UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE

UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ - UNOCHAPECÓ
Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais
Riciéri Naue Mocelin
EFEITOS DA N-ACETILCISTEÍNA SOBRE PARÂMETROS
COMPORTAMENTAIS EM PEIXES-ZEBRA
Chapecó – SC, 2015
1
UNIVERSIDADE COMUNITÁRIA DA REGIÃO DE CHAPECÓ
Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais
EFEITOS DA N-ACETILCISTEÍNA SOBRE PARÂMETROS
COMPORTAMENTAIS EM PEIXES-ZEBRA
Riciéri Naue Mocelin
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação
da
Universidade
Comunitária da Região de Chapecó,
como parte dos pré-requisitos para a
obtenção do título de Mestre em Ciências
Ambientais.
Orientadores: Prof. Dr. Angelo Piato
Prof. Dra. Leila Zanatta
Chapecó – SC, 2015
Ficha catalográfica elaborada por
Joseana Foresti
CRB 14/536
M688e
Moce l i n , Ri c i é r i Naue
Ef e i t os da N- ace t i l c i s t e í na sob r e pa r âme t r os compo r t amen t a i s
em pe i xes - zeb r a / Ri c i é r i Naue Moce l i n . - 2015 .
44 p .
Di sse r t ação (Mes t r ado em Ci ênc i as Amb i en t a i s )
Comun i t á r i a da Reg i ão de Chapecó , 2015
I nc l u i b i b l i og r a f i as
- Un i ve r s i dad
1 . Pe i xe o r namen t a l . 2 . Pe i xe - Ef e i t o do s t r ess .
3 . Ans i edade . I .P i a t o , Ange l o Lu i s St apasso l i . I I . Zana t t a ,
Le i l a . I I I . T í t u l o .
CDD ed . 21 - 639 . 34
2
3
A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu,
mas pensar o que ninguém ainda pensou
sobre aquilo que todo mundo vê.”
Arthur Schopenhauer
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AGRADECIMENTOS
Agradecer primeiramente ao meu Pai Giovani Mocelin, minha Mãe Claudete
Naue Mocelin e meu irmão Diego Naue Mocelin, pelo exemplo de vida, pela educação,
oportunidade e pelo apoio durante toda minha caminhada, as forças para que pudesse
atingir mais este objetivo vieram de vocês. Aos demais familiares que também tiveram
sua importância.
Ao meu Orientador Dr. Angelo Piato, por toda paciência e dedicação, pelo esforço
e por acreditar em mim. Pessoa que considero como meu 2º pai, que além de orientar
profissionalmente, teve participação importante no desenvolvimento de caráter e
crescimento intelectual. Um grande amigo, um parceiro, um pai, um orientador.
A minha Orientadora Dra. Leila Zanatta, que não mediu esforços em acolher este
trabalho com a saída da instituição do Angelo, por sua vez também acreditou que este
projeto poderia ser executado. Agradeço a dedicação e apoio durante todo este processo.
Colega Matheus Felipe Marcon, muito obrigado por todo apoio, grande amigo,
parceiro, colega de mestrado, ajudante, e hoje, colega de doutorado. Aos colegas de
projeto Ana Paula Herrmman, Cassiano Lazarotto Rambo, Fernanda Bevilaqua, Aline
Rohden, os meus sinceros agradecimentos pelo apoio.
Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Ciências Ambientais pelos
ensinamentos. Ao Coordenador do programa Dr. Jacir Dal Magro, à secretaria Luciana
Lunelli, parabéns pela organização e prestação de serviços.
Universidade Comunitária da Região de Chapecó (UNOCHAPECÓ) pela
disponibilização dos laboratórios e respectivos técnicos, em especial ao Centro de
Bioterismo da Universidade, onde foi concentrado o maior tempo de execução deste
projeto, meu obrigado as responsáveis Natascha e Kelly pela paciência e dedicação.
Não deixo de agradecer as instituições parceiras como a Universidade de Passo
Fundo (UPF), através dos amigos e colaboradores Dr. Leonardo Barcellos e Murilo
Sander de Abreu, por cederem o espaço para pesquisa, também a Universidade Federal
do Rio Grande do Sul (UFRGS) através do orientador Dr. Angelo Piato.
