Apresentação - Esalq

Programa de Pós-Graduação em
Genética e Melhoramento de Plantas
LGN 5799 - SEMINÁRIOS EM
GENÉTICA E MELHORAMENTO DE PLANTAS
Fungos mutualistas x patogênicos:
Genômica estrutural e sua contribuição para o
entendimento das relações fungo-planta
Doutoranda: Léia Cecília de Lima Fávaro
Orientador: Dr. Welington Luiz de Araújo
Departamento de Genética
Avenida Pádua Dias, 11 - Caixa Postal 83, CEP: 13400-970 - Piracicaba - São Paulo - Brasil
Telefone: (0xx19) 3429-4250 / 4125 / 4126 - Fax: (0xx19) 3433-6706 - http://www.genetica.esalq.usp.br/semina.php
Discuta, do ponto de vista evolutivo, o fato de que
um microrganismo endofítico pode se tornar
patogênico.
(Exame de Qualificação)
Tema do seminário
Fungos mutualistas x patogênicos:
Genômica estrutural e sua contribuição para o
entendimento das relações fungo-planta
SUMÁRIO
Genomas: aspectos gerais
Fungos: importância
Simbiose entre plantas e fungos
Mutualismo X Parasitismo
Análise genômica comparativa:
evolução da fitopatogenicidade
Considerações / Desafios /
Perspectivas
Genomas: aspectos gerais
Algumas definições...
Genômica
Estrutural
O genoma de um organismo
representa o complemento
total de genes e é portanto,
um estoque de informação
biológica
independente
do
contexto.
Genômica
Funcional
Uma
abordagem
holística
(baseada em sistemas) para
estudar o fluxo de informação
dentro de uma célula;
Aplicação de métodos de alto processamento e
tecnologias automatizadas à biologia, permitindo
análise funcional do genoma, proteoma e
metaboloma de um organismo.
Transcriptoma
Proteoma
Metaboloma
Contêm informação biológica
altamente dependente do
contexto - dinâmica
Talbot (2003)
Genomas: aspectos gerais
Genomas completamente seqüenciados
Junho = 819
Janeiro 2008
Publicados
Fonte: http://www.genomesonline.org
Genomas: aspectos gerais
Projetos de seqüenciamento de genomas
Janeiro 2008 – 3520 projetos
Junho = 3823
Fonte: http://www.genomesonline.org
Genomas: aspectos gerais
Projetos de seqüenciamento de acordo com o grupo
filogenético - Janeiro 2008
Fonte: http://www.genomesonline.org
Genomas: aspectos gerais
Grupos de eucariotos com projetos genoma
Janeiro 2008
Fonte: http://www.genomesonline.org
Genomas: aspectos gerais
Análise genômica
comparativa de todo um
reino eucariótico
van Baarlen et al (2007)
Base genética e
evolutiva dos
diferentes estilos de
vida dos fungos
patogênese
mutualismo
saprofitismo
Acúmulo de
seqüências
genômicas
Ferramentas de
bioinformática e de
genômica funcional
microarranjos
proteoma
metaboloma
Um melhor entendimento da biologia de fungos não somente
facilita o uso inteligente dos fungos benéficos, mas também
permite avanços no controle de espécies patogênicas.
Fungos: importância
Organismos Modelo
1941: Teoria
um gene, uma enzima
Neurospora crassa
Prêmio Nobel em 1958: Beadle, Tatum e
Lederberg - Estudos pioneiros com o fungo
Neurospora e a bactéria E. coli.
Genética Bioquímica
George W. Beadle
1996: Primeiro organismo eucariótico a ter o genoma
seqüenciado
Levedura -
Saccharomyces
cereviseae
Fungos: importância
Produção de fármacos:
penicilina, cefalosporina,
taxol, proteínas heterólogas
Produção
de álcool
Indústria
Produção
de vinhos
Produção de ácidos
orgânicos – ácido cítrico
Controle biológico de insetos praga
Cogumelos comestíveis
Fungos: importância
Em contraste aos benefícios...
Patógenos de animais e plantas
Antracnose do milho –
Ferrugem asiática na soja -
Colletotrichum graminicola
Phakopsora pachyrhizi
Carvão do milho –
Vassoura de bruxa do cacau-
Mancha preta do Citrus –
Ustilago maydis
Crinipellis perniciosa
Guignardia citricarpa
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
A simbiose entre fungos e plantas é um
fenômeno amplamente distribuído na natureza.
