 8) fosfoglicerato quinase. 9) enolase; 10) piruvato quinase; 11) piruvato; ferredoxina oxidoredutase; 12) fosfate acetiltranferase; 13) acetato quinase; 14) NADH: ferrodoxina oxidoredutase; 15) desidrogenase A enzima gyrase reversa geralmente é encontrada em microrganismos que possuem uma temperatura ótima de crescimento de 65°C. Portanto, é encontrada na maioria das arquebacterias. Confalonieri e colaboradores (1993) estudaram a girase reversa de Sulfolobus acidocaldarius. Os resultados indicaram que a enzima é formada pela associação de duas enzimas distintas: a topoisomerase e a putative helicase. O domínio da helicase pertence à classe de proteínas ligantes ao ATP. Incluem as enzimas da síntese do DNA, transportadores e 19 fatores de alongamento. A classe de topoisomerase é proveniente da família de DNA topoisomerases I. TERMÓFILOS E PSICRÓFICOS Dentre as Archaea as mais estudadas são as classificadas como termófilos. Possuem temperatura ótima de crescimento próximo de 45°C. Entretanto as denominadas de hipertermofílicos a temperatura ótima é em torno de 80°C. O primeiro extremófilo capaz de crescer a temperaturas próxima a 70°C foi identificado na década de 60. Este microrganismo foi denominado de Thermus aquaticus. Despertou interesse devido à possibilidade de ser utilizado em processo inovador na área da biotecnologia. Na mesma época foi descoberta a Sulfolobus acidocaldarius, uma arqueabacteria que cresce a elevada temperatura e sob condição ácida.. Quando submetido a altas temperaturas a célula começa a sofrer problemas de lise celular. Para coibir tal problema, as archaeabacterias possuem uma parede celular com maior rigidez. Como também a membrana citoplasmática possui uma estrutura química constituída por lipopolissacarídeos (lipoglycan) que consistem de lipídeos tetraéter com unidades de manose e glicose. Esses lipídeos apresentam ligações covalentes entre as unidades de phytanyl, formando uma monocamada da membrana citoplasmática, o que confere uma resistência a temperatura elevada. O DNA começa-se a desnaturar sob temperatura elevada. O citoplasma de hipertermófilos metanogênicos contém grandes quantidades de 2,3-difosglicerato de potássio cíclico que evita possíveis danos - como na replicação do DNA forma sítios sem a presença purinas - que ocorrem a elevadas temperaturas. Em arqueas que não possuem o metabolismo metanogênico, há a produção de DNA topoisomerase conhecida por DNA gyrase reverse. A gyrase reverse introduz supercoils no DNA com o gasto de ATP, que auxilia na estabilização. Para evitar a desnaturação de proteínas, as arqueobacterias apresentam uma grande quantidade de proteínas denominadas chaperonas. Estas proteínas ajudam a evitar no desnaturamento de outras proteínas, estando presente em aproximadamente 80% do citoplasma celular. As proteínas apresentam um aumento das pontes de hidrogênios, aumento de interações hidrofóbicas e uma menor porcentagem de aminoácidos termolábeis. Os 20 aminoácidos presentes em termoenzimas são asparagina, glutamato, cisteina, metionina e triptrofano, que possuem menos sucessibilidade à degradação. Em contraste com os termófilos, as arqueabacterias psicrofilos crescem em baixas temperaturas. São encontrados em diversos ambientes submarinos congelados, como a Antártica. São microrganismos planctônicos que vivem livre na água ou imobilizados em partícula. Sua ocorrência na água é em torno de 104 células por mililitro, mesmo sob condição ambiental possui com escassez nutricional. A arquebacteria psicrófilo Polaromanos vacuolata temperatura ótima de crescimento de 4°C. A temperatura superior a 12°C compromete a sua reprodução. Este grupo de microrganismos é objeto de pesquisa em indústria de refrigeração. Geralmente sob condições de baixa baixas temperaturas ocorre a inativação de proteínas. Para contornar esse problema, a célula apresenta uma menor quantidade de aminoácidos com pontes de hidrogênio, como o dissulfeto como também, as interações hidrofóbicas da estrutura protéica. O resultado é o aumenta da flexibilidade da molécula das proteínas. HALÓFILOS As arquebacterias Halófilos que são também designados