Uma infecção ou doença pode ter profundos efeitos em outra infe
Propaganda
INSTITUTO OSWALDO CRUZ Mestrado em Biologia Parasitária “COINFECÇÃO POR TRYPANOSOMA EVANSI (STEEL 1885), BALBIANI 1888, E PELO VÍRUS DA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA EM CAVALOS DO PANTANAL SUL-MATOGROSSENSE” Daniela Rozas Parreira RIO DE JANEIRO Abril de 2009 i INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Parasitária Daniela Rozas Parreira “COINFECÇÃO POR TRYPANOSOMA EVANSI (STEEL 1885), BALBIANI 1888, E PELO VÍRUS DA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA EM CAVALOS DO PANTANAL SUL-MATOGROSSENSE” Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências. Orientador: Dr. Heitor Miraglia Herrera RIO DE JANEIRO Abril de 2009 ii INSTITUTO OSWALDO CRUZ Pós-Graduação em Biologia Parasitária Daniela Rozas Parreira “COINFECÇÃO POR TRYPANOSOMA EVANSI (STEEL 1885), BALBIANI 1888, E PELO VÍRUS DA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA EM CAVALOS DO PANTANAL SUL-MATOGROSSENSE” ORIENTADOR : Dr. Heitor Miraglia Herrera Aprovada em: 01/04/2009 Banca examinadora: Dr. Adauto José Gonçalves de Araújo FIOCRUZ/ENSP Profa Dra. Rosângela Zacarias Machado UNESP/Jaboticabal Dr. Paulo Sérgio D’Andrea FIOCRUZ/IOC RIO DE JANEIRO Abril 2009 iii Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Biologia de Tripanosomatídeos do IOC/FIOCRUZ sob orientação do Dr. Heitor Miraglia Herrera. iv Aos meus pais, Lúcio e Clélia e ao meu querido irmão André pelo amor incondicional que sempre dedicaram a mim e por nunca medirem esforços para me apoiar em cada passo da minha vida. v AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus por ter me presenteado com irmão e pais maravilhosos, por colocar cada pessoa amiga no meu caminho e por, mesmo às vezes questionando sua existência nos momentos difíceis, nunca ter permitido que eu perdesse a minha fé. Ao meu orientador Dr. Heitor Miraglia Herrera pela confiança e orientação, além do carinho e amizade que sempre teve comigo. À Dra. Ana Maria Jansen por ter me recebido com muito carinho em seu laboratório e pelas sugestões sempre bem vindas. A TODOS os amigos do Laboratório de Biologia de Tripanosomatídeos pela amizade e companheirismo, principalmente ao Marcos Lima, à Moema, ao Vanderson Vaz, à Monica Caroline, ao Miguel Fernando ao Vitor Rademaker e à Fabiana Rocha, que colaboraram para a elaboração dessa dissertação, sempre dispostos a ajudar. Aos amigos da FIOCRUZ, em especial à minha turma de mestrado, o “quorum sensing”, porque mesmo separados, estamos juntos. Aos funcionários das fazendas onde realizei o meu trabalho, por auxiliarem nas coletas dos materiais. Ao Laboratório de Viroses Veterinárias da UFFRJ pela colaboração com os diagnósticos para Anemia Infecciosa Equina. Ao Dr. Rafael Monteiro pelo auxílio com as amostras de fezes. À Dra. Reinalda Lanfredi e à Dra. Débora dos Anjos do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da UFRJ pela ajuda na identificação dos ovos de helmintos. Ao fotógrafo Rodrigo Méxas pelo registro de todos os exames para Anemia Infecciosa Equina. Aos amigos Luciane Parreira, Marina, Paula, Raphael, Carol Monteiro, Luciana Rodrigues, Tamara, Carol Mendes, Sheylla, Saulo, Fábio, João, Vitor, Ana Cláudia e todos aqueles que, perto ou longe, simplesmente tornaram meus dias mais agradáveis. Quem tem amigos, tem tudo! Um agradecimento especial ao meu namorado Rafael, pela amizade, compreensão, apoio e muita paciência. E a todos aqueles que de alguma forma colaboraram para a elaboração desse trabalho. vi RESUMO O impacto resultante da interação entre distintos parasitos quanto à saúde do hospedeiro, bem como ao estabelecimento de infecções subsequentes, constitui uma lacuna no conhecimento das coinfecções naturais. O “mal de cadeiras”, causado por Trypanosoma evansi e a Anemia Infecciosa Equina (AIE), causada pelo vírus da AIE (VAIE) são enfermidades endêmicas no Pantanal, a maior planície inundável do planeta. Nesta região, a principal atividade econômica é a pecuária extensiva, onde a utilização dos equinos é de extrema importância no manejo do gado. Deste modo, infecções imunossupressoras e anemiantes em cavalos podem comprometer drasticamente a economia local. Nesse estudo, avaliamos o impacto da coinfecção por T. evansi e pelo VAIE, diagnosticada através da soro-prevalência, na saúde dos equinos, expressa por variáveis hematológicas, considerando duas categorias de idade/manejo dos animais e períodos de início e final da estação chuvosa no Pantanal sul mato-grossense. Investigamos ainda a possibilidade dessa coinfecção favorecer a ocorrência de surtos de “mal de cadeiras” na região e a interferência da infecção por helmintos nesta coinfecção. Nossos resultados mostraram ambas as infecções, por T. evansi e pelo VAIE, ocorrem de maneira independente uma da outra e que de forma geral, o parasitismo por T.evansi e/ou pelo VAIE não