Caracterização de uma Molécula Ligadora de

HEIDI PAUER
“Caracterização
de uma Molécula Ligadora de
Fibronectina Plasmática em Bacteroides fragilis”
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências (Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos
requisitos necessários à obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas (Microbiologia)
Orientadora: Regina Maria Cavalcanti Pilotto Domingues
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA PROF PAULO DE GÓES
RIO DE JANEIRO
AGOSTO DE 2008
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ii
Pauer, Heidi
Caracterização de uma Molécula Ligadora de Fibronectina Plasmática em
Bacteroides fragilis / Heidi Pauer – Rio de Janeiro, 2008
XVI, 57
Dissertação (Mestrado em Ciências Biológicas)
Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes, 2008.
Orientadora: Regina Maria Cavalcanti Pilotto Domingues
Referências bibliográficas: 47-55
1. Aderência 2 Bacteroides fragilis. 3. Fibronectina Plasmática 4. Proteína de
membrana externa 6. Proteína de membrana externa dependente de TonB I.
Regina Maria Cavalcanti Pilotto Domingues. II. UFRJ, Instituto de Microbiologia
Prof. Paulo de Góes, Mestrado em Ciências Biológicas (Microbiologia). III.
Caracterização de uma Molécula Ligadora de Fibronectina Plasmática em
Bacteroides fragilis
iii
Heidi Pauer
Caracterização de uma Molécula Ligadora de Fibronectina Plasmática em
Bacteroides fragilis
Rio de Janeiro, 12 de agosto de 2008
(Regina Maria Cavalcanti Pilotto Domingues, Ph.D, UFRJ)
(Sergio Eduardo Longo Fracalanzza, Ph.D, UFRJ)
(Marinella Silva Laport, Ph.D, UFRJ)
(Geraldo Renato de Paula, Ph.D, UFF)
(Eliane de Oliveira Ferreira, Ph.D, UFRJ)
iv
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Biologia de Anaeróbios, Departamento de
Microbiologia Médica, Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes, Centro de Ciências da
Saúde (CCS), Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a orientação da Profª Regina Maria
Cavalcanti Pilotto Domingues.
v
A todos que me apoiaram,
ajudaram e contribuíram para
conquista de mais uma etapa
vi
“Ninguém é tão grande que
não possa aprender, nem tão
pequeno que não possa
ensinar”.
(Píndaro, poeta romano)
vii
AGRADECIMENTOS
O tempo passou e enfim é chegada a hora de agradecer a todos que de alguma forma
colaboraram para a concretização deste trabalho, ou melhor, que ajudaram a completar mais
uma etapa. Eu creio que esta parte de agradecimentos é uma tarefa difícil, pois muitas vezes
cometemos injustiças e por esquecimento não mencionamos nomes de pessoas que também
contribuíram para o trabalho. Nada na vida conquistamos sozinhos. Sempre precisamos de
outras pessoas para alcançar os nossos objetivos. Muitas vezes um simples gesto pode mudar
a nossa vida e contribuir para o nosso sucesso. Em especial eu agradeço a:
A Deus de oportunidade de chegar até aqui;
Aos meus pais que me deram não somente a vida, mas principalmente a minha
educação e condições de estudo, e que mesmo estando longe, sempre me apoiaram e me
incentivaram a seguir em frente;
As minhas irmãs (atualmente barrigudinhas – cuidem bem dos meus futuros
sobrinhos....) que sempre me “ajudaram” de uma maneira ou outra a superar problemas e
seguir em frente...;
Aos meus tios e primos, que apesar de não agüentarem mais ouvirem falar de
bactérias, clonagem, mutação, ... (e não entenderem nada), sempre me apoiaram;
A minha querida orientadora Regina Domingues que sempre demonstrou acreditar
no meu potencial, pela oportunidade oferecida, pela paciência, pela orientação e
principalmente pelo bom convívio nestes anos de trabalho. Com ela tive a oportunidade de
enriquecer meu conhecimento, espero ter alcançado as suas expectativas;
A minha co-orientadora internacional Prof. Dra. Lili (para alguns Dra. Eliane de
Oliveira Ferreira...) que apesar de ter me abandonado na graduação (foi se “divertir” nos
EUA) voltou e me ajudou muito na realização deste trabalho;
A professora Candida Ferreira, pela amizade e apoio e mesmo aposentada continua
fazendo parte da família anaeróbios;
viii
A professora Rosangela Soares pela ajuda através de seus conhecimentos para a
realização desta dissertação;
Aos demais anaeróbios, quero dizer, integrantes do Laboratório de Biologia de
Anaeróbios: a Renatinha (segundo algumas pessoas somos “chicletes”...) que tem passado
pelo mesmo sofrimento que eu (dissertação, projeto de doutorado, ....); a Karlinha (que
continua voando pelos corredores); Ilana (nova funcionária da Fiocruz) que ainda continua
com os “choques alcoólicos”; Lívia que depois da correria de seu mestrado, tem estado numa
fase mais tranqüila (eu acho que não vai durar muito)...; Priscila, praticamente uma
orientadora...; Mariana, a mãe da Alice mais fofinha do mundo; Lala (Laís), a senhora Dud’s;
Rafael, o único mestrando; Bruno, sempre muito prestativo, ajudando a todos; Felipe, o mais
novo seguidor da Livia; Natasha, a mais nova escraviária, quero dizer estagiária do
laboratório; Renato, o professor da UFF que não consegue nos abandonar; e aos sempre
anaeróbios Joyce “Maria” e DD (Deyse), uma vez anaeróbio sempre anaeróbio;
E é claro um agradecimento especial ao anaeróbio mor Joaquim, sempre disposto a
nos ajudar e me faz ficar enrolando no laboratório;
A professora Thaís Souto Padrón, Coordenadora da Pós-graduação, e as
funcionarias da secretaria da Pós-graduação Safira e Luciana, pelo suporte oferecido durante o
decorrer do mestrado;
A Dilma pela sua constante e enorme boa vontade e atenção na biblioteca;
A todos os professores e funcionários do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de
Góes pelo suporte para realizar este trabalho;
Aos órgãos financiadores: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Ministério
da Ciência e Tecnologia (MCT/Pronex) e Ministério da Saúde do Brasil, pelo suporte
financeiro.
ix
RESUMO
Heidi Pauer
Caracterização de uma Molécula Ligadora de Fibronectina Plasmática em
Bacteroides fragilis
Orientadora: Regina Maria Cavalcanti Pilotto Domingues
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em
Ciências Biológicas.
A ligação do Bacteroides fragilis a fibronectina plasmática foi investigada utilizando cepas
isoladas de bacteriemia. As cepas foram cultivadas em um meio sintético no qual variações
nas concentrações de cisteína determinaram alterações no potencial de oxido-redução (Eh).
Todas as cepas testadas foram capazes de aderir a fibronectina plasmática quando cultivadas
tanto em condições oxidadas (alto Eh) quanto reduzidas (baixo Eh). Dentre as cepas
analisadas, a 1405 foi a que apresentou maior aderência frente à fibronectina, sendo desta
forma escolhida para estudos mais detalhados. Tratamentos químicos das proteínas de
membrana externa (PMEs) (proteinase K, tripsina e metaperiodato de sódio) sugeriram o
envolvimento de uma molécula protéica na interação entre B. fragilis e fibronectina
plasmática. Análises por SDS-PAGE das PMEs revelaram diferenças entre os extratos obtidos
das duas condições de cultivo mencionadas anteriormente. Na condição oxidada, proteína de
aproximadamente 102, 100, 77, 73, 50 e 40 kDa apresentaram maior expressão. Por “dot
blotting” foi observado que quando a cepa 1405 era cultivada na condição oxidada, seus
extratos de PMEs reconheciam melhor à fibronectina. Tal resultado foi confirmado pelo
“Western blotting”, que revelou uma proteína de aproximadamente 102kDa como uma
proteína ligadora à fibronectina. Esta proteína foi seqüenciada e comparada com o genoma de
B. fragilis revelando ser uma PME dependente de TonB.
Palavras-chave: Aderência, Bacteroides fragilis, Fibronectina Plasmática, Proteína de
Membrana Externa, Proteína de Ligação a Libronectina
Rio de Janeiro
Agosto de 2008
x
ABSTRACT
Heidi Pauer
Characterization of Plasmatic Fibronectin -Binding Molecule in
Bacteroides fragilis
Orientadora: Regina Maria Cavalcanti Pilotto Domingues
Resumo da Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
(Microbiologia), Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da Universidade Federal do
Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em
Ciências Biológicas.
The binding of Bacteroides fragilis to plasmatic fibronectin was investigated using strains
isolated from bacteremia. The strains were cultivated in a synthetic media in which variations
in cysteine concentrations determined alterations in the oxidation-reduction potential (Eh). All
the strains assayed were capable of adhering to plasmatic fibronectin when cultivated under
oxidizing (higher Eh) and reducing (lower Eh) conditions. Among the strains analyzed, the
1405 strain showed greater adherence to the front fibronectin, thus it was selected for further
investigations. Chemical treatments of outer membrane protein (OMPs) (proteinase K, tripsin
and meta-sodium periodate) suggested the involvement of a proteic molecule in the
interaction between B. fragilis and plasmatic fibronectin. SDS-PAGE analysis of OMPs
revealed differences between the extracts obtained from two conditions for growing
mentioned above. On the oxidizing conditions, proteins of approximately 102, 100, 77, 73, 50
and 40 kDa showed biggest expression. By dot blotting analysis has been observed that when
the 1405 strain was cultivated under oxidizing condition, it OMPs extracts recognized better
the fibronectin. This result was confirmed by western blotting, which showed a protein of
approximately 102 kDa as a fibronectin-binding protein. This protein was sequenced and
compared with the genome of B. fragilis revealing be a putative TonB-dependent OMP.
Keywords: Adherence; Bacteroides fragilis; Plasmatic Fibronectin; Fibronectin-Binding
Protein; Outer Membrane Protein;
Rio de Janeiro
Agosto de 2008
xi
ÍNDICE
LISTA DE TABELAS E FIGURAS .................................................................................xiii
LISTA DE ABREVIATURAS ...........................................................................................xv
1 – INTRODUÇÃO ..............................................................................................................1
2 – OBJETIVOS.................................................................................................................19
3 - MATERIAIS E MÉTODOS .........................................................................................20
3.1. Cepas bacterianas .......................................................................................................... 20
3.2. Condições de cultivo .....................................................................................................20
3.3. Interferência do Eh na expressão de moléculas ligadoras a fibronectina plasmática........ 21
3.3.1. Preparo das esferas de látex ........................................................................................21
3.3.2. Triagem através de ensaios de aglutinação..................................................................21
3.4. Avaliação do envolvimento das PME na adesão à fibronectina plasmática.....................22
3.4.1. Obtenção dos extratos enriquecidos em PME..............................................................22
3.4.2. Análise eletroforética..................................................................................................23
3.4.3. Análise por “dot blotting”...........................................................................................23
3.5. Determinação da natureza química das moléculas ligadoras de fibronectina plasmática .24
3.5.1. Tratamento com tripsina e protease K......................................................................... 24
3.5.2. Tratamento com metaperiodato de sódio.....................................................................24
3.6. “Western blotting”......................................................................................................... 25
3.7. Seqüenciamento de uma das prováveis proteínas de ligação a fibronectina ....................25
4 – RESULTADOS............................................................................................................. 27
4.1. Aderência bacteriana a esferas de látex recobertas com fibronectina plasmática............. 27
4.2. Avaliação da interferência do Eh na expressão de PMEs................................................27
4.3. Avaliação do envolvimento das PME na adesão a fibronectina ...................................... 28
4.4. Determinação da natureza química da molécula ligadora a fibronectina .........................28
xii
4.5. Identificação da proteína ligadora a fibronectina plasmática em B. fragilis ....................29
5 – DISCUSSÃO.................................................................................................................37
6 – CONCLUSÕES ............................................................................................................ 46
8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 47
ANEXO............................................................................................................................... 56
xiii
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Tabela 1. Cepas de Bacteroides fragilis isoladas de bacteriemias selecionadas para este
estudo........................................................................................................................................20
Tabela 2. Identificação da proteína de B. fragilis por espectrometria de massa MALDITOFTOF (MS/MS) a partir de digestão em gel da proteína selecionada.................................30
Figura 1: Esquema da matriz extracelular. Representação das principais macromoléculas
formadoras da MEC, colágeno, integrina, fibronectina, laminina e proteoglicana...................14
Figura 2. Esquema de uma molécula de fibronectina apresentando as duas cadeias ligadas por
pontes dissulfeto e sítios de ligação a diferentes moléculas.....................................................16
Figura 3. Aderência das cepas de B. fragilis a esferas de látex recobertas com fibronectina
plasmática. Títulos de aglutinação das cepas de B. fragilis obtidos a partir de culturas em
condição oxidada (
) e reduzida (
).
