Análise in vitro da participação do colesterol na interação de

Análise in vitro da participação do colesterol na interação
de macrófagos peritoneais de camundongos com
Bacteroides fragilis.
Kayo Cesar Bianco Fernandes
Rio de Janeiro
2012
ii
KAYO CESAR BIANCO FERNANDES
Aluno do Curso de Tecnologia em Biotecnologia
Matrícula 0913800113
Análise in vitro da participação do colesterol na interação
de macrófagos peritoneais de camundongos com
Bacteroides fragilis.
Trabalho de Conclusão de Curso, apresentado ao Curso de
Graduação em Tecnologia em Biotecnologia da UEZO
como parte dos requisitos para a obtenção do grau de
Tecnólogo em Biotecnologia, sob a Orientação da Profª.
Jessica Manya Bittencourt Dias Vieira.
Rio de Janeiro
Julho de 2012
iii
Dedico esse trabalho aos meus pais que
me ajudaram durante esta caminhada.
iv
Agradecimentos
Gostaria de agradecer aos meus pais que estiveram ao meu lado me
apoiando em todos os momentos me dando carinho e suporte emocional para que
eu conseguisse vencer todos os desafios que surgiram durante todo este
percurso. Obrigado por sempre acreditarem na minha capacidade (mesmo
quando eu mesmo duvidava) e por me ensinarem que o esforço e a perseverança
são capazes de superar qualquer limitação. Ter vocês como pais é meu maior
orgulho, espero poder lhes trazer alegrias sempre.
Ao meu irmão, que me apoiou em cada passo da minha vida.
À minha namorada Meire Watanabe, por me apoiar em muitas decisões,
ouvir meus problemas, minhas inseguranças, meus medos e por sempre me
mostrar o caminho certo sem perder o sorriso no rosto.
Às minhas amigas e companheiras, Barbara Succar, Juliana Succar,
Juciara Batista, que sempre estiveram ao meu lado em todos os momentos bons
e ruins me ouvindo e dando apoio moral. Por me acompanhar ao longo dessa
jornada, exercitando a paciência, além de boas risadas.
À minha orientadora, Dr.ª Jéssica Manya, por ter me concedido um voto de
confiança. Tendo sempre se demonstrado gentil e compreensiva em todas as
vezes que precisei de sua ajuda. Obrigada por esta oportunidade, sei que ainda
tenho muito que aprender.
Ao meu co-orientador, Dr. Sérgio Seabra, por me ensinar tudo procurando
ter paciência nos momentos em que eu olhava para ele no final da explicação e
dizia “Não entendi nada” e pelos gritos de estímulo.
À Aline Lorete, minha companheira de Iniciação que sempre me ajudou no
trabalho além de ser uma ótima companhia.
A meu colega de estágio, Pedro Rodrigues, por dizer sempre a coisa
errada na hora certa.
Ao Prof. Fabio Fortes que sempre mostrou a solução óbvia dos problemas.
v
Ao Prof. Carlos Falcão, que sempre tinha uma frase épica, “O Quê?”.
Agradeço a minhas companheiras de laboratório, Juliana Chal, Adriana
Sacramento e Ezaine Torquato, por tornarem minha estada no laboratório muito
agradável com as gargalhadas que arrancaram de mim e pelo apoio que me
deram quando necessitei.
Agradeço a todos do LTBM, LTCC e do Setor de Microbiologia do LTCC,
que ajudaram na confecção deste trabalho.
vi
Lista de Figuras
Figura 1 – Classificação de cepas, produtoras e não produtoras de TBF
05
Figura 2 – Molécula de β-ciclodextrina
06
Figura 3 – Micrografia eletrônica de varredura de macrófago sadio apresentando
em sua superfície ondulações na membrana
07
Figura 4 – Representação do mecanismo de fagocitose em macrófago ativado por
interferon-Ɣ
08
Figura 5 – Representação do animal no lavado peritoneal para obtenção de
macrófagos
14
Figura 6 – Esquema representando os insertos de 0,4µm
16
Figura 7 – Ensaio de viabilidade celular após tratamento com βCD
19
Figura 8 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa de
B. fragilis ATCC 25285
20
Figura 9 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa
ELI1.1
21
Figura 10 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa
ES31.3
22
Figura 11 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa
078320
23
Figura 12 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa
ATCC 43859
24
Lista de Tabelas
Tabela 1: Classificação dos diferentes tipos de respiração
01
Tabela 2: Informações clínicas de algumas das espécies do genero Bacteroide 02
Tabela 3: Impacto do uso de antibióticos e sepse intra-abdominal e formação de
abscessos em ratos
E
F
Tabela 4: Cepas de B. fragilis utilizadas neste estudo
03
13
E
F
E
F
vii
Tabela 5: Analise dos dados obtidos nos resultados
18
Lista de Siglas
TBF
Toxina de B. fragilis
BFET
B. fragilis enterotoxigênico
BFNT
B. fragilis não-toxigênico
βCD
β-ciclodextrina
MØ
Macrófagos
INF-ɣ
Interferon-ɣ
LPS
NO
Lipolissacarídeo
Óxido Nítrico
iNOS
Enzima a síntese do óxido nítrico induzida
MEV
Microscopia Eletrônica de Varredura
BHI–PRAS
ATCC
Brain Heart Infusion Pre-Reduced Anaerobically Sterilized
Ameican Type Cell Culture
ASS
Ágar Sangue Suplementado
PBS
Phosphate Buffered Saline
DMEM
SFB
DMSO
CaCo
Dulbelco’s modified Eagle’s Médium
Soro Fetal Bovino
Dimetilsulfóxido
Cacodilato de Sódio
viii
Resumo
Bacteroides é um gênero bacteriano composto por bastonetes gramnegativos, não esporulados, anaeróbios estritos. A espécie B. fragilis é
componente da microbiota intestinal, beneficiando seus hospedeiros, já que
fisicamente excluem os patógenos em potencial de colonizar o intestino. Além
disso, tal espécie é considerada patógeno oportunista em humanos, com a
capacidade de causar infecções na cavidade peritoneal e levar à formação de
abscessos quando ocorre um trauma, por exemplo, no sítio de colonização. Em
um processo infeccioso, as bactérias precisam burlar o sistema imune a fim de
manter a infecção ativa, ou seja, necessitam escapar da atividade microbicida das
células que o compõem, tais como os macrófagos. Estes últimos atuam pela
produção de radicais livres como o óxido nítrico (NO), o qual é sintetizado pela
enzima NO sintase induzida (iNOS). Dados anteriores indicam que a espécie B.
fragilis é capaz de alterar a atividade microbicida de macrófagos, causando danos
não só à membrana plasmática bem como alterações aos filamentos de actina. O
objetivo deste trabalho foi analisar os efeitos da interação de B. fragilis com
macrófagos peritoneais de camundongo (MØ) a fim de esclarecer de forma mais
detalhada os resultados obtidos anteriormente. Para tanto, foram realizados
ensaios de depleção parcial de colesterol bem como análises com utilização de
insertos de 0,4µm após eventos de interação, associados à microscopia eletrônica
de varredura. Os resultados apontam que a depleção de colesterol potencializa os
efeitos da interação e, ainda, que tais efeitos independem do contato
B.fragilis:MØ.