Agradecer à banca avaliadora, Dra. Anna Maria Siebel da Unochapecó e ao Dr.
Diogo Losch de Oliveira da UFRGS.
Muito Obrigado!
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RESUMO
MOCELIN, Ricieri Naue. Efeitos da N-acetilcisteína sobre parâmetros comportamentais
em peixes-zebra. Dissertação (Mestrado). Universidade Comunitária da Região de
Chapecó, 2015, 44p.
Os transtornos de ansiedade apresentam elevada prevalência e podem causar impactos
importantes na qualidade de vida dos indivíduos. Para o tratamento desses transtornos são
utilizados ansiolíticos, fármacos com eficácia limitada e com relevante incidência de
efeitos adversos. Dessa forma, é fundamental a busca por novos compostos mais eficazes
e com menos efeitos adversos. Nesse contexto, considerando o papel da N-acetilcisteína
(NAC) como modulador de importantes sistemas de neurotransmissão relacionados a
psicopatologias, o objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos da exposição à NAC sobre
parâmetros comportamentais em peixes-zebra. Peixes-zebra de ambos os sexos foram
expostos à NAC (0,1, 1,0 e 10,0 mg/L), fluoxetina (10,0 mg/L) ou bromazepam (1,5
mg/L) por 10 minutos. Posteriormente, os animais foram individualmente submetidos aos
testes comportamentais. Os protocolos experimentais foram aprovados pela CEUAUnochapecó (nº 019/13). Os resultados foram analisados por ANOVA de uma ou duas
vias seguida do post-hoc de Tukey (n=12-15). Inicialmente, avaliou-se o efeito da NAC
e fluoxetina no teste de tanque novo por 6 min. NAC não alterou nenhum parâmetro
comportamental, enquanto que animais expostos à fluoxetina apresentaram significativo
aumento no tempo de permanência na porção superior do aquário (p<0,01 x controle). No
segundo protocolo, avaliou-se o efeito da NAC em um modelo de estresse agudo por
perseguição. Após os tratamentos, animais foram perseguidos com uma rede por 2
minutos e submetidos ao teste de tanque novo. NAC preveniu as alterações
comportamentais (distância total percorrida, tempo de permanência nas zonas inferior,
média e superior) induzidas pelo estresse agudo por perseguição. No terceiro protocolo,
peixes-zebra foram expostos aos tratamentos anteriores e submetidos ao teste de claroescuro. Animais expostos à NAC aumentaram significativamente o tempo de
permanência no lado claro do aparato em relação ao controle (p<0,05). Esse efeito foi
comparável ao ansiolítico bromazepam. Os resultados do presente estudo demonstram
pela primeira vez que a NAC possui propriedades anti-estresse e tipo-ansiolítica em
peixes-zebra, com o potencial de prevenir desordens psiquiátricas induzidas pelo estresse,
tais como ansiedade e depressão. Mais estudos são necessários para justificar o uso da
NAC em transtornos psiquiátricos.
Palavras-chave: N-acetilcisteína; Ansiedade; Estresse; Peixe-zebra.
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ABSTRACT
MOCELIN, Ricieri Naue. Effects of N-acetylcysteine on behavioral parameters in
zebrafish. Dissertation (Master). Universidade Comunitária da Região de Chapecó, 2015,
44p.
Anxiety disorders have high prevalence and may cause significant impacts on the life
quality of the individuals. For the treatment of these disorders are used anxiolytics, drugs
with limited effectiveness and significant incidence of adverse effects. Thus, it is essential
to search for new compounds, more effective and with fewer side effects. Considering
the role of N-acetylcysteine (NAC) as a modulator of important neurotransmission
systems related to psychopathologies, the aim of this study was to evaluate the effects of
exposure to NAC on behavioral parameters in zebrafish. Zebrafish of both sexes were
exposed to NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L), fluoxetine (10.0 mg/L) or bromazepam (1.5
mg/L) for 10 minutes. After, the animals were individually subjected to behavioral
testing. The experimental protocols were approved by CEUA-Unochapecó (No. 019/13).
