Doseamento do álcool etílico no sangue (Método de Widmark)

ETANOL
Trabalho n.º 1
Doseamento do álcool etílico no sangue
(Método de Widmark)
Propriedades físicas e químicas
O álcool é um líquido incolor, de odor característico.
Densidade – 0,8
Ponto de Ebulição – 78,5 oC
Solúvel na água em todas as proporções.
Formula química - CH3CH2OH
O etanol, como todos os álcoois, é um redutor, podendo ser oxidado de duas formas:
directamente por combustão completa, com formação de CO2 + H2O,
ou em duas etapas ( POR OXIDAÇÃO ENZIMÁTICA), com formação de aldeído
acético seguido do ácido acético, conforme o esquema seguinte:
CH3CH2OH →
CH3COH →
CH3COOH
O ÁLCOOL E O ORGANISMO
O TRAJECTO DO ÁLCOOL NO ORGANISMO
Absorção
O álcool ingerido passa através do esófago e chega ao estômago. Se o indivíduo está
em jejum, a absorção no estômago é praticamente nula, atingindo o intestino pouco
depois. Se o estômago está cheio, o álcool, é em parte absorvido lentamente através
das suas paredes, uma vez que permanece durante um certo tempo em contacto com
os alimentos, o álcool não absorvido passa para o intestino delgado, onde é absorvido
rapidamente.
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Transformações metabólicas do Álcool
Ao contrário dos Lípidos, Hidratos de Carbono e Proteínas, o álcool não é
armazenado nos órgãos, portanto é imediatamente metabolizado.
É no fígado que cerca de 95% do álcool é oxidado, os 5% restantes são metabolizados
noutros órgãos ( rins, cérebro e pâncreas).
Sabe-se que os efeitos tóxicos do álcool no fígado estão directamente relacionados
com o seu metabolismo, sendo por isso importante compreender as várias etapas do
seu metabolismo.
PRIMEIRA ETAPA: Transformação do Etanol em Acetaldeído
Existem 3 vias possíveis:
A) Via da álcool-desidrogenase (ADH)
É a via principal. A ADH, enzima cujo co-factor é o NAD, fica localizada no
citoplasma da célula hepática. Em condições normais permite a oxidação de 7 a 8 g de
Etanol por hora, ou seja, 100 mg por Kg de peso corporal por hora.
A reacção pode ser representada do seguinte modo:
CH3CH2OH + NAD+
CH3COH + NADH
Foram caracterizadas várias enzimas de ADH. Além disso é possível distinguir numa
população dois grupos de indivíduos geneticamente determinados em função da ADH
típica e os indivíduos com a ADH atípica, que possui in vitro uma actividade quatro a
cinco vezes superior. No entanto, in vitro, não há diferenças nítidas na eliminação do
Etanol.
B) Sistema de oxidação microssomal (SOM)
Pensa-se que este sistema oxida sensivelmente cerca de 20% do Etanol ingerido,
aumentando esta proporção com a importância do consumo de álcool. Tal como as
outras oxidações microssomais, este sistema é susceptível de ser induzido.
A reacção pode ser representada do seguinte modo:
CH3COH +NADP+ + 2H2O
CH3CH2OH + NADPH + O2
Este sistema (SOM) é pouco específico, permitindo o metabolismo de numerosas
substâncias, tais como medicamentos ou tóxicos industriais.
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C) Via catalase
Esta via intervém pouco frequentemente em indivíduos normais, adquirindo maior
importância no alcoolismo crónico, devido a uma adaptação enzimática induzida pelo
Etanol.
A reacção pode se representada do seguinte modo:
CH3CH2OH + H2O2
CH3COH + H2O2
SEGUNDA ETAPA : Catabolismo do Acetaldeído
O Acetaldeído produzido na oxidação do Álcool (1ª etapa) é em seguida oxidado,
transformando-se em Ácido Acético que se encontra sob a forma de Acetil-CoA. A
reacção necessita da presença de ADH ( aldeído desidrogenase) e NAD+.