levou a importantes prejuízos à saúde dos animais. A infecção por helmintos não representou risco à saúde dos animais nem interferiu no impacto da coinfecção por T.evansi e o VAIE. O grau de prejuízo à saúde dos cavalos, expresso por variáveis hematológicas e soro-prevalências das infecções, nas fazendas estudadas pôde ser associado ao manejo empregado em cada fazenda e não diretamente às infecções. Observamos que a infecção dos equinos por T.evansi, em sua maioria ocorre quando jovens, ainda não em serviço, enquanto que a infecção pelo VAIE ocorre predominantemente após serem postos em serviço. Além disso, embora não houvesse parasitemia patente, observamos soro-conversão de alguns animais. Verificamos que o manejo a que os cavalos em serviço estavam submetidos constitui um fator de risco à infecção pelo VAIE e, assim a transmissão pode ser facilitada pela atividade humana. A coinfecção com esses microparasitos pode ser um dos fatores do desencadeamento de surtos de “mal de cadeiras” principalmente entre os animais em serviço, uma vez que a imunobiologia da infecção pelo VAIE pode favorecer a multiplicação do T. evansi. Ainda, complexas inter-relações ambientais, fisiológicas e parasitárias podem conferir um caráter temporal assimétrico à epidemiologia das enfermidades estudadas. vii ABSTRACT The impact of the interaction between distinct parasites in relation to host health, and the establishment of new parasites, is not well known yet. The “mal de cadeiras”, caused by T. evansi, and the equine infection anemia (EIA), caused by the EIA virus (EIAV), are endemic diseases of horses in the Pantanal, the greatest wetland in the world. In this region the main economic activity is extensive cattle ranching, where horses are extremely important for cattle management. For this reason, infections that cause immune depression and anemia in horses could drastically compromise local economy. Here, we evaluated the impact of the coinfection by T. evansi and by EIAV, diagnosed through serology, in the health of equines, expressed through hematologic parameters, using two age/management categories and two time periods, the beginning and the end of the wet season in the southern Pantanal, in Mato Grosso do Sul State. We also investigated the possible influence of this co-infection in “mal de cadeiras” outbreaks and the impact of helminth infection in this co-infection. Our results showed both T. evansi and EIAV infection occurs independently of each other and neither one presented important damage to the health of horses. The degree of health damage in the animals, expressed by hematologic parameters and serum prevalence of infections, could be associated to horse management in each farm and not directly to infections. We observed that T. evansi infection occurs when horses are young, not in service, whereas the infection by EIAV occurs predominantly after being in service. Additionally, yet patent parasitemia was not observed, we verified that some animals became positive through the course of the study. We also observed that the management of horses in service could be a factor influencing the risk of EIAV infection and consequently transmission could be increased as a result of human activity. The co-infection by these microparasites may be one of the factors promoting “mal de cadeiras” outbreaks, mainly among horses in service, as the immunobiology of EIAV can favor T. evansi multiplication. Moreover, complex environmental, physiological and parasitological inter-relationships can be causing a temporal asymmetry to the epidemiology of both studied diseases. Helminth infections do not represent danger to equines health in the studied areas, nor in the resultant due to co-infection by T. evansi and EIAV. viii LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1: Exemplos de mamíferos domésticos e silvestres que podem ser hospedeiros para Trypanosoma evansi. Onde: 1- Equus cabalus 2-Oecomys marmorae, 3- Canis familiaris, 4- Bos indicus, 5- Desmodus rotundus , 6- Gracilinanus agilis , 7- Hydrochoerus hydrochaeris, , 8- Nasua nasua................................................................................................22 Figura 2: Sinais neurológicos encefálicos em cavalo com tripanossomíase. A ataxia dos membros pode ser observada pelos membros torácicos afastados e pelo cruzamento dos membros pélvicos. FONTE: Rodrigues e cols. 2005................................................................26 Figura 3: Estrutura esquemática do vírus da Anemia Infecciosa Equina. FONTE: Leroux e cols.2004...................................................................................................................................28 Figura 4: Teste de IDGA. As linhas de precipitação indicam reações positivas relativas ao soro controle. Foto: Rodrigo Méxas.........................................................................................31 