Results were analyzed by one or two ways ANOVA followed by Tukey post-hoc (n= 1215). Initially we evaluated the effect of NAC and fluoxetine in the novel tank test for 6
min. NAC did not change any behavioral parameters evaluated, while animals exposed
to fluoxetine showed significantly increased time in the upper portion of the tank (p<0.01
x control). In the second protocol, we evaluated the effect of NAC in an acute stress model
for chasing. After the treatments, animals were chased with a net for 2 minutes and
submitted to the novel tank test. NAC prevented the behavioral changes (distance, time
in the bottom zone, middle zone and upper zone) induced by acute stress. In the third
protocol, zebrafish were exposed to previous treatments and subjected to the light-dark
test. Animals exposed to NAC significantly increased the time spent in the light side of
the apparatus compared to control (p<0.05). This effect was comparable to bromazepam.
The results of this study demonstrated for the first time that NAC has anti-stress properties
and anxiolytic-like effects in zebrafish, to potentially prevent the stress-induced
psychiatric disorders such as anxiety and depression. More studies are needed to justify
the use of NAC in psychiatric disorders.
Keywords: N-acetylcysteine; anxiety; stress; Zebrafish.
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LISTA DE FIGURA
Figura 1 – Estrutura química da N-Acetilcisteína .......................................................... 19
Figura 2 – Mecanismo de ação da N-Acetilcisteína ........................................................ 19
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LISTA DE FIGURAS DO ARTIGO
Figura 1 - Schematic representation of the experimental protocol................................. 30
Figura 2 - Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and FLU (10.0 mg/L) on total distance
traveled (A), number of crossings (B), maximum speed (C), time in the bottom (D), time
in the middle (E), and time in the upper zone of the tank (F) in the novel tank test in
zebrafish.......................................................................................................................... 31
Figura 3 - Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and FLU (10.0 mg/L) on total distance
traveled (A), number of crossings (B), maximum speed (C), time in the bottom (D), time
in the middle (E), and time in the upper zone of the tank (F) in the acute stress test in
zebrafish.......................................................................................................................... 32
Figura 4 - Effects of NAC (0.1, 1.0 and 10.0 mg/L) and BMZ (1.5 mg/L) on time in the
lit side of the tank (A), latency to first crossing (B) and number of crossings (C) in the
light/dark test.................................................................................................................. 33
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LISTA DE TABELA
Tabela 1 – Results of two-way analysis of variance (ANOVA) for acute stress test......33
10
LISTA DE QUADRO
Quadro 1: Principais ansiolíticos utilizados na clínica .................................................. 15
11
LISTA DE ABREVITAURAS
5-HT
Serotonina
AMPA
α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propiônico
BZP
Benzodiazepínicos
CEUA
Comissão de Ética no Uso de Animais
DSM-V
Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais 5ª (V) edição
EROs
Espécies Reativas de Oxigênio
GABA
Ácido Gama-aminobutírico
GSH
Glutationa
IL-1β
Interleucina 1
IL-6
Interleucina 6
ISRS
Inibidor Seletivo da Recaptação de Serotonina
mGluR
Receptor Glutamatérgico do tipo Metabotrópico
NAC
N-acetilcisteína
NMDA
N-metil-D-aspartato
NOR
Noradrenalina
SNC
Sistema Nervoso Central
TNF-α
Fator de Necrose Tumoral
TST
Tail Suspension Test (Teste de Suspensão pela Cauda)
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 13
2 OBJETIVOS ............................................................................................................. 22
2.1 Objetivo geral .......................................................................................................... 22
2.2 Objetivos específicos .............................................................................................. 22
3 ARTIGO CIENTÍFICO ......................................................................................... 23
3.1 Introduction ............................................................................................................. 29
3.2 Materials and Methods ............................................................................................ 30
3.3 Results ..................................................................................................................... 31
3.4 Discussion ............................................................................................................... 31
Referênces ..................................................................................................................... 33
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................. 35
REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 36
13
1
INTRODUÇÃO
As psicopatologias causam impactos importantes na vida das pessoas e na
sociedade. Uma meta-análise realizada por Walker e colaboradores (2015) mostrou que
a mortalidade é maior entre os pacientes com algum tipo de transtorno mental em
comparação à população geral. Alterações no estado mental são responsáveis por cinco a
cada dez das principais causas da incapacidade e morte prematura (INSEL et al., 2013).
