BRCA1 - BVS MS - Ministério da Saúde

BRCA1
INFLUÊNCIA DE ALTERAÇÕES NA 5'UTR DO GENE BRCA1
ENCONTRADAS EM PACIENTES COM CÂNCER DE MAMA
HEREDITÁRIO NA TRANSCRIÇÃO
1,2
1
Fernandes, L.R. ; Costa, E.C.B. ; Moreira, M.A.M.
Universidade Federal do Rio de Janeiro
2
Instituto Nacional de Câncer
Tabela 1: Alterações observadas na 5'UTR em
pacientes do grupo de Aconselhamento
Genético em Câncer de Mama e/ou Ovário do
INCA.
INTRODUÇÃO
No Brasil, o câncer se apresenta como uma expressiva causa de mortalidade. De acordo com o
Instituto Nacional de Câncer, as estimativas brasileiras para os anos de 2008 e 2009 apontaram o mesmo
perfil da magnitude observada no mundo: O câncer de mama permanece como o segundo tipo de câncer
mais freqüente no mundo e o primeiro entre as mulheres, com um risco estimado de 51 casos a cada 100
mil mulheres. Já na região Sudeste o câncer de mama é o mais incidente, com um risco estimado de 68
casos novos a cada 100 mil mulheres (Estimativa 2008, INCA, http://www.inca.gov.br
/estimativa/2008/versaofinal.pdf).
Cerca de 10% dos casos de câncer de mama apresentam um padrão monogênico de transmissão,
caracterizando a chamada síndrome de predisposição ao câncer de mama e/ou ovário
(www.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=336). Em aproximadamente 64% destas famílias, mutações
germinativas no gene BRCA1 podem ser identificadas por seqüenciamento direto (Ford et al, 1998).
Outros fatores que foram associados ao desenvolvimento do câncer de mama são alterações que não
afetam a função do gene BRCA1, mas sua expressão. Estudos têm relatado que até 33% dos casos de
câncer de mama esporádico foram associados ao baixo nível de expressão do gene BRCA1 devido a
hipermetilação da região promotora, sugerindo que o perfil de expressão do RNA mensageiro esteja
associado ao desenvolvimento do tumor (Miyamoto et al, 2002).
A região promotora do gene BRCA1 possui dois éxons alternativos que não são traduzidos,
denominados 1A (5'UTR-a) e 1B (5'UTR-a), e cada um deles tem seu próprio promotor: Alfa e Beta
respectivamente (Xu et al, 1997) (Figura 01 A). As 5'UTRs contém motivos capazes de regular diversos
aspectos da função do transcrito, como a exportação nuclear, a localização citoplasmática, a eficiência de
tradução e a estabilidade do transcrito (Hughes, 2006). A estrutura da região 5'UTR-b do gene BRCA1
revela mecanismos potenciais, adicionais aos promotores, na regulação de sua expressão, como a
formação de estruturas secundárias (Sobczac e Krzyzosiak, 2002) e a presença de um elemento de
ligação para receptor de estrogênio (ERE) (Xu et al, 1997) (Figura 01 B). Recentemente, mutações que
causam doenças como síndrome de hiperferritinemia e cataratas, trombocitemia hereditária e doença de
Alzheimer, através do aumento ou diminuição da eficiência de tradução, têm sido documentadas,
definindo a patofisiologia traducional como um novo mecanismo de doenças humanas (Cazzola e Skoda,
2000). Estudos envolvendo câncer de mama esporádico mostraram que transcritos contendo a
seqüência 5'UTR-a são os únicos observados em tecido mamário normal, enquanto ambos os transcritos
contendo seqüências 5'UTR-a ou 5'UTR-b podem ser observados em tecidos com a patologia. Além
disto, a eficiência da tradução do transcrito contendo a seqüência 5'UTR-b é 10 vezes menor que com a
seqüência 5'UTR-a (Sobczak e Krzyzosiak, 2002), assim, esse fator também poderia estar relacionado
com a redução da expressão de BRCA1.
Paciente
Região Analisada
Ex.1A