(a)
Taxa de aderência: 4+: fortemente positivo; 3+:
forte positivo; 2+ moderado positivo; 1+: fraco positivo; e 0 negativo.
Cepa selecionada
para estudos mais detalhados....................................................................................................31
Figura 4. Avaliação da interferência do Eh na expressão de proteínas da membrana externa
(PME) da cepa de B. fragilis 1405 por SDS-PAGE e análise densitométrica – Linha 1 –
padrão de peso molecular (kDa); linhas 2 e 3 – PME da cepa 1405 nas condições oxidada e
reduzida, respectivamente.........................................................................................................32
Figura 5. Análises pelo método do “Dot blotting” dos extratos de PME da cepa de B. fragilis
1405 na condição oxidada (OX) e reduzida (RD). O teste foi realizado em duplicata. A
fibronectina foi utilizada como controle positivo e somente os anticorpos primário e
secundário, sem fibronectina, como controle negativo.............................................................33
Figura 6. “Dot blotting” com os extratos enriquecidos em PMEs da cepa 1405 cultivada em
meio oxidado (Ox) e reduzido (Rd). Extratos não tratados (C) incubados com fibronectina
plasmática e marcados com anticorpo anti-fibronectina foram utilizados como controle. Os
xiv
extratos de PME foram incubados com metaperiodato de sódio (M), proteinase K (P) e
tripsina (T). As amostras foram testadas em duplicata. Fibronectina plasmática (10 µg/mL) foi
utilizado como controle positivo, e o anticorpo primário e secundário sem fibronectina foram
utilizados como controle negativo............................................................................................34
Figura 7. SDS-PAGE e análise por “Western blotting” das PME da cepa 1405 obtida a partir
de crescimento em condições oxidadas (Ox) e reduzidas (Rd). Linha 1: Padrão de peso
molecular; linha 2: controle da fibronectina plasmática; linha 3: PME da cepa 1405 obtidas a
partir de condição oxidada (Ox); linha 4: PME da cepa 1405 obtidas a partir de condição
reduzida (Rd); linha 5, 6, 7: bandas detectadas pelo “western blotting” . A seta () indica as
bandas detectadas......................................................................................................................35
Figura 8. SDS-PAGE e análise por “Western blotting” das PME da cepa 1405 obtida a partir
de crescimento em condições oxidadas (Ox) e reduzidas (Rd). Linha 1: Padrão de peso
molecular; linha 2: PME da cepa 1405 obtidas a partir de condição oxidada (Ox); linha 3:
PME da cepa 1405 obtidas a partir de condição reduzida (Rd); linha 4, 5: bandas detectadas
pelo “Western blotting” . A seta () indica as bandas detectadas...........................................36
Figura 9: Exemplos de proteínas de membrana externa dependente de TonB: FepA e a
OmpA........................................................................................................................................44
xv
LISTA DE ABREVIATURAS
AEC
3-amino-9-ethylcarbazole
BfPAI
Ilha de patogênicidade de B. fragilis (Bacteroides fragilis Pathogenicity Island)
BFT
Toxina do Bacteroides fragilis (Bacteroides fragilis toxin)
BHI
Caldo de infusão de cérebro e coração (Brain Heart Infusion)
BSA
Soro Albumina bovina (Bovine Serum Albumin)
cm
Centímetros
CPC
Complexo Polissacarídico Capsular
DNA
Ácido desoxirribonucléico (Deoxyribonucleic acid)
DO
Densidade ótica
EDTA
Ethylenediaminetetraacetic acid
Eh
Potencial redox ou potencial de oxido-redução
ETBF
Bacteroides fragilis enterotoxigênica (Enterotoxigenic Bacteroides fragilis)
GAGs
Glicosaminoglicanas
g/L
Gramas por litro
h
Hora
Kb
Kilobases
LPS
Lipopolissacarídeo
M
Molar
MEC
Matriz extracelular
mg/L
Miligramas por litro
min
minutos
ml
Mililitros
mM
Milimolar
mv
Milivolts
xvi
NTBF.
Bacteroides fragilis não enterotoxigênica (Non-toxigenic Bacteroides fragilis)
OX
Condição oxidada
PAGE
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (Polyacrilamide gel electro phoresis)
Pb
Pares de bases
PBS
Tampão fosfato (Phosphate buffer saline)
PCR
Reação em Cadeia da Ppolimerase (Polymerase Chain Reaction)
PME
Proteínas de Membrana externa
PRAS
Pré-reduzido e esterilizado em anaerobiose (Pre-Reduced Anaerobically
Sterilized)
PSA
Polissacarídeo A do B. fragilis
RD
Condição reduzida
Rpm
Rotação por minuto
rRNA
Ácido ribonucléico ribossômico (Ribossomal ribonucleic acid)
s
Segundos
SDS
Sodium dodecyl sulphate
UFC
Unidade formadora de colônias
UFRJ
Universidade Federal do Rio de Janeiro
V
Volts
Zn
Zinco
µg
Microgramas
µL
Microlitros
µm
Micrometros
ºC
Graus Celsios
1 – INTRODUÇÃO
Um dos maiores temas da vida em nosso planeta é a complexa e benéfica interação
que ocorre entre eucariotos e procariotos. As interações que ocorrem entre seres humanos e as
bactérias se inserem neste contexto. Como adultos, albergamos uma diversa comunidade
bacteriana cujo número total excede a soma de todas as nossas células somáticas e
germinativas (SAVAGE, 1977; XU et al., 2003). Durante os primeiros dias de vida, se inicia
a colonização da superfície do hospedeiro por várias bactérias e, gradualmente, parte delas
passam a compor a microbiota indígena. Ao longo da vida passamos a ser expostos
continuamente a um fluxo de microrganismos através do contato com outros indivíduos,
animais e ambiente local. A colonização inicial é influenciada tanto por fatores inatos quanto
ambientais, os quais podem explicar a composição específica da microbiota de cada sítio, por
exemplo, a microbiota da cavidade oral é diferente da presente na parte inferior do trato
gastrointestinal (KÖNÖNEM, 2005).
O intestino humano é colonizado por um complexo e abundante consórcio de
microrganismos que, junto com a barreira mucosa e o sistema imune local, são parte do
ecossistema intestinal (GORDON et al., 1997). Como já mencionado, o número total de
bactérias que colonizam nossa superfície corporal é estimado como sendo cerca de 10 vezes
maior do que o número total de células somáticas. O impacto dessa comunidade microbiana
na fisiologia humana é mais pronunciado no intestino, tendo em vista de que esse órgão
contém a maioria de nossas bactérias (SAVAGE, 1977; ZOCCO, 2007). O hospedeiro é
protegido da microflora intestinal residente por barreiras físicas e químicas formadas pelo
epitélio gastrointestinal (KAGNOFF et al., 1997). Essas barreiras são reforçadas pela resposta
imune adquirida da mucosa. Durante o desenvolvimento deste ecossistema, as células B e T
antígeno específicas aprendem a regular as suas respostas aos microrganismos residentes,
tanto que um estado de controlada inflamação é estabelecido em hospedeiros adultos
2
(CEBRA, 1999). A microflora intestinal é a chave reguladora do sistema imune desde que ela
seja capaz de induzir tolerância a certos epítopos microbianos e uma potencial resposta imune
contra outros (BRAUN-FAHRLANDER et al., 2002). Sabe-se que esses microrganismos e
seus genomas nos fornecem importantes atividades fisiológicas que não são codificadas pelo
próprio genoma humano, como a habilidade de realizar várias reações bioquímicas
(HOOPER, MIDTVEDT & GORDON, 2002).
As bactérias anaeróbias são componentes predominantes da microbiota anfibiôntica
podendo ser encontradas em diversos sítios anatômicos do corpo humano, como a cavidade
oral, a pele, o trato genital feminino e o trato gastrointestinal (GIBBONS, 1974; GORBACH,
1977; SHAH, 1992). Esses microrganismos participam efetivamente do metabolismo
hospedeiro através da produção de vitaminas essenciais, cofatores e ácidos graxos
(FERREIRA, DOMINGUES & UZEDA, 2003).
Juntamente com os anaeróbios facultativos, os anaeróbios estritos presentes na
microbiota fornecem uma barreira natural à colonização por microrganismos patogênicos. Por
outro lado, as superfícies altamente colonizadas representam também as “portas de entrada”
para os tecidos e para a corrente sangüínea. Após qualquer tipo de comprometimento da
integridade destas superfícies, estes microrganismos têm acesso a áreas usualmente estéreis,
levando ao estabelecimento de infecções endógenas (FERREIRA, DOMINGUES & UZEDA,
2003). As infecções anaeróbias podem ocorrer em todos os sítios anatômicos, incluindo o
sistema nervoso central, abdômen, pélvis, pele e tecidos moles. Pelo fato de serem fastidiosos,
esses organismos são de difícil isolamento a partir de espécimes clínicos e desta forma são
freqüentemente negligenciados. Sua freqüência de associação a processos infecciosos é ainda
pouco elucidada, devido ao uso de métodos inadequados para isolamento e identificação, uma
vez que são requeridas técnicas específicas de coleta, transporte e cultivo de espécimes
3
obtidos de quadros que possam ter microrganismos anaeróbios envolvidos na sua etiologia
(SUMMANEN et al.,1993; BROOK, 2002a).
As bactérias anaeróbias mais importantes clinicamente consistem dos gêneros
Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyromonas spp., Fusobacterium spp. e Bilophila spp.
(bastonetes Gram-negativos), Peptostreptococcus spp. (cocos Gram-positivos), Clostridium
spp. (bacilos Gram-positivos formadores de esporos) e Actinomyces spp., Propionibacterium
spp., Eubacterium spp., Lactobacillus spp. e Bifidobacterium spp. (não esporulados) e
Veillonella spp. (cocos Gram-negativos) (FINEGOLD, 1977; SUMMANEN et al., 1993;
BROOK, 2002b).
No intestino grosso, estão presentes aproximadamente 1800 gêneros, englobando
cerca de 15000 a 36000 espécies bacterianas, destas, cerca de 90% correspondem aos filos
Firmicutes e Bacteroidetes e acredita-se que espécies dos gêneros Bacteroides,
Bifidobacterium e Eubacterium estejam dentre as predominantes (DIBAISE et al., 2008). O
rompimento do equilíbrio na relação entre a microbiota e o hospedeiro pode selecionar
algumas espécies microbianas que passam da condição de comensais à patógenos,
estabelecendo um modelo de infecção oportunista de origem endógena (JOUSIMIES-SOMER
et al., 2002). Diferentes espécies do gênero Bacteroides são predominantes na microbiota
anfibiôntica intestinal humana (POXTON et al., 1997). As espécies mais frequentemente
isoladas de amostras fecais são B. vulgatus e B. thetaiotaomicron, enquanto que B. fragilis é o
patógeno anaeróbio mais comum em infecções intra-abdominais e pélvicas (FINEGOLD,
1977). Esses processos infecciosos endógenos são mais frequentemente polimicrobianos,
envolvendo espécies aeróbias e anaeróbias, onde o resultado da infecção é fortemente
influenciado pelas características patogênicas das diferentes espécies envolvidas (SZOKE et
al., 1997).