O custo global para o tratamento de distúrbios de saúde mental em 2010 foi de 2,5 trilhões
de dólares e deverá aumentar para 6,5 trilhões até 2030 (BLOOM et al., 2011). Além
disso, é estimado que aproximadamente 14% das mortes em todo mundo seja atribuída a
algum transtorno mental (WALKER et al., 2015). Esse panorama é agravado pelo fato
de que indústrias farmacêuticas estão investindo cada vez menos em pesquisa e
desenvolvimento de novos psicofármacos e retirando ou redirecionando seus esforços
para outras áreas (INSEL; SAHAKIAN, 2012). Um dos motivos para essa perda de
interesse é que os psicofármacos atualmente disponíveis no mercado apresentam eficácia
limitada e alta incidência de efeitos adversos. Além disso, apesar do grande número de
novos compostos satisfatoriamente avaliados em estudos pré-clínicos, a maior parte
desses candidatos falham em alguma fase de estudos clínicos (INSEL, 2012). Sabe-se que
aproximadamente 80% de diferentes compostos químicos já testados falharam na Fase II
dos ensaios clínicos e 70% dos resultados pré-clínicos não são replicáveis (KOLA;
LANDIS, 2004).
A ansiedade é um transtorno psiquiátrico crônico e frequentemente incapacitante,
representando um alto custo para os indivíduos, para as famílias e para a sociedade
(KESSLER et al., 2007). Esse transtorno induz importante morbidade neuropsicológica,
sendo a forma mais comum de transtorno psiquiátrico, afetando cerca de 25 a 30% da
população e ocorrendo em pelo menos um episódio durante a vida (KESSLER et al.,
2005). De acordo com o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSMV, 2014), os transtornos de ansiedade são classificados em: transtorno de ansiedade de
separação, transtorno de pânico, agorafobia, transtorno de ansiedade social (fobia social),
transtorno de ansiedade generalizada, transtorno de ansiedade induzida por substância,
transtorno de ansiedade associado a outra condição médica e transtorno de ansiedade sem
outras especificações.
14
O tratamento dessa psicopatologia é realizado através de assistência psicológica e
farmacoterapia; no entanto, se estima que cerca de 40-50% dos pacientes são refratários
ao tratamento farmacológico (WU et al., 2012). Os fármacos de primeira escolha para o
tratamento são os ansiolíticos (benzodiazepínicos e não-benzodiazepínicos), os
antidepressivos (inibidores seletivos da recaptação de serotonina (5-HT) (ISRS) e os
inibidores da recaptação de 5-HT e noradrenalina (NOR)). No entanto, esses fármacos
causam diversos efeitos colaterais, incluindo sonolência, sedação e diminuição da
coordenação motora (no caso dos benzodiazepínicos (BZP)), disfunções sexuais,
gastrointestinais e de sono (no caso dos antidepressivos) (WU et al., 2012). O uso crônico
dos BZP pode provocar tolerância e/ou dependência, além de síndrome de abstinência e
altas doses podem ser fatais, principalmente se utilizadas com outros depressores do SNC
(BRUNTON et al., 2012). Além disso, os ISRS funcionam adequadamente em apenas 3040% dos pacientes (STEIN; ANDREWS, 2015). Tanto o uso de BZD como o de ISRS
está associado ao aumento na taxa de suicídio, sendo esse aumento de 31% e 45% para
antidepressivos e BZD, respectivamente (TIIHONEN et al., 2015).
Os principais ansiolíticos (e nomes comerciais), o mecanismo de ação e os
principais efeitos adversos estão descritos no quadro 1 abaixo.
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Quadro 1: Principais ansiolíticos utilizados na clínica.
Nome Comercial
ISRS
Antidepressivos
Antidepressivos ISRS
Mecanismo de Ação
Efeitos Colaterais
Modula os efeitos póssinápticos
da
transmissão
de
GABAA, resultando
num aumento da
inibição pré-sináptica.
Sedação, leve perda de
memória, diminuição
do estado de alerta,
tempo
reação
retardado,
déficit
visuais-espaciais,
reações
amnésicas,
irritabilidade
Diazepam
Valium®
Clonazepam
Rivotril®
Oxazepam
Serax®
Bromazepam
Somalium®
Lorazepam
Lorax®
Alprazolam
Frontal®
Buspirona
Buspar®
Agonista
parcial
seletivo nos receptores
5-HT1A e 5-HT2 de 5HT. Possui moderada
afinidade
por
receptores D2 de
dopamina.