O resultado desta interação pode variar
mutualismo - comensalismo - parasitismo
Continuum simbiótico
Na maioria dos casos, a planta hospedeira não sofre
danos, e de fato, pode ter vantagem com a colonização
pelo fungo. Exemplo: micorrizas e fungos endofíticos
Kogel et al (2006)
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
Associação micorrízica: Interação mutualística entre fungos e
raízes de plantas – mais intensamente estudada.
Endomicorriza (Micorriza Arbuscular)
Filo Zigomicetos
Ectomicorriza
Principalmente Basidiomicetos
Ampla ocorrência em
todos os ecossistemas
Surgimento das plantas
terrestres (460 m.a.)
Espécies arbóreas - florestas
Biotróficos
Brundrett (2001)
Reinhardt (2007)
Douglas fir e Laccaria bicolor.
Martin et al (2001, 2008)
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
Anatomia de uma raiz com micorriza arbuscular.
Siqueira et al (2002)
Ipê: sem e com micorriza.
Siqueira et al (2002)
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
Continuum simbiótico
mutualismo - comensalismo - parasitismo
Comensalismo e Mutualismo: Requerem um balanço
sofisticado (sob controle genético, fisiológico e ambiental) entre
as demandas do fungo e a resposta de defesa da planta.
Se a interação torna-se desbalanceada: os sintomas de
doença aparecem ou o fungo é excluído pelas reações de defesa
da planta hospedeira.
Interações microrganismo-planta
Doença é exceção
Considerada como um
status desbalanceado
da simbiose
Kogel et al (2006)
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
Triângulo da doença. Interações compatíveis entre um patógeno e o
hospedeiro somente resultam em doença se as condições ambientais
forem favoráveis. van Baarlen et al (2007)
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
Para ilustrar como esta relação é complexa:
A colonização de diferentes hospedeiros pode
fazer com que um fungo adote estilos de vida
contrastantes.
Mutações em genes únicos: Mudanças no estilo de vida do fungo
patogênico para mutualista
ou
mutualista para patogênico
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
Science 2 April 1993: Vol. 260. no. 5104, pp. 75 - 78
Genetic Conversion of a Fungal Plant Pathogen to a
Nonpathogenic, Endophytic Mutualist
Stanley Freeman and Rusty J. Rodriguez
Department of Plant Pathology, University of California, Riverside, CA 92521
Fungo ascomiceto Colletotrichum magna – antracnose em
cucurbitáceas (melancia) - hemibiotrófico
Objetivos:
Analisar
a
genética
envolvida
patogenicidade e na especificidade ao hospedeiro.
na
Obtenção de mutantes (UV) – um mutante não patogênico (path-1)
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
Science 2 April 1993: Vol. 260. no. 5104, pp. 75 - 78
Genetic Conversion of a Fungal Plant Pathogen to a Nonpathogenic, Endophytic Mutualist
Stanley Freeman and Rusty J. Rodriguez
Department of Plant Pathology, University of California, Riverside, CA 92521
Seedlings melancia após 10 dias da
inoculação (selvagem, mutante, mutante +
selvagem)
Monitoramento da colonização do selvagem
e path-1. Atraso na colonização.
Path-1: compatível para incompatível Reconhecimento do patógeno pela planta
?
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
Science 2 April 1993: Vol. 260. no. 5104, pp. 75 - 78
Genetic Conversion of a Fungal Plant Pathogen to a Nonpathogenic, Endophytic Mutualist
Stanley Freeman and Rusty J. Rodriguez
Department of Plant Pathology, University of California, Riverside, CA 92521
E a gama de hospedeiros do mutante é igual à
do selvagem?
Mutante path-1 protege
seedlings de melancia contra o
patógeno Fusarium
oxysporum f. sp. niveum
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
Science 2 April 1993: Vol. 260. no. 5104, pp. 75 - 78
Genetic Conversion of a Fungal Plant Pathogen to a Nonpathogenic, Endophytic Mutualist
Stanley Freeman and Rusty J. Rodriguez
Department of Plant Pathology, University of California, Riverside, CA 92521
Esporulação, Adesão dos conídios, Formação de apressório,
Infecção e Gama de hospedeiros
Mutante não
patogênico path-1:
=
Tipo
selvagem
Um fungo fitopatogênico pode ser modificado por mutação para
crescer como um endofítico não patogênico (um único gene)
A genética envolvida na patogenicidade e na especificidade ao
hospedeiro é diferente.