como “halobacteria” em razão do gênero Halobacterium ter sido o primeiro representante desse grupo mais pesquisado. Halobacterias são gram negativas, aeróbias e capazes de viver em ambientes com concentração salina muito elevada. Reproduzem-se por divisão binária e não possuem endósporos. A maioria das linhagens não apresenta mobilidade. Entretanto, as espécies móveis se locomovem através de flagelo polar. Apresentam o metabolismo quimiorganotróficos, sendo que a maioria das espécies são aeróbios obrigatórios. Diferentes aminoácidos e ácidos orgânicos são utilizados como fontes de carbono e energia e requerem uma grande variedade de fatores de crescimento. Algumas espécies de Halobacterium apresentam a capacidade de oxidar carboidratos. A cadeia de transporte dos elétrons contém os citocromos a, b e c. A conservação de energia durante o crescimento sob 21 condições de aerobiose é resultado da força motriz dos prótons decorrentes de reações quimiósmoticos mediado pela membrana celular. O deslocamento da água tende a seguir a direção onde a concentração salina é elevada, promovendo a desidratação celular. Halobaceruim salinarum possui uma concentração de cloreto de potássio elevada no citoplasma célular. Algumas halobactérias são equipadas com bombas de potássio, permitindo que essa concentração no interior da célula seja maior que a encontrada no meio de crescimento celular. Portanto, as enzimas no citoplasma possui atividade sob altas concentrações deste sal. No entanto, as proteínas isoladas do H. salinarum necessitam de uma elevada concentração de cloreto de sódio como cofator. Para evitar o rompimento celular as Halófilos possuem uma parede celular constituída por glicoproteínas que tem uma maior porcentagem de aminoácidos que atraem o íon Na + para o contorno da célula. Em eletromicrografias ( Figura 8) arquebacteria parece semelhante a um bactérias gram negativas, porém + Na conecta a superfície da parede celular da Halobaceruim e é essencial para manter a integridade celular. Quando a concentração de íons de sódio é insuficiente ocorre a lise das paredes célula, levando ao rompimento da célula. (a) (b) Figura 8 Eletro-micrografia da seção do halófilo Halobacterium salinarum. (a) Longitudinal seção. (b) Alta magnificação da eletro-micrografia mostrando a estrutura regular da célula Outro problema é a desnaturação de proteínas, o sal tende a realizar ligações hidrofóbicas, fazendo com que os polipeptídios agreguem-se e perda atividade. As 22 glicoproteínas de Halobaceruim contêm aminoácidos com grupos ácidos como aspartato e glutamato. Nessas proteínas ficam expostos os aminoácidos de carga negativa, de maneira que, quando os íons positivos entram em contato com a proteína, esta se estabiliza. (Eisenberg & Watchel 1987; Danson 1988). Eisenberg & Watchel (1987) As linhagens Natronobacterium, Natronosomonas e Natronococcus possuem as características de halófilos como também de alcolinofílos. Essas arquibacterias são diferentes de outros microrganismos do mesmo grupo. Apresentam um crescimento ótimo em baixas concentrações do íon Mg2+ e pHs elevados na faixa de 9 a 11. Na composição da parede celular apresentam diéter de lipídeos e polímeros de acido glutâmico em especial oligossacarídeos contendo N-acetilglicosamina, glicose, e outros tipos de açúcar que estão ligados através do grupo amino do aminoácido glutanima. METANOGÊNICAS As Archaeas apresentam uma característica exclusiva que é o metabolismo metanogênico. Não se conhece outro tipo de organismo que consiga produzir metano como produto de seu metabolismo. As metanogênicas são microrganismos anaeróbios estritos e que liberam metano como resíduo do seu metabolismo e não apresentam outro fonte de energia (Whitman 1985). Vivem em ambientes com ausência de oxigênio e abundância de matéria orgânica, sendo encontradas, principalmente, em pântanos, açudes, lagos, sedimentos marinhos e rúmen bovino. Elas retiram o hidrogênio e gás carbônico desses ambientes e utilizam em seu metabolismo. Vivem em simbiose com outros tipos de microrganismo, convertendo os produtos finais da fermentação em gás metano. As metanogênicas são gram positivas a maioria das espécies identificadas são mesófilas e liberam metano como resíduo do seu metabolismo. Em função de sua fisiologia, são classificadas em dois grupo como a metanogênicas acetoclásticas, e as hidrogenotróficas. As metanogênicas acetoclásticas utilizam o acetato como fonte de carbono e energia, sendo os predominantes na digestão anaeróbia. Desenvolvem-se na forma de filamentos e tem grande importância na formação da trama bacteriana presente nos grânulos. 