Palavras-chave: Bacteroides fragilis, macrófagos peritoneais de camundongo,
ensaios de interação, colesterol, β-ciclodextrina, microscopia eletrônica de
varredura.
ix
Abstract
Bacteroides is a bacterial genus composed of gram-negative, nonsporulated and strict anaerobes rods. The B. fragilis species is an intestinal
microbiota component, wich brings benefits to the host since it physically excludes
the potential pathogens from colonizing the gut. Besides, such species is
considered an human opportunistic pathogen with the ability to cause infection on
peritoneal cavity inducing abscess formation when occurs a trauma, for example,
in the colonization site. During an infection process bacteria need to escape from
immune system in order to maintain the infection active, wish means, they need to
avoid microbicide activity of the immune system cells like macrophages. The latter
act by free radicals production such as nitric oxide (NO), which is synthesize by
NO synthase inducible (iNOS). Previous data showed that B. fragilis species is
capable of modify macrophages (MØ) microbicide action, causing not only
plasmatic membrane damages as also alteration on actin filaments. The aim of
this work was analyze B. fragilis effects on macrophages after interaction events to
clarify in detail the results obtained before. To do so, it was realized partial
cholesterol depletion essays as well analyses using transwell after interaction
events, associated to scanning electron microscopy. The results indicate that
cholesterol depletion potentize the interaction effects and, also such effects are
independent from B. fragilis:MØ contact.
Key-worlds:
Bacteroides
fragilis,
mice
peritoneal
macrophages,
bacteria/macrophages interaction, cholesterol, β-ciclodextrin, analysis by electron
microscopy.
x
“Tenha em mente que tudo que você aprende na escola é trabalho de muitas
gerações. Receba essa herança, honre-a, acrescente a ela e, um dia, fielmente,
deposite-a nas mãos de seus filhos.”
Albert Einstein
xi
Sumário
Lista de Figuras
vi
Lista de Tabelas
vi
Lista de Siglas
vii
Resumo
viii
Abstract
ix
Epígrafe
x
1- Introdução
01
1.1 – Aeróbios x Anaeróbios
01
1.2 – Gêneros Bacteroides
02
1.3 – Bacteroides Fragilis
03
1.4 – O colesterol de membrana
05
1.5 – Macrófagos
06
1.6 – Macrófago e o óxido nítrico
09
1.7 – Escapando da fagocitose
09
2 - Objetivos
11
2.1 – Objetivo Geral
11
2.2 – Objetivos Específicos
11
3 - Material e Métodos
12
3.1. Cepas bacterianas
12
3.2. Obtenção de Macrófagos Peritoneais de Camundongos (MØ)
13
3.3. Interação in vitro
14
.
3.4. Ensaio com β-ciclodextrina
15
3.4.1. Analise da viabilidade celular
15
3.4.2. Depleção parcial do colesterol pré-interação
15
3.5. Ensaio com Insertos 0,4µM
15
3.6. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
16
xii
4- Resultados
17
5- Discussão
25
6- Conclusões
28
7- Referências Bibliográficas
29
1
1.
INTRODUÇÃO
1.1.
AERÓBIOS X ANAERÓBIOS
Todo organismo realiza um tipo de respiração para manter-se vivo. Alguns
organismos realizam a respiração aeróbia; enquanto que outros realizam a
respiração anaeróbia (Tabela 1).
Tabela 1: Classificação dos diferentes tipos de respiração. Adaptado de
http://users.med.up.pt/cc04-10/Microdesgravadas/12_Anaerobias.pdf
Aeróbios
Necessitam de O2 para desenvolvimento e multiplicação.
Anaeróbios
Estritos
Anaeróbios
Extremamente sensíveis a
Não necessitam de O2
para desenvolvimento e
multiplicação.
Tolerantes
Anaeróbios
Facultativos
concentração de O2.
Moderadamente sensíveis: toleram
baixas concentrações de O2.
Podem ou não utilizar O2
para seu crescimento e
multiplicar.
Crescem em aerobiose e são
capazes de obter energia pela
fermentação de compostos
orgânicos.
A respiração aeróbica se desenvolve principalmente nas mitocôndrias e
requer oxigênio. Ela é formada por três fases: glicólise, ciclo de Krebs e cadeia
respiratória.
Já a respiração anaeróbia, também chamada de respiração anaeróbica, ou
também de fermentação, ocorre apenas na ausência de oxigênio. Contudo, a
sensibilidade dos microrganismos ao oxigênio varia, sendo classificados como
anaeróbios estritos, anaeróbios facultativos e anaeróbios tolerantes (ENGELKIRK
et al., 1992). A bactéria responsável por causar o botulismo, Clostridium
botulinum, só sobrevive na ausência de oxigênio sendo assim classificada como
anaeróbia estrita. Essa bactéria produz algumas toxinas que podem levar à morte
do hospedeiro. Mas as bactérias anaeróbias não causam somente prejuízos. O
gênero Lactobacilos, anaeróbios facultativos, são utilizados na produção de
2
iogurtes e coalhadas, além disso, essas mesmas bactérias são encontradas em
nosso intestino e auxiliam na fabricação de algumas vitaminas.
1.2.
GÊNERO Bacteroides
Dentre as bactérias anaeróbias, se encontra o gênero Bacteroides formado
por bastonetes Gram-negativos anaeróbios estritos, não esporulados, bileresistentes e que podem ou não apresentar motilidade. São componentes
predominantes da microbiota das membranas mucosas (BROOK, 1995;
FERREIRA et al., 2003), colonizam a orofaringe e os tratos gastrintestinal e
genital feminino de seres humanos. As doenças infecciosas causadas por tais
microrganismos originam-se, principalmente, de sua disseminação endógena, a
partir de superfícies mucosas colonizadas para locais do organismo normalmente
estéreis (FINEGOLD & GEORGE, 1989; GOLDSTEIN, 1995; FERREIRA et al.,
2003).
As espécies de Bacteroides têm se destacado pela sua alta incidência de
isolamento, como é o caso, principalmente, da espécie B.fragilis (Tabela 2). Além
disso, as espécies deste gênero normalmente apresentam resistência a
antimicrobianos (FERREIRA et al., 2003). Estudos realizados por SEARS, C.L.
(2012), utilizando dois antibióticos diferentes, gentamicina e clindamicina,
demostraram a resistência do B. fragilis aos mesmos (Tabela 3).
Tabela 2: Informações clínicas de algumas das espécies do genero Bacteroides,
(PAUL G. ENGELKIRK).
Espécies
Informação clinica
Espécies mais isoladas de processos infecciosos dos
B. fragilis
B. ovatus
B. thetaiotaomicron
tecidos moles (61%)
Ocasionalmente isoladas de amostras clínicas (5%)
Freqüentemente encontradas em amostras clínicas
(17%)
Ocasionalmente isoladas de processos infecciosos (6%)
B. vulgatus
3
Tabela 3: Impacto do uso de antibióticos e sepse intra-abdominal e formação de
abscessos em ratos (Adaptado de SEARS, C.L. 2012).
Condições
Formação de abscessos
Mortalidade
Controle
100%
37%
Gentamicina
98%
4%
Clindamicina
5%
35%
Gentamicina/Clindamicina
6%
7%
A mucosa intacta representa uma importante barreira que previne
microrganismos de se espalharem para outros sítios. Portanto, as infecções
anaeróbias ocorrem normalmente na presença de fatores que são predisponentes
como necrose tecidual, causada por trauma ou cirurgia, insuficiência vascular ou
a presença de tumores (BROOK, 1987).
1.3.
Bacteroides fragilis
A espécie B. fragilis apesar de minoritária na microbiota intestinal, é a mais
frequentemente associada a processos infecciosos, tais como bacteremias
(GOLDSTEIN & CITRON, 1988), infecções intra-abdominais (CRABB et al, 1990),
abscessos (BROOK & FINEGOLD, 1981) e infecções em tecidos moles (BROOK,
1987). Além disso, apesar de centenas de espécies bacterianas colonizarem o
trato gastrintestinal, o predomínio da espécie B. fragilis e da espécie anaeróbia
facultativa Escherichia coli em peritonites secundárias é comum (ONDERDONK et
al., 1974), reiterando o conceito de que as infecções anaeróbias são geralmente
polimicrobianas.
Acredita-se que tal espécie se destaque como um dos principais patógenos
em infecções anaeróbias devido a sua versatilidade em causar processos
infecciosos distintos (ONDERDONK et al., 1977a; 1990; ONDERDONK, 2005).