Sem
qualquer efeito sob
GABA.
Tontura, sonolência,
náusea, dor de cabeça,
visão turva, confusão,
diarreia,
insônia,
tremor.
Fluoxetina
Prozac®
Sertralina
Zoloft®
Paroxetina
Paxil®
Citalopram
Celexa®
Cefaléia, náusea e
outros
efeitos
Gastrointestinais,
tremor,
insônica,
disfunção sexual.
Escitalopram
Lexapro®
Venlafaxina
Efexor XR®
Duloxetina
Cymbalta®
Medeia a recaptação
de 5-HT no terminal
pré-sinaptico;
bloqueia a recaptação
resultando
em
neurotransmissão
serotoninérgica
aumentada
e
prolongada,
provocando
estimulação
de
autorreceptores 5-HT.
Inibem
tanto
a
recaptação de 5-HT
quanto noradrenalina.
Provocam aumento da
neurotransmissão
serotoninérgica e/ou
noradrenérgica,
induzindo a ativação
de autorreceptores 5HT.
Agonista 5-HT1A
Benzodiazepínicos (BZP)
Princípio Ativo
Náusea, tontura, boca
seca, cefaleia, elevação
da pressão arterial.
Náusea,
tontura,
insônia,
cefaleia,
constipação.
Fontes: As Bases Farmacológicas da Terapêutica (Brunton et al., 12ª, 2012); Farmacologia Básica e Clínica (Katzung, 12ª, 2014);
Guia de Farmacoterapia (Martin & Talbert, 1ª, 2015); MEDSCAPE, disponível em: www.medscape.com, acesso em: 20 de Junho de
2015.
16
As bases neurobiológicas dos transtornos de ansiedade não são completamente
conhecidas. Diversos sistemas de neurotransmissores estão envolvidos nos transtornos de
ansiedade, como por exemplo, gabaérgico, serotonérgico, glutamatérgico, além de outros
neurotransmissores, neuromoduladores e peptídeos (FREITAS-FERRARI et al., 2010).
Estima-se que 20-30% dos neurônios do SNC são gabaérgicos, sendo o GABA o
principal neurotransmissor inibitório (OLSEN; SIEGHART, 2009; ULRICH; BETTLER,
2007). O GABA pode atuar em receptores ionotrópicos ou metabotrópicos. Os receptores
ionotrópicos medeiam a transmissão inibitória rápida do SNC, potencializando a
afinidade do GABA pelo receptor. Logo, ocorre abertura de canais de cloreto e
hiperpolarização do neurônio pós-sináptico provocando inibição de processos
intracelulares (RUDOLPH; KNOFLACH, 2011). São divididos em dois tipos principais:
A e B. O receptor GABAA contém duas subunidades α, duas subunidades β e uma
subunidade γ com dois sítios de ligação formados por subunidades α e β. Já os receptores
GABAB ou metabotrópicos funcionam como autorreceptores pois inibem a liberação de
GABA e são divididos em GABABR1 e GABABR2 (RUDOLPH; KNOFLACH, 2011).
O sítio de ligação dos BZP é formado por uma das subunidades α (α1, α2, α3 ou
α5) e uma subunidade γ (possivelmente γ2 por estar presente em 90% dos receptores
GABAA) (BRUNTON et al., 2012). A identificação das funções fisiológicas e
farmacológicas dos diferentes subtipos de receptores GABAA (LOW et al., 2000;
CRESTANI et al., 2001; CRESTANI et al., 2002) é essencial para a busca e
desenvolvimento de novos fármacos com menores efeitos colaterais (ex.: ansiolíticos
não-sedativos) ou compostos com indicações distintas dos BZP (ex.: fármacos de melhora
cognitiva e analgésicos), isso através de uma maior afinidade apenas ao subtipo do
receptor desejado, a exemplo do valor terapêutico para danos cognitivos da esquizofrenia
pelos agonistas seletivos de receptores GABAA nas subunidade α1 e α2 (RUDOLPH;
KNOFLACH, 2011).