Um patógeno pode expressar estilos de vida simbiótico não patogênico
Reavaliação da função dos fungos na estrutura e
dinâmica de comunidades vegetais
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
Fungo endofítico Epichloe festucae e Lolium perenne (gramínea )
Tolerância stress biótico
Crescimento
Objetivos: Screening de mutantes - busca de genes simbióticos
Isolaram um mutante que alterou a interação:
mutualística
parasítica
gene NoxA: NADPH oxidase
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
Análise citoquímica: produção
de ROS foi reduzida no mutante
Expressão de PR
proteínas em
Lolium colonizadas
com selvagem e
mutante noxA
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
Mudança de mutualismo para parasitismo pela
mutação em um único gene do fungo.
Nova função para
interação mutualista.
ROS
na
regulação
da
Mecanismo da simbiose:
Produção de ROS pelo gene noxA de Epichloe in planta
regula negativamente o desenvolvimento e ramificação
das hifas, prevenindo a colonização excessiva do tecido
vegetal.
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
O que faz um fungo ser patogênico?
No reino Fungi, a capacidade de causar doenças em plantas parece ter originado
múltiplas vezes durante a evolução. Berbee (2001)
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
Capacidade de fenótipo complexo
diversidade
na
biologia
de
causar doença: desenvolvimento e tipos de sintomas
Cada espécie patogênica tem evoluído uma
maneira especial para invadir as plantas e
causar doença.
Uma vez dentro da planta, três estratégias de
colonização
são
empregadas
(para
o
crescimento e desenvolvimento):
necrotrofia
biotrofia
hemibiotrofia
Simbiose entre plantas e fungos - Mutualismo X Parasitismo
Identificação de genes envolvidos na patogenicidade:
vias, proteínas e
genes do processo
patogênico
Alvos no fungo para controle
(fungicidas ou drogas antifúngicas)
químico
Alvos no hospedeiro podem ser modificados
para reduzir sua susceptibilidade ao
patógeno (plantas geneticamente modificadas)
http://www.phi-base.org/
Sumário do número de espécies e genes envolvidos na
patogenicidade
Winnenburg
et al (2008)
Análise genômica comparativa: evolução da
fitopatogenicidade
Disponibilidade
de seqüências
genômicas
Diferenças entre
patógenos e não
patógenos ao nível
genômico
É possível identificar mecanismos
moleculares comuns associados com
espécies de fungos que causam
doenças em plantas?
Análise genômica comparativa: evolução da
fitopatogenicidade
Genomas de fungos e oomicetos fitopatogênicos disponíveis publicamente
Soanes et al (2007)
Análise genômica comparativa: evolução da
fitopatogenicidade
Published June 4, 2008
Background - Introdução
Fungos e oomicetos patogênicos: diversidade de doenças e desafio
para o desenvolvimento de estratégias de controle duráveis.
Principal objetivo da pesquisa atual: identificar mecanismos
moleculares necessários para patogênese em várias espécies.
Análise genômica comparativa: evolução da
fitopatogenicidade
Background - Introdução
Esforços para identificação
patogenicidade:
Mutação – deleção gene alvo
de
determinantes
de
Alteração do fenótipo
Somente para poucos fungos fitopatogênicos (modelo)
Estudar um gene de cada vez:
Processos governados por muitos genes (haustório)
Patógenos biotróficos (não cultivados)
Comparação de genomas de fungos
patogênicos e não patogênicos
Análise genômica comparativa: evolução da
fitopatogenicidade
Comparação de 36 genomas de espécies diferentes (34 fungos e 2 oomicetos)
Identificação de grupos de
genes ortólogos
Identificação de famílias de
proteínas (Pfam)
(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)
Identificação de proteínas
secretadas (secretoma)
(SignalP 3.0/WoLF PSORT)
Análise comparativa de
ascomicetos
fitopatogênicos e
saprófitos
Análise genômica comparativa: evolução da
fitopatogenicidade
Resultados
Agrupamento de seqüências: Todas as proteínas preditas
de 36 espécies foram agrupadas por MCL (Markov Chain
Clustering).
348.787 proteínas
Um total de 282.061 proteínas
preditas foram agrupadas em
23.724 clusters
Cada cluster representando
um grupo de genes
ortólogos putativos
http://www.e-fungi.org.uk
Análise genômica comparativa: evolução da
fitopatogenicidade
Resultados
fitopatogênicos X não patogênicos: genômica
comparativa
Não existem fatores de
patogenicidade conservados em e
específicos à todas as espécies de
fitopatógenos.