23 ΔG0 = -31kJ Equação 1- Metabolismo de acetoclástica - Oxidação de acetato para a produção de energia As hidrogenotróficas são capazes de produzir metano a partir de hidrogênio e gás carbônico, resultando em uma maior liberação de energia. ΔG0 = -131kJ Equação 2- Metabolismo de hidrogenotroficos - Oxidação de gás carbônico para a produção de energia ARQUEOBACTÉRIAS QUE OXIDAM ENXOFRE Arqueobactérias dependentes de enxofre são conhecidas por solfataras. Crescem em temperatura elevada na faixa de 50 a 87°C. Algumas espécies preferem condições acidas e crescem em pH 4 a 5,5. A linhagem Sulfolobus é quimiorganotroficos e oxida o enxofre ou compostos orgânicos. Enquanto que a Thermoproteus que removem elétrons do H2 e do H2S. Foram isoladas de amostras provenientes de diferentes locais como Itália, Iceland, Nova Zelândia, Yellowstone National Park em Wyoming (EUA), principalmente em áreas com atividades geológicas. Schonheit & Schafer (1995) descreveram o modelo metabólico de arqueobacterias que oxidam enxofre. São litotróficos extremófilos e na sua maioria hipertermófilos que reduzem o H2 a H2S. Utilizam o H2 e CO2 como fontes de energia e de carbono, respectivamente. O mecanismo de ganho de energia no metabolismo que utiliza o sulfalto, ocorre através do transporte de elétrons e fosforilação oxidativa. A via metabólica e energética da redução do H2S acontece de maneira semelhante aos mesófilos redutores de enxofre. 24 Figura 9 – Enzimas envolvidas na redução do sulfato a H2S. Enzimas: 1) ATP sulfurilase; 2) pirofosfatase; 3) Adenililsulfato (APS) redutase; 4) sulfito redutase. APLICAÇÕES A utilização de enzimas em escala industrial vem sendo ampliada anualmente. Após a descoberta das Archaea, o interesse das enzimas sintetizadas por arqueobacterias, ampliou a área de interesse das enzimas comerciais. Como no processo industrial as operações são conduzidas sob condições adversas principalmente, de temperatura e pH, as enzimas produzidas pelas Archaea, podem ser utilizadas nessas operações ou em etapas adicionais. Sempre com os objetivos de aumentar a eficiência dos processos industriais e reduzir os custos de produção. Atualmente, um dos grandes problemas enfrentados por pesquisadores é a condições dos ambientes para o crescimento das archabactérias selvagens. Entretanto, esse problema pode ser contornado quando se expressa essas enzimas em bactérias heterólogos, que mantém suas características originais ( Eicheler 2011 ). As enzimas sintetizadas por Archaea são conhecidas como extremoenzimas. Podem ser produzidas por linhagem de DNA recombinante, ou seja, a produção pode ser realizada sem a necessidade da cultura desses extremófilos. O gene, que consiste em uma parte específica do DNA, pode ser inserido no microrganismo “domesticados”, possibilitando a produção de clones para a produção de enzimas desejadas. Pesquisadores têm explorado duas possibilidades para avaliar o potencial desse microrganismo. O teste consiste na forma tradicional, ou seja, é realizado um cultivo desses microrganismos. Em seguida, verifica-se se 25 possuem a capacidade de produzir a enzima para a finalidade desejada. Caso apresente um resultado positivo, os genes responsáveis pela produção da proteína são codificados e isolados, assim, eles podem ser inseridos em outro hospedeiro. O outro método consiste em realizar o crescimento aleatório de extremófilos. Em seguidas o DNA é isolado e através de técnicas de DNA recombinante é inserido em hospedeiros dosmesticados. A partir do crescimento das colônias que contem o gene, é realizado experimentos para verificar a atividade dessas enzimas. TERMOENZIMAS Aplicação de enzimas