CH3COH + NAD+ + H2O
CH3COOH + NADH + H+
TERCEIRA ETAPA : Degradação do Ácido Acético
O ácido Acético , sob a forma de Acetil-CoA, pode seguir duas vias:
I)Degradado no ciclo de Krebs com a formação de água e dióxido de carbono
II) Utilizado na síntese de colesterol e ácidos gordos.
CH3COOH + ATP,CoA
AMP,Ppi + CH3CoA
(Acetil-CoA)
Ciclo de Krebs
CO2 + H2O
Síntese de Ác. gordos e colesterol
ALCOOLÉMIA
A alcoolémia define-se como a concentração de álcool no sangue, expressa em g/l.
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A alcoolémia varia em função do tempo, ela aumenta rapidamente à medida que se dá
a absorção, diminuindo depois lentamente durante a degradação do álcool no fígado.
A alcoolémia resulta do equilíbrio a dado momento entre a absorção, a oxidação e a
eliminação do álcool.
Observando a curva de alcoolémia pode-se verificar que varia em função do tempo e
aumenta à medida que se dá a absorção, diminuindo depois lentamente durante a
degradação do álcool no fígado.
Alcoolémia
1,0
0,8
PERIGO
0,6
0,4
0,2
0,0
1
2
3
4
5
6
7
Tempo ( horas)
A curva de alcoolémia varia com uma série de parâmetros tais como: variações
individuais (ex.: peso, sexo ou estado geral do indivíduo), existência ou não de
alimentos no estômago e com as características de bebida ingerida.
IMPORTÂNCIA DA DETERMINAÇÂO DA ALCOOLÉMIA
A determinação da taxa de alcoolémia é a melhor maneira de apreciar o estado de
intoxicação alcoólica de um indivíduo.
Segundo a chamada “Lei do Álcool”(Dec. Lei n.º 3782 de 29 de Março) a
determinação da alcoolémia é o método oficial de análise. A lei pune os condutores
cuja taxa de alcoolémia for superior a 0,5 g/L.
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INTOXICAÇÃO ALCOÓLICA AGUDA
Aspectos clínicos
Esta intoxicação provoca toda uma série de perturbações que evoluem em três fases:
I)
Fase de Excitação
Esta fase corresponde a um período de euforia, ausência de inibições psíquicas e
também a uma diminuição do próprio controlo. Em alguns casos, a excitação do
indivíduo corresponde a um exacerbamento da agressividade e do instinto sexual,
podendo transformar-se num indivíduo perigoso. O indivíduo não tem consciência do
seu estado, o que constitui uma fonte de acidentes quer ao volante de um automóvel
quer no local de trabalho. Há na realidade uma diminuição das capacidades visuais e
auditivas e do tempo de reacção.
II)
Fase de incoordenação
Os movimentos voluntários tornam-se difíceis de executar. Há incoerência na
conversa e o indivíduo apresenta-se em estado de confusão mental.
O álcool provoca uma analgesia mais ou menos forte, tornando o indivíduo
embriagado pouco sensível a quedas e golpes. O estado de embriaguez pode terminar
aqui por uma fase de sono mais ou menos profundo. Ao acordar o indivíduo sente
dores de cabeça, náuseas e indisposição. Se estes sintomas não são observados é
porque a intoxicação é mais grave podendo o quadro clínico alterar-se
progressivamente com o aparecimento de palidez com bradicardia e miose.
III)
Fase de coma
A fase de sono pode ir até ao coma. Nesta altura o indivíduo torna-se insensível às
excitações exteriores, os reflexos desaparecem, pode observar-se midríase,
relaxamento dos esfíncteres e diminuição da temperatura central.
O grau de intoxicação é função da alcoolémia.
Para valores muito baixos (0,2 a 0,3 g/L), já aparecem modificações sensoriais,
motoras e psíquicas, como se ilustra no quadro seguinte:
TAXA DE ALCOOLÉMIA
0,1
0,15
0,6
1,0
1,5
2 a 2,2
4,0
5a7
OBSERVAÇÕES
Não se observam alterações
Controlo motor ligeiramente atingido
Prolongamento do tempo de reacção
Taxa crítica: Prolongamento do tempo de reacção
Aparecimento de incoordenação motora
Prolongamento do tempo de reacção auditivo e óptico
Perturbações neuro-sensoriais nítidas
Embriaguez clínica em 50 % dos indivíduos
Embriaguez evidente em 100 % dos indivíduos
Coma
Morte
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ALCOOLISMO CRÓNICO
O alcoolismo crónico é mais discreto que o agudo. No início é ignorado ou
inconsciente, mas é uma forma particularmente perigosa para a saúde.