Constituído por receptores acoplados à proteína G (5-HT1, 5-HT2, 5-HT4-7) e
receptor de canal iônico (5-HT3), os receptores de serotonina são classificados em 14
subtipos (5-HT1A, 1B, 1D, 1E, 1F, 2A, 2B, 2C, 3, 4, 5A, 5B, 6 e 7) (BRUNTON et al., 2012). A serotonina e
seus receptores desempenham papéis críticos na regulação da cognição, comportamento
alimentar, sexual e humor (LAMBE et al., 2011). Os receptores são expressos no córtex
17
pré-frontal humano e desenvolvem excitabilidade desta região do SNC, agindo como um
neuromodulador para regulação emocional e resiliência (BLAND et al., 2003; HOLMES,
2008; KRYSTAL; NEUMEINSTER, 2009).
Desequilíbrios no sistema serotoninérgico estão relacionados à etiologia de
diversos transtornos psiquiátricos (HETRICK et al., 2007; OLIVIER et al., 2010).
Receptores de serotonina do tipo 5-HT1A e 5-HT2A parecem ter efeitos opostos sobre a
ansiedade; por exemplo, a inibição de receptores 5-HT1A (LANZENBERGER et al.,
2007) e ativação de receptores 5-HT2A (WEISSTAUB et al., 2006) podem estar
relacionados à atividade tipo-ansiolítica em ratos. A inibição do receptor 5-HT5A pode
influenciar nas condições ansiolíticas sob estresse (LAMBE et al., 2011). A buspirona,
prescrita para transtornos de ansiedade, é um agonista parcial dos receptores 5HT1A e
classificada como um não-BZP. Atua sobre os receptores serotonérgicos 5HT1A présinápticos acarretando na diminuição da frequência de liberação de serotonina e
noradrenalina (BRUNTON et al., 2012). O efeito terapêutico não é observado com o uso
agudo do fármaco, necessitando de vários dias de tratamento para que a resposta
farmacológica se torne evidente.
Anormalidades no sistema glutamatérgico têm sido observadas em várias doenças
psiquiátricas, como esquizofrenia e transtorno obsessivo compulsivo (DEEPMALA et al.,
2015). O glutamato extracelular é regulado através de um sistema de transporte de alta
afinidade dependente de Na+ (ROTHSTEIN et al., 1996). O sistema trocador cistinaglutamato localizado nas células gliais, possui papel secundário na manutenção dos níveis
de glutamato no meio extracelular (BAUZO et al., 2012). Esse sistema troca cistina
extracelular por glutamato intracelular (KUPCHIK et al., 2012), também possui
importante papel na produção de glutationa (GSH), sintetizada a partir de L-cistina e
glutamato, participando da regulação do estresse oxidativo (WANG; CYNADER, 2000).
Os
receptores
glutamatérgicos
são
classificados
em
ionotrópicos
e
metabotrópicos. Os ionotrópicos são divididos em α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol
propiônico (AMPA), N-metil-D-aspartato (NMDA) e Cainato. Os metabotrópicos são
subdivididos em grupo 1, 2 e 3 (mGluR) (BRUNTON et al., 2012). O sistema
glutamatérgico tem se mostrado importante na fisiopatologia e terapêutica de doenças
psiquiátricas como transtornos de humor. O sistema foi proposto com base em dados préclínicos de antagonistas NMDA (ZARATE et al., 2006).
18
Um excesso de glutamato pode levar à ativação de NDMA que por sua vez
provoca danos e degeneração neuronal devido a um possível e significativo influxo de
Ca2+ nos neurônios (BARGER; BASILE, 2001; PIANI; FONTANA, 1994; SATTLER;
TYMIANSKI, 2001). A ativação de receptores metabotrópicos tipo 1 (mGluR1) pode
causar neurotoxicidade por inibir a neuroproteção contra espécies reativas de oxigênio
(EROs) e uma significativa perda de GSH intracelular (DENG et al., 2004).
A partir da década de 80, o sistema glutamatérgico passou a ser alvo de estudos e
vem ganhando grande interesse na pesquisa relacionada a distúrbios psiquiátricos e
comportamentais. Evidência dessa ação é marcadamente destacada pela rápida ação
antidepressiva do antagonista de receptores NMDA cetamina, quando administrada em
diferentes doses (MURROUGH et al., 2013; SOS et al., 2013; ZARATE et al., 2012;
ZARATE et al., 2006), o que pode sugerir um novo alvo de resposta clínica antidepressiva
de maneira eficaz com ação em 3 horas (DIAZGRANADOS et al., 2010). Sendo o
glutamato uma molécula presente em todo o sistema nervoso central, cuja transmissão
está sujeita a uma fina regulação e que ao mesmo tempo em que é modulado também
modula vários outros sistemas de neurotransmissores, se tornando um alvo farmacológico
importante na área de psiquiatria (HASHIMOTO, 2011).