4
O gênero Bacteroides é composto por espécies de bactérias anaeróbias estritas na
forma de bastonetes Gram-negativos, não esporulados, não móveis, sacarolíticos e resistentes
à bile. No passado, devido a pobre definição do gênero, mais de 50 espécies de Bacteroides
foram listadas no Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology (HOLDEMAN, KELLEY &
MOORE, 1984). Após novos estudos e realocação de várias espécies em novos gêneros,
criou-se o chamado “grupo Bacteroides fragilis”, do qual faziam parte 10 espécies, sendo
elas: Bacteroides distasonis, B. eggerthi, B. caccae, B. merdae, B. stercoris, B. ovatus, B.
uniformis, B. vulgatus, B. thetaiotaomicron e B. fragilis. Através da análise da seqüência do
gene 16S rRNA, as espécies B. distasonis e B. merdae foram reclassificadas e transferidas
para um novo gênero, passando a se chamar Parabacteroides distasonis
e P. merdae
(SAKAMOTO & BENNO, 2006). Recentemente, o chamado “grupo B. fragilis” foi extinto e
suas espécies passaram a fazer parte novamente apenas do gênero Bacteroides juntamente
com outras espécies menos conhecidas de Bacteroides (OLSEN & SHAH, 2008).
Os anaeróbios são predominantes na microbiota do intestino, onde chegam a superar
as bactérias facultativas em uma proporção de 1000:1 (WILLIS, 1991). Apesar do predomínio
do gênero Bacteroides nestas populações anfibiontes, a espécie B. fragilis é a que está
presente em menor número, representando cerca de 2% da microbiota fecal humana (SHAH
& COLLINS, 1989; SHAH, 1992). As demais espécies do gênero é que na verdade
representam os principais componentes desta população microbiana, como por exemplo, o B.
thetaiotaomicron que representa 6% de todas as bactérias e 12% dos Bacteroides (ZOCCO,
2007), estas, entretanto, não são isoladas de forma tão significativa a partir de processos
infecciosos como a espécie B. fragilis, que chega a ser considerada como a de maior
importância na clínica médica, dentre os anaeróbios (FINEGOLD & LANCE, 1989;
PANTOSTI et al., 1995; SZÖKE et al., 1996). Tal constatação tem incentivado
microbiologistas a pesquisarem a existência de fatores de virulência na espécie que expliquem
5
o seu maior potencial de agressão (NAMAVAR et al., 1989; HOFSTAD, 1992; PATRICK,
1993; BOTTA et al., 1994).
Muitos fatores de virulência de B. fragilis têm sido apresentados como responsáveis
por sua sobrevivência e disseminação no organismo hospedeiro (KASPER et al., 1979a).
Parâmetros ambientais são capazes de influenciar diretamente na expressão de fatores de
virulência bacterianos, como a temperatura, o pH, a osmolaridade, a disponibilidade de fontes
de carbono e de ferro e o potencial de oxido-redução (Eh) (FINLAY & FALKOW, 1997).
Alguns estudos sugerem que apesar de B. fragilis estar em menor quantidade na microbiota
fecal, ele é o principal microrganismo associado à mucosa do cólon (NAMAVAR et al.,
1989). A sua proximidade a mucosa intestinal do corpo em decorrência de suas propriedades
adesivas poderiam assim contribuir para a sua atuação como o mais importante patógeno do
gênero em infecções extra-intestinais (POXTON et al., 1997).
Um fator fortemente associado à virulência desta espécie é a expressão de uma cápsula
polissacarídica. Os polissacarídeos capsulares de B. fragilis são importantes determinantes
imunológicos de resposta celular e humoral em hospedeiros animais e humanos e possuem
estruturas bioquímicas distintas de outros antígenos capsulares bacterianos (KASPER et al.,
1979b; SHAPIRO et al., 1982; ONDERDONK et al., 1989). Estruturalmente, esses
polissacarídeos compõem um complexo iônico de moléculas referido como Complexo
Polissacarídico Capsular (CPC) (ONDERDONK et al., 1977; SHAPIRO et al., 1986). O CPC
é capaz de induzir a formação de abscessos intra-abdominais em animais de experimentação
(ONDERDONK et al., 1977; PANTOSTI et al., 1993; TZIANABOS et al., 1993;
PANTOSTI et al., 1995), sendo também responsável pela aderência do B. fragilis a células do
hospedeiro (PRUZZO, GUZMÀN & DAINELLI, 1989). Inicialmente, foram decritos três
polissacarídeos capsulares, denominados A, B e C (TZIANABOS et al., 1992; COMSTOCK,
PANTOSTI & KASPER, 2000; KALKA-MOLL et al., 2001). Em 2001, Krinos e
6
colaboradores demonstraram que a espécie é capaz de modular seus antígenos de superfície
pela expressão de até oito polissacarídeos capsulares distintos. No entanto, a principal
característica desses polissacarídeos é a presença de grupos com cargas positivas e negativas
em cada unidade repetitiva. Estes domínios específicos carregados são denominados
“zwitterions” e interagem com o sistema imune hospedeiro de forma a coordenar uma
resposta celular que freqüentemente leva a formação de abscessos (KALKA-MOLL et al.,
2001; RUIZ-PEREZ et al., 2005). Recentemente foi verificado que o polissacarídeo A (PSA)
de B. fragilis encontrado na microbiota anfibiôntica intestinal ajuda a proteger o hospedeiro
de doenças inflamatórias intestinais (MAZMANIAN, ROUND & KASPER, 2008).
Outras estruturas que também são importantes no processo de adesão de B. fragilis são
as estruturas fimbriais (PRUZZO, DAINELLI & RICCHETTI, 1984) e as proteínas de
membrana externa (PME) (PATRICK et al.,1988; DOMINGUES et al., 1991; FERREIRA et
al., 2006). As PME também são importantes na manutenção da estrutura da célula, e no
transporte passivo (WEXLER, 2002). Pelo fato da membrana externa ser a primeira barreira
encontrada pelos antibióticos, as PME podem interferir na sua habilidade de matar ou inibir o
crescimento da célula bacteriana. Apesar de existir pouca informação a respeito do papel que
as PME desempenham em bactérias anaeróbias, alguns estudos realizados com algumas
espécies similares as espécies encontradas no gênero Bacteroides, como P. distasonis,
demonstraram que a alta resistência desses microrganismos pode não estar relacionada com a
produção de β-lactamases, já que a maioria das cepas são negativas para a produção desta
enzima e sim com alterações em PME tipo porinas (WEXLER, 2002). Em 1998, Domingues e
colaboradores realizaram um estudo comparando o perfil de PME de diferentes cepas de B.
fragilis, previamente categorizadas como virulentas (isoladas de processos infecciosos) ou
avirulentas (isoladas de meio ambiente e microbiota humana), e mostraram que as cepas de
origem comensal apresentavam um perfil de PME diferente daquelas isoladas de processos
7
infecciosos. Além disso, estas cepas mostraram baixos títulos aglutinantes em ensaios
realizados com anticorpos preparados a partir de extratos de proteínas totais de cepas
virulentas. Os autores sugeriram que a diferença no perfil das PME das cepas de origem
comensal em relação aos isolados clínicos possa estar correlacionada com a virulência da
espécie.
Outro possível atributo de virulência é a produção de enzimas extracelulares como
hialuronidases, DNAses, lipases e proteases que em um sítio infeccioso poderiam ajudar na
degradação de componentes do tecido hospedeiro e facilitar a nutrição. Além de contribuir
para a evasão do sistema imune e disseminação bacteriana (MACFARLANE & GIBSON,
1988; GUZMÁN, PLATÉ & PRUZZO, 1990; MACFARLANE & MACFARLANE, 1991).
Em 1996, Patrick e colaboradores, relataram a liberação de vesículas de membrana externa
pela espécie B. fragilis as quais, aparentemente, estariam envolvidas na amplificação do
potencial patogênico desta bactéria em decorrência do fato de carrearem tanto enzimas como
moléculas de LPS.
Algumas cepas de B. fragilis são capazes de produzir uma enterotoxina denominada
“Bacteroides fragilis Toxin” (BFT). A BFT, também conhecida como uma colagenase do tipo
IV, é uma metaloprotease dependente de Zn++ capaz de induzir a uma resposta secretória no
trato intestinal de humanos e outros animais com subseqüente estabelecimento de um quadro
de diarréia aquosa (MONCRIEF et al., 1995). Essa toxina é codificada pelo gene bft e é capaz
de alterar a morfologia de células epiteliais do trato intestinal (FRANCO et al., 1997;
CHUNG et al., 1999). Franco e colaboradores, em 1999, relataram que o gene bft está contido
em um pequeno elemento genético, designado ilha de patogênicidade de B. fragilis
(“Bacteroides fragilis Pathogenicity Island” – BfPAI). As cepas produtoras de BFT são
denominadas “Enterotoxigenic Bacteroides fragilis” (ETBF) e foram associadas a casos de
diarréia em humanos pela primeira vez em 1987 nos Estados Unidos, por Myers e
8
colaboradores, e inúmeros estudos subseqüentes vieram a comprovar a associação de cepas
ETBF e a diarréia humana (SACK et al., 1992; SACK et al., 1994; PANTOSTI et al. 1997).
Existem ainda na literatura relatos do isolamento de cepas ETBF de quadros de bacteriemias,
sugerindo uma possível atuação para esta toxina nos estágios iniciais dos processos
extraintestinais (PANTOSTI et al., 1994; KATO et al., 1996; PANTOSTI et al., 1997).
Atualmente, sabe-se que a BFT pode estar associada ao desenvolvimento de doenças
inflamatórias crônicas (PRINDIVILLE et al., 2000; SEARS, 2006) e também a processos de
câncer do cólon (TOPRAK et al., 2006).
A BFT atua clivando proteínas constituintes das junções celulares (“tight junctions”),
como a E-caderina, e esta degradação proteolítica determina alterações na morfologia das
células epiteliais, propiciando tanto a perda de fluidos como processos de inflamação e
translocação bacteriana (HÄSE & FINKELSTEIN, 1993; KATO et al., 1996; WU et al.;
1998). Em 1999, Franco e colaboradores estudaram de forma comparativa cepas ETBF e
cepas de B. fragilis não-enterotoxigênicas (“Non-toxigenic Bacteroides fragilis” – NTBF).
Foi verificado que a BfPAI, que albergava o gene bft e um gene para uma segunda
metaloprotease (mpII), estava presente exclusivamente em cepas ETBF, sendo estas definidas
como pertencentes ao padrão genético I. Cinqüenta e dois porcento das cepas NTBF
analisadas não possuíam nem BfPAI nem uma região lateral à BfPAI, de aproximadamente 12
kb. Estas cepas foram designadas NTBF padrão II. As cepas NTBF restantes não
apresentavam BfPAI, mas continham a região lateral, sugerida como sítio de inserção para a
ilha e estas foram designadas como NTBF pertencentes ao padrão genético III (FRANCO et
al., 1999).
Em um trabalho realizado por nosso grupo de pesquisa, Antunes e colaboradores, em
2004, descreveram a detecção de um baixo percentual de cepas ETBF no Brasil. No entanto,
os autores atentaram para a presença de um percentual considerável de cepas NTBF
9
pertencentes ao padrão III, isoladas tanto de fezes de crianças diarréicas como de crianças
saudáveis. Este dado veio a sugerir a possibilidade de futuras mudanças no fenótipo de
enterovirulência de B. fragilis em nosso país.