O alcoolismo crónico ou etilismo pode resultar da repetição de crises de embriaguez,
ou do consumo excessivo de bebidas alcoólicas durante numerosos anos. Enquanto
que a intoxicação ocasional é reversível, a absorção regular de álcool pelo organismo
durante um longo período, vai originar graves repercussões metabólicas e lesões em
numerosos órgãos, como o aparelho digestivo, sistema nervoso, aparelho
cardiovascular, pulmões, glândulas hormonais e sexuais.
No aparelho digestivo observam-se efeitos negativos a nível do esófago, estômago,
fígado e pâncreas. A absorção do álcool através da mucosa estomacal vai intervir
sobre a motricidade e secreção do estômago. No fígado, uma sobrecarga dos
hepatócitos conduz a necrose celular e a perturbação no metabolismo dos hidratos de
carbono, de proteínas e dos lípidos. O etanol desempenha ainda um importante papel
nas pancreatites crónicas.
No que respeita ao sistema nervoso, as consequências do alcoolismo crónico são
igualmente bastante graves. O alcoolismo crónico é responsável por uma alteração
progressiva da personalidade, por lesões e perturbações encefálicas, polinevrites e
lesões oculares.
O conceito e função da bebida alcoólica têm evoluido ao longo dos tempos,
actualmente o aumento do consumo de álcool a nível da população mundial tem
“levantado” diversos problemas de ordem social que se tornaram num tema de debate
frequente, tal como o consumo de drogas de abuso.
As tabelas seguintes têm por objectivo informar da percentagem de álcool existente
nas bebidas de maior consumo.
BEBIDAS
Cerveja de barril
Cerveja de garrafa
Vinhos correntes
Licores
Brandy
Whisky
Rum
% DE ÁLCOOL
2,5 a 3
3,5 a 5
10 a 16
39 a 43
40 a 47
45 a 50
50 a 55
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TIPO DE RECIPIENTE
Imperial
Garrafa de cerveja
Copo de vinho tinto
Copo de Whisky
Copo de Cognac
CAPACIDADE (ml)
200
200
70
60
35
CONTEÚDO DE ÁLCOOL (ml)
5
8
9
30
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Toxicologia analítica
A determinação de álcool etílico é das análises mais frequentes solicitadas nos
laboratórios de Toxicologia. O seu interesse situa-se em três âmbitos diferentes:
I)
II)
III)
Estas determinações interessam aos agentes da autoridade para controlo do
estado de sobriedade dos condutores e assim sancionar aqueles cuja taxa de
alcoolémia seja superior a 0,5 g/L.
Interessam às empresas, quer as que utilizam como análise de rotina para
terem conhecimento se os seus funcionários estão ou não a trabalhar sob
influência do álcool, quer às que as utilizam somente em casos de distúrbios e
acidentes de trabalho.
O apuramento da taxa alcoolémia interessa sobretudo à Toxicologia Forense.
Recolha da amostra
Para determinar a concentração de álcool no sangue recorre-se normalmente à colheita
de 3 tipos de amostra: sangue, ar expirado e urina
SANGUE
No que diz respeito à recolha desta amostra biológica temos que destacar dois casos:
Recolha de sangue em condutores de veículos ou funcionários de empresas;
Recolha de sangue post-mortem.
Em qualquer dos casos, antes da recolha da amostra de sangue, a área da pele deve ser
desinfectada com um anti-séptico, como por exemplo, uma solução aquosa de cloreto
de mercúrio1:1000.
O álcool, como é evidente, não deve ser utilizado.