em processos industriais aumenta cada vez mais nas industriais biotecnológicas (Battershy 1985). São utilizadas principalmente em processos de hidrólise. Uma parte significante do custo da produção da enzima é proveniente da manutenção da estabilidade enzimática. As termoenzimas são consideradas como um grande potencial para as indústrias farmacêuticas, alimentícias, química como também aplicadas no tratamento de efluentes. A utilização dessas enzimas apresenta vantagens quando aplicadas nos processos. As reações podem ser conduzidas sob temperaturas mais elevadas ditas extremófilos com temperatura ótima superior a 60°C, que proporciona aumento da taxa de infusão e solubilidade. Como conseqüência diminui a viscosidade e a tensão superficial do sistema. Isso ajuda na reduz de custos com o bombeamento, filtração, centrifugação, além de aumentar a taxa de transferência de massa. Verifica-se também no processo uma redução da contaminação microbiana de patógeno. O uso de temperaturas mais elevadas reduz a viscosidade de líquidos. Glicosil hidrolases Glicosil hidrolases são capazes de hidrolisar as ligações glicosídicas de dois carboidratos ou uma ligação entre carboidrato e não-carboidrato. Foram caracterizadas várias configurações α-glicosidases e β-glicosidases de arqueobacterias. 26 Amilases A enzima α-amilase hidrolisa a ligação α-1,4-glicosidica de maneira randômica produzindo glicose e oligossacarídeos. Estudos realizados com α-amilases de termofilos como Pyrococcus woesi, (Koch et al., 1991) e P. furiosus (Brown et al., 1990; Koch et al., 1990) verificaram que a temperatura ótima dessas enzimas é de aproximadamente 100°C. A maioria de termofilos produz pulanase II, que hidrolisa ligações α-1,6-glicosídicas. Os genes de P. furiosus e P. woesi foram clonados em células de E. coli, que expressaram a enzima (Ru¨diger et al., 1995; Dong et 1997). Em processos industriais a enzima é utilizada no processo de liquefação (Figura 10). O amido consiste em grânulos semicristalinos insolúveis, com baixa atividade enzimática. Inicialmente, o processo consiste no aquecimento do amido para aumentar a sua solubilidade. Condição fundamental para melhor atividade das enzimas. Figura 10 CELULASES A celulose, dentre os materiais naturais, é o biopolímero mais abundante do planeta (Bayer & Lamed 1992) e pode ser hidrolisada, por mecanismos químico ou enzimático, a glicose. A degradação microbiana da celulose é total e específica e tem estimulado o uso dos 27 processos iotecnológicos na área das fermentações de matérias-primas celulolíticas. Na natureza, esses processos representam a maior fonte de carbono no solo (Lynch et al. 1981). A hidrólise da celulose por celulases resulta na produção final de glicose. A enzima por ser proteína, não conseguem deslocar com facilidade, devido a barreira da lignina nas células dos vegetais. Portanto o difícil acesso destas enzimas às fibras de celulose constitui o principal problema para o processo da biodegradação do polímero. (Thiemann et al. 1980). Atualmente, a hidrólise da celulose tem tido destaque devido aos programas de energia renovável. A glicose produzida principalmente, na hidrolise enzimática da celulose pode ser utilizada na produção do biotetanol. Numa proposta de substituir a gasolina pelo etanol, como fonte de energia. Na indústria alimentícia, as celulases são usadas em vários processos, principalmente, na extração de: componentes do chá verde, purificação da proteína de soja, como também na purificação dos óleos essenciais e do amido da batata doce. Essas enzimas participam são utilizadas nos processos de produção do vinagre de laranja, do polímero Agar nutriente e na clarificação de sucos das frutas cítricas (Orberg 1981) Bauer et all (1999) verificaram a produção de endoglucanases por P. furiosus. Kegen et al (1993) verificou o crescimento desses extremófilos em celobiose e Voorhorst et al (1995) puderam expressar esses genes em E. coli.Outros estudos (Grogan, 1991) puderam verificar a produção de β-glicosidases estáveis em outros arqueobacterias. BIOEXTRAÇÃO DE MINÉRIOS Os minérios utilizados como metais são praticamente