Figura 5: Estágios de vida livre dos estrôngilos de equinos, onde: 1-ovo não embrionado, 2ovo embrionado, 3-larva de 1º estádio (L1), 4-larva de 2º estádio (L2), 5-larva de 3º estádio (L3- forma infectante). FONTE: Nielsen e cols. 2007.............................................................33 Figura 6: O Pantanal ...............................................................................................................36 Figura 7: Importância dos equinos na criação extensiva de gado no Pantanal........................37 Figura 8: Cavalos da fazenda FA organizados para a realização da coleta de sangue. Pantanal- Mato Grosso do Sul. Janeiro de 2007......................................................................41 Figura 9: Hematologia. 1- tubos contendo sangue com EDTA; 2-leitura do microhematócrito; 3- confecção do esfregaço; 4- câmara de Neubauer............................................42 Figura 10: Técnica do micro-hematócrito. As setas indicam formas tripomastigotas. Cor da fotografia alterada para melhor visualização dos parasitos.......................................................43 Figura 11: Coluna de troca iônica DEAE-celulose..................................................................44 ix Figura 12: Lâmina para IDGA mostrando as 7 cavidades no gel de Ágar. As cavidades contém: Ag = Antígeno; 1, 3, 5 = soro-controle; 2, 4, 6 = soro testado. Podem ser observadas 1 reação negativa (cavidade 2) e 2 positivas (cavidades 4 e 6). FOTO: Rodrigo Méxas.........46 Figura 13: Percentual de equinos infectados/co-infectados por Trypanosoma evansi e pelo Vírus da Anemia Infecciosa Eqüina (VAIE) da fazenda FA do Pantanal sul-matogrossense em janeiro de 2007. Os valores absolutos estão nos topos das colunas..........................................49 Figura 14: Percentual de equinos infectados/co-infectados por Trypanosoma evansi e pelo Vírus da Anemia Infecciosa Eqüina (VAIE) da fazenda PA do Pantanal sul-matogrossense em janeiro de 2007. Os valores absolutos estão nos topos das colunas..........................................50 Figura 15: Prevalência das infecções por Trypanosoma evansi e pelo Vírus da Anemia Infecciosa Equina (VAIE) nos equinos da fazenda FA do Pantanal sul-matogrossense em Dezembro de 2007. Os valores absolutos estão nos topos das colunas...................................53 Figura 16: Prevalência das infecções por Trypanosoma evansi e pelo Vírus da Anemia Infecciosa Equina (VAIE) nos equinos da na fazenda FA do Pantanal sul-matogrossense em Abril de 2008. Os valores absolutos estão nos topos das colunas............................................53 Figura 17: Prevalência da infecção por Trypanosoma evansi nos equinos da fazenda FA do Pantanal sul-matogrossense em Dezembro de 2007 e Abril de 2008 de acordo com as categorias de idade/manejo. A categoria A engloba animais jovens e a B animais já submetidos ao serviço de rotina da fazenda. Os valores absolutos estão nos topos das colunas......................................................................................................................................54 Figura 18: Prevalência da infecção pelo Vírus da Anemia Infecciosa Equina nos equinos da fazenda FA do Pantanal sul-matogrossense em Dezembro de 2007 e Abril de 2008 de acordo com as categorias de idade/manejo. A categoria A engloba animais jovens e a B animais já submetidos ao serviço de rotina da fazenda. Os valores absolutos estão nos topos das colunas......................................................................................................................................55 Figura 19: Percentual de equinos infectados por estrongilídeos, ascarídeos, oxiurídeos e cestóides na fazenda FA do Pantanal sul-matogrossense em dezembro de 2007 e abril de 2008...........................................................................................................................................59 x Figura 20: Número de equinos de acordo com o número de ovos por grama de fezes em Dezembro de 2007 e Abril de 2008..........................................................................................59 xi LISTA DE TABELAS Tabela 1. Efetivo de equídeos no Brasil, no Estado do Mato Grosso do Sul e no município de Corumbá....................................................................................................................................35 Tabela 2: Médias das variáveis entre os perfis de infecção na fazenda FA. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskall-Wallis.....................................................................................51 Tabela 3: Médias das variáveis entre os perfis de infecção na fazenda PA. