BRCA1 - BVS MS

AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DE ALTERAÇÕES NA REGIÃO
PROMOTORA DO GENE BRCA1 OBSERVADAS EM PACIENTES COM
CÂNCER DE MAMA HEREDITÁRIO NA EXPRESSÃO DE GENE REPÓRTER
1,2
1
Fernandes, L.R. ; Costa, E.C.B. ; Moreira, M.A.M.
1
Universidade Federal do Rio de Janeiro
2
Instituto Nacional de Câncer
2
INTRODUÇÃO
BRCA1
b
a
Ex.1A
Ex.1B
(1 4 1 p b )
ERE
AUG
Éxon 2
Tabela 1: Alterações observadas na região promotora do gene
BRCA1 em pacientes do grupo de Aconselhamento Genético em
Câncer de Mama e/ou Ovário do INCA
Paciente
Região Analisada
Substituição
P091
5’UTR-b
g3988 A>C
P113
5’UTR-b
g3777 G>A
P033
P121
5’UTR-b
g3800 C >T
P127
Promotor a g3292 T>C
Promotor b g3593 G>A
g3800C>T
5’UTR-b
RESULTADOS
A atividade relativa de luciferase observada sob a influência de cada região promotora com alteração foi comparada a região
promotora selvagem, mas a diferença não foi significativa em nenhuma avaliação (p>0,05) (Figura 4).
Figura 4: Desenho gráfico do resultado obtido através da análise em
luminômetro. Foram comparadas as médias da atividade relativa de luciferase
observada em cada ensaio realizado em triplicata. O desvio padrão das médias
das triplicatas está evidenciado em cada coluna (DP). Para avaliação da variação
na expressão foi utilizado o teste t pareado (www.graphpad.com). A comparação
das atividades relativas de luciferase observadas sob a influência das regiões
promotoras avaliadas não mostrou diferença significativa entre nenhuma delas
(p>0,05)
Figura 1: (A) Representação esquemática da região promotora de
BRCA1. O círculo em rosa indica região semelhantes ao motivo de
ligação para receptor de estrogênio, enquanto o verde indica o códon
de início de tradução localizado no éxon 2. A seta indica o sentido da
transcrição. (Figura retirada e adaptada de Sobczak e Krzyzosiak,
2002)
5’UTR-a
5’UTR-b
OBJETIVOS
Avaliação da influência de 5 variações na região promotora de BRCA1, observadas em 5 pacientes caracterizados com síndrome
da predisposição ao câncer de mama, na transcrição e tradução de gene repórter.
MATERIAL E MÉTODOS
As alterações g3800C>T, g3988A>C, g3777G>A, g3292 T>C e g3593 G>A foram detectadas na região promotora do gene
BRCA1 (GenBank L78833) em 5 pacientes do Programa de Aconselhamento Genético em Câncer de Mama e/ou Ovário do INCA
(Costa et al, 2005) (Tabela 01). Essas variantes, assim como a região promotora selvagem, foram clonadas no vetor pGL3-basic
(Promega, Figura 2). Os plasmídeos recombinantes construídos foram transfectados em linhagem celular MCF7 utilizando
lipofectamina (Invitrogen), assim como plasmídeo pRL-CMV. O perfil de expressão das construções foi analisado em
luminômetro (Figura 3).
Figura 3: Desenho experimental utilizado no estudo da região promotora
do gene BRCA1
CONCLUSÕES
Ao contrário do descrito na literatura para outras alterações na região promotora de BRCA1 em casos de câncer esporádico, as
alterações avaliadas nesse estudo não modificaram o perfil de expressão do gene repórter. Entretanto podem influenciar a
expressão de BRCA1 associada a outros fatores no indivíduo que não puderam ser reproduzidos in vitro, uma vez que foram
encontradas em pacientes que não apresentaram mutação na região codificante do gene.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Costa ECB. (2005) Dissertação de Mestrado - Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, Departamento de Genética, Pós-graduação em Genética
Ford D, Easton DF, Stratton M, et al (1998) Am.J.Hum.Gent.,62:676-689.