A questão da resistência aos antimicrobianos também tem sido considerada por alguns
autores no âmbito da virulência de B. fragilis (SALYERS & SHOEMAKAER, 1995;
SALYERS & SHOEMAKAER, 1996). A princípio pode-se imaginar que cepas mais
virulentas são as que possuem maior capacidade de causar dano na cavidade intra-abdominal.
No entanto, microrganismos bem sucedidos não são necessariamente os mais agressivos, mas
sim os que possuem a capacidade de suplantar as condições adversas do ambiente como a
limitação de fontes de nutrientes, a atuação das defesas do hospedeiro ou a ação de
antimicrobianos (SIMON & GORBACH, 1984). O tratamento da maioria das infecções
anaeróbias, quase sempre, torna-se complicado pela natureza polimicrobiana das infecções e
pela crescente resistência aos antimicrobianos que esse grupo microbiano vem apresentando
desde a década de 1970 (TALLY et al., 1979; BROOK, 2002a). Neste contexto, dentre as
bactérias anaeróbias, o gênero Bacteroides é o que possui o maior espectro de mecanismos de
resistência desenvolvidos contra vários antimicrobianos empregados no tratamento das
infecções, em especial aos β-lactâmicos (TALLY et al., 1979). Com isso, as espécies desse
gênero têm representado importantes modelos no estudo da resistência bacteriana
(RASMUSSEN, BUSH & TALLY, 1997). O extinto “grupo B. fragilis” era um grupo
heterogêneo quanto a susceptibilidade aos agentes antimicrobianos, especialmente aos βlactâmicos e à clindamicina. A espécie B. fragilis foi por muitos anos considerada como a
mais susceptível aos agentes antimicrobianos utilizados no tratamento de infecções por
anaeróbios (RASMUSSEN, BUSH & TALLY, 1997). Entretanto, em um trabalho realizado
por Koeth e colaboradores (2004), foram detectadas cepas de B. fragilis apresentando
resistência ao imipenem, à clindamicina e à amoxicilina/ácido clavulâmico. Neste estudo,
10
também foi verificada a presença de duas cepas resistentes ao metronidazol, considerado um
dos principais antimicrobianos utilizados no tratamento de infecções anaeróbias.
Como já mencionado anteriormente, B. fragilis é a bactéria anaeróbia mais
freqüentemente isolada de processos infecciosos em humanos, incluindo infecções intraabdominais e bacteriemias. Um caso de bacteriemia anaeróbica é definido a partir do
isolamento, em uma hemocultura, de uma bactéria anaeróbica sozinha ou em combinação
com outros microrganismos (HUNG et al., 2005). A presença de bacteriemia anaeróbia tem
diminuído constantemente através de várias décadas passadas. Na década de 1970, os casos de
bacteriemias em pacientes que sofreram queimaduras representavam 25% e hoje, representam
cerca de 5% (GOLDSTEIN, 1996). Estas infecções geralmente são secundárias a um foco de
infecção primária e apesar de possuirem uma baixa incidência e um menor impacto clínico
(0,5 a 9%) (HUNG et al., 2005; ZAHAR et al., 2005), permanecem associadas a uma
significativa mortalidade (27-55%) (REGULES et al., 2007), provavelmente devido à
dificuldade de isolamento e identificação destes microrganismos (WILSON & LIMAYE,
2004).
Os organismos especificamente envolvidos nas bacteriemias anaeróbias dependem
assim de uma doença de base, latente ou não, como neoplasias, cirurgias gastrointestinais,
obstétricas ou ginecológicas recentes, obstrução intestinal, extração dentária, dentre outros
(BROOK, 2002a; 2002b). B. fragilis, juntamente com outros membros do antigo “grupo B.
fragilis” representam de 36-64% dos anaeróbios isolados do sangue (MORRIS et al., 1993).
Outros microrganismos anaeróbios frequentemente isolados de hemocultura são os
Clostrideos, especialmente C. perfringens, além de Peptostreptococcus spp., Prevotella spp.,
Porphyromonas spp. e Fusobacterium spp. (BROOK, 2002a; 2002b), sendo o trato
gastrointetinal a principal fonte de contaminação responsável por metade das bacteriemias
11
anaeróbias e o trato genital feminino responsável por 20% destes quadros (MORRIS et al.,
1993).
B. fragilis, assim como outras bactérias anaeróbias, em condições fisiológicas de
colonização no trato intestinal não são expostas ao oxigênio. Porém, quando estas são
expostas a um ambiente aeróbio, como no caso de uma bacteriemia, o estresse oxidativo é
praticamente inevitável e por isso uma resposta adaptativa pode ser desencadeada. Os
mecanismos utilizados por estas bactérias para sobreviverem em ambientes oxigenados ainda
não estão totalmente elucidados, mas alguns estudos têm demonstrado que na espécie B.
fragilis a expressão de enzimas como a catalase e a superóxido desmutase pode vir a
determinar uma proteção efetiva contra a toxicidade do oxigênio (Rocha & Smith, 1998). Em
1989, Albright e colaboradores sugeriram a existência de uma série de sensores microbianos
que permitem aos microrganismos a produção, rápida e coordenada, de uma resposta às
mudanças ambientais. Também em 1989, Miller, Mekalanos & Falkow destacaram que a
expressão de fatores de virulência poderia estar diretamente associada aos reguladores de
respostas às condições ambientais.
Para as bactérias anaeróbias obrigatórias, o potencial de oxido-redução ou potencial
redox (Eh) representa um importante parâmetro ambiental na capacidade de sobrevivência.
Sabe-se que estes microrganismos necessitam de ambientes com Eh mais baixo em função da
necessidade da manutenção de grupamentos sufidrilas de enzimas essenciais na forma
reduzida (GOLDNER, 1984). A presença de oxigênio vem a ser tóxica não apenas em função
da geração de radicais livres, mas também pela oxidação de tais grupamentos. Assim, as
bactérias anaeróbias buscam na natureza sítios específicos que apresentem não só uma baixa
tensão de oxigênio, mas também um baixo Eh, condições que estão presentes, por exemplo,
no cólon humano (GOLDNER, 1984).
12
A resposta do B. fragilis ao estresse oxidativo pode representar uma vantagem
adaptativa durante os primeiros eventos para o estabelecimento de um processo infeccioso e é
fato que a capacidade de sobrevivência de uma bactéria representa também um aspecto
decisivo no seu potencial de agressão. Em 1993, Goldner e colaboradores realizaram
experimentos onde uma cepa de B. fragilis foi cultivada em diferentes níveis de Eh utilizando
como agente redutor a cisteína em concentrações variáveis de 0,05 g/L (oxidado) e 2,5 g/L
(reduzido), sendo avaliada a capacidade de aderência e invasão a linhagem de células HeLa.
Os autores demonstraram que ao cultivar B. fragilis em um meio mais oxidado, este era capaz
de penetrar mais facilmente nas células e quando a bactéria era cultivada em um meio mais
reduzido, estas apresentavam uma tendência de se agregarem na superfície da linhagem de
células HeLa. Estes resultados sugeriram uma relação entre o Eh e as propriedades de
aderência e invasão de B. fragilis.
A aderência a tecidos do hospedeiro representa um evento crucial no processo de
estabelecimento de uma infecção, uma vez que microrganismos não aderentes são
rapidamente eliminados por eficientes mecanismos fisiológicos de remoção bacteriana.
Microrganismos que conseguem aderir a tecidos do hospedeiro podem permanecer no
ambiente extracelular e colonizá-lo ou serem internalizados para um compartimento
intracelular, permitindo um escape dos mecanismos de defesa do hospedeiro (OFECK,
HASTY & DOYLE, 2003). Os mecanismos de aderência podem ser substancialmente
diferentes entre bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, de acordo com as características
das suas superfícies. Nas bactérias Gram-positivas a parede celular é formada por proteínas,
ácido teicóico e lipoteicóico, peptideoglicana e polissacarídeos, todos já havendo sido
implicados em processos de aderência. As bactérias Gram-negativas expressam em sua
superfície fimbrias, proteínas de membrana externa, lipopolissacarídios e o glicocálice,
13
estruturas estas também já descritas como adesinas para inúmeras espécies (MADIGAN,
MARTINKO & PARKER, 2004).
As adesinas bacterianas são estruturas de superfície que reconhecem receptores
específicos presentes nas células eucarióticas ou em moléculas hospedeiras presentes em
determinados sítios corporais. É este reconhecimento que influencia e define o nicho que a
bactéria é capaz de ocupar e o seu tropismo por determinada região o hospedeiro (OFEK,
HASTY & DOYLE, 2003). Para o gênero Bacteroides diversas estruturas de superfície já
foram descritas como possíveis adesinas (ODERDONK et al., 1977; HOFSTAD, 1992;
PATRICK, 1993). Como já mencionado, as fimbrias parecem estar envolvidas em processos
de hemaglutinação e adesão à células intestinais humanas (PRUZZO, DAINELLI &
RICHETTI, 1984; FERREIRA et al., 1999) e adesinas do tipo lectinas também já foram
descritas para a espécie (ROGEMOND & GUINET, 1986), assim como ácido siálico e
macromoléculas ricas neste açúcar já foram identificados como possíveis receptores para estas
adesinas (DOMINGUES et al., 1992).
Muitos autores têm demonstrado que componentes da matriz extracelular (MEC) são
alvos potenciais para aderência de microrganismos patogênicos (VERCELOTTI et al., 1985;
PAULSSON, LJUNG & WADSTRÖN, 1992) e que diversas espécies expressam estruturas
de superfícies específicas para esses componentes sendo essas referidas como “Componentes
de Superfície Microbiana que Reconhecem Moléculas Adesivas da Matriz” (MSCRAMMs –
Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules) (PATTI et al.,
1994).
A MEC é uma complexa rede de macromoléculas encontrada em todos os organismos
multicelulares, principalmente no tecido conjuntivo de órgãos do corpo dos vertebrados e
apresentam diferentes e complexas funções, principalmente funções regulatórias sobre as
14
células com as quais estão em contato, podendo influenciar no seu desenvolvimento,
migração, proliferação, forma e função (ALBERTS et al., 1997).
A capacidade de cepas bacterianas de aderir a componentes da MEC já foi descrita
para várias espécies tais como, Streptococcus pyogenes (KREIKEMEYER, KLENK &
PODBIELSKI, 2004), Staphylococcus aureus (BENTZMANN et al., 2004) e Pseudomonas
aeruginosa (BENTZMANN, PLOTKOWSKI & PUCHELLE, 1996). Tal capacidade pode
estar envolvida diretamente com a patogenicidade desses microrganismos (HALL et al., 2003;
SILLANPA et al., 2004).
Figura 1: Esquema da matriz extracelular. Representação das principais macromoléculas
formadoras da MEC, colágeno, integrina, fibronectina, laminina e proteoglicana.
As macromoléculas que constituem a MEC são produzidas por células localizadas na
própria matriz e na maioria dos casos, essas são fibroblastos, condroblastos e osteoblastos
(ALBERTs et al., 1997). Existem duas classes principais de macromoléculas formando a
MEC (Figura 1): as glicosaminoglicanas (GAGs), que são cadeias polissacarídicas
normalmente encontradas ligadas covalentemente a proteínas formando proteoglicanas, e as
15
proteínas fibrosas, que possuem dois tipos funcionais distintos: o estrutural (colágeno e
elastina) e o adesivo (fibronectina e laminina). As proteínas fibrosas são responsáveis pela
resistência a forças elásticas, pela organização da matriz e pela ligação entre a matriz e as
células que a circundam ou que nela estão embebidas (função adesiva) (ALBERTS et al.,
1997; LODISH et al., 2002).