insolúveis em sulfitos, fazendose necessária a degradação dessas fontes para a liberação de íons. Caso essa concentração de minérios seja baixa, a extração por processo química é inviável quanto ao fator econômico. Portanto a biolixiviação é uma proposta interessante (Johson 1985). Estudos realizados verificaram que Sulfulobus spp conseguem lixiviar o metal em sulfito (Brierley& Brierley, 1986). As arquebacterias são extremamente termófilos, crescem a temperatura ótima de 80°C, o que acelera o processo de reação. Ademais são capazes de atacar a partícula de refratora de molibdênio que contem minérios de sulfito. O pH de 28 crescimento encontra-se na faixa de 2 a 4. Sob essas condições de acidez, o meio favorece a lixiviação de metais. Essas propriedades das linhagens de arqueobactérias de lixiviar os metais são considerados de grande interesse. Alguns estudos sobre a bioextração de minério utilizando metais preciosos como o ouro e prata foram realizados (Hutchins et all, 1988). Em processos semelhantes à bioextração, algumas arqueobactérias termoacidofílicas foram utilizadas para a retirada de enxofre do carvão vegetal. Processo conduzido com baixas perdas de energia (Kargi 1986). O carvão possui uma taxa de enxofre que varia de 1 a 10% na forma de pirita. A remoção de enxofre apresenta uma grande importância ambiental, pois sua remoção pode levar a menor influência em chuvas ácidas. A arqueobacteria Sulfolobus acidoaldarius apresentou um grande remoção de enxofre do carvão (Kargi 1986). A alta temperatura de operação (70°C) melhorou a taxa de oxidação química da pirita de enxofre pela oxidação do ferro metálico que é produzida por oxidação microbiológica da pirita metálica no carvão. BACTERIORHODOPSIN Bacteriorhodopsin de Halobacterium halobium é uma membrana integral de proteínas (membranas púrpuras) que consiste em uma única cadeia de polipeptídios contendo cromóforos retinais (Kusdner 1985). Os efeitos de da dependência de luz na translocação de prótons do interior para o exterior da célula geram um gradiente eletroquímica na membrana que será utilizado para a geração de ATP. Biotecnologicamente, espera-se que o uso de membranas artificiais possa gerar energia a partir do da luz solar (Prentis 1981). Embora o potencial para a produção de uma tecnologia de eletricidade a baixo custo, há problemas para ainda não solucionados. O bacteriorhodopsin deve ser preparado em um meio em que se permita apenas a passagem de prótons. Além disso, as moléculas das proteínas devem estar sob mesma orientação para que a passagem de prótons ocorra de maneira regular. No entanto, verificou-se que a membrana púrpura são bastante resistentes, podem ser renaturadas após drásticas desnaturações e as moléculas podem ser corretamente orientadas através da aplicação de uma corrente elétrica (Kungi et all, 1988). 29 Essa eletricidade gerada por estes microrganismos tem sido visto como um grande potencial para a produção de biochips para uma nova geração de computadores (Hong 1966). A sensibilidade a luz e a robustez da proteína fazem com que traga vantagens nessa área. Outra possível aplicação seria a utilização da membrana púrpura para a geração de água potável (Prentis 1981). A co-imobilização dos íons H+/Na+ no anteporte do bacteriorhodopsin na membrana possibilitaria o bombeamento dos íons através da membrana , possibilitando que a água seja dessalinizada. TRATAMENTO DE ÁGUAS RESIDUAIS No processo de oxidação da matéria orgânica em ambientes anaeróbicos ocorrem processos metabólicos de fermentação e respiração. Enquanto que na fermentação, a oxidação da matéria orgânica é realizada na ausência de um aceptor final de elétrons, na respiração são utilizados aceptores inorgânicos, tais como: NO3- (redução de nitrato), SO4-2 (redução de sulfato) ou CO2 (formação de metano). A digestão anaeróbica ocorre em etapas sequenciais, ou seja, representa um sistema ecológico que envolve processos metabólicos complexos. Esse sistema (figura) depende da atividades de alguns microrganismo: baterias fermentativas (ou acidogênicas), bactérias sintróficas (ou acetogênicas) e microrganismos metanogênicos. 