Figura 1: (A) Representação esquemática da região
promotora de BRCA1. O círculo em rosa indica motivo de
ligação para receptor de estrogênio. A seta indica o sentido
da transcrição. (B) Representação esquemática das
estruturas secundárias observadas na 5'UTR-b,
representadas pela linha preta, até do códon inicial (AUG).
Os círculos na cor verde indicam a presença de uORFs
(upstream Open Reading Frames). As setas em vermelho
indicam a posição aproximada onde as alterações
observadas, em cada paciente, se encontram (Figura
adaptada de Sobczak e Krzyzosiak, 2002).
ERE
5’UTR-a
5’UTR-b
A
P113
P033
P121
P127
P091
B
OBJETIVOS
Avaliação da influência de 3 variações na 5'UTR de BRCA1, observadas em 5 pacientes caracterizados
com síndrome da predisposição ao câncer de mama, na transcrição e tradução de gene repórter.
MATERIAL E MÉTODOS
As alterações g3800C>T, g3988A>C e g3777G>A foram detectadas na região 5'UTR-b do gene
BRCA1 (GenBank L78833) em 5 pacientes do Programa de Aconselhamento Genético em Câncer de
Mama e/ou Ovário do INCA (Costa et al, 2005) (Tabela 01). Essas variantes, assim como as 5'UTR-a e b
selvagens, foram clonadas no vetor pEGFP-N1(Clontech, Figura 02). Os plasmídeos recombinantes
construídos foram transfectados em linhagem celular MCF7, utilizando lipofectamina (Invitrogen) e o
perfil de expressão das construções foi analisado através de citometria de fluxo (Figura 03).
Clonagem
pEGFP-N1
Substituição
EGFP
SV40 poly A
Kan/Neo
Figura 2: Desenho esquemático do vetor pEGFPN1 utilizado para construção dos plasmídeos
recombinantes no estudo da 5'UTR. Cada éxon 1B e
1A amplificados foram inseridos no sítio múltiplo de
clonagem (rosa), adjacente ao gene EGFP
(Enhanced Green Fluorescent Protein), sendo
transcritos sob o comando do promotor CMV
(Cytomegalovirus). (Figura adaptada de clontech Catalog
#6085-1)
Figura 3: Desenho experimental utilizado no
estudo da 5'UTR do gene BRCA1.
RESULTADOS
A intensidade média de fluorescência (MFI) observada sob a influência da 5'UTR-b selvagem foi
significativamente menor que a 5'UTR-a selvagem (p<0,0001)(Figura 04). A MFI observada em cada
5'UTR-b com alteração foi comparada a 5'UTR-b selvagem, mas a diferença não foi significativa em
nenhuma avaliação (p>0,1) (Figura 04).
Figura 4: Desenho gráfico resultado obtido através de
citometria de fluxo. Foram comparadas as médias da
intensidade de fluorescência observadas em cada ensaio
(MFI) realizado em triplicata. Para avaliação da variação
na expressão foi utilizado o teste t pareado
(www.graphpad.com/ quickcalcs/ttest1.cfm). A MFI
observada sobre a influência da 5'UTR-a selvagem (*) foi
significativamente superior as observadas sob influência
da 5'UTR-b, tanto selvagem quanto as variantes. A
comparação entre as MFIs observadas sob influencia das
5'UTRs-b avaliadas não mostrou diferença significativa
entre nenhuma delas.
Ex.1B
(1 4 1 p b )
Sítio Múltiplo de
pUC ori
4733 pb
BRCA1

CMV
CONCLUSÕES
Ao contrário do descrito na literatura para outras alterações na 5´UTR de BRCA1 em casos de câncer
esporádico, as alterações avaliadas nesse estudo não modificaram o perfil de expressão do gene repórter.
Entretanto podem influenciar a expressão de BRCA1 associada a outros fatores no indivíduo que não
puderam ser reproduzidos in vitro, uma vez que foram encontradas em pacientes que não apresentaram
mutação na região codificante do gene.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Cazzola M, Skoda RC. (2000) Blood. 1;95(11):3280-8.
Costa ECB. (2005) Dissertação de Mestrado - Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, Departamento de Genética, Pós-graduação em
Genética
Ford D, Easton DF, Stratton M, et al (1998) Am.J.Hum.Gent.,62:676-689.
Hughes TA. (2006) Trends Genet. Mar;22(3):119-22.
Miyamoto K, Fukootmi T, Asada K, et al (2002) Jnp. J.Clin.Oncol., 32(3):79-84.
Sobczak K and Krzyzosiak WJ. (2002) The Journal of Biological Chemistry, 277(19):17349-17358.
Xu, C.-F., Chambers, J. A., and Solomon, E. (1997) J. Biol. Chem. 272, 2099420997
MS - Ministério da Saúde
INCA Instituto Nacional de Câncer
FAF - Fundação Ari Frauzino para Pesquisa e Controle do Câncer
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
FAPERJ Fundação para o Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
Projeto Gráfico: Serviço de Edição e Informação Técnico-Científica / CEDC / INCA
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