A membrana basal é um tipo especializado de MEC e representa uma das barreiras
iniciais para o estabelecimento de infecções causadas pelo B. fragilis, sejam elas infecções
invasivas na cavidade peritoneal ou bacteriemias com disseminação para outros órgãos
considerados alvos potenciais como o fígado, o cérebro e os pulmões, já que essa membrana
está subjacente ao epitélio intestinal, cuja microbiota faz parte o B. fragilis, ou recobrindo o
endotélio. A membrana basal ou lâmina basal é uma camada fina e contínua que separa o
tecido conjuntivo do parênquina. Ela é formada de glicoproteínas e proteoglicanas que
interagem umas com as outras. Os principais componentes da MEC que formam a lâmina
basal são o colágeno tipo IV, a laminina, o nidogênio e o sulfato de heparana. Também são
encontrados em menor quantidade a fibronectina, a osteonectina e o colágeno tipo VII
(YURCHENKO & SCHITTNY, 1990).
Além de estarem presente na membrana basal, vários componentes da MEC estão
presentes no plasma ou em outros fluidos corporais como, por exemplo, a fibronectina e a
vitronectina. A conformação de alguns componentes difere significativamente quando a
glicoproteína está imobilizada em tecidos ou na superfície ou na sua forma solúvel (LJUNGH,
MORAN & WADSTRÖN, 1996). Alguns autores têm relatado que adesinas microbianas
como Yad A expressa por Yersinia enterocolitica e a fímbria P de Escherichia coli se ligam a
fibronectina imobilizada, mas não a fibronectina solúvel, o que pode significar que estas
adesinas reconheçam um domínio que é somente exposto quando a fibronectina está
imobilizada no tecido (WESTERLUND et al., 1991; SCHULZE-KOOPS et al., 1993).
16
A fibronectina é uma glicoproteína dimérica que consiste de duas cadeias de
polipeptídios similares, mas não necessariamente idênticas, ligados por pontes dissulfeto na
região carboxi(C)-terminal (figura 2) (ROMBERGER, 1997). Esta proteína apresenta uma
estrutura extensa e flexível, além de possuir sítios de ligação para diferentes células e
moléculas, incluindo sulfato de heparana, DNA, colágeno, actina e fibrina, bem como para
bactérias e superfície de células eucariota (DEAN, 1989; WALIA et al., 2004). A fibronectina
tem a capacidade de interagir fortemente com outros componentes da MEC e está envolvida
em diversos processos celulares como adesão, migração e disseminação celular, organização
do citoesqueleto (microfilamentos), transformação oncogênica, fagocitose, dentre outros
(HYNES & YAMADA, 1982, KWON, QIU & HIRAON, 2007).
Figura 2. Esquema de uma molécula de fibronectina apresentando as duas cadeias ligadas por
pontes dissulfeto e sítios de ligação a diferentes moléculas.
Podem ser encontrados no organismo humano pelo menos dois tipos de fibronectina: a
fibronectina celular e a fibronectina plasmática. A fibronectina celular está presente na MEC
na sua forma imobilizada sendo sintetizada por diferentes tipos celulares como fibroblastos,
condrócitos, células endoteliais, algumas células epiteliais e macrófagos, depositado e
organizado na MEC. A fibronectina plasmática é encontrada no plasma na sua forma solúvel
17
sendo sintetizada e excretada principalmente pelos hepatócitos (WALIA et al., 2004; KWON,
QIU & HIRAON, 2007). Embora estas duas formas de fibronectina sejam distintas, são
muitos similares quanto a aspectos estruturais e às suas propriedades (HYNES & YAMADA,
1982). A fibronectina plasmática é uma proteína de alto peso molecular (220 kDa) cujas
principais funções estão relacionadas a respostas do hospedeiro à infecções (MARTIN et al.,
2004). Estudos já demonstraram que vários efeitos na patogênese de sepse tem sido proposto
para fibronectina, pois ela é capaz de interagir com os macrófagos em quase todos os estágios
da resposta inflamatória à infecção; atuam em conjunto do sistema retículo-endotelial na
remoção de restos de colágeno, plaquetas danificadas e tecido necrótico; possui um papel na
manutenção da integridade vascular, na cicatrização de ferimentos e no desencadeamento do
processo de coagulação sanguínea; sendo também capaz de atuar como um modulador no
sistema complemento, estimulando sua capacidade bactericida (MOSHER, 1976; SABA &
JAFFE, 1980; PROCTOR, 1987; MARTIN et al., 2004). A concentração de fibronectina no
plasma humano vem sendo estudado como um possível fator de diagnóstico. Em pessoas
saudáveis, a concentração de fibronectina é de aproximadamente 261 mg/L. Já foram
descritas situações em que a concentração desta proteína diminui, como na coagulação
intravascular disseminada e sepse, provavelmente devido ao aumento do catabolismo
secundário da fibronectina plasmática para a formação intravascular de fibrina. Há também
situações em que ocorre o aumento na concentração de fibronectina, como em nefrites ou em
colestase, provavelmente devido a defeitos na remoção desta molécula ou ao aumento de sua
síntese devido ao estresse ao qual os hepatócitos estão submetidos (MARTIN et al., 2004).
Em 1994, Nagy, Manncke & Werner avaliaram a capacidade de diferentes espécies do
gênero Bacteroides de aderirem a fibronectina e a vitronectina e, foi observado que eram
capazes de aderir a fibronectina. A capacidade de Campylobacter jejuni, bactéria patogênica
Gram-negativa que também causa doenças gastrointestinais como a diarréia, também foi
18
estudada quanto a sua capacidade de aderir a fibronectina. Através de tratamentos da bactéria
com proteinase K observou-se que esta diminuiu a ligação a fibronectina e demonstrou que o
componente de ligação a fibronectina na superfície celular é de natureza protéica (KUUSELA
et al., 1989; MOSER & SCHRODER, 1995; JOH et al., 1999).
Alguns trabalhos já têm demonstrado que o B. fragilis pode tanto reconhecer como
aderir a diferentes proteínas da MEC, como laminina, fibronectina, vitronectina e colágeno
(NAGY et al., 1994; SOKE et al., 1996; FERREIRA et al., 2006). Entretanto, nenhum dado
tem sido apresentado sobre a forma com que esses microrganismos se aderem a fibronectina
plasmática e quais as moléculas responsáveis por essa aderência. Como já mencionado
anteriormente, sabe-se que fatores ambientais como o Eh pode interferir e modificar a
patogenicidade de uma bactéria (GOLDNER et al, 1993), mas a interferência deste fator na
expressão de proteínas de superfície, e a alteração da capacidade deste microrganismo de
reconhecer e se ligar a componentes da MEC, como a fibronectina, nunca foi avaliada. Sendo
assim, percebemos ser interessante o estudo da interação de B. fragilis com esta molécula para
um melhor entendimento do potencial de agressão da espécie.
19
2 – OBJETIVOS
Este estudo teve como objetivo principal caracterizar moléculas ligadoras de
fibronectina plasmática em cepas de Bacteroides fragilis isoladas de bacteriemia e a avaliação
da interferência do potencial de óxido-redução na expressão destas adesinas. As seguintes
etapas foram realizadas:
1) Realizar uma triagem do comportamento de cepas de B. fragilis isoladas de
bacteriemia quanto à capacidade de adesão à fibronectina plasmática após cultivo em duas
condições de Eh, oxidada e reduzida;
2) Avaliar a interferência da variação de Eh na expressão de PME;
3) Avaliar o envolvimento de proteínas de superfície na adesão à fibronectina
plasmática;
4) Confirmar a natureza química das moléculas ligadoras de fibronectina através de
tratamentos químicos e determinação do peso molecular destas adesinas;
5) Identificar a proteína de superfície responsável pela ligação a fibronectina
plasmática;
20
3 - MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Cepas bacterianas
Para a realização deste estudo foram utilizadas 11 cepas de B. fragilis isoladas de
quadros de bacteriemia (Tabela 1), pertencentes à Coleção de Cultura do Laboratório de
Biologia de Anaeróbios do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes da UFRJ.
Tabela 1. Cepas de Bacteroides fragilis isoladas de bacteriemias selecionadas para este
estudo
Cepas
País de origem
Ano do isolamento
1037
Brasil
1991
1081
Brasil
1993
1241
Brasil
1994
1384-B
Brasil
1997
1405
Brasil
2000
1409
Brasil
2000
1417
Brasil
2001
1427
França
2003
1428
França
2003
1429
França
2003
1439
França
2003
3.2. Condições de cultivo
As possíveis condições de potencial de oxido-redução (Eh) encontradas in vivo por B.
fragilis foram mimetizadas in vitro utilizando um meio quimicamente definido desenvolvido
por Varel e Bryant (1974) (Anexo A). Para este estudo, duas condições de Eh foram
selecionadas, uma condição oxidada (0,05 g/L de cisteína (Eh7 +100mV)) e uma condição
21
reduzida (2,5 g/L de cisteína (Eh7 -60mV)). Quanto mais reduzido o meio, mais negativo o
Eh, e quanto mais oxidado o sistema, mais alto o Eh. Depois do estabelecimento destas
condições, 300 µL de cada cultura previamente obtida em BHI-PRAS (1,2x109 UFC/mL)
foram inoculados em 5 mL de meio em ambas as condições. No momento do inóculo foi
adicionada ao meio 200 µL de uma solução de glicose (50%). Os tubos foram incubados por
18 h a 37oC. Esta forma de cultivo foi utilizada para todos os experimentos.
3.3. Interferência do Eh na expressão de moléculas ligadoras a fibronectina plasmática
3.3.1. Preparo das esferas de látex
As esferas de látex (Sigma; diâmetro: 0,83 µm) foram preparadas de acordo com
Szöke e colaboradores (1996), com algumas modificações. Um mililitro da suspensão de
esferas de látex foi misturada com 3 mL do tampão glicina-NaOH (0,17M; pH 8,2),
centrifugado (3000 xg, 20 min) e lavado (2x) no mesmo tampão. Após ressuspender o
sedimento em 3 mL de tampão, foram adicionados 200 µg/mL de fibronectina plasmática
(Sigma). A suspensão foi agitada horizontalmente (180 rpm a temperatura ambiente por 18 h),
centrifugada e lavada (2x) com o tampão glicina-NaOH contendo 0,05% de soro albumina
bovina (BSA; Sigma). As esferas de látex foram mantidas a 4ºC até o momento de uso.
3.3.2. Triagem através de ensaios de aglutinação
Para a realização deste teste, as 11 cepas de B. fragilis foram crescidas nas duas
condições de Eh por 18 h/37ºC, centrifugadas (3000 xg/10 min) e lavadas com tampão fosfato
(PBS) 0,1M, pH 7,2. As células bacterianas foram ressuspensas (escala 2 de McFarland ou
109 UFC/mL) e 10 µL dessa suspensão bacteriana foram misturados, em uma lâmina, com 10
µL da suspensão de esferas de látex previamente recobertas com fibronectina. Estas duas
gotas foram gentilmente misturadas e a reação de aglutinação foi classificada após 2 min
22
como: fortemente positivo (4+); forte positivo (3+); moderadamente positivo (2+); fraco
positivo (1+); e sem aglutinação (0) (NAIDU et al., 1988). Como controles negativos, as
suspensões bacterianas foram misturadas, nas mesmas proporções, somente com o tampão
glicina-NaOH ou com as esferas de látex recobertas com BSA (2 mg/mL de tampão glicinaNaOH) para verificar a ocorrência de auto-aglutinação. A leitura das lâminas foi realizada a
olho nu (NAGY, MANNCKE & WERNER, 1994).
