EXAME de ENGENHARIA GENÉTICA

EXAME de ENGENHARIA GENÉTICA
Data: 6 de Setembro de 2005
(Época Especial)
Duração máxima: 2h 30 min
A degradação bacteriana de hidrocarbonetos aromáticos envolve circuitos regulatórios
complexos. Alguns desses circuitos utilizam diferentes proteínas regulatórias
denominadas factores sigma (), necessários para o reconhecimento do promotor e a
iniciação da transcrição. Diversos factores  encontram-se frequentemente presentes
nos genomas bacterianos e cada um deles apresenta diferentes capacidades de iniciar a
transcrição a partir de diferentes conjuntos de promotores. Em Pseudomonas putida,
os genes para o catabolismo de hidrocarbonetos aromáticos (m-xileno, tolueno) e
fenois encontram-se frequentemente sob o control de 54.
A estirpe P. alcaligenes P25X é uma bactéria do solo capaz de degradar xilenois e
cresois bem como os seus derivados metilados e halogenados via a denominada via do
gentisato. Sabe-se que esta estirpe apresenta genes isofuncionais (que codificam
proteínas com a mesma função) para esta via, em que um conjunto desses genes é
expresso constitutivamente enquanto que o outro conjunto é induzido pela presença
dos substratos aromáticos. De modo a investigar o papel de 54 na referida via
degradativa, foi construído o mutante G54 por inserção de uma cassete, que confere
resistência a canamicina, no gene codificante rpoN cuja sequência de nucleótidos era
conhecida.
1- Diga em que consiste essa manipulação genética e indique, justificando, os vários
passos envolvidos.
O papel de 54 na resposta fisiológica de P25X à indução por gentisato foi estudado
comparando os perfis de expressão global desta estirpe e do mutante G54 sob indução
por gentisato. Para tal, recorreu-se à electroforese em gel de agarose a 2 dimensões
(Zhao et al, Proteomics 2005, 5, 1868-1876):
2) Diga em que consiste a técnica. Refira-se aos seus fundamentos e ao interesse da
sua utilização para o fim pretendido.
Esta análise comparativa do proteoma revelou que 39 das 355 proteinas separadas no
gel tinham a expressão reduzida para metade, ou mais de metade, em resultado da
inactivação do gene rpoN. Com excepção de 3, essas proteínas foram identificadas
por espectrometria de massa, com base na similaridade das suas sequências de
aminoácidos com a de proteínas cujas funções em outros organismos se encontram
descritas e de acesso livre, através da internet, em bases de dados. Os “spots” das
proteínas a analisar foram retiradas manualmente do gel, digeridas com a protease
tripsina e o perfil dos péptidos gerados determinado usando o MALDI-TOF/TOF e
este comparado com os esperados para as proteínas presentes em bases de dados.
3) i) Explique porque razão a sequenciação de muitas dezenas de genomas
bacterianos, em conjunto com o avanço da genómica funcional e da bioinformática,
veio permitir a abordagem experimental utilizada.
ii) Indique hipóteses razoáveis para explicar o facto de 3 das 355 proteínas não terem
podido ser identificadas.
Verificou-se que, na sua maioria, as proteínas, cuja concentração é alterada na estirpe
selvagem por indução por gentisato, se encontram envolvidas no metabolismo de
compostos de carbono. Entre elas, a enzima gentisato 1,2-dioxigenase, é induzível por
gentisato. Esta é uma das duas proteínas celulares que apresentam aquela actividade
enzimática chave da via do gentisato, sendo a outra expressa constitutivamente.
Pretende-se saber se o aumento do conteúdo da proteína induzível por gentisato
resulta ou não de regulação ao nível transcricional.
4) i) Refira a abordagem experimental que usaria para esclarecer esta questão.
ii)Diga como procederia para obter o material biológico essencial e específico para
realizar essa experiência, tendo em atenção o seu objectivo
iii) Diga, justificando, se essa mesma experiência permite ou não esclarecer se o gene
que codifica a referida proteína catabólica faz parte de um operão (ou seja, se
encontra agrupado com outros genes cuja transcrição é realizada de dorma
coordenada,originando um único transcrito multicistónico que inclui a informação dos
vários genes). Caso a abordagem seleccionada o não permita, diga que experiência
alternativa deveria fazer para esclarecer também essa questão.
5) Suponha que a hipótese da estrutura operónica se confirma e que pretende localizar
no cromossoma e clonar uma região extensa, com cerca de 10 kb, onde se localiza
esse e outros genes da referida via catabólica. Ainda que conheça a sequência desse
gene em particular, não conhece a sequência completa do genoma da estirpe em
consideração. Esquematize, justificando, os vários passos que deveria levar a cabo
para atingir o objectivo indicado. Se existirem várias possíveis alternativas, espera-se
que opte por uma delas e que desenhe a experiência completa baseada nessa opção.
6) Pretende-se caracterizar bioquimicamente e estruturalmente a dioxigenase em
questão. Para tal precisa-se de obter uma concentração elevada de proteína pura.
Sabendo que conhece a sequência do gene codificante e que pretende fazer a
superprodução por engenharia genética, diga, justificando sumariamente, como
procederia e que plasmídeos, células hopedeiras, e outras condições experimentais
relevantes, utilizaria nessa estratégia.