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskall-Wallis.....................................................................................51 Tabela 4: Variáveis hematológicas comparadas entre as fazendas FA e PA...........................52 Tabela 5: Médias das variáveis hematológicas entre as categorias A e B, nas coletas de dez/07 e abr/08. Os valores de p referem-se ao teste de Mann-Whitney..................................56 Tabela 6: Médias das variáveis hematológicas da população total e das categorias A e B, entre as coletas. Os valores de p referem-se ao teste de Wilcoxon...........................................56 Tabela 7: Médias das variáveis hematológicas comparadas entre os animais agrupados de acordo com os perfis de infecção em dezembro/07. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskall-Wallis.........................................................................................................................57 Tabela 8: Médias das variáveis hematológicas comparadas entre os perfis de infecção em abril/08. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskall-Wallis.............................................58 xii LISTA DE APÊNDICES Apêndice 1: Prevalência das infecções por T. evansi e pelo VAIE na fazenda FA em janeiro de 2007. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Apêndice 2: Prevalência das infecções por T. evansi e pelo VAIE na fazenda PA em janeiro de 2007. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Apêndice 3 : Médias e desvios-padrão das variáveis entre os perfis de infecção na fazenda FA em janeiro de 2007. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskall-Wallis. Apêndice 3.1: Teste de Kruskal-Wallis para a variável Ht na fazenda FA em Janeiro/07. Apêndice 4 : Médias e desvios -padrão das variáveis entre os perfis de infecção na fazenda PA em janeiro de 2007. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskall-Wallis. Apêndice 5: Variáveis hematológicas comparadas entre as fazendas FA e PA. Apêndice 6: Prevalência das infecções por Trypanosoma evansi e pelo vírus da Anemia Infecciosa Equina na fazenda FA em Dezembro de 2007. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Apêndice 7: Prevalência das infecções por Trypanosoma evansi e pelo vírus da Anemia Infecciosa Equina na fazenda FA em Abril de 2008. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Apêndice 8: Correlação entre as categorias de manejo/idade e a infecção por T. evansi na fazenda FA em Dezembro de 2007. Os valores de p referem-se ao teste de correlação do coeficiente Phi. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Apêndice 9: Correlação entre as categorias de manejo/idade e a infecção por T. evansi na fazenda FA em Abril de 2008. Os valores de p referem-se ao teste de correlação do coeficiente Phi. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Apêndice 10: Correlação entre as categorias e a infecção pelo VAIE na fazenda FA em Dezembro de 2007. Os valores de p referem-se ao teste de correlação do coeficiente Phi. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Apêndice 11: Correlação entre as categorias e a infecção pelo VAIE na fazenda FA em Abril de 2008.Os valores de p referem-se ao teste de correlação do coeficiente Phi. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. xiii Apêndice 12: Médias das variáveis hematológicas entre as categorias A e B, nas coletas de Dezembro /07 e Abril/08. Os valores de p referem-se ao teste de Mann-Whitney. Apêndice 13: Médias das variáveis hematológicas da população de cavalos da fazenda FA entre as coletas de dez/07 e abr/08. Os valores de p referem-se ao teste de Wilcoxon. Apêndice 14: Médias das variáveis hematológicas da categoria A da fazenda FA entre as coletas de dez/07 e abr/08. Os valores de p referem-se ao teste de Wilcoxon. Apêndice 15: Médias das variáveis hematológicas da categoria B da fazenda FA entre as coletas de dez/07 e abr/08. Os valores de p referem-se ao teste de Wilcoxon. Apêndice 16: Médias das variáveis hematológicas comparadas entre os animais da fazenda FA agrupados de acordo com os perfis de infecção em Dezembro/07. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskal-Wallis. Apêndice 16.1: Teste de Kruskal-Wallis para a variável RBC em dezembro/07. Apêndice 17: Médias das variáveis hematológicas comparadas entre os perfis de infecção em abril/08. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskall-Wallis. Apêndice 17.1: Teste de Kruskal-Wallis para as variáveis Ht, RBC e neutrófilos em abril/08. Apêndice 18: Variáveis hematológicas entre os grupos de perfis de infecção da categoria A em dezembro/07. Apêndice 19: Variáveis hematológicas entre os grupos de perfis infecção da categoria B em dezembr/07. Apêndice 20: Variáveis hematológicas entre os grupos de perfis infecção da categoria A em abril/08. Apêndice 21: Variáveis hematológicas entre os grupos de perfis infecção da categoria B em abril/08. xiv LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS Abr abril AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida AIE Anemia Infecciosa Equina CATT Card