A alta incidência de transtornos psiquiátricos na população, especialmente os
transtornos de ansiedade, associada à falta de eficácia clínica dos ansiolíticos e a alta
incidência de efeitos adversos, funciona como um motivador na busca de compostos com
melhor eficácia clínica e menor incidência de efeitos adversos.
A N-acetilcisteína (NAC) é um antioxidante, mucolítico e também utilizado no
tratamento de intoxicação por paracetamol (DEAN et al., 2011a). Esse fármaco apresenta
boa tolerabilidade e baixa incidência de efeitos adversos (WHYTE et al., 2007), apesar
de não existir estudos a longo prazo. Alguns efeitos adversos com altas doses foram
pontualmente relatados, como hipertensão arterial em ratos (PALMER et al., 2007) e
estado status epilepticus com hipertensão intracraniana e posterior morte do paciente
(BAILEY et al., 2004). Apesar disso, baixas doses a NAC podem ser utilizadas como
adjuvante para o tratamento de epilepsia (DEVI et al., 2006).
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Figura 1: Estrutura química da N-Acetilcisteína (Fonte: http://www.wikiwand.com/it/Acetilcisteina)
Estruturalmente, a NAC é derivada de N-acetil do aminoácido L-cisteína.
Precursora de cistina, a NAC age no trocador cistina-glutamato presente em astrócitos,
aumentando a quantidade de glutamato extrassináptico (BAKER et al., 2008). Essa
elevação promove uma maior ativação de receptores metabotrópicos de glutamato
(mGluR2/3) localizados no espaço extra sináptico, resultando em diminuição da liberação
sináptica de glutamato e consequente redução na ativação de receptores glutamatérgicos
pós-sinápticos, especialmente do tipo NMDA (DEAN et al., 2011b).
Figura 2: Mecanismo de ação da N-Acetilcisteína (fonte: autor/adaptado de Dean et al., 2011)
O efeito da NAC em modelos pré-clínicos (HERRMANN et al., 2014; LEE et al.,
2014; COSTA-CAMPOS et al., 2013; LINCK et al., 2012; BAUZO et al., 2012) e clínicos
20
(DEAN et al., 2015; OLIVER et al., 2015; PRADO et al., 2015; NIKOO et al., 2015; LIU
et al., 2014; GRANT et al., 2014; BERK et al., 2013; BERK et al., 2008) tem sido
recentemente avaliado. Herrmann e colaboradores (2014) demonstraram a capacidade da
NAC em prevenir a hipersensibilidade induzida por anfetamina no modelo de isolamento
social em camundongos, sugerindo assim que o composto pode ser útil na intervenção de
pacientes com riscos de desenvolver psicoses. O uso da NAC também já foi
preliminarmente documentado em transtornos de ansiedade, como por exemplo, na
tricotilomania (GRANT et al., 2009), mas seu efeito ansiolítico não foi caracterizado em
modelos animais, que podem identificar usos específicos bem como potenciais efeitos
adversos. Outra particularidade da NAC está na sua capacidade de reduzir as citocinas
pró-inflamatórias IL-1β (interleucina-1) e TNF-α (fator de necrose tumoral) conferindo
assim uma atividade anti-inflamatória (CHEN et al., 2008; KHAN et al, 2004; MALHI;
BERK, 2007; OJA et al., 2000).
A ansiedade pode causar estresse oxidativo, o qual pode ser definido como o
desequilíbrio entre a formação e remoção de agentes oxidantes no organismo, decorrente
da geração excessiva de EROs incluindo radicais livres, e/ou diminuição de antioxidantes
endógenos (NG et al., 2008). A GSH é um antioxidante endógeno e a NAC induz a
reposição de GSH no SNC, podendo trazer resultados positivos relacionados a doenças
psiquiátricas, como a ansiedade (FRIES; KAPCZINSKI, 2011). Estudos apontam ainda
que a introdução de modeladores de glutamato como a NAC, pode ser uma possibilidade
promissora para o tratamento de distúrbios de humor, uma vez que o glutamato é
considerado como o caminho final comum de tratamento terapêutico para a depressão e
outros distúrbios de humor como a ansiedade (COSTA-CAMPOS et al., 2013).