Depois de recolhida, é adicionado um anticoagulante à amostra de sangue. Se a
amostra não é analisada imediatamente, o anticoagulante a usar é o fluoreto de sódio,
pois além de ser um anticoagulante é também um conservante. A amostra deve ser
mantida à temperatura de 4 oC.
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Quando a determinação do álcool é feita em cadáveres (ex.: caso de mortes na
estrada), a recolha de sangue é feita a partir do coração, normalmente sem ser feita na
autópsia. A amostra recolhida nestas condições pode ser realmente “sangue do
coração” ou somente um fluido do organismo resultante de danos que provocaram a
morte, os resultados podem assim ser totalmente falsos. Obviamente, quanto maior for
o traumatismo sofrido, incluindo ruptura de órgãos, maior será o erro cometido ao
analisar a tal amostra de sangue. Neste caso, e acompanhando a determinação da
concentração de álcool no sangue deveria ser feita uma análise da composição total da
amostra, ou testes que confirmem que se trata de uma amostra normal de sangue que
vai ser analisada. Mesmo quando são executadas autópsias, é pratica comum a recolha
de uma única amostra de sangue, proveniente do coração intacto.
A prática que é seguida e aconselhada pelos patologistas é a recolha de várias
amostras de sangue. Assim, deveria ser recolhido sangue do lado esquerdo do coração
quando intacto e das veias femural e cubital, para que possa ser confirmada a
distribuição de álcool no sangue através do organismo.
Um alto teor de álcool no estômago de um cadáver pode causar difusão do mesmo a
partir do conteúdo estomacal, para o fluído pericardial e algumas vezes para o sangue
do coração. Analisando os resultados de vários estudos feitos, verificamos que as
opiniões não coincidem. Enquanto que alguns autores concluem que há um aumento
nítido de álcool no fluído pericardial e no sangue do coração proveniente de uma
difusão do estômago, outros há que afirmam que esta migração post-mortem do álcool
é pouco significativa.
As amostras de sangue devem ser recolhidas do cadáver o mais cedo possível, ou,
caso contrário, este deve ser armazenado imediatamente em câmara frigorífica. Este
princípio deve ser sempre cumprido a fim de obtermos os resultados que
correspondam ao valor inicial da alcoolémia. Se estas condições não forem
verificadas vão aparecer alterações deste valor devido a uma destruição ou
neoformação de álcool post-mortem resultante da fermentação nos vários tecidos.
URINA
A determinação da concentração de álcool na urina poderá ter interesse nos casos em
que não seja possível a obtenção de uma amostra de sangue, como é o caso de
indivíduos para quem esta recolha possa ser gravemente prejudicial à saúde
AR EXPIRADO
Á medida que os aparelhos de análise de ar expirado se vão aperfeiçoando, vai
havendo crescente confiança nos resultados dos novos analisadores.
Antes da recolha da amostra de ar expirado recomenda-se a lavagem da boca com
água. Esta amostra é normalmente analisada imediatamente depois da recolha, mas
pode ser armazenada durante cerca de duas horas num saco de cloreto de polivinilo ou
de alumínio flexível.
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Determinação da alcoolémia
Podemos considerar dois grupos de técnicas:
Métodos directos (análise de sangue);
Métodos indirectos (análise de outros produtos biológicos, principalmente ar
expirado).
Métodos directos
Dentro destes métodos podemos distinguir: Métodos clássicos;
Métodos recentes.
Métodos clássicos
A reacção de ANSTIE é a base de numerosos métodos para doseamento do álcool,
mais conhecidos por “Métodos do Dicromato”.
Em 1863, Anstie reparou que o reagente que veio mais tarde a adoptar o seu nome (1g
de K2Cr2O7 dissolvido em 300 ml de H2SO4 concentrado) virava de amarelo para
verde azulado à temperatura ambiente, quando se faz borbulhar através dele ar que
passou primeiro através de uma solução aquosa diluída de álcool ou uma urina de um
indivíduo obtida pouco depois da ingestão de uma bebida alcoólica. Esta mudança de
cor é consequência da redução do dicromato, cujo ião crómio sofre uma variação de
valência +6 para +3, devido à oxidação do álcool a ácido acético.
