28 sorbato e benzoato - Ministério da Agricultura
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Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA Secretaria de Defesa Agropecuária – SDA Coordenação Geral de Apoio Laboratorial - CGAL Manual de Métodos de Análises de Bebidas e Vinagres Não alcoólicos SORBATO E BENZOATO Método 28 1. MÉTODO Cromatográfico 2. PRINCÍPIO Baseia-se na destilação da amostra com arraste de vapor, extração com éter etílico-éter de petróleo, detecção sob luz UV e posterior identificação (semi-quantitativo) em cromatografia em camada delgada. 3. MATERIAL 3.1. EQUIPAMENTOS a) Lâmpada ultravioleta com comprimento de onda de 254 nm. b) Evaporador rotatório. c) Estufa d) Agitador magnético e) Balança analítica 3.2. REAGENTES E SOLUÇÕES a) Solução de ácido fosfórico 4 N: Pipetar 76,8 mL de ácido fosfórico concentrado p.a e diluir para 1000 mL com água. b) Solução-padrão de ácido sórbico (1 mg/mL): Pesar 0,1339 g de sorbato de potássio p.a e diluir para 100 mL com água. c) Solução-padrão de ácido benzóico (5 mg/100 mL): Pesar 0,5900 g de benzoato de potássio p.a e diluir para 100 mL com água. d) Sulfato de sódio anidro e) Éter etílico f) Éter de petróleo g) Sulfato de magnésio heptahidratado p.a h) Ácido tartárico p.a. i) Fase Móvel: j) Acetona-etanol-hidróxido de amônio 25% (70: 5: 20), preparada recentemente. k) Reagente cromogênico: Solução I : verde bromocresol a 0,075% e azul de bromofenol a 0,025% em etanol. Solução II: permanganato de potássio a 0,25% e carbonato de sódio decaidratado a 0,50% em água. Misturar as soluções I e II (1:1) no momento do uso. A mistura é instável e não se conserva além de 5 minutos. 3.3. VIDRARIA E OUTROS MATERIAIS a) Placas de cromatografia em camada fina “Kieselgel 60 F254” de 20 x 20 cm b) Cuba cromatográfica c) Vaporizador d) Conjunto de destilação com arraste de vapor. e) Micropipeta de 10 mL Edição: 1 Revisão: 0 Página 1 de 3 Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA Secretaria de Defesa Agropecuária – SDA Coordenação Geral de Apoio Laboratorial - CGAL Manual de Métodos de Análises de Bebidas e Vinagres Não alcoólicos f) g) h) i) SORBATO E BENZOATO Método 28 Barra magnética Funil de separação Erlenmeyer com boca e rolha esmerilhada Pipeta volumétrica de 50 mL 4. PROCEDIMENTO 4.1. PREPARO DA SOLUÇÃO DE AMOSTRA 4.1.1. REFRIGERANTES E REFRESCOS Pipetar 50 mL da amostra descarbonatada, colocar num funil de separação, acidificar com 2 mL da solução de ácido fosfórico e agitar. Extrair com 25 mL de éter etílico-éter de petróleo (1:1). Transferir a camada aquosa para um segundo funil de separação e extrair novamente com 25 mL de éter etílico-éter de petróleo. Juntar as fases etéreas e filtrar. Secar com sulfato de sódio anidro. Concentrar a 46-50ºC a vácuo, até cerca de 2 mL. Transferir quantitativamente para erlenmeyer com tampa, lavando o balão com pequenas porções de éter etílico-éter de petróleo e evaporar à temperatura ambiente até secura. 4.1. 2. SUCOS DE FRUTAS Pipetar 50 mL da amostra em balão de destilação, adicionar 0,5 g de sulfato de magnésio e 0,5 g de ácido tartárico. Destilar com arraste de vapor d’água até recolher 200 mL do destilado. Prosseguir como em 4.1.1 e extrair com porções de 50 mL de éter etílico-éter de petróleo (1:1). 4.1.3. POLPAS Pesar amostra conveniente e prosseguir como em 4.1.2. 4.2. PREPARO DAS SOLUÇÕES PADRÕES 4.2.1. PADRÃO DE ÁCIDO SÓRBICO Pipetar 1 mL da solução-padrão de ácido sórbico, dissolver em 50 mL de água destilada e prosseguir como em 4.1.1. 4.2.2. PADRÃO DE ÁCIDO BENZÓICO Pipetar 5 mL da solução-padrão de ácido benzóico, dissolver em 50 mL de água destilada e prosseguir como em 4.1.1. 4.2.3. PADRÃO DE ÁCIDOS SÓRBICO E BENZÓICO Pipetar 1 mL da solução-padrão de ácido sórbico, 5 mL da solução-padrão de ácido benzóico, dissolver em 50 mL de água destilada e prosseguir como em 4.1.1. 4. 3 CROMATOGRAFIA Dissolver os resíduos das amostras em 1 mL de éter etílico e aplicar 5 µL da amostra e 8 µL dos padrões na placa. Correr até 12 cm. Remover a placa e secar em estufa a 100º C durante 5 minutos e esfriar à temperatura ambiente. 5. CÁLCULO E EXPRESSÃO DO RESULTADO Edição: 1 Revisão: 0 Página 2 de 3 Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA Secretaria de Defesa Agropecuária – SDA Coordenação Geral de Apoio Laboratorial - CGAL Manual de Métodos de Análises de Bebidas e Vinagres Não alcoólicos SORBATO E BENZOATO Método 28 Observar a placa cromatográfica sob luz UV. Quando isolados, o ácido sórbico se apresenta como uma mancha fluorescente escura situada acima da do ácido benzóico, ao passo que este se apresenta como uma mancha marron-clara, elipsóide e com menor Rf. Quando o ácido sórbico está em mistura com o ácido benzóico, na amostra ou na mistura de padrões, passa a se situar imediatamente abaixo do ácido benzóico. Nesta inversão dos Rf, o ácido sórbico passa a ter um Rf menor que o ácido benzóico, o qual não sofre alterações e mantém sua forma elipsóide e seu Rf, enquanto o ácido sórbico apresenta-se em forma característica de “meia lua”, contornando a parte inferior da mancha do ácido benzóico (Quadro 2). QUADRO 1 . Valores de Rf dos ácidos sórbico e benzóico, isolados e em mistura. Rf Conservadores Isolado Àcido sórbico Ácido benzóico 0,80 0,58 Em mistura 0,53 0,58 Após a pulverização com o reagente cromogênico, o ácido sórbico dá uma coloração azul e o ácido benzóico uma coloração amarela. Rf = Dm D fm Onde: Dm = Distância percorrida pela mancha. Dfm = Distância percorrida pela fase móvel. A ocorrência de ácido sórbico e/ou benzóico na amostra é interpretada como presença, estando acima ou abaixo do limite mínimo detectável. QUADRO 2 . Teores detectáveis dos conservadores em mg/100 mL. Conservadores UV Após a revelação Ácido sórbico 0,6 0,8 Ácido benzóico 12 24 REFERÊNCIA INSTITUTO de tecnologia de alimentos. Manual técnico de análise química de alimentos. Campinas, 1990. Edição: 1 Revisão: 0 Página 3 de 3
