PROPOSTA DE TUTORIA DE PROJECTOS

Modelo de Proposta de Projecto
PROPOSTA DE TUTORIA DE PROJECTOS
Disciplinas de Investigação do Mestrado Integrado em Medicina
Orientador responsável (docente ou investigador doutorado da FMUC):
Paulo Pereira
Centro/Serviço/Instituto: Centro de Oftalmologia - IBILI
EMAIL: [email protected]
Área Temática do Projecto:
Biologia Celular e Molecular. Biologia do Envelhecimento e Doenças Crónicas.
Duração do projecto:
2 semestres
(indicar especificamente se o projecto é susceptível de ser continuado ao longo do tempo do
curso) O projecto é susceptível de ser continuado ao longo do tempo.
Financiamento: Sim
Não
Agência Financiadora: FCT
Exigência de competências prévias aos alunos? Sim
x
Não
Quais?
Conhecimentos gerais de Biologia Celular e Bioquíimica
(não aplicável a alunos do 1º e 2º anos do mestrado integrado)
Título do projecto:
Diálogo transversal entre a autofagia e a via da ubiquitina-proteassoma:
competição ou colaboração?
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Modelo de Proposta de Projecto
Resumo (Max. de 300 palavras):
A competência das células para eliminar proteínas lesadas e/ou obsoletas tem
uma importância fulcral para o seu funcionamento normal. Uma alteração ou
deficiência no funcionamento das vias que conduzem à degradação destas
proteínas pode conduzir a diversas patologias. Um exemplo clássico é o das
doenças neurodegenerativas como Alzheimer,
Parkinson ou a doença de
Huntington, onde a acumulação de agregados proteicos é uma das marcas
centrais destas patologias.
As células possuem várias vias para a degradação e reciclagem de proteínas
modificadas.
A
via
da
ubiquitina-proteassoma
(UPP)
é
a
via
melhor
documentada. No entanto, nos últimos anos, tem sido sugerido que outras vias
como a autofagia, incluindo a macroautofagia e a autofagia mediada por
chaperones (CMA), têm um papel relevante na eliminação selectiva de
proteínas obsoletas. Até há bem pouco tempo, considerava-se que estas vias
funcionavam independente e separadamente. Não obstante, estudos mais
recentes
sugerem
que
este
paradigma
pode
ser
falso
e
que
vias
aparentemente diferentes podem comunicar entre si. Nalguns casos foram já
encontrados substratos proteicos que podem ser degradados quer pela via da
UPP quer por macroautofagia. Este e outros resultados sugerem que vias
aparentemente distintas podem partilhar pontos de contacto e “comunicar”.
Neste projecto propõe-se que na sequência de estímulos adequados, as células
podem activar simultaneamente vias alternativas para a eliminação de
proteínas lesadas. Mais especificamente, procurar-se-á estudar se alguns
substratos proteicos podem estar a ser degradados por mais que uma destas
vias. Como estimulo de lesão celular serão utilizados os oxisterois, ou óxidos
de colesterol. Estes compostos têm propriedades citotóxicas e estão presentes
no organismo. Neste projecto propõe-se um novo mecanismo através do qual
diferentes vias de degradação proteica podem interagir em resposta a um
estimulo específico, de forma a compensarem o funcionamento deficiente de
uma destas vias. Esta estratégia contribuiria para minimizar os efeitos tóxicos
da acumulação de proteínas lesadas nas células e constituiria assim uma
componente estratégica de reparação celular e sobrevivência.
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Modelo de Proposta de Projecto
(área, importância, meios, metodologias, etc.)
Objectivos (Max de 500 palavras):
Com este estudo pretendemos estudar os efeitos dos oxisteróis como
activadores de vias de degradação proteica específicas incluindo autofagia e
degradação pela via Ubiquitina-Proteassoma. Procuram-se os mecanismos
moleculares que regulam a potencial interacção entre vias de degradação ou
resposta ao stress incluindo a UPP, a macroautofagia e a CMA. Mais
concretamente procuraremos clarificar se, em resposta a lesões como a
induzida pelos oxiesterois, as diferentes vias competem entre si para degradar
os substratos, ou se colaboram entre si para minimizar os danos produzidos
pela acumulação de proteínas lesadas.