3.4. Avaliação do envolvimento das PME na adesão à fibronectina plasmática
3.4.1. Obtenção dos extratos enriquecidos em PME
Os extratos enriquecidos de PME da cepa 1405, que obteve maior aderência após
cultivo na condição oxidada, foram obtidos segundo a metodologia descrita por Bölin,
Norlander & Wolf-Watz, 1982. Após o cultivo da bactéria nas duas condições de Eh a
suspensão contendo a cepa de interesse foi lavada em PBS 0,1 M pH 7,2 (2x), centrifugada a
4000 xg e ressuspensa em tampão de lise (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 com 1 mM de EDTA). As
células foram então rompidas em um sonicador (Ultrassonic Procesor) em 5 ciclos de 15
segundos a 4ºC. As células intactas foram removidas por centrifugação a 4000 xg por 10 min.
A fração do envelope foi coletada após uma centrifugação de 100000 xg por 30 min a 4°C. O
sedimento foi tratado (2x) com uma solução de 3% de Sarcosyl (Sigma) e centrifugado a
13000 xg por 10 min. A fração contendo as PME foi mantida a -20°C até o momento do uso.
Análises através de SDS-PAGE e análises densitométricas (“Molecular Analyst” versão 1.6)
foram realizadas para verificar as alterações nos perfis de PME expressas nas condições
oxidada e reduzida.
23
3.4.2. Análise eletroforética
As análises de SDS-PAGE foram realizadas segundo Laemmli, 1970 em géis
descontínuos de Bis-acrilamida (4% empacotamento; 12% separação) em tampão de corrida
Tris-glicina (Tris 0,1M Glicina 1M e 0,5% de SDS). Para verificar a concentração de
proteínas nos extratos enriquecidos em PME foi utilizado o método de Bradford (Quick Start
Bradford Protein Assay; BioRad). As proteínas (1mg/mL) foram misturadas com um tampão
de amostra (Tris HCl pH 6,8, 10% de SDS, 10% de glicerol e 0,05% de azul de bromofenol),
fervidas (100ºC) por 5 min e submetidas a eletroforese (90V). Como controle da corrida foi
utilizado um padrão de peso molecular de proteínas (200 kDa até 6 kDa; Invitrogen). Os géis
foram corados com Azul de Comassie brilhante R-250 e descorados com uma solução
contendo 40% de metanol e 10% de ácido acético.
3.4.3. Análise por “dot blotting”
Extratos enriquecidos em PME da cepa 1405 foram submetidos a um “imunoblotting”
indireto para verificar o possível envolvimento das PME na adesão a fibronectina. Para
realizar este teste uma membrana de nitrocelulose (8 cm x 3 cm) foi umedecida em tampão
TBST (10 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 0,05% Tween 20, pH 8,0) por 5s. Os extratos das
PME (1 mg/mL) foram colocados sobre a membrana e deixados secar. A membrana foi então
lavada (2x) com tampão TBST e incubada “overnight” com tampão de bloqueio (TBST, 5%
de leite em pó; Skim Milk) a 4°C. Após a incubação, a membrana foi lavada (2x) com tampão
TBST por 20 min sob agitação e incubada com fibronectina plasmática (10 µg/mL) em
tampão TBST por 1 h a temperatura ambiente sob suave agitação. Após a incubação com a
fibronectina plasmática, a membrana foi lavada (2x) com o tampão TBST e incubada a
temperatura ambiente por 1 h com o anticorpo primário (anti-fibronectina de camundongo;
1:1000 em tampão TBST; Sigma). Após lavar a membrana (2x) com tampão TBST a
24
membrana foi incubada com o anticorpo secundário de camundongo conjugado a peroxidase
(diluição 1:5000 em tampão TBST; Sigma) por 1 h a temperatura ambiente sob leve agitação
e após a incubação, lavada (2x) com tampão TBST. Para a revelação da membrana, esta foi
incubada com acetato de sódio 0,05 M por 4 min a temperatura ambiente sob leve agitação.
Decorrido este tempo, foi acrescentado 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) (1:25 mL de NaAc
0,05 M). Após 2 min sob agitação, 15 µL de peróxido de hidrogênio (10 volumes) foi
acrescentado, deixando revelar durante 6 min sob agitação. A reação foi parada colocando a
membrana na água. Foi utilizado como controle positivo a fibronectina plasmática.
3.5. Determinação da natureza química das moléculas ligadoras de fibronectina
plasmática
Para determinação da natureza química da molécula ligante a fibronectina plasmática,
foram realizados tratamentos químicos e enzimáticos dos extratos enriquecidos em PME.
3.5.1. Tratamento com tripsina e protease K
Extratos enriquecidos em PME foram incubados com tripsina e proteinase K diluídas
em PBS pH 7,4 obtendo-se assim as seguintes concentrações finais: 20 µg/mL e 5 µg/mL. A
digestão foi realizada incubando-se os extratos por 1 h a 37°C. Os extratos tratados foram
então submetidos ao “dot blotting” (como descrito no item 3.6.3). Extratos enriquecidos em
PME não tratados foram usados como controle positivo (FERREIRA et al., 2006).
3.5.2. Tratamento com metaperiodato de sódio
Para avaliar o envolvimento de açucares de superfície na adesão a fibronectina
plasmática, os extratos enriquecidos em PME foram diluídos em uma solução de 100 mM de
metaperiodato de sódio em tampão acetato de sódio 0,05 M (pH 5,0) por 1 h a 37°C
25
(FERREIRA et al., 2006). Os extratos tratados foram então submetidos ao “dot blotting”
(item 3.4.3). Extratos enriquecidos em PME, não tratados, foram usados como controle
positivo
3.6. “Western blotting”
Após a extração das PME da cepa 1405, como descritos no item 3.4.1., e separação
por SDS-PAGE (90V) as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose
(“overnight”, 30V) a 4°C. Após o término da transferência, a membrana foi incubada em
tampão de bloqueio (TBST com 5% de leite em pó; Skim Milk) “overnight” a 4°C. Após este
período de incubação, a membrana foi lavada em tampão TBST (10mM de Tris, 150 mM de
NaCl, 0,1% de Tween 20, pH 8,0) por 20 min e, incubada com uma solução de fibronectina
(10µg/mL) em TBST por 1h a temperatura ambiente sob agitação. Após a incubação com a
fibronectina plasmática, a membrana foi lavada (2x) com o tampão TBST durante 15 min, sob
agitação suave, e incubada a temperatura ambiente por 1h com o anticorpo primário antifibronectina (1:1000; Sigma) em TBST. Após lavar (2x) a membrana com tampão TBST, a
membrana foi incubada com o anticorpo secundário conjugado a peroxidase (1:5000 em
tampão TBST; Sigma). Finalmente, a membrana foi lavada 3x em tampão TBST e revelada
como descrito no item 3.4.3.
3.7. Seqüenciamento de uma das prováveis proteínas de ligação a fibronectina
Após a revelação do “western blot” foi realizado o sequenciamento de uma das bandas
detectadas que correspondem a provável proteína de ligação a fibronectina plasmática. Para
isso, foi realizado uma corrida eletroforética em gel de SDS-PAGE dos extratos enriquecidos
com PMEs e corado com azul de Comassie brilhante R-250. Desse gel foi recortado a banda
com peso molecular igual a detectada no “western blot” que corresponde a proteína de
26
interesse. Esse fragmento do gel foi então enviado ao Laboratório de Proteoma do Instituto de
Bioquímica da UFRJ para a realização da espectrofotometria de massa (MS/MS).
27
4 – RESULTADOS
4.1. Aderência bacteriana a esferas de látex recobertas com fibronectina plasmática
Foi observado que todas as cepas de B. fragilis selecionadas para o estudo foram
capazes de aderir a fibronectina plasmática através de ensaios de aglutinação com esferas de
látex, tanto quando as células bacterianas eram obtidas após cultivo em meios apresentando
um alto Eh (condição oxidada) como quando eram obtidas após cultivo em meios
apresentando um baixo Eh (condição reduzida) (Figura 3).
No entanto, a partir da leitura dos testes de aglutinação observamos que o Eh era capaz
de interferir na capacidade destas bactérias aderirem a glicoproteína estudada, o que pode ser
comprovado pela distinção do comportamento das cepas quanto à capacidade de aderência,
como demonstrado na figura 3. Das cepas testadas, 63,6% (7/11) tiveram uma capacidade de
aderência maior quando crescidas em meio com alto Eh, 18,2% (2/11) não mostraram
diferença quanto à variação do Eh e 18,2% (2/11) expressaram maior capacidade de aderência
quando as células testadas foram obtidas a partir de meio com menor Eh.
A cepa 1405 foi selecionada para estudos mais detalhados por ter apresentado uma
maior diferença na capacidade de se aderir a este componente plasmático quando comparados
os resultados obtidos entre a condições oxidada e reduzida.
4.2. Avaliação da interferência do Eh na expressão de PMEs
A expressão das PMEs da cepa 1405 foi comparada entre culturas obtidas nas
condições oxidada e reduzida. Após análise dos perfis eletroforéticos dos extratos
enriquecidos em PME, foi observada uma considerável variabilidade. Como pode ser
observado na figura 4, bandas de aproximadamente 102 kDa, 100 kDa, 77 kDa, 73 kDa, 50
kDa e 40 kDa se apresentaram de forma mais intensa no perfil eletroforético dos extratos de
28
PMEs obtidos a partir de culturas obtidas na condição oxidada do que na condição reduzida.
As análises densitométricas confirmaram as diferenças visuais dos perfis eletroforéticos
(Figura 4).
4.3. Avaliação do envolvimento das PME na adesão a fibronectina
Em uma tentativa de identificar as estruturas bacterianas envolvidas na adesão a
fibronectina plasmática, foram realizadas análises pelo método de “imunoblotting” indireto.
As análises da cepa 1405 confirmaram o envolvimento dos extratos contendo PME na adesão
a fibronectina. O reconhecimento do anticorpo anti-fibronectina foi mais forte para os extratos
obtidos a partir de culturas na condição oxidada do que na reduzida (Figura 5). Este resultado
reforça a hipótese de que as moléculas responsáveis pela aderência a fibronectina plasmática
estejam presentes na superfície bacteriana.
4.4. Determinação da natureza química da molécula ligadora a fibronectina
Os extratos enriquecidos em PME da cepa 1405 passaram por tratamento químico
(metaperiodato de sódio) e enzimático (proteinase K e tripsina). Esses tratamentos visaram
elucidar a natureza química da adesina bacteriana implicada no reconhecimento e ligação a
fibronectina plasmática. Os resultados obtidos são apresentados na figura 6.
O tratamento dos extratos enriquecidos em PME com proteases determinou uma
grande inibição na ligação a fibronectina plasmática, especialmente quando os extratos foram
pré-tratados com proteinase K.
O tratamento com metaperiodato de sódio, feito com o propósito de oxidar os
carboidratos presentes nos extratos, não determinou inibição na ligação a fibronectina,
ratificando que a adesina bacteriana tenha uma natureza protéica.
29
4.5. Identificação da proteína ligadora a fibronectina plasmática em B. fragilis
Na tentativa de identificarmos o peso molecular da proteína envolvida na ligação a
fibronectina, foi realizado um ensaio de “Western blotting”, sendo observado uma leve
marcação em uma banda de aproximadamente 102 kDa e 30 kDa (Figura 7 e 8), sugerindo
que estas sejam provavelmente proteínas de ligação a este componente plasmático.
A proteína contendo a proteína de 102 kDa foi extraída do gel de SDS-PAGE e
enviada para uma análise proteômica MS/MS para a obtenção dos peptídeos. A banda de 30
kDa será posteriormente enviada para análise proteômica. Os dados obtidos a partir da
espectrometria
de
massa
foi
analisado
contra
o
banco
de
dados
da
NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Os nucleotídeos se revelaram como uma PME putativa
dependente de TonB (nº de acesso: BF0466) (Tabela 2).
30
Tabela 2. Identificação da proteína de B. fragilis por espectrometria de massa MALDITOFTOF (MS/MS) a partir de digestão em gel da proteína selecionada.