Os fármacos atualmente disponíveis para o tratamento da ansiedade apresentam
limitações como síndrome de abstinência, tolerância, dependência, além de alguns
apresentarem baixa eficácia e outros ainda necessitarem de mais estudos para elucidação
de seu mecanismo de ação. Portanto, torna-se necessária a busca de novos compostos ou
então propor um novo uso a um conhecido fármaco já disponível na clínica, com menores
efeitos adversos e melhor eficácia clínica em transtornos psiquiátricos além do
mecanismo de ação inovador. Com isso, existe uma oportunidade de os cientistas
praticarem o que chamam de “Repurposing” de compostos que já superaram e passaram
21
pelos obstáculos de desenvolvimento, verificando assim possíveis relações com a
psiquiatria (INSEL et al., 2013).
Nesse contexto, considerando o papel da NAC como agente modulador em
diversas vias relevantes aos transtornos psiquiátricos, o objetivo desse trabalho foi avaliar
os efeitos comportamentais da NAC em peixes-zebra.
22
2
OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar os efeitos comportamentais da N-acetilcisteína (NAC) em peixes-zebras.
2.2 Objetivos Específicos
2.2.1
Avaliar os efeitos comportamentais da exposição à NAC (0,1, 1,0 e 10 mg/L)
no teste de tanque novo em peixes-zebra.
2.2.2
Avaliar os efeitos comportamentais da exposição à NAC (0,1, 1,0 e 10 mg/L)
em peixes-zebra submetidos a um protocolo de estresse agudo;
2.2.3
Avaliar os efeitos comportamentais da exposição à NAC (0,1, 1,0 e 10 mg/L)
no teste de claro/escuro em peixes-zebra.
23
3
MATERIAIS E MÉTODOS, RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os tópicos descritos acima fazem parte de um artigo submetido e aceito na Revista
Pharmacology, Biochemistry and Behavior (carta de licença de uso).
24
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35
4
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados do presente estudo demonstram pela primeira vez que a NAC possui
propriedades anti-estresse e tipo-ansiolítica em peixes-zebra. Não houve diferença
significativa entre a NAC e controle em relação à distância total percorrida, número de
cruzamentos entre as diversas porções do aquário e velocidade máxima. Dessa forma, a
exposição à NAC não causa alterações motoras relevantes nos animais. Nesse teste,
animais expostos à fluoxetina apresentaram aumento no tempo de permanência na porção
superior do aquário. Esses dados já foram observados em estudos anteriores com
fluoxetina na concentração de 100 µg/L por duas semanas (EGAN et al., 2009).
O modelo de estresse agudo por perseguição foi capaz de diminuir a distância total
percorrida, o número de cruzamentos, o tempo de permanência na porção média e o tempo
de permanência na porção superior e, consequentemente, aumentar o tempo de
permanência na porção inferior do aparato. A partir desses resultados pode-se afirmar que
o protocolo foi ansiogênico para os animais. Entretanto, a exposição à NAC foi capaz de
prevenir todas essas alterações induzidas pelo estresse.
No teste de claro/escuro, NAC foi capaz de aumentar o tempo de permanência no
lado claro do aparato, com resultado comparável ao ansiolítico bromazepam. Além disso,
NAC diminuiu a latência para o primeiro cruzamento nas três concentrações utilizadas no
estudo.
Os resultados mostram que a NAC foi capaz de prevenir claramente o
comportamento ansiogênico induzido pelo protocolo de estresse agudo, podendo ser
interpretado como um efeito anti-estresse. Pode-se sugerir que a NAC possui um alto
potencial de prevenir ou atuar como um adjuvante no tratamento de transtornos
psiquiátricos que podem ser induzidos pelo estresse como ansiedade e depressão.
Contudo, mais estudos são necessários para justificar o uso da NAC em estresse e
transtornos psiquiátricos associados.
36
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ANEXO
Carta de Aprovação da CEUA-Unochapecó