4
Neste contexto, alguns fatores de virulência têm sido propostos a fim de explicar o
seu comportamento patogênico e o destaque de B. fragilis em relação aos demais
componentes da microbiota intestinal em função da expressão de fatores de
virulência que poderiam conferir a espécie vantagens ecológicas (KASPER et al.,
1979; MYERS & SHOOP, 1987). Dentre os fatores de virulência já descritos, a
cápsula tem sido um dos mais estudados pela sua atuação como evasina
bacteriana e como participante da formação de abscessos (LINDBERG et al.,
1990; HOSFTAD, 1992; DUERDEN, 1994; KALKA – MOLL et al., 2001). Uma
observação importante foi a de que a cápsula de B. fragilis sozinha foi suficiente
para induzir a formação de abcessos em murinos (SEARS, C.L. et al. 2012).
Estudos anteriores realizados por COMSTOCK et al. (1999) constataram que o B.
fragilis possui o sistema de polissacarídeo mais complexo já descrito. Verificou-se
que B. fragilis apresenta a capacidade de sintetizar oito polissacarídeos
capsulares distintos. No entanto, curiosamente, cada cepa de B. fragilis apresenta
apenas um único membro desta família de polissacarídeos sobre a sua superfície.
Algumas cepas de B. fragilis podem secretar uma potente toxina,
denominada Toxina de B. fragilis (TBF), que rapidamente induz alterações na
biologia e transdução de sinal nas células epiteliais do cólon, bem como estimula
a resposta inflamatória neste sítio, tanto em humanos quanto em modelos
experimentais (SEARS, C.L. et al., 2008). A espécie B. fragilis pode ser dividida
em dois grupos com base na expressão de TBF. As BFNT (B. fragilis nãotoxigênico) não possuem o gene para expressão da TBF que promove a saúde da
mucosa e aquelas consideradas BFET (B. fragilis enterotoxigênico) expressam o
TBF (Fig. 1). Embora todos os B. fragilis têm a capacidade de induzir a formação
de abcesso em seres humanos, apenas as cepas BFET têm sido associadas com
doença diarréica humana. Além disso, até o presente o gene TBF não foi
identificado em quaisquer outros Bacteroides ou espécies microbianas (SEARS,
C.L. 2012). A expressão do gene TBF ocasiona a doença diarreica em humanos,
porém cepas BFET podem colonizar de forma exacerbada indivíduos, os quais
permanecem assintomáticos. Um estudo realizado por WU et al. (2006) demostra
que o receptor de TBF é uma proteína de membrana sensível à depleção de
colesterol. Os mesmos estudos ainda sugerem que os receptores de TBF estejam
localizados em jangadas lipídicas, ricas em colesterol (WU et al., 2006).
5
Fig. 1 – Classificação de cepas, produtoras e não produtoras de TBF (Adaptado de SEARS, C.L.
2012).
1.4. O COLESTEROL DE MEMBRANA
O colesterol é um lipídio encontrado nas membranas de células de
mamíferos. Este lipídio é componente essencial das membranas celulares
estando envolvido na regulação da fluidez das mesmas, assim como em
processos de sinalização celular, quando este se encontra associado a jangadas
lipídicas. Vários estudos têm demonstrado que o colesterol pode ser utilizado para
auxiliar na entrada de inúmeros patógenos em seus hospedeiros (WU et al.,
2006). O colesterol de membrana presente em células eucarióticas poder ser
depletado pela ação da droga β-ciclodextrina (βCD) (Fig. 2), ou de seus
derivados, o que ocasiona a desestruturação das jangadas lipídicas e
consequentemente bloqueio de diversos processos biológicos. (VENTURINI et al.,
2008).
As ciclodextrinas são polímeros formados por monômeros de glicose que
são obtidos a partir da degradação de amido. As mais conhecidas são de origem
natural e classificadas como α (alfa), β (beta), ou γ (gama), de acordo com a
quantidade de monômeros de glicose que as formam (VENTURINI et al., 2008).
6
Fig. 2 – Molécula de β-ciclodextrina (VENTURINI et al.,
2008)
1.5.
MACRÓFAGOS
Diferentes mecanismos de defesa atuam concomitantemente e de forma
complementar em vários sítios, inclusive na cavidade peritoneal. Nesta última,
numa primeira etapa ocorre a depuração pelos vasos linfáticos e a fagocitose, o
que parece ser o principal mecanismo antimicrobiano no sítio da infecção (DUNN
et al., 1985; 1987), por macrófagos residentes (MØ). Os MØ são formas
diferenciadas de monócitos originários da medula óssea, que logo após sua
produção migraram pela corrente sanguínea para os tecidos, onde se fixaram e
sofreram diferenciação. MØ são células componentes do sistema imune de
mamíferos, integrando o sistema mononuclear fagocítico (VAN FURTH et al.,
1972)(Fig. 3). Sabe-se que os MØ são células fagocíticas profissionais que
participam de forma relevante na imunidade inata e adquirida dos organismos,
sendo caracterizadas como células apresentadoras de antígenos (MACMICKING.
et al. 1997). Deste modo, nas primeiras horas do desafio microbiano, os MØ são
os responsáveis pela atividade fagocítica na cavidade peritoneal (DUNN et al.,
1985; 1987).
7
Fig. 3 – Micrografia eletrônica de varredura de macrófago sadio apresentando em sua superfície
ondulações na membrana.
O processo de fagocitose tem inicio quando as células microbianas são
reconhecidas pelos MØ, logo após são englobadas e degradadas em seu interior,
ocorrendo à formação de vesículas especializadas, denominadas fagossomos.
Estes por sua vez se fundem aos lisossomos, vesícula contendo enzimas
produtoras de radicais óxidos, formando o fagolisossomo. Simultaneamente,
receptores que participam da fagocitose mandam sinais que ativam diversas
enzimas no interior do fagolisossomo, as quais têm por fim degradar a bactéria
(Fig. 4).
8
Fig. 4 – Representação do mecanismo de fagocitose em macrófago ativado por interferon-Ɣ.
Adaptado de http://classes.midlandstech.edu/carterp/Courses/bio225/chap16/lecture3.htm
MØ expressam receptores de citosinas, tal como o interferon-ɣ (INF-ɣ).
Esta citosina quando se liga aos receptores dos MØ torna-os ativados, o que
aumenta a atividade microbicida do mesmo, por exemplo, pela produção de óxido
nítrico. A ativação do MØ também pode correr através da injeção em
camundongos de tioglicolato ou LPS (lipolissacarídeo), agentes pró-inflamatórios,
é possível fazer com que os MØ entrem num estado funcional intermediário entre
residente e ativado, estado este designado como elicitado ou estimulado (COHN,
1978).
O IFN- ɣ quando se liga aos receptores dos MØ torna-os ativados, levando
a ativação da enzima a síntese do óxido nítrico induzida (iNOS) , por exemplo,
responsável pela produção de óxido nítrico (NO). Posteriormente, outros
mecanismos são mobilizados, incluindo o bloqueio mecânico do processo
infeccioso na tentativa de impedir sua disseminação, o que se traduz na formação
de abscessos (DUNN et al., 1985; 1987; MADDAUS et al., 1988).
9
1.6. MACRÓFAGO E O OXIDO NÍTRICO
A ativação dos MØ leva a sinalização intracelular que induz a translocação
de um fator de transcrição, o que resulta na expressão de várias enzimas, como a
iNOS que sintetiza NO (BUTCHER et al, 2001). O NO, juntamente com outros
radicais superóxido e hidroxila, está relacionado ao mecanismo antimicrobiano
dos macrófagos chamado “burst” oxidativo ou estresse oxidativo. Neste caso os
MØ utilizam os efeitos citotóxicos de vários tipos de oxidantes como mecanismo
de defesa a favor do hospedeiro (HURST & BARRETTE, 1989; MILLER &
BRITIGAN, 1997).