Banda
“Sequence
“Peptides matched”
ID
Proteína
YNPTYGFGLNGQR
gi|53713281
Proteína Putativa de
coverage” (%)
102 kDa
4%
LGIDWNLYAR
membrana externa
DFSTPWR
dependente de TonB
TAYNVFYGFGR
31
5
Taxa de aderência
(a)
+4
+3
ox
+2
rd
+1
0
09
14
39
14
28
14
37
10
27
14
41
12
05
14
17
14
-B
84
13
81
10
29
14
Cepas de Bacteroides fragilis
Figura 3. Aderência das cepas de B. fragilis a esferas de látex recobertas com fibronectina
plasmática. Títulos de aglutinação das cepas de B. fragilis obtidos a partir de culturas em
condição oxidada (
) e reduzida (
).
(a)
Taxa de aderência: 4+: fortemente positivo; 3+:
forte positivo; 2+ moderado positivo; 1+: fraco positivo; e 0 negativo.
para estudos mais detalhados
Cepa selecionada
32
kDa
1
2
3
250
160
105
75
50
35
100
200
300
400
Oxidado
10
Reduzido
PM
Figura 4. Avaliação da interferência do Eh na expressão de proteínas da membrana externa
(PME) da cepa de B. fragilis 1405 por SDS-PAGE e análise densitométrica – Linha 1 –
padrão de peso molecular (kDa); linhas 2 e 3 – PME da cepa 1405 nas condições oxidada e
reduzida, respectivamente.
33
C+ (3µl)
C-
OX
C+ (5µl)
C+ (7µl)
OX
RD
RD
Figura 5. Análises pelo método do “Dot blotting” dos extratos de PME da cepa de B. fragilis
1405 na condição oxidada (OX) e reduzida (RD). O teste foi realizado em duplicata. A
fibronectina foi utilizada como controle positivo e somente os anticorpos primário e
secundário, sem fibronectina, como controle negativo.
34
Figura 6. “Dot blotting” com os extratos enriquecidos em PMEs da cepa 1405 cultivada em
meio oxidado (Ox) e reduzido (Rd). Extratos não tratados (C) incubados com fibronectina
plasmática e marcados com anticorpo anti-fibronectina foram utilizados como controle. Os
extratos de PME foram incubados com metaperiodato de sódio (M), proteinase K (P) e
tripsina (T). As amostras foram testadas em duplicata. Fibronectina plasmática (10 µg/mL) foi
utilizado como controle positivo, e o anticorpo primário e secundário sem fibronectina foram
utilizados como controle negativo.
35
Figura 7. SDS-PAGE e análise por “Western blotting” das PME da cepa 1405 obtida a partir
de crescimento em condições oxidadas (Ox) e reduzidas (Rd). Linha 1: Padrão de peso
molecular; linha 2: controle da fibronectina plasmática; linha 3: PME da cepa 1405 obtidas a
partir de condição oxidada (Ox); linha 4: PME da cepa 1405 obtidas a partir de condição
reduzida (Rd); linha 5, 6, 7: bandas detectadas pelo “western blotting” . A seta () indica as
bandas detectadas.
36
Figura 8. SDS-PAGE e análise por “Western blotting” das PME da cepa 1405 obtida a partir
de crescimento em condições oxidadas (Ox) e reduzidas (Rd). Linha 1: Padrão de peso
molecular; linha 2: PME da cepa 1405 obtidas a partir de condição oxidada (Ox); linha 3:
PME da cepa 1405 obtidas a partir de condição reduzida (Rd); linha 4, 5: bandas detectadas
pelo “Western blotting” . A seta () indica as bandas detectadas.
37
5 – DISCUSSÃO
A espécie B. fragilis faz parte de um gênero de bactérias geneticamente semelhantes
que são predominantes na microbiota do trato gastrintestinal. Esta bactéria está presente como
componente minoritário na microbiota intestinal humana, quando comparadas às demais
espécies do gênero. No entanto, esta pode ser considerada a bactéria anaeróbia mais
freqüentemente encontrada em infecções extra-intestinais no homem. Sendo assim, a busca
por fatores de virulência que expliquem essa predominância sobre as demais espécies assume
um caráter de grande relevância (GOLDSTEIN, 1995).
Bactérias são confrontados com numerosos desafios ambientais, um dos quais é a
necessidade de se aderir a uma ou mais moléculas de superfície mucosa corporais entre sua
porta de entrada no hospedeiro e o sítio onde exista condição favorável de colonização. Para
que estas bactérias consigam se manter em diferentes ambientes, como o trato respiratório
superior, o trato gastrintestinal, ou o sistema urogenital, a bactéria deve ser capaz de interagir
com diferentes receptores em distintas superfícies. Para atingir este objetivo, pressões
evolucionárias têm selecionado clones bacterianos que expressam mais de um tipo de
adesinas sendo assim capaz de se aderir a diferentes moléculas do organismo hospedeiro
(OFEK, HASTY & DOYLE, 2003).
A capacidade de aderência da espécie B. fragilis tem sido proposta como um dos
principais fatores de virulência da espécie (PRUZZO, GUZMÀN & DAINELLI, 1989;
PATRICK & LUTTON, 1990). As principais estruturas que podem estar envolvidas na
aderência dessa espécie são a cápsula polissacarídica (COMSTOCK & KASPER, 2006) e
fimbrias expressas na superfície dessa bactéria que podem aderir tanto a células epiteliais
como a células do sistema imune (PATRICK et al., 2003).
38
A adesão de patógenos a moléculas do hospedeiro é um importante passo no processo
de infecção, e sua capacidade de aderência a diferentes superfícies depende da expressão de
certos componentes da superfície bacteriana, chamadas de adesinas, que podem reconhecer
moléculas da superfície do hospedeiro, moléculas plasmáticas ou componentes da MEC
(OFEK, HASTY & DOYLE, 2003). Sabe-se hoje, que algumas dessas adesinas são
responsáveis pela colonização de superfícies do hospedeiro, translocação através do tecido
endotelial e invasão a tecidos adjacentes. Após a invasão, algumas bactérias podem
eventualmente atingir a corrente sanguínea e se disseminar pelo organismo, causando
infecção em outros tecidos e órgãos (SCHWARZ-LINEK et al., 2004).
As bactérias possuem distintas e alternativas adesinas responsáveis pela aderência a
células do hospedeiro e a expressão destes componentes pode ser regulado por parâmetros
ambientais como as fontes de ferro (DABO et al, 2006). Diversos eventos complexos estão
envolvidos nas infecções bacterianas e estes podem comprometer o funcionamento de um
dado tecido ou mesmo resultar em sua destruição. A aderência dos microrganismos aos
tecidos do hospedeiro é um momento inicial e crítico para a colonização de uma determinada
superfície, mesmo porque aqueles que não são capazes de se aderir são rapidamente
eliminados pelos mecanismos fisiológicos, tais como peristaltismo, batimento ciliar, dentre
outros (SCHWARZ-LINEK et al., 2004). As bactérias que conseguem aderir a uma superfície
podem permanecer no meio extracelular ou serem internalizadas para um compartimento
intracelular. Este último evento traz algumas vantagens para a bactéria, já que esta pode
escapar dos mecanismos de defesa do hospedeiro, persistir e ainda invadir outros tecidos
podendo vir a atingir a corrente sangüínea, o que levaria a disseminação da infecção (COYNE
et al., 2000).
As adesinas bacterianas podem reconhecer e se ligar a algumas proteínas da MEC,
como colágeno, elastina, fibrinogênio, laminina, fibronectina e vitronectina. Embora estas
39
proteínas estejam normalmente abaixo das células epiteliais de membranas mucosas, elas
podem se tornar expostas pelo rompimento da barreira mucosa por diversos mecanismos. A
fibronectina é um dos componentes da MEC conhecida por suportar a aderência bacteriana.
Este componente está presente no corpo humano como uma rede fibrilar polimérica na MEC
ou como protômeros solúveis nos fluidos corporais (JOH, et al, 1999). Além disso, esta
glicoproteína propicia a adesão de vários microrganismos a tecidos hospedeiros, sendo
também capaz de opsonizar, por exemplo, o Staphylococcus aureus (OFEK, HASTY &
DOYLE, 2003). Estes mecanismos nos quais proteínas da MEC podem interagir com
microrganismos patogênicos podem favorecer o progresso de infecção ou as defesas do
organismo (RODRIGUES et al., 2003).
O número de bactérias conhecidas que expressam proteínas de ligação a fibronectina é
grande (HASTY et al., 1994). Entretanto, o mero fato de que uma proteína de ligação a
fibronectina esteja presente não indica que esta proteína funciona como uma adesina. Na
realidade, somente poucos estudos têm claramente documentado a interação da proteína
ligadora a fibronectina como uma mediadora direta da adesão (OFEK, HASTY & DOYLE,
2003). Uma espécie bacteriana que tem sido em estudada é o Streptococcus pyogenes, na qual
mais de seis diferentes proteínas ligadoras a fibronectina foram identificadas (FINLAY &
CAPARON, 2000).
Em nosso estudo, foi avaliada a interferência do Eh na capacidade de adesão à
fibronectina plasmática em cepas de B. fragilis e para isso foi inicialmente utilizado o método
de aglutinação em látex. Esta metodologia é amplamente utilizada e diversos autores já
haviam demonstrado sua rapidez e praticidade (NAGY, MANNCKE & WERNER, 1994;
EIRING et al., 1995; SZÖKE et al., 1996; OFEK, HASTY & DOYLE, 2003).
40
As cepas de B. fragilis utilizadas em nosso estudo foram capazes de aderir a
fibronectina plasmática testada, tanto quando as células bacterianas testadas eram obtidas a
partir de culturas na condição oxidada quanto na reduzida, porém, 63,6% das cepas
apresentaram maior adesão a fibronectina plasmática quando crescidas em alto Eh, condições
esta que é encontrada por exemplo, na circulação sangüínea. Nenhum estudo anterior analisou
a interferência do Eh em cepas de B. fragilis quanto à adesão a fibronectina solúvel. Em 1994,
Nagy, Manncke & Werner avaliaram a capacidade de diferentes espécies do “grupo B.
fragilis” isoladas de fezes, sangue, após cirurgia ginecológica e abdominal, de aderirem a
fibronectina e a vitronectina. Foi observado que todas as cepas testadas eram capazes de
aderir a fibronectina, mas que cepas pertencentes às espécies B. fragilis e B. vulgatus o faziam
com maior freqüência.
B. fragilis é uma bactéria anaeróbica comensal que constitui somente de 1-2% da
microbiota do trato gatrointestinal humano, ainda assim, esta representa o anaeróbio
predominantemente isolado de casos de sepse intra-abdominal e de bacteriemias. Quando B.
fragilis “escapa” do intestino, geralmente como resultado da destruição da mucosa induzida
por uma doença ou ruptura no trato gastrintestinal ou através de traumas decorrentes de
cirurgia intestinal, ele pode resultar em uma patologia significativa, incluindo a formação de
abscessos em múltiplos sítios corporais (por exemplo: na cavidade abdominal, cérebro,
fígado, pélvis e pulmão) e invasão da corrente sanguínea. Na verdade, com a destruição da
parede do intestino, inúmeros membros da microbiota intestinal tem acesso a cavidade
peritoneal normalmente estéril, e durante o início, no estágio agudo da infecção,
(aproximadamente 20 h), anaeróbios facultativos como a E. coli, são os membros mais ativos
da infecção, estabelecendo preliminarmente a destruição dos tecidos e a redução do Eh dos
tecidos oxigenados. Uma vez que o oxigênio tenha sido suficientemente removido, anaeróbios
como o B. fragilis passam a predominar (PUMBWE, SKILBECK, & WEXLER, 2006).