Hughes TA. (2006) Trends Genet. Mar;22(3):119-22.
Miyamoto K, Fukootmi T, Asada K, et al (2002) Jnp. J.Clin.Oncol., 32(3):79-84.
Sobczak K and Krzyzosiak WJ. (2002) The Journal of Biological Chemistry, 277(19):17349-17358.
MS INCA FAF CAPES FAPERJ
Projeto Gráfico: Serviço de Edição e Informação Técnico-Científica / CEDC / INCA
De acordo com o Instituto Nacional de Câncer, as estimativas brasileiras para os anos de 2008 e 2009, o câncer de mama
permanece como o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo e o primeiro entre as mulheres, com um risco estimado de
51 casos a cada 100 mil mulheres. (Estimativa 2008, INCA, http://www.inca.gov.br/estimativa/2008/versaofinal.pdf). Cerca de
10% dos casos de câncer de mama apresentam um padrão monogênico de transmissão, caracterizando a chamada síndrome de
predisposição ao câncer de mama e/ou ovário (www.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=336). Em aproximadamente 64%
destas famílias, mutações germinativas no gene BRCA1 podem ser identificadas por seqüenciamento direto (Ford et al, 1998).
Outros fatores que foram associados ao desenvolvimento do câncer de mama são alterações que não afetam a função do gene
BRCA1, mas sua expressão. Estudos têm relatado que até 33% dos casos de câncer de mama esporádico foram associados ao
baixo nível de expressão do gene BRCA1 devido a hipermetilação da região promotora, sugerindo que o perfil de expressão do
RNA mensageiro esteja associado ao desenvolvimento do tumor (Miyamoto et al, 2002).
A região promotora do gene BRCA1 possui dois éxons alternativos que não são traduzidos, denominados 1A (5'UTR-a) e 1B
(5'UTR-b), e cada um deles tem seu próprio promotor: Alfa e Beta, respectivamente (Figura 1). A maior atividade da transcrição
do gene BRCA1 encontra-se no promotor alfa. O promotor beta tem uma atividade aproximadamente 1/150 mais fraca do que o
promotor alfa, contudo a atividade do promotor beta pode ser modulada por elementos em cis localizados no promotor alfa e
receptores de estrogênios localizados no éxon 1B. Isto sugere que a expressão da transcrição do gene BRCA1 pode ser coregulada pelos dois promotores e pelo estrogênio (Sobczak e Krzyzosiak, 2002).
As 5'UTRs contém motivos capazes de regular diversos aspectos da função do transcrito, como a exportação nuclear, a localização
citoplasmática, a eficiência de tradução e a estabilidade do transcrito (Hughes, 2006). Estudos envolvendo câncer de mama
esporádico mostraram que transcritos contendo a seqüência 5'UTR-a são os únicos observados em tecido mamário normal,
enquanto ambos os transcritos contendo seqüências 5'UTR-a ou 5'UTR-b podem ser observados em tumores. Além disto, a
eficiência da tradução do transcrito contendo a seqüência 5'UTR-b é 10 vezes menor que com a seqüência 5'UTR-a (Sobczak e
Krzyzosiak, 2002), assim, esse fator também pode estar relacionado com a redução da expressão de BRCA1. Até o momento não
foram descritas alterações pontuais na região promotora de BRCA1 que possam estar relacionadas ao desenvolvimento de
tumores de mama hereditários.
Figura 2: Desenho esquemático do vetor pGL3-Basic utilizado na construção dos
plasmídeos recombinantes construídos para o estudo da região promotora. Cada região
amplificada foi inserida no sítio múltiplo de clonagem (azul escuro), adjacente ao gene
luc+, que codifica a proteína luciferase. (Figura retirada e adaptada de
www.promega.com)