NO é um radical gasoso solúvel em água e lipídios, reage na água com
oxigênio e seu produto reativo gera outros radicais (ex. dióxido de nitrogênio,
NO2), anions moderadamente estáveis (ex. nitrito, NO 2-), anions muito estáveis
(ex. nitrato, NO3-), óxidos altamente estáveis (ex. trióxido de dinitrogênio, N2O3) e
peróxidos instáveis (ex. peroxinitrito, ONOO -). Biologicamente, a maioria dessas
formas é passível de surgir em poucos segundos após a ativação da iNOS
(MACMICKING, XIE & NATHAN, 1997).
Dados da literatura demonstraram que alguns patógenos têm a capacidade
de inibir a produção de NO por MØ (SEABRA. et al., 2002), assim como o contato
inicial entre as células, determinando uma vantagem na sua sobrevivência
durante o processo infeccioso (MACMICKING. et al., 1997).
1.7. ESCAPANDO DA ATIVIDADE MICROBICIDA DOS MØ
Estudos que analisaram os efeitos da interação de MØ com cepas da
espécie B. fragilis, utilizando imunocitoquímica e microscopia eletrônica de
transmissão e varredura, mostraram que tais bactérias são capazes de gerar
alterações em tais fagócitos (VIEIRA et al, 2005, VIEIRA et al, 2009). Ensaios in
vitro de imunocitoquímica demostraram extravasamento dos filamentos de actina,
os quais foram coincidentes com a marcação para iNOS. Além disso, análises da
resposta dos MØ infectados demonstrou que houve uma queda na produção de
NO nos MØ infectados (VIEIRA et al, 2005), o que também já foi observado para
outros patógenos (DAMATTA et al, 2000; SEABRA. et al., 2002; LÜDER et al,
2003).
10
Analises realizadas com o objetivo de testar o tipo de morte, apoptose ou
necrose, sofrida pelos macrófagos após os ensaios de interação com B. fragilis,
indicaram que a morte dos mesmos estaria ocorrendo por um processo similar à
necrose, com a formação de poros na membrana dos fagócitos (VIEIRA et al,
2009). Ainda, análises in vivo apresentaram resultados similares às análises in
vitro (VIEIRA et al, 2009).
As infecções causadas por bactérias anaeróbias são eventos clínicos
comuns e algumas se manifestam de forma muito grave, resultando em altas
taxas de letalidade. Além disso, as infecções anaeróbias facilmente escapam ao
diagnóstico laboratorial devido às precauções especiais necessárias à coleta e
transporte dos espécimes clínicos. Essas condições são indispensáveis à
realização de estudos bacteriológicos adequados, e em particular para esses
microrganismos. Adicionalmente, muitos laboratórios estão despreparados para o
manejo de alguns ou da maioria dos anaeróbios.
A biologia da espécie B. fragilis tem sido objeto constante de investigações
nos últimos anos e, apesar, de já serem conhecidos alguns dos aspectos relativos
às interações com o hospedeiro, muito ainda falta para o completo entendimento
dos processos causados por este importante patógeno anaeróbio. Dessa forma,
mostra-se importante avaliar a interação de B. fragilis com células hospedeiras de
maneira a complementar o conhecimento já adquirido, assim como elucidar os
mecanismos envolvidos nos eventos de interação.
11
2. OBJETIVO
2.1. OBJETIVO GERAL
Tendo em vista os resultados previamente observados para a espécie
B.fragilis com relação às alterações ocasionadas aos MØ infectados, o objetivo
deste estudo foi aprofundar as análises realizadas a fim de compreender de forma
mais precisa as moléculas e mecanismos envolvidos no processo de interação
bactéria: MØ.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Analisar através do tratamento com β-ciclodextrina a importância do
colesterol de membrana na interação B. fragilis: MØ;
 Avaliar a necessidade do contato B. fragilis:MØ para observação dos
efeitos citotóxicos, através da utilização de insertos de 0,4µm durante os
ensaios de interação B. fragilis:MØ;
 Realizar ensaios de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) após os
ensaios com β-ciclodextrina com a finalidade de observar os efeitos
ocasionados à topologia dos MØ.
12
3.
MATERIAL E MÉTODOS
3.1. CEPAS BACTERIANAS
As cepas 078320, ES 31.1, ELI 1.1 foram obtidas a partir da Coleção de
Cultura do Laboratório de Biologia de Anaeróbios (IMPPG/UFRJ). Tais cepas
foram reativadas em caldo BHI–PRAS (Brain Heart Infusion Pre-Reduced
Anaerobically Sterilized) (HOLDEMAN, KELLY & MOORE, 1984) a partir de
estoque em meio de Chopped meat, sendo incubadas por 24h a 37ºC. As cepas
ATCC (Ameican Type Cell Culture) 43859 e ATCC 25285 foram obtidas da
Coleção de Cultura Bacteriana do Laboratório de Microrganismos de Referência
(INCQS/FIOCRUZ) e reativadas em caldo Tioglicolato a partir de estoque
liofilizado, sendo incubadas por 48h a 37ºC. Critérios de viabilidade e pureza
foram utilizados, após semeadura em placas de ágar sangue suplementado (ASS)
com vitamina K (10 μg/mL) e hemina (5 μg/mL). Após o período de incubação, em
ambiente de anaerobiose (80% de N 2, 10% de H2 e 10% de CO2), as colônias
foram repicadas para novo caldo BHI-PRAS, para avaliação morfo-tintorial pelo
método de Gram, modificado por Kopeloff, e confirmação do tipo respiratório
(JOUSIMIES-SOMER et al., 2002; FERREIRA. et al., 2003).
As suspensões bacterianas usadas nos experimentos foram obtidas por
cultura em caldo BHI-PRAS a 37°C. Brevemente, as células foram centrifugadas
por 10 min a 3600rpm após crescimento por 24 horas, lavadas com PBS
8
(Phosphate Buffered Saline), e ressuspensas a uma concentração de 6x10
UFC/mL, usando a escala 2 de McFarland .
13
Tabela 4: Cepas de B. fragilis utilizadas neste estudo.
CEPA
ESPÉCIE
ATCC 43859
ORIGEM
Processo diarréico
Abscesso de apêndice
ATCC 25285
B. fragilis
ES 31.3
ELI 1.1
078320
Processo diarréico
Microbiota intestinal normal
Processo diarréico
3.2. OBTENÇÃO DE MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE CAMUNDONGOS
Os macrófagos (MØ) foram obtidos como descrito por SEABRA et al. (2002). Os
MØ foram estimulados pela inoculação intraperitoneal de 30mg/mL de tioglicolato
em camundongos suíços de 48 dias. Após 72h, foi realizado lavado peritoneal nos
camundongos com 5mL de DMEM gelado (Dulbelco’s modified Eagle’s médium /
Sigma® - St Louis, MO/USA). O protocolo de estudos com animais foi revisto e
aprovado pelo comitê de ética de experimentos animais da Universidade Estadual
do Norte Fluminense Darcy Ribeiro(número de permissão 98).
14
Fig. 5 – Ilustração do procedimento de obtenção dos MØ – lavado peritoneal de camundongo.
Adaptado de http://www.scielo.br/img/revistas/acb/v20s1/25565f1.gif
As células peritoneais, obtidas através do lavado peritoneal, foram
incubadas em gelo apenas até o momento da centrifugação, centrifugadas a
3600rpm por 10 min a 4°C, ressuspensas em meio DMEM gelado, contadas com
6
auxílio de microscópio óptico, e ajustadas para 2x10 células/mL em meio DMEM
gelado. Para a obtenção de células aderentes, 180 μl de suspensão foram
espalhados sobre lamínulas em cada orifício de placa de 24 poços. Após 1 hora
de incubação a 37°C numa atmosfera a 5% de CO , os poços foram lavados com
2
DMEM sem soro por duas vezes, para remoção das células não aderentes em
seguida a placa foi incubada, por 24 horas, com 500 μl de DMEM suplementado
com 5% de soro fetal bovino inativado por calor (SFB / Laborclin® - Pinhais,
Paraná, Brasil) e 2 μl/ml de interferon- (IFN- / Sigma®) para ativação dos
macrófagos.