Plano de trabalhos (Max de 1500 Palavras):
Tarefa 1
Procurar-se-á caracterizar e produzir controlos para as 3 vias de degradação
acima referidas: UPP, macroautofagia e CMA. Para este efeito iremos utilizar
uma linha celular imortalizada de células do epitélio pigmentado da retina
(ARPE-19).
Estas
células
serão
incubadas
durante
espaços
de
tempo
diferentes, na presença ou ausência de diferentes concentrações de oxisteróis.
Para verificar se os oxisterois estão a induzir a degradação de proteínas pela
via da ubiquitina-proteassoma serão analizados os extractos celulares por
western blot, marcando as proteínas com um anticorpo contra a ubiquitina.
Desta forma todas as proteínas que estiverem conjugadas com cadeias de
poliubiquitina serão marcadas. A conjugação de várias ubiquitinas a uma
determinada proteína é um sinal de degradação pelo proteassoma. Assim é
possivel verificar se a incubação com os oxisterois aumenta a quantidade de
proteínas conjugadas com ubiquitina. Para confirmar que os oxisterois não
estão a inibir o proteassoma, mas antes a induzir a degradação de proteínas
pela UPP, será analisada a actividade do proteassoma utilizando um substrato
fluorogénico. Este substrato emite fluorescência quando clivado e é especifico
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Modelo de Proposta de Projecto
para o proteassoma. Assim é possível relacionar o sinal de fluorescência
produzido com a actividade do proteassoma.
Para observar a activação da macroautofagia as células
com
um
plasmídeo
que
codifica
a
proteína
de
serão transfectadas
fusão
EGFP-LC3
e
subsequentemente expostas a oxiesterois. A GFP (Green Fluorescent Protein) é
uma proteína que emite fluorescência de cor verde quanto excitada com luz
azul. A LC3 é uma proteína citoplasmática que é considerada um marcador da
macroautofagia. De facto quando há activação da autofagia a LC3 é clivada e
translocada para as vesículas autofágicas. Neste caso serão analisados os
extractos celulares por western blot, marcando as proteínas com um anticorpo
para a GFP. Alternativamente células ARPE-19 serão cultivadas em lamelas de
vidro e fixadas para observação por microscopia confocal. A activação da
macroautofagia conduz a um aumento da LC3 clivada (LC3-II) e a uma
diminuição da LC3 citoplasmática (LC3-I).
Paralelamente procura-se avaliar de que forma é que o complexo mTOR é
regulado em resposta aos oxisterois. O complexo mTOR é o elemento fulcral na
principal via de activação da macroautofagia. A sua activação, nomeadamente
através
da
fosforilação
pela
Akt,
actua
como
um
forte
inibidor
da
macroautofagia. Prevê-se que a presença de oxiesterois conduzirá a uma
diminuição dos níveis de Akt na célula. Procurar-se-á assim analisar os níveis
celulares de Akt em resposta aos oxiesterois por western blot assim como
sobreexpressar esta enzima para tentar recuperar o fenótipo.
Para analisar a activação da autofagia mediada por chaperones procede-se à
imunoprecipitação da proteína Lamp2. Esta proteína encontra-se na membrana
dos lisossomas e é responsável pela entrega de substratos proteicos, que
interagem com um complexo de chaperones moleculares, ao lúmen do
lisossoma, para subsequente degradação. A imunoprecipitação permitirá ainda
coimunoprecipitar proteínas que interagem directamente ou indirectamente
com a Lamp2. Depois de imunoprecipitar a Lamp2 as amostras serão
analisadas por western blot, marcando com anticorpos para os chaperones
moleculares, nomeadamende Hsc70, Hsp90 e Hsp40.
