sintese de um mini-gene sintético capaz de expressar uma proteina

Seminário de Iniciação Científica da UNIFAL-MG – Edição 2012
Síntese de um mini-gene sintético capaz de expressar uma proteína
com potencial para o desenvolvimento de testes diagnósticos e vacina
para a Febre Aftosa
João Leite Costa Prado*1; Luiz Felipe Leomil Coelho1; Luiz Cosme Cotta Malaquias1
*[email protected]
1
Laboratório de Vacinas, UNIFAL-MG
Palavras-chave: Febre Aftosa, PCR Assimétrico, sequenciamento, diagnóstico, vacina.
Introdução
A Febre Aftosa é causada por um vírus não
envelopado, RNA fita única senso positiva
pertencente ao gênero Aphtovirus da família
Picornaviridae. O desenvolvimento de testes
diagnósticos e novas vacinas para a Febre Aftosa é
fundamental, pois é uma doença epidêmica,
altamente contagiosa que afeta bovinos, suínos e
ovinos. A proteína estrutural VP-1 encontrada no
vírus da Febre Aftosa se destaca por ser altamente
conservada entre os diferentes sorotipos e ter
probabilidade de alta ligação ao MHC. Desta forma,
objetivou-se em sintetizar um mini-gene sintético
construído através da análise computacional da
proteína imunogênica VP-1 com potencial para
desenvolvimento de novas vacinas e testes de
diagnóstico para a Febre Aftosa.
bases diferentes do esperado, gerando dois códons
de parada nas posições 51 e 60, levando a
produção de uma proteína com peso molecular
menor do que o esperado. O plasmídeo 2
apresentou um par de base (T para C) diferente da
sequencia
esperada
na
posição
79
e
consequentemente
um
aminoácido
diferente
também (Pro-Leu). O plasmídeo 3 apresentou a
sequencia idêntica da esperada contendo 320 pares
de base, sendo portanto capaz de sintetizar a
proteína esperada sem erros.
Metodologia (material e métodos)
O fragmento foi sintetizado através de quatros
reações de PCR Assimétrico pelo anelamento de
oito oligonucleiotídeos específicos. O fragmento
obtido foi clonado em plasmídeo de expressão de
proteínas pTrcHis (Invitrogen) e utilizados para
transformação de bactérias Escherichia coli TOP 10
por choque térmico. Os clones recombinantes foram
selecionados por PCR. Três colônias foram
selecionadas e os plasmídeos recombinantes
extraídos usando o Kit NucleoSpin. A sequência de
nucleotídeos foi obtida por sequenciamento e
analisada por programas de bioinformática para a
comparação com a sequência desejada.
Figura 1: PCR Assimétrico, para síntese do mini-gene.
Conclusões
Com a análise do sequenciamento dos três
plasmídeos pode-se perceber que o fragmento foi
sintetizado por PCR Assimétrico com sucesso. E
estudos futuros deverão ser conduzidos para a
expressão da proteína recombinante utilizando o
plasmídeo extraído do clone 3 que apresentou a
sequencia de nucleotídeos idêntica a desenhada
para conferir imunidade ao vírus da Febre Aftosa.
Agradecimentos
Resultados e discussão
Através das reações de PCR Assimétrico foi
possível sintetizar o gene artificial de 320 pares de
base. Através dos ensaios de sequenciamento e
analises de bioinformática obteve-se os seguintes
resultados, o plasmídeo 1 apresentou seis pares de
A CNPq, a FAPEMIG e a UNIFAL-MG
Referências bibliográficas
Liu X.; Wang Y.; Zhang Y.; Fang Y.; Pan L.; Lü J.; et al. Cloning,
codon-optimized expression and homology modeling of structural
protein VP1 from foot and mouth disease virus.2011