3.3. INTERAÇÃO IN VITRO
As interações bactérias-macrófagos foram realizadas por 2 horas em estufa
a 37C numa atmosfera a 5% de CO2, usando uma proporção de 1:200,
macrófago:bactérias. Após o período de incubação, os poços foram lavados duas
vezes com DMEM sem soro.
15
3.4. ENSAIO COM β-CICLODEXTRINA (βCD)
3.4.1. ANÁLISE DA VIABILIDADE CELULAR
A concentração adequada para o tratamento com βCD deve ser controlada
de acordo com a linhagem celular, para que o tratamento com a droga não afete a
morfologia e a viabilidade da célula. Por este motivo, foi necessário definir a
concentração adequada de βCD a ser utilizada no tratamento dos macrófagos de
forma a depletar uma quantidade significativa de colesterol sem comprometer a
viabilidade da célula. Para este fim, as células foram obtidas como descrito no
item 3.2. E logo após, as mesmas foram tratadas com concentrações de 5, 10, 20,
30 e 40mM (milimolar) de βCD. As alíquotas foram diluídas de um estoque de
100mM, preparado com 3ml de DMSO (Dimetilsulfóxido) filtrado e 7ml de DMEM
estéril. A viabilidade celular foi avaliada após 24 e 48h, através de ensaio com
azul de Trypan na concentração de 0,4% em PBS, foi possível avaliar que a
concentração de 10mM, depletou uma maior quantidade de colesterol sem afetar
a viabilidade das células.
3.4.2. DEPLEÇÃO PARCIAL DO COLESTEROL PRÉ-INTERAÇÃO
Os MØ foram obtidos como descrito no item 3.2. E, logo após o período de
incubação por 24 horas com DMEM suplementado, as células foram lavadas duas
vezes com DMEM sem soro e incubadas novamente com DMEM, contendo βCD
a uma concentração de 10mM, por 24h, a fim de obter o maior depleção possível
de colesterol. Após a incubação por 24 horas com a βCD, as células foram
lavadas duas vezes com DMEM.
As interações bactérias-macrófagos foram realizadas como descrito no
item 3.3. Após o período de incubação, os poços foram lavados duas vezes com
DMEM sem soro.
3.5. ENSAIO COM INSERTOS 0,4µM
Estes ensaios foram realizados a fim de avaliar a necessidade do contato
para ocorrência dos efeitos que porventura sejam observados após os eventos de
interação. Os ensaios de interação foram realizados conforme item 3.3 e 3.4.2 da
seção Material e Métodos, porém foram utilizados insertos 0,4µm (fig. 6).
16
Os insertos não permitem que haja o contato direto da B. fragilis com o
macrófago, a membrana permite apenas a passagem de possíveis substratos
produzidos pelas células. Após os ensaios, os MØ foram analisados por
microscopia eletrônica de varredura de acordo com o protocolo descrito na seção
3.6 do Material e Métodos.
Fig.
6
–
Esquema
representando
os
insertos
de
0,4µm.
Adaptado
de:
http://wires.wiley.com/WileyCDA/WiresArticle/wisId-WNAN53.html
3.6. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV)
Após os eventos de interação de cepas de B. fragilis com macrófagos nos
tempos determinados para cada experimento, as células foram lavadas com
DMEM sem soro, fixadas em Karnovsky, (2,5% [v/v] de glutaraldeído e 4% [v/v] de
paraformaldeído em tampão CaCo (Cacodilato de Sódio) 0,1 M), por 40 min, e
lavadas com PBS. As células foram pós-fixadas em solução de tetróxido ósmio e
tampão CaCo na proporção 1:1, a temperatura ambiente, por 40 min, protegidas
da luz e posteriormente lavadas em PBS. As células foram desidratadas em série
gradual de acetona (40-100% / 15 min cada), secas através de ponto crítico
usando CO2, montadas em suportes de alumínio, e cobertas com ouro (20-30nm)
para observação em microscópio eletrônico de varredura JEOL (VIEIRA et al.,
2009).
17
4. RESULTADOS
No ensaio de viabilidade celular com βCD foi possível averiguar que a
concentração mais adequada de βCD foi 10mM por fornecer depleção eficiente do
colesterol celular sem comprometer a viabilidade celular (Fig. 7). Os MØ foram
tratados com 10 mM da droga e infectadas com as diferentes cepas de B. fragilis.
Juntamente foi realizado controle das infecções sem a βCD, ambas foram
observadas com auxílio de MEV.
Foi observado que após os ensaios, MØ não infectados estavam íntegros
(Fig. 8 - 12, A), apresentando ondulações de membrana plasmática, típicos
destas células. Contrariamente, os MØ não infectados, porém tratados com βCD
(Fig. 8 - 12, B) apresentaram diminuição do numero de ondulações de membrana
(Fig. 8 - 12, B cabeça de setas). MØ infectados com as cepas ATCC 25285, ELI
1.1, ES31.3, 078320 e ATCC 43859 de B. fragilis, mas não tratados com βCD
(Fig. 8 - 12, C) apresentaram poucas ondulações. Observou-se ainda a formação
de lesões na superfície dos macrófagos infectados com as cepas de B. fragilis e a
presença de bactérias aderidas aos fagócitos (Fig. 8 - 12, C).
MØ tratados com βCD e infectados com as cepas ATCC 25285, ELI 1.1,
ES31.3, 078320 e ATCC 43859 de B. fragilis (Fig. 8 - 12, D), apresentaram maior
adesão bacteriana (Fig. 8 - 12, D). Nas mesmas imagens nota-se que a
membrana dos macrófagos apresentava formação de estruturas parecidas com
poros.
Com a utilização dos insertos 0,4um, nos ensaios de interação não tratados
com βCD (Fig. 8 - 12, E), a menor formação das ondulações de membrana foi
aparente. Da mesma forma nos ensaios de interação nos quais os insertos foram
utilizados, juntamente com βCD, a membrana dos MØ infectados não apresentou
as ondulações características (Fig. 8 - 12, F). Houve também o aumento do
número de poros nas células tratadas e com insertos (Fig. 8 - 12, F) em
comparação com as células não tratadas (Fig. 8 – 10 e 12, A). Na cepa 078320,
os efeitos foram observados em menor escala (Fig. 11), se comparado com as
outras cepas.
18
Após a analise dos dados obtidos através das imagens, foi possível
expressa-las através da seguinte tabela (Tabela 5).
Tabela 5: Analise dos dados obtidos nos resultados.
Condições
MØ não infectado (Pranchas 1-5, A)
MØ não infectado + βCD (Pranchas 15, B)
MØ infectados (Pranchas 1-5, C)
MØ infectados + βCD (Pranchas 1-5,
D)
MØ não infectados + Insertos de
0,4µm (Pranchas 1-5, E)
MØ infectados + βCD + Insertos de
0,4µm (Pranchas 1-5, F)
Membrana
Interação + Ondulações
Sem ondulações
Poucas ondulações (Lesões)
Poros + aumento da adesão bacteriana
Sem ondulações
Ondulações não características + poros
19
% de MØ
% de MØ
A
B
Fig. 7 - Ensaio de viabilidade celular após tratamento com βCD. Painel A – MØ tratados com βCD
por 24h. Painel B - MØ tratados com βCD por 48h.
.
20
A
B
C
D
E
F
Figura 8 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa de B. fragilis ATCC
25285. A - MØ controle, não infectado, apresentando típicas ondulações de membrana (setas). B MØ controle tratados com βCD, aparente perda das ondulações é notada (cabeça das setas). C MØ infectados com a cepa ATCC 25285 sem tratamento com βCD. O rompimento da membrana é
aparente (seta). D – MØ tratados com βCD e infectados com a cepa ATCC 25285. Nota-se a
presença de bactérias aderidas (seta) e redução significativa de ondulações na membrana, o
rompimento da membrana é aparente (cabeça de seta). E – Ensaio de Insertos 0,4µm de MØ não
tratados com βCD, infectados com a cepa ATCC 25285. Nota-se a ausência de ondulações
características (seta) F – Ensaios de Insertos 0,4µm de MØ tratados com βCD, infectados com a
cepa ATCC 25285 formação de pseudopodes é notada (seta).