Um aumento da
actividade da CMA traduz-se por uma maior interacção entre a Lamp2 e os
chaperones moleculares referidos.
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Modelo de Proposta de Projecto
Tarefa 2
Com o objectivo de verificar se os oxisteróis podem induzir a degradação de
alguns substratos do proteassoma por macroautofagia, as células ARPE-19
serão transfectadas com EGFP-LC3, incubadas na presença de oxisterois e/ou
3-MA, um inibidor da macroautofagia, e fixadas em lamelas. As preparações
serão então marcadas com anticorpos para a ubiquitina. O recurso a esta
técnica de imunofluorescência permite avaliar a eventual colocalização de
vesículas autofagicas com proteínas conjugadas com ubiquitina. Procurar-se-á
ainda observar a distribuição subcelular das vesículas recorrendo à marcação
dos núcleos com a sonda Hoescht, já que em alguns casos foi observada a
localização deste tipo de vesículas autofágicas na região perinuclear, rodeando
grandes agregados proteicos (agressomas). Adicionalmente procurar-se-á
marcar as células com anticorpos contra a vimentina ou contra a tubulina para
confirmar a formação de agressomas, pois existe uma colocalização entre o
citosqueleto e estas estruturas.
Tarefa 3
A CHIP (carboxyl terminus of Hsc70 Interacting Protein) é uma proteína que
interage com o chaperone Hsc70 e que apresenta ao mesmo tempo actividade
de ligase de ubiquitina (E3). As ligases de ubiquitina estão na base de uma
reacção sequencial que, juntamente com outras enzimas, conjuga ubiquitina às
proteínas. A formação de cadeias longas de ubiquitina é um sinal de
degradação pelo proteassoma. Considera-se actualmente que proteínas como a
CHIP são uma parte essencial do controlo de qualidade proteico efectuando a
triagem de proteínas obsoletas. Uma das hipóteses que está na base deste
projecto é a que sugere que substratos que seriam normalmente dirigidos para
a via da UPP pela CHIP, sejam degradados pela via da CMA,
devido à sua
relação estreita com os chaperones moleculares. Com este objectivo procurase avaliar se existe interacção entre a maquinaria de CMA e a CHIP. Para isso a
Lamp2 de células ARPE-19 incubadas com oxiesterois ou inibidores do
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proteassoma
é
imunoprecipitada.
Procura-se
determinar
se
a
CHIP
coimunoprecipita com a Lamp2, sugerindo uma interacção entre a duas
proteínas. Esta hipótese será ainda confirmada através do isolamento dos
lisossomas
das
ARPE-19,
pesquisando-se
os
extractos
por
habituais
substractos da CHIP. Como controlos as células ARPE-19 serão transfectadas
com CHIP mutada no domínio de interacção com a Hsc70. Essas CHIP mutadas
vão competir pelos substratos com a CHIP selvagem, actuando como
dominantes negativos.
(fases, objectivos, metodologias, resultados de cada fase, calendarização, etc.)
Competências específicas do projecto a adquirir pelo aluno:
O aluno deve participar no desenho de um projecto de investigação e
desempenhar algumas tarefas de laboratório que permitam testar e responder
a uma hipótese de trabalho.
O aluno deve ainda aprender a analisar de modo critico os resultados obtidos e
saber discuti-los na forma escrita e oral. O aluno deve ainda saber estabelecer
a relevância dos resultados obtidos para o avanço do conhecimento nesta área.
(Entre outros requisitos, os alunos deverão ser capazes de formular uma hipótese científica;
ser capazes de desenhar um projecto científico e identificar a sua relevância face ao estado do
actual
do
conhecimento;
saber
desenhar
experiências
científicas
aplicando
protocolos
específicos; saber interpretar e discutir de forma crítica os resultados obtidos; descrever e
expor oralmente os resultados obtidos.)
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