41
Sob circunstâncias fisiológicas, B. fragilis permanece em um estado de harmonia com
o hospedeiro tendo a sua multiplicação limitada (GOLDNER, COQUIS-RONDON &
CARLIER, 1993). Porém, com a formação de lesões, seu microambiente pode tornar-se mais
oxidado (alto Eh) e esta bactéria pode se tornar patogênica (HOFSTAD, 1992). Estudos já
demonstraram que alterações no Eh podem influenciar no potencial de patogenicidade de B.
fragilis e que algumas cepas se tornam mais invasivas em linhagens de células HeLa
(GOLDNER, COQUIS-RONDON & CARLIER, 1993; FERREIRA, et al., 2006) quando em
alto Eh. Em nosso estudo, como já mencionado, a maioria das cepas (7/11) isoladas de
quadros de bacteriemias apresentaram maior aderência a fibronectina quando crescidas em
condição oxidada, sugerindo que um alto Eh poderia influenciar na expressão de moléculas de
ligação. Análises comparativas dos perfis eletroforéticos das PME da cepa 1405, obtidos a
partir de culturas variáveis quanto ao Eh, revelaram distinção na intensidade de algumas
bandas nestes perfis.
A fim de confirmarmos se a molécula ligadora a fibronectina estava localizada na
superfície bacteriana, mais especificamente como um constituinte de membrana externa, foi
realizado um “dot blotting” de extratos enriquecidos em PMEs. Foi possível observar uma
marcação mais intensa, com anticorpos anti-fibronectina, para os extratos obtidos a partir de
células crescidas na condição oxidada. Este resultado sugeriu o envolvimento das PME de B.
fragilis na ligação a esta molécula. Ferreira e colaboradores, 2006, relataram a capacidade de
cepas de B. fragilis isolados de processos infecciosos de aderir a laminina e demonstraram
que as PME estavam envolvidas neste processo de adesão.
Como mencionado anteriormente, a importância clínica do B. fragilis nas infecções
anaeróbias é bem conhecida. Esforços têm sido focados na existência de propriedades
particulares de patogenicidade e a capacidade de adesão do B. fragilis já tem sido sugerido
como um dos mais importantes fatores de virulência (PRUZZO, et al., 1989; PATRICK et al.,
42
1999). Pouco se sabe sobre o possível envolvimento de suas moléculas de superfície,
especialmente as PME, na patogenicidade do B. fragilis. Essas proteínas de superfície
possuem um papel importante em eventos como adesão, invasão e evasão das defesas do
hospedeiro e de agentes antimicrobianos (WEXLER, 2002). Por esse motivo e também por já
terem sido discutidas como adesinas para outras espécies bacterianas (LANTZ et al., 1991;
PATTI et al., 1994; MARQUES et al., 2001), é que nos pareceu tentador prosseguir na
avaliação do envolvimento destes componentes de superfície na ligação a fibronectina.
Decidimos por etapas que visaram a definição da natureza química da molécula
ligadora de fibronectina e para isso, os extratos enriquecidos em PME foram submetidos a
tratamentos químico e enzimático. O tratamento com proteinase K determinou uma maior
inibição da aderência do que o tratamento com tripsina. Isso se deve ao fato da proteinase K
ter um maior espectro de ação, ratificando de qualquer forma, a participação de uma adesina
protéica. O tratamento com metaperiodato de sódio não alterou a capacidade de ligação a
fibronectina sugerindo que a adesina detectada deve ser uma proteína e não uma
glicoproteína. As MSCRAMMs envolvidas nestas interações tem sido caracterizadas de
natureza protéica, como por exemplo as FnbpA de S. aureus (SIGNÃS et al., 1989), FsoE em
E. coli (WESTERLUND et al., 1989) e YadA em Yersinia spp. (TERTTI et al., 1992).
Para podermos determinar o peso molecular da proteína de ligação a fibronectina foi
realizado um ensaio de “western blotting”. Nestes ensaios foi detectada uma leve marcação
em duas bandas de aproximadamente 102 kDa e 30 kDa nos extratos obtidos a partir de
culturas em ambas as condições, oxidada e reduzida. Através da análise por espectrometria de
massa MALDI-TOF TOF foi identificada a proteína de 102 kDa como uma PME dependente
de TonB como uma provável proteína de ligação a fibronectina.
A cepa K12 de E. coli é considerada como modelo de organismo na genética
microbiana. A primeira vista, portanto, não vem a ser uma surpresa que um sofisticado
43
mecanismo de transdução de sinal trans-envelope tenha sido primeiramente descoberto neste
microrganismo. Inicialmente dois genes foram identificados, sendo observado que, após
mutação, a bactéria se tornava resistente a infecção pelo bacteriófago T1, sendo então os
genes nomeados TonA e TonB (T-one). Mais tarde, o papel fisiológico destas proteínas foi
elucidado. A PME TonA atua como um receptor/transportador para o sideróforo ferricromo
tipo hidroxamato e, conseqüentemente, foi renomeada FhuA (“ferric hydroxamate uptake”).
Para realizar o transporte de ferricromo através da membrana externa, a FhuA interage com
TonB, uma proteína perisplamática com um N-terminal ancorado na membrana
citoplasmática (CHANG et al., 2001; KODDING et al., 2005; SEAN PEACOCK, 2005). Para
obter energia para este processo de transporte ativo, TonB também interage com um
complexo de proteínas na membrana citoplasmática consistindo de ExbB e ExbD (BRAUN &
BRAUN, 2002; POSTLE & KADNER, 2003; FERGUSON & DEISENHOFER, 2004).
Vários homólogos de FhuA tem sido identificados em outras bactérias. A maioria está
envolvida na captura de macromoléculas que são grandes para difusão via porinas de
membrana
externa,
principalmente
complexos
ferro-sideróforos
e
vitamina
B12.
Coletivamente estas proteínas são chamadas receptores TonB dependentes depois de
confirmada sua homologia com E.coli. Alguns receptores TonB dependentes são também
importantes para percepção de sinais ambientais e estão associados a patogenicidade
(KOEBNIK, 2005).
44
TonB
TonB
Figura 9: Exemplos de proteínas de membrana externa dependente de TonB: FepA e a
OmpA.
Além de uma membrana citoplasmática, que é comum a todos os organismos, as
bactérias Gram-negativas possuem uma membrana externa, o que impede a absorção de
nutrientes essenciais. Ao contrário de pequenas moléculas que atravessam a membrana
externa por difusão passiva através de porinas transmembranas, substratos que sejam
considerados pouco permeáveis através porinas (maiores que ~ 600 Da), ou que estejam
presentes em concentrações muito baixas requerem transporte ativo para sua translocação
através da membrana externa (NIKAIDO, 2003). Sendo assim, o transporte de
macrosubstâncias através do sistema de transporte tem se mostrado essencial para a
sobrevivência destes microrganismos.
A proteína TonB funciona como um transdutor de energia acoplado a membrana
citoplasmática para ativar o transporte de sideróforos e vitamina B12 através da membrana
externa e provavelmente de outras bactérias Gram-negativas (REYNOLDS et al., 1980;
ROOF et al., 1991). Além de sua capacidade de transportar moléculas, em Pasteurella
45
multocida, por exemplo, esta proteína também é capaz de reconhecer e se ligar a fibronectina
(DABO et al., 2005).
Após a identificação da proteína ligadora a fibronectina plasmática, foi realizado uma
análise no genoma do B. fragilis observando então que o gene da proteína de interesse
continha 2790 pb. Como já mencionado, foram confeccionadas seqüências iniciadoras sendo
então realizada a amplificação do gene de interesse. Através desta amplificação, verificou-se
que seria possível futuras análises desta proteína através da clonagem e mutação deste gene .
A influência da aderência como um fator de virulência para B. fragilis permanece
ainda como uma questão em aberto. Nos parece evidente que para algumas cepas, certas
proteínas tenham a sua expressão alterada em resposta a parâmetros ambientais, como Eh.
Nossos resultados sugerem que adesinas de natureza protéica presente na superfície bacteriana
podem ter sua expressão influenciada por alterações no Eh. Porém, estudos adicionais serão
necessários para que possamos melhor avaliar o papel destas moléculas na patogênese das
infecções determinadas por este microrganismo, sejam bacteriemias ou outros processos
extra-intestinais.
Dados presentes na literatura científica demonstram a capacidade da espécie B. fragilis
em reconhecer e aderir a componentes da MEC, como fibronectina, vitronectina, laminina,
dentre outros (NAGY, MANNCKE & WERNER, 1994; SZOKE et al., 1996). Porém,
avaliações referentes à interferência de parâmetros ambientais na expressão destas moléculas
de ligação bem como a importância destes mecanismos na patogenicidade não estão
disponíveis.
46
6 – CONCLUSÕES
1) Cepas de B. fragilis isoladas de quadros de bacteriemias são capazes de aderir
significativamente a fibronectina tanto na condição oxidada quanto na reduzida, sendo
observado, no entanto, que a maioria das cepas (63,6%) expressa uma maior capacidade de
adesão quando cultivadas em condições de maior Eh (oxidado);
2) Alterações no Eh influenciaram a expressão de PME, pelo menos para a cepa
estudada (1405), sendo verificadas alterações especialmente em bandas de aproximadamente
102 kDa, 50 kDa e 40 kDa;
3) Análises pelo método de “dot blotting” dos extratos enriquecidos em PME da cepa
1405 sugeriram o possível envolvimento de uma proteína de superfície na aderência a
fibronectina, sendo observada uma maior marcação em extratos obtidos a partir de culturas na
condição oxidada;
4) Através do método de “western blotting” foi verificada a marcação de bandas de
aproximadamente 102 kDa e 30 kDa, sugerindo serem estas as moléculas de ligação a
fibronectina;
5) Tratamentos de extratos enriquecidos em PME com proteases revelaram o
envolvimento de uma molécula de ligação a fibronectina de natureza protéica.
6) O seqüenciamento da proteína de 102 kDa revelou ser esta uma PME dependente
de TonB.
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56
ANEXO
Preparo do meio de cultura quimicamente definido
Primeira etapa:
Substâncias
Quantidade
Volume
Sulfato ferroso.7H2O
40 mg
10 mL
Cloreto de cálcio.2H2O
270 mg
10 mL
Cloreto de magnésio.6H2O
200 mg
10 mL
Cloreto de manganês.4H2O
100 mg
10 mL
Cloreto de cobalto.6H2O
100 mg
10 mL
Rezasurina
10 mg
10 mL
Vitamina B12*
5 mg
10 mL
Hemina
5 mg
25 mL
150 mg/75 mg
10 mL
50 g
100 mL
DL – metionina/L – metionina
Glicose
* Diluição de 1:10 para obter uma solução de 5 mg/L
Segunda etapa: Preparo do tampão
Substâncias
Quantidade
Sulfato de amônio
1g
Fosfato de potássio monobásico
0,9g
Fosfato de potássio dibásico
2,26g
Cloreto de sódio
0,9g
Água destilada
500ml
Terceira etapa: Dissolver as seguintes quantidades em 500 mL do tampão
Substâncias
Quantidade
Sulfato ferroso
1 mL
Cloreto de cálcio
1 mL
Cloreto de magnésio
1 mL
57
Cloreto de manganês
1 mL
Cloreto de cobalto
1 mL
Rezasurina
1 mL
Vitamina B12
1 mL
Hemina
25 mL
DL-metionina/L-metionina
1 mL
Completar o volume para um litro com água destilada (467 mL)
Quarta etapa: Concentração de cisteína – Eh oxidado e reduzido
Concentração de cisteína por litro de meio
Eh
0,05 g
Oxidado
2,5 g
Reduzido
Quinta etapa: Após adicionar a cisteína aferir o pH do meio para 7,6. O meio deve ser
preparado em atmosfera de anaerobiose (PRAS) e depois autoclavado (121°C, 15 min.). No
momento do inoculo acrescentar 0,02 mL de glicose/mL de meio
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