21
A
B
C
D
E
F
Figura 9 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa ELI 1.1. A - MØ
controle, não infectados, apresentando típicas ondulações de membrana (setas). B – MØ controle
tratados com βCD, nota-se ausência de ondulações na membrana (seta). C - MØ infectados com a
cepa ELI 1.1, poros na membrana são aparentes. D – MØ tratados com βCD e infectados com a
cepa ELI 1.1. Apresentando extravasamento de citoplasma celular e redução significativa de
ondulações na membrana (setas). E - MØ infectados não tratados com βCD, utilizando-se do
insertos, ausência de ondulações características é notada. F – MØ infectados tratados com βCD,
utilizando insertos, observa-se ausência de ondulações.
22
A
B
C
D
E
F
Figura 10 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa ES 31.3 de B.
fragilis. A - MØ controle, não infectados, apresentando típicos ondulações de membrana (setas). B
– MØ controle tratados com βCD nota-se a redução de ondulações na membrana. C - MØ
infectados com a cepa ES 31.3, apresentam poros na membrana (setas). D – MØ tratados com
βCD e infectados com a cepa ES 31.3 com redução de ondulações características na membrana
plasmática (seta). E - MØ infectados não tratados com βCD, utilizando insertos. Poros na
membrana são notáveis (seta). F – MØ infectados tratados com βCD, utilizando insertos. Poros de
membrana aparentes (setas) e redução de ondulações.
23
A
B
C
D
E
F
Figura 11 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa 078320 de B.
fragilis. A - MØ controle, não infectados, apresentando típicos ondulações de membrana (setas). B
– MØ controle tratados com βCD. Nota-se a ausência de ondulações tipícas. C - MØ infectados
com a cepa 078320, apresentam poros na membrana (setas). D – MØ tratados com βCD e
infectados com a cepa 078320, nota-se grande numero de bactérias aderidas. E - MØ infectados
não tratados com βCD, utilizando-se do insertos. Nota-se a formação de pseudopodes (setas). F –
MØ infectados tratados com βCD, utilizando insertos, formação de pseudopodes é observado
(seta), mas em menor quantidade, do que as células não infectadas.
24
A
B
C
D
E
F
Figura 12 – Micrografia Eletrônica de Varredura de MØ infectados com a cepa ATCC 43859. A MØ controle, não infectados, apresentando típicos ondulações de membrana (setas). B – MØ
controle tratados com βCD. Ausência de ondulações tipicas é observado. C - MØ infectados com a
cepa ATCC 43859, apresentam poros na membrana(setas). D – MØ tratados com βCD e
infectados com a cepa ATCC 43859, nota-se a presença de bactéria aderida ao MØ. E - MØ
infectados não tratados com βCD, utilizando-se do insertos. Apresenta a formação significativa de
poros na membrana (seta). F – MØ infectados tratados com βCD, utilizando insertos,
apresentando poro na membrana (seta).
25
5.
DISCUSSÃO
Microrganismos que constituem parte da microbiota normal têm papel
importante na manutenção da saúde do organismo hospedeiro através da
produção de vitaminas essenciais, como a vitamina K, cofatores e ácidos graxos.
As bactérias anaeróbias são componentes das microbiota de humanos, animais e
outros, predominando no trato gastrintestinal, principalmente no cólon, além de
também colonizarem regiões como pele, cavidade oral, trato respiratório superior
e trato urogenital (FINEGOLD & GEORGE, 1989; SHAH et al., 2009).
Já se sabe que a espécie B. fragilis é causadora de algumas infecções
como formação de abcessos, sepse, infecções abdominais, entre outros (TALLY
& HO, 1987). Neste âmbito, vários mecanismos bacterianos vêm sendo
apontados como atuantes, inclusive aqueles relacionados com a resistência à
fagocitose. Além disso, alguns fatores de virulência têm sido propostos a fim de
explicar o comportamento patogênico da espécie. Foi observado que a
composição química da cápsula polissacarídica de B. fragilis é diferente de outros
polissacarídeos bacterianos (KASPER, 1976), além de ter sido mostrado que a
imunização de ratos com essa cápsula purificada conferia proteção aos animais
frente a novas infecções (KASPER et al., 1979; SHAPIRO et al., 1982; 1986).
Estudos em animais mostraram que somente cepas encapsuladas eram
virulentas (ONDERDONK et al., 1974; 1976; 1977a). Estudo mais recente
demonstrou que a cápsula de B. fragilis sozinha é capaz de induzir a formação de
abscessos em murinos (SEARS, C.L. 2012). Os autores deste estudo sugeriram
que o B. fragilis possui o sistema de polissacarídeo mais complexo conhecido até
o momento.
Algumas cepas de B. fragilis podem secretar TBF que, rapidamente, induz
uma resposta inflamatória no cólon, tanto em humanos quanto em modelos
experimentais (SEARS, C.L. et. al
2008). Também já foi demonstrado que o
receptor de TBF é sensível à depleção do colesterol de membrana, o que indicou
que receptores da TBF estão ligados a jangadas lipídicas, ricas em colesterol
(WU et al., 2006).
A capacidade dos microrganismos de aderir a tecidos do hospedeiro é
considerada um fator determinante para colonização e infecção (BEACHEY,
1981). Adicionalmente, foi visto que a produção de enzimas hidrolíticas capazes
26
de degradar diferentes componentes dos tecidos, também vêm sendo descritas
como potenciais fatores de virulência de espécies do gênero Bacteroides (BOTTA
et al., 1994). Para B. fragilis, diversas estruturas de superfície também já foram
descritas como possíveis adesinas (HOFSTAD, 1992; PATRICK, 1993).
MØ são células fagocíticas do sistema imune de mamíferos, caracterizadas
como
células
apresentadoras
de
antígenos
(VAN
FURTH
et
al.,1972;
MACMICKING, XIE & NATHAN, 1997). Tais células, quando ativadas, secretam
uma variedade de citocinas. A superfície dos MØ é repleta de receptores que
reconhecem moléculas expressas por patógenos e auxiliam no processo de
fagocitose (ESWARAPPA et al., 2008). Quando não infectados, esses fagócitos
apresentam em sua superfície estruturas (projeções) denominadas ondulações de
membrana, as quais estavam aparentes nos MØ controle de todos os
experimentos realizados (Pranchas 1-5 A). Tais projeções já foram observadas
em estudos anteriores (VIEIRA et al., 2005 e 2009).
Neste estudo, cinco cepas de B. fragilis foram utilizadas a fim de analisar o
papel do colesterol nos eventos de infecção dos MØ com B. fragilis. Ensaios
utilizando βCD, um polímero que auxilia na depleção parcial do colesterol, e
insertos 0,4µm, aparato que não permite o contato das bactérias com os MØ
foram utilizados para esse fim. Os efeitos foram observados por microscópio
eletrônico de varredura.
A fim de compreender a relevância do colesterol no processo de infecção do
B. fragilis, foi avaliado o efeito da depleção do colesterol celular no evento da
infecção. A concentração adequada para o tratamento com βCD é controlada de
acordo com o tipo celular, para que o tratamento com a droga não afete a
morfologia e a viabilidade celular. Assim foram realizados ensaios nos quais as
células foram tratadas com concentrações de 5, 10, 20, 30 e 40mM de βCD, com
posterior avaliação da viabilidade utilizando Azul de Trypan. Os resultados
mostram que a concentração de 10mM é a mais adequada, por proporcionar
maior depleção do colesterol sem afetar a viabilidade do MØ (Fig. 7).