Mais tarde surgiram uma série de variações do método de Anstie, variações essas que
envolviam o uso de ácido sulfúrico (em diversas concentrações), com o aumento da
temperatura inicial e finalmente a determinação quantitativa do dicromato ou do ácido
acético.
De entre os métodos que se baseiam na reacção de Anstie, talvez o mais conhecido
seja o “MÉTODO DE WIDMARK”.
Este método vai ser efectuado durante as aulas práticas e será discutido com mais
pormenor no final desta introdução.
Os métodos da ”CÉLULA DE CONWAY” também se fundamentam na mesma
reacção. Esta reacção passa-se numa célula (célula de Conway) em que na parte
central é colocado o dicromato e na parte lateral o sangue e uma solução saturada de
carbonato de sódio. O álcool existente no sangue é separado deste por um processo
de difusão, sucedendo depois a reacção já descrita anteriormente.
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Os dois tipos de métodos que utilizam a célula de Conway podem ser:
Semi-quantitativos – teste diz-se positivo se se verificar uma mudança de
coloração na solução de dicromato existente na parte
central da célula;
Quantitativo – Lê-se no espectrofotómetro a absorvância do dicromato.
O “MÉTODO DO PERMANGANATO DE FRIEDMAN E KLAAS” é outro método
clássico. Neste método o álcool é separado por intermédio de uma destilação. Parte do
destilado é misturado com permanganato de potássio e hidróxido de sódio e aquecido
a 100 oC durante 20 minutos. Depois de arrefecido e acidificado, o excesso de
permanganato é determinado por iodometria.
MÉTODOS RECENTES
Método Enzimáticos
Estes métodos baseiam-se na oxidação do etanol na presença de uma enzima álcooldesidrogenase (ADH) e de difosfopiridina nucleótido (DPN) segundo a reacção:
CH3CH2OH + DPN
→
CH3CHO + DPNH2
Para impedir a reversibilidade da reacção pode ser adicionada semicarbazina
(NH2NHCONH2) para combinar com o acetaldeído e um tampão para manter o pH
entre 8,6 e 9,6. O DPNH2 formado é depois determinado no espectrofotómetro.
Quanto à preparação da amostra, podemos referir que o soro pode ser utilizado
directamente, mas o sangue total tem de ser primeiro destilado ou desproteinizado.
O método enzimático apesar de ser considerado um método específico, não apresenta
uma especificidade absoluta, pois a enzima ADH, para além de reagir com o etanol,
reage também com o isopropanol e com o butanol, embora com estes últimos a taxa
de oxidação seja muito menor do que com o etanol.
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Cromatografia de fase gasosa
A cromatografia de fase gasosa é um método analítico em que é possível a
determinação do álcool por diversas técnicas:
Injecção líquida(após desproteinização ou diluição do sangue);
Injecção gasosa(Headspace).
Na técnica de “headspace”, a concentração de álcool na fase gasosa está
correlacionada com a concentração do mesmo no sangue, segundo a lei de Henry.
Depois de conhecida a concentração de álcool na fase gasosa e sabendo o coeficiente
de partilha, facilmente se calcula a concentração do mesmo no sangue.
O frasco é colocado em banho-maria a uma determinada temperatura, durante um
intervalo de tempo, de modo a que o álcool existente na amostra entre em equilíbrio
com a fase gasosa.
A cromatografia de fase gasosa é um método altamente específico e de grande
sensibilidade e rigor, sendo o mais utilizado em estudos de avaliação da credibilidade
quer de técnicas mais recentes quer dos métodos clássicos.
Célula de Combustível
Este aparelho (Alcoómetro AE-DI) utiliza uma célula electroquímica de combustível
para detectar e medir a concentração de álcool no vapor de “headspace” acima da
amostra de sangue ou no ar expirado. Neste sistema, o álcool existente na amostra é
electro-quimicamente oxidado a ácido acético em presença do eléctrodo de platina, na
célula de combustível. Esta reacção liberta electrões a partir da molécula do álcool,
formando um fluxo de electrões que produz uma variação de voltagem através de uma
resistência externa. Esta voltagem é directamente proporcional à concentração de
álcool no vapor “headspace”, o qual, por sua vez, está em equilíbrio com a
concentração do álcool no fluído, segundo a lei de Henry.