As diferenças são devidas à expansão
de certas famílias de genes nos
genomas de espécies fitopatogênicas
associadas com funções necessárias
para a patogênese
Análise genômica comparativa: evolução da
fitopatogenicidade
Resultados
fitopatogênicos X não patogênicos: genômica
comparativa
Famílias de proteínas que foram pelo menos duas vezes mais
comuns nos proteomas de fitopatógenos do que nos saprófitos:
Vias de metabolismo secundário:
Proteases e peptidases:
Enzimas degradadoras de parede celular:
NLPs: disparam respostas de defesa, necrose e
morte celular em plantas, podem agir como
fatores de virulência
Catabolismo de compostos tóxicos:
Análise genômica comparativa: evolução da
fitopatogenicidade
Resultados
Análise comparativa do secretoma de fitopatógenos e
não patógenos
Em bactérias e oomicetos: proteínas secretadas (efetores) são importantes
para estabelecer a infecção da planta, desarmando as defesas e subvertendo os
processos celulares para as necessidades dos patógenos invasores.
%
Porcentagem do
proteoma total
que é secretada
em cada fungo
(predição)
Análise genômica comparativa: evolução da
fitopatogenicidade
Resultados
Análise comparativa do secretoma de fitopatógenos e
não patógenos
Famílias de proteínas que foram exclusivas ou pelo menos duas
vezes mais comuns no secretoma de fitopatógenos do que nos
saprófitos:
Potenciais efetores em fungos:
•
•
•
•
•
podem
Proteases secretadas
Fatores de transcrição
Proteínas envolvidas em rearranjos do citoesqueleto
Interações proteína-proteína
Isochorisimatases secretadas específicas de patógenos:
suprimir as defesas dependente de ácido salicílico da planta
Genes efetores são alvo direto das forças evolutivas que dirigem a coevolução
(arms race) entre patógeno e hospedeiro, pois seus fenótipos se estendem às
células e tecidos da planta (seleção positiva – taxa evolutiva acelerada)
Análise genômica comparativa: evolução da
fitopatogenicidade
Conclusões
Embora a evolução da fitopatogenicidade tenha
acontecido várias vezes e os estilos de vida
destes fungos sejam diversos, as comparações
genômicas permitem:
Apontar novas famílias de genes que podem ter funções
na virulência de fitopatógenos, permitindo sua seleção para
estudos funcionais;
Identificar mecanismos patogênicos conservados
inovações e adaptações patogênicas linhagem-específicas;
e
Revelar onde eventos de transferência gênica horizontal
contribuíram para aquisição de novas funções associadas à
virulência
Análise genômica comparativa: evolução da
fitopatogenicidade
Desafios e Perspectivas:
Como aplicar a riqueza de informações obtidas a partir dos
estudos genômicos para melhorar a produção vegetal?
A descoberta de genes efetores de fungos que tem
importante contribuição para virulência pode permitir a
identificação dos melhores genes R a serem utilizados.
Efetores podem permitir a identificação dos processos que
são perturbados na planta hospedeira, permitindo a
modificação destes alvos para insensibilidade, ou
Utilização dos genes alvo na planta como marcadores QTL
para o melhoramento vegetal.
Bent & Mackey (2007)
Análise genômica comparativa: estudos evolutivos
Duplicação e perda de genes: inovação funcional
Os princípios que governam estes processos não são entendidos
Acúmulo de genomas: reconstrução da
duplicação e perdas de genes entre espécies
história
de
Análise genômica comparativa: estudos evolutivos
Estudos de duplicação e perda de genes: resolução de
ortologia e paralogia (difícil)
Sistema
computacional
(SYNERGY)
Resolução da história evolutiva de
todos os genes de 17 genomas de
fungos ascomicetos (300 milhões de
anos de evolução)
Análise genômica comparativa: estudos evolutivos
Reconstrução dos eventos evolutivos
Aparecimento
Duplicação
Perda
Patógenos de plantas:
História evolutiva complexa
Transferência Horizontal
Expansão e perda de genes
de metabolismo secundário
Expansão e perda de genes
de receptores celulares
Soanes et al (2007)
Análise genômica comparativa: estudos evolutivos
Duplicação e
perda de genes:
é altamente limitada pelas
propriedades funcionais e padrões
de interação dos genes.
Genes relacionados à estress exibem mais duplicações,
enquanto genes relacionados ao crescimento mostram
seleção contra tais mudanças.
Destino funcional de
genes duplicados:
raramente divergem quanto a função
bioquimica, mas divergem com
relação ao controle regulatório.
Criação das ferramentas de análise: extensão deste tipo de análise
para outros organismos (plantas e animais)
Considerações / Desafios / Perspectivas
Acúmulo de seqüências genômicas de fungos:
Resposta da planta à colonização por fungos
mutualistas e patogênicos:
padrões comuns nos
primeiros estágios de
infecção
www.plantcell.org/cgi/content/full/tpc.105.035410/DC1
Surgimento de novas linhas de pesquisa: análise in silico –
biologia de sistemas
OBRIGADA!