Do ponto de vista dos aspectos morfológicos, os MØ não tratados com
βCD revelaram algumas alterações, quando infectados, sugestivas de liberação
de conteúdo citoplasmático por estas células (Fig 8, D). Análises dos MØ tratados
27
com βCD demonstraram que as alterações observadas anteriormente na
morfologia (perda das ondulações) dos MØ ocorriam mesmo sem a interação
(Fig. 8 - 12, B), sugerindo a participação do colesterol nos eventos de interação.
As observações das interações de MØ tratados com βCD e infectados com as
cepas ATCC 25285, ELI 1.1, ES 31.3, 078320 e ATCC 43859, todas da espécie
B. fragilis, resultaram em ruptura da membrana dos MØ bem como na perda
aparente das ondulações na superfície dos mesmos, além de apresentar
membrana porosa e aumentar a taxa de adesão bacteriana. A MEV dos ensaios
de tratamento com βCD após eventos de interação revelaram a alteração na
superfície dos macrófagos infectados com todas as cepas B. fragilis estudadas,
inclusive com a diminuição das ondulações na membrana (Fig. 8 - 12, D, setas).
Os ensaios de tratamento com βCD mostraram que a depleção de
colesterol da membrana dos MØ aumenta o dano causado ao fagócito após a
interação com as cepas de B. fragilis. Tais achados sugerem que o colesterol
participa do mecanismo de interação. Já foi observado anteriormente que a
depleção de colesterol altera a ação da toxina TBF secretada por B. fragilis, em
razão da possível presença de receptores da toxina em jangadas lipídicas ricas
em colesterol. No caso deste estudo, o efeito parece ser contrário, uma vez que a
depleção do colesterol potencializa a ação da molécula produzida por B. fragilis,
causando aumento no número de poros na membrana e mais perda das
ondulações características da mesma.
Os achados obtidos sugerem que algum agente tóxico produzido por B.
fragilis causa danos aos MØ com efeito potencializado pela depleção de
colesterol. O aumento dos danos causados nos MØ sugerem fortemente a
existência de uma molécula macrofágica capaz de protegê-los contra a ação do
TBF, ou, a toxina produzida pelo B. fragilis não depende de receptores ligados às
jangadas lipídicas, tendo ação independente do colesterol dos MØ. Desta forma,
análises complementares, utilizando técnicas de proteômica serão necessárias
para elucidar a molécula envolvida no mecanismo de interação, bem como
alterações moleculares ocasionadas na superfície dos macrófagos pós-infecção.
28
6.
CONCLUSÕES
Nossos resultados demonstraram que a infecção de macrófagos
peritoneais de camundongos com cepas de B. fragilis alteram de fato a morfologia
desses fagócitos. Demostraram também que a depleção parcial do colesterol
pode intensificar os efeitos da interação, além de indicarem que não há
necessidade de contato célula:célula para que haja alteração na morfologia do
fagócitos profissionais. Portanto, a partir dos resultados conclui-se que:
1. B. fragilis não necessita do contato direto com MØ para induzir alterações
na morfologia dos mesmos, o que sugere a produção e liberação de um
agente tóxico, pela bactéria.
2. A depleção parcial do colesterol afeta de forma direta a interação de MØ
com B. fragilis, potencializando-a.
29
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADAMS, D.O. & HAMILTON, T.A. - The cell biology of macrophage activation.
Annual Review of Immunology. 2: 283-318. 1984.
ASHWELL, G. & HARFORD, J.
Carbohydrate-specific receptors of the liver.
Annual Review of Biochemistry. 51: 531-554. 1982.
BROOK, I. Pathogenicity & Therapy of anaerobic bacteria in upper respiratory tract
infections. The Pediatric Infectious Disease Journal. 6: 131-136. 1987.
BROOK, I. & FINEGOLD, S. M. Aerobic & Anaerobic Bacteriology of cutaneous
abcesses in children. Pediatrics. 67: 891-895. 1981.
BUTCHER, B.A., KIM, L., JOHNSON, P.F. & DENKERS, E.Y. Toxoplasma gondii
tachyzoites inhibit proinflammatory cytokine induction in infected macrophages by
preventing nuclear translocation of the transcription factor NF-kB. The Journal of
Immunology. 167: 2193-2201. 2001.
COHN, Z.A. The activation of mononuclear phagocytes: fact, fancy and future. The
Journal of Immunology. 121: 813-816. 1978.
COMSTOCK LE, COYNE MJ, TZIANABOS AO, PANTOSTI A, ONDERDONK AB,
KASPER DL. Analysis of a capsular polysaccharide biosynthesis locus of
Bacteroides fragilis. Infection and Immunity. 67:3525e32. 1999
CRABB, J. H., FINDBERG, R., ONDERDONK, A. B. & KASPER, D. L. T cell
regulation of Bacteroides fragilis induced intraabdominal abscesses. Reviews of
Infectious Diseases. 12 (S2): S178-184. 1990.
CROCKER, P.R. & GORDON, S.
Properties and distribution of a lectin-like
hemagglutinin differentially expressed by murine stromal tissue macrophages.
The Journal of Experimental Medicine. 164:1862-1875. 1986.
DAMATTA, R. A, SEABRA, S. H., MANHAES, L. & DE SOUZA. Nitric oxide is not
30
involved in the killing of Trypanosoma cruzi by chicken macrophages.
Parasitology Research. 86: 239-243. 2000.
DE SOUZA, W.; DUARTE, E.S.M.; URBINA, J.A.; VOMMARO, R. C.
Antiproliferative activities of two novel quinuclidine inhibitors against Toxoplasma
gondii tachyzoites in vitro. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v.58, p.59–
65, 2006.
DOBBIE, J. W. Serositis: Comparative analasys of histological findings and
pathogenic mechanisms in nonbacterial serosal inflammation. Peritoneal Dialysis
International. 13: 256-269. 1993.
DUERDEN, B. I. Virulence factors in anaerobes. Clinical Infectious Diseases. 18
(Suppl. 4): S.253-9. 1994.
DUNN, D. L., BARKE, R. A., EWALD, D. C. & SIMMONS, R. L. Macrophages and
translymphatic absortion represent the first line of host defense of the peritoneal
cavity. Archives of Surgery. 122: 105-110. 1987.
DUNN, D. L., BARKE, R. A., KNIGHT, N. B., HUMPHREY, E. W. & SIMMONS, R.
L. Role of resident macrophages, peripheral neutrophils, and translymphatic
absorption in bacterial clearance from the peritoneal cavity. Infection and
Immunity. 49:257-264. 1985.
EZEKOWITZ, R.A.B., AUSTYN, J., STAHL, P.D. & GORDON, S. Surface
properties of bacillus. Calmette-Guérin-activeted mouse macrophages reduced
expression of mannose-specific endocytosis, Fc receptors, & antigen F4/80
acompanies induction of Ia. The Journal of Experimental Medicine. 154: 60-76.
1981.
EZEKOWITZ, R.A.B. & STAHL, P.D. The structure and function of vertebrate
mannose lectin-like proteins. Journal of Cell Science. 9: 121-33. 1988.
FERREIRA, M.C.S.; DOMINGUES, R.M.C.P & UZEDA, M. In: Manual de
31
Bacteriologia de Anaeróbios, Rio de Janeiro, Brasil. 2003.
FINEGOLD, S. M., GEORGE, W. L. In: Anaerobic Infections in Humans.
Academic Press, San Diego, CA. 1989.
GIBSON III, F. C., ONDERDONK, A. B., KASPER, D. L. A & TZIANABOS, A. O.
Cellular Mechanism of Intraabdominal abscess formation by Bacteroides fragilis.
The Journal of Immunology. 160: 5000-5006. 1998.
GOLDSTEIN,
E.J.
Anaerobes
under
assault:
from
cottage
industry
to
industrialization of medicine and microbiology. Clinical Infectious Diseases.
20(2): S112-116. 1995.