O resultado é fornecido em termos de taxa de álcool no sangue em unidades
escolhidas até um mínimo de 0,01 mg/ml.
Esta técnica tem ainda a vantagem de ser rápida, uma vez que não necessita de
tratamento prévio da amostra e requer apenas 1 a 2 minutos entre amostras sucessivas.
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Este é o método que foi aprovado para a determinação directa de alcoolémia no
âmbito da lei Portuguesa.
MÉTODOS INDIRECTOS
Todos os testes do álcool no ar expirado se baseiam no princípio de que a distribuição
do álcool entre o sangue e o ar alveolar obedece à lei de Henry.
Estes testes compreendem técnicas rápidas, não invasivas e que têm a vantagem de
poderem ser utilizadas na estrada por agentes da autoridade, não necessitando da
presença de médicos ou técnicos de laboratório.
Os analisadores de ar expirado podem ser classificados em 2 grupos. Esta
classificação está relacionada com a precisão, especificidade e rigor dos resultados
obtidos, assim temos os Analisadores de Triagem e os Analisadores Formais.
Analisadores de Triagem
São sistemas simples, cómodos e geralmente portáteis, mas os resultados podem
conter uma margem de erro que os torna inadequados na prova legal definitiva da taxa
real de alcoolémia. São utilizados na vigilância das estradas, tornando-se necessário a
utilização de métodos mais rigorosos sempre que o ar expirado do condutor revelar
um teor de álcool superior à taxa limite.
Analisadores Formais
Estes aparelhos, embora alguns deles se baseiem em princípios idênticos aos dos
Analisadores de Triagem, são mais rigorosos pois sofrem alguns aperfeiçoamentos
técnicos. Apesar do maior rigor, não são normalmente utilizados na vigilância das
estradas, pois a maioria requer fornecimento externo de energia.
Metodologia a utilizar na aula prática
Método de Widmark
É um micro-método valorosíssimo quando se tem que trabalhar com pequenos
volumes de sangue.
Neste método, o álcool é separado do sangue por intermédio de difusão no frasco de
Widmark, em banho-maria à temperatura de 60 oC e durante duas horas. Depois de
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retirado o frasco do banho, o excesso de dicromato que não é reduzido pelo álcool é
titulado por Iodometria.
O método de Widmark não é específico, há centenas de compostos orgânicos que
poderão causar a redução do dicromato na presença de ácido sulfúrico concentrado.
No entanto, grande parte destes compostos não são voláteis. Os que são voláteis,
como o éter, clorofórmio e alguns solventes industriais reduzem o dicromato muito
lentamente, e, para além deste facto, a concentração destes compostos no sangue,
provocaria no indivíduo uma grave intoxicação ou mesmo a morte.
REACÇÕES:
3 C2H5OH + 2 K2Cr2O7 + 8 H2SO4
H 2O
→ 3 CH3COOH + 2 Cr2(SO4)3 + K2SO4 + 11
(x2) K2Cr2O7 + 6 KI + 7 H2SO4 → Cr2(SO4)3 + 4 K2SO4 + 7 H2O +3 I2
(x2) 3 I2 + 6 Na2S2O3 → 3 Na2S4O6 + 6 NaI
Apuramento de resultados
PM (Etanol) =46
3 C2H5OH ⇔ 12 Na2S2O3
PM Etanol / 4=46/4=11,5
C2H5OH ⇔ 4 Na2S2O3
÷3
Na2S2O3 ⇔ PM C2H5OH / 4
Solução de Hipossulfito 0,01 N
÷4
0,01 eq Na2S2O3⇔ 1000 ml
1 eq ⇔ V ml
1 equivalente de Na2S2O3 em V= 105 ml
105 ml Na2S2O3 (N /100) ⇔ 11,5 g
V B - VA ⇔ X
( VB ml - VAml) Na2S2O3 ⇔ X g/álcool em 0,2 ml de sangue
X g  0,2 ml (toma de ensaio)
Y
 1000 ml
Y = Quantidade de álcool em g /L
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