30 Figura 11 - Como os microrganismos não são capazes de assimilar a matéria orgânica complexa é necessário que ela seja hidrolisada a compostos que possam ser transportado através da membrana citoplasmática e, no citoplasma as reações enzimáticas possam ocorrer. As bactérias fermentativas acidogênicas, covertem a matéria orgânica complexa (carboidratos, lipídeos, proteínas) por fermentação e hidrólise em compostos mais simples, principalmente ácidos orgânicos, alem de hidrogênio e dióxido de carbono. A hidrolise ocorre pela excreção de enzimas extracelulares, ocorrendo de maneira lenta, sendo que vários fatores como a temperatura, pH do meio, tamanho das partículas, composição do substrato, concentração de NH4+, e os produtos de hidrolise, podem afetar o nível de hidrolise do substrato ( Lettinga ET AL, 1996). Os microrganismos sintróficos acetogênicos convertem os compostos orgânicos intermediários, como o propionato e o butirato, em acetato, hidrogênio e dióxido de carbono. Esses microrganismos dependem da atividade dos metanogênicos. A formação de H2 faz com que o valor de ph decresça. Além de que a produção de acetato e butirato são termodinamicamente inibidas pela presença de concentrações baixas de hidrogênio. Por fim, os microrganismos metanogênicos convertem o acetato e hidrogênio produzidos na etapa anterior e os convertem em metano e dióxido de carbono. A produção de 31 metano é vista como uma alternativa limpa para a digestão de matéria orgânica que é degradas (Daniel 1984. Kirsop 1984). Aproximadamente 5,0 x 1015g de metano são liberados na atmosfera a cada ano. Do total cerca de 70% correspondem à produção biológica e o saldo é proveniente de emissões naturais, queima de biomassa e extração mineral. O uso de biogás passa a ser um recurso sob o aspecto econômico viável, devido a grande proporção de biogás produzido como também a fatores operacionais. Considerando que as arqueobacterias metanogênicas apresentam o metabolismo anaeróbio, reduzindo o custo de aeradores no processo. A otimização do processo de produção de biogás envolve os estudos de termodinâmica, cinética e o metabolismo de interação de microrganismos (Daniel 1984. Kirsop 1984). CONCLUSÃO As arquebactérias contribuíram para a sistemática dos organismos em três domínios Archaea, Eukarya e Bacteria. O estudo de ribossomos possibilitou verificar que estas possuem genes presentes tanto em eucarióticos como em bactérias, e através disso compreender melhor a ramificações das espécies. As bactérias classificadas no domínio Archaea são extemófilas porque possuem membrana citoplasmática e parede celular de composição química especial. Tais características conferem propriedades que permitem a exploração de vida em ambientes considerados inóspitos para a vida. A diversidade das arquebactérias quanto ao seu metabolismo e condições de crescimento classifica as bactérias nos grupos de halófilos, termófilos, psicrófilos, metanogênicos e as que oxidam os íons metálicos. São microrganismos que por desenvolver em diferentes nichos ecológicos são indicados para o tratamento de água com resíduos orgânicos e inorgânicos. Sintetizam uma variedades de enzimas que por apresentarem atividade enzimática ótima sob condição especial de temperatura e pH, são consideradas de grande potencial para a industrial. As principais enzimas comerciais produzidas por arquebactérias são as celulases, amilases e as utilizadas nas técnicas da biologia molecular como as polimerases e as enzimas de restrição. 32 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS BAUER MW, DRISKILL LE, CALLEN W, SNEAD MA, MATHUR EJ, KELLY RM. An Endoglucanase, Egla, From The Hyperthermophilic Archaeon Pyrococcus Furiosus Hydrolyzes Beta-1,4 Bonds In Mixed Linkage (1 3),(1 4)-Beta-D-Glucans And Cellulose. J Bacteriol 1999;181:284–90. BATTERSBY, A. R. 1985. Enzymes in Organic Synthesis. Ciba Foundation Symposia. 111(A. R. Battersby, chairman) Chichester; John Wiley. BAYER, E.A. & LAMED, R. 1992. The cellulose paradox: pollutant par excellence and/or a reclaimable natural resource? Biodegradation 3:171-188. 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