GOLDSTEIN, E. J. C. & CITRON, D. M. Annual incidence, epidemiology, and
comparative in vitro susceptibilities to cefoxitin, cefotetan, cefmetazole and
ceftizoxime of recent
community-acquired isolated of the
Bacteroides fragilis
group. Journal of Clinical Microbiology. 26: 2361-2366. 1988.
HOFSTAD, T. Virulence factors in anaerobic bacteria. European Journal of
Clinical Microbiology & Infectious Diseases 11: 1044-1048. 1992.
HOLDEMAN, L. V., KELLY, R. W., & MOORE, W. E. C. Genus I. Bacteroides
Castellani and Chalmers 1919, 959 AL, p. 604-631. In Krieg, N. R. & Holt, J. G.
(ed.), Bergey’s manual of systematic bacteriology, vol. 1. The Williams &
Wilkins Co., Baltimore. 1984.
JOUSIMIES-SOMER, H. R., SUMMANEN, P., CITRON, D. M., BARON, E. J.,
WEXLER, H. M. & FINEGOLD, S. M. In: Wadsworth – KTL. Anaerobic
Bacteriology Manual. Ed. Star Publishing company. 6thed. Belmont, California.
2002.
KALKA – MOLL, W.M.; WANG, Y.; COMSTOCK, L.E.; GONZALEZ, S.E.;
TZIANABOS,
A.o.&
KASPER,
D.L.
Immunochemical
and
biological
characterization of three capsular polysaccharides from a single Bacteroides
32
fragilis strain. Infection and Immunity., 69, 2339-2644, 2001.
KASPER, D. L., ONDERDONK, A. B., POLK, B. F. & BARTLETT, J. G. Surface
antigens as virulence factors in infection with Bacteroides fragilis. Reviews of
Infectious Diseases. 1: 278-88. 1979.
LINDBERG, A. A., WEINTRAUB, A., ZAHRINGER, U. & RIETSCHEL, E. T.
Structure-activity relationships in lipopolysaccharides of Bacteroides fragilis .
Journal of Infectious Diseases. 12 Suppl. 2: 133-141. 1990.
LÜDER, C.G., ALGNER, M., LANG, C., BLEICHER, N., GROSS, U. Reduced
expression of the inducible nitric oxide synthase after infection with Toxoplasma
gondii
facilitates
parasite
replication
in
activated
murine
macrophages.
International Journal for Parasitology. 33(8):833-44. 2003.
MACMICKING, J., XIE, Q. & NATHAN, C. Nitric oxide and Macrophage fuction.
Annual Review of Immunology. 15: 323-350. 1997.
MADDAUS, M. A, AHRENHOLZ, D. & SIMONNS, R. L. The biology of peritonitis
and implications for treatment. Surgical Clinics of North America. 68: 431-443.
1988.
MILLER, R. A., & BRITIGAN, B.E. Role of oxidants in microbial pathophysiology,
Clinical Microbiology Reviews. 10(1): 1–18. 1997.
MYERS, L. L. & SHOOP, D. S. Association of enterotoxigenic Bacteroides fragilis
with diarrheal disease in young pigs. American Journal of Veterinary Research.
48: 774-775. 1987.
NAMAVAR, F., VERWEIJ-VAN VUGHT, M. A. J. J. & MACLAREN, D. M. A study of
the candidate virulence factors of Bacteroides fragilis. Journal of General
Microbiology. 137: 1431-1435. 1991.
33
ONDERDONK, A. B. Animals models simulating anaerobic infections. Anaerobe.
11: 189-195. 2005.
ONDERDONK, A. B., CISNEROS, R. L., FINBERG, R., CRABB, J. H. & KASPER,
D. L.
Animal model system for studying virulence of and host response to
Bacteroides fragilis. Reviews of Infectious Diseases. 12 (S2): S169-177. 1990.
ONDERDONK, A. B., KASPER, D. L, CISNEROS, R. L. & BARTLET, J. G. The
capsular polysaccharide of Bacteroides fragilis as a virulent factor: comparison of
the pathogenic potential of encapsulated and unencapsulated strains. Journal of
Infectious Diseases. 136: 82-89. 1977a.
ONDERDONK, A. B., WEINSTEIN, W. M., SULLIVAN, N. M., BARLETT J. G. &
GORBACH, S. L. Experimental intra-abdominal abscess in rats: Quantitative
bacteriology of infected animals. Infection and Immunity. 10: 1256-1259. 1974.
PAUL G. ENGELKIRK, JANET DUBEN-ENGELKIRK, V.R. DOWELL, JR.
Principles and Practice of Clinical Anaerobic Bacteriology, California, USA,
1992.
ROBINSON, J. P. Oxygen & Nitrogen reactive metabolites & phagocytic cells. In:
Phagocyte Function: A guide for Research and Clinical Evaluation. Ed. J. P.
Robinson & George F. Babcock, pp.217, 1998.
SEABRA, S. H., DE SOUZA, W. & DAMATTA, R.A. Toxoplasma gondii partially
inhibits nitric oxide production of activated murine macrophages. Experimental
Parasitology. 100: 62–70. 2002.
SEARS, C. L., In celebration of Sydney M. Finegold, M.D.: Bacteroides fragilis in
the colon: The good & the bad. Anaerobe 18: 192-196, 2012
SEARS, C.L., ISLAM, S., SAHA, A., ARJUMAND, M., ALAM, N.H., FARUQUE,
A.S. et al. Enterotoxigenic Bacteroides fragilis infection is associated with
inflammatory diarrhea. Clinical Infectious Diseases;47:797-803. 2008
34
SHUAI, K. Interferon-activated signal transduction to the nucleus. Current
Opinion in Cell Biology. 6: 253-259. 1994.
SUNG, S. S., NELSON, R. S. & SILVERSTEIN, S. C. Yeast mannans inhibit
binding and phagocytosis of zymosan by mouse peritoneal macrophages. The
Journal of Cell Biology. 96: 160-166. 1983.
VAN DEN BERG, T.K., BREVÉ, J.J.P., DAMOISEAUX, J.G.M.C., DÖPP, E.A.,
KELM, S., CROCKER, P.R., DIJKSTRA, C.D. & KRAAL, G.
Sialoadhesin on
macrophage: Its identification as a lymphocyte adhesion molecule. The Journal of
Experimental Medicine. 176: 647-655. 1992.
VAN FURTH, R., COHN, Z.A., HIRSCH, J.G., HUMPHREY, J.H., SPECTOR, W.G.
& LANGEVOORT, H.L. - The Mononuclear Phagocyte System: a new classification
of macrophages, monocytes and their precursors cell. Bulletin of the World
Health Organization. 46: 845-852. 1972.
VENTURINI, C.G., Nicolini J., Machado C. e Machado V.G., Propriedades e
Aplicações Recentes das Ciclodextrina, Química Nova, Vol. 31, No. 2: p 360-368
2008.
VIEIRA, J.M.B.D., VALLIM, D.C., AMÉRICO, M.A., FRACALLANZA, S.E.L.,
VOMMARO, R.C., DOMINGUES, R.M.C.P. Bacteroides fragilis induce necrosis on
mice peritoneal macrophages: In vitro and in vivo assays. Biochemical and
Biophysical Research Communications. 387(4):627-32. 2009.
VIEIRA, J.M.B.D., VALLIM, D.C, FERREIRA, E.O., SEABRA, S.H., VOMMARO,
R.C., AVELAR, K.E.S., DE SOUZA, W., FERREIRA, C.M.S., DOMINGUES,
R.M.C.P. Bacteroides fragilis interferes with iNOS activity and leads to pore
formation in macrophage surface. Biochemical and Biophysical Research
Communications. 326: 607–613. 2005.
35
WU, S., SHIN, J. ZHANG, G., COHEN, M., FRANCO, A., SEARS, C.L. The
Bacteroides fragilis toxin binds to a specific intestinal epithelial cell receptor.
Infection and immunity, Sept. 2006, p. 5382–5390