Agglutination Test Cols colaboradores CID coagulação intravascular disseminada DEAE dietilaminoetil Dez dezembro EDTA ácido etilenoamino tetracético di-sódico ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay EOS eosinófilos ha hectares Ht hematócrito IDGA Imunodifusão em gel de Agar Kg quilograma Km quilômetros Km2 quilômetros quadrados L3 larva de terceiro estádio LINF linfócitos MAPA Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento MHCT micro-hematócrito mg miligrama(s) mL mililitro (s) xv mm milímetros MON monócitos n números NEUT neutrófilos PBS salina tamponada com fosfato (Phosphate Buffer Saline) PCR Ração em Cadeia da Polimerasae RBC contagem de células vermelhas (red blood cells) RIFI reação de imunofluorescência indireta VAIE Vírus da Anemia Infecciosa Equina VAT tipo antigênico variável VGM volume globular médio WBC contagem de leucócitos (White blood cells) % porcento (s) µL microlitros xvi SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................19 1.1 INFECÇÕES CONCOMITANTES........................................................................19 1.2 A INFECÇÃO POR Trypanosoma evansi..............................................................21 1.2.1 O parasito................................................................................................21 1.2.2 Histórico..................................................................................................23 1.2.3 A tripanossomíase por T. evansi............................................................25 1.2.4 O Diagnóstico..........................................................................................26 1.3 A INFECÇÃO PELO VÍRUS DA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA................27 1.3.1 O vírus da Anemia Infecciosa Equina (VAIE)............................. .......27 1.3.2 Histórico..................................................................................................29 1.3.3 A anemia infecciosa equina....................................................................30 1.3.4 O diagnóstico...........................................................................................31 1.4 A INFECÇÃO POR HELMINTOS........................................................................32 1.4.1 Os helmintos............................................................................................32 1.4.2 A helmintíase por estrongilídeos (estrongilose equina).......................32 1.4.3 Diagnóstico..............................................................................................34 1.5 O PANTANAL ......................................................................................................34 1.6 O CAVALO PANTANEIRO..................................................................................38 2 OBJETIVOS.........................................................................................................................39 2.1 OBJETIVO GERAL...............................................................................................39 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................39 3 METODOLOGIA................................................................................................................40 3.1 ÁREA DE ESTUDO...............................................................................................40 3.2 OS CAVALOS........................................................................................................40 xvii 3.3 COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO..............................................................41 3.4 HEMATOLOGIA..................................................................................................42 3.5 EXAME PARASITOLÓGICO PARA T. evansi...................................................43 3.6 SOROLOGIA........................................................................................................44 3.6.1 Reação de imunofluorescência indireta (RIFI)...................................44 3.6.2 Imunodifusão em gel de ágar (IDGA).................................................45 3.7 ANÁLISES DAS FEZES........................................................................................46 3.8 ANÁLISES ESTATÍSTICAS.................................................................................47 3.8.1 Coleta Janeiro/2007................................................................................47 3.8.2 Coletas de Dezembro/2007 e Abril/2008...............................................48 4 RESULTADOS....................................................................................................................49 4.1 COLETA DE JANEIRO DE 2007..........................................................................49 4.1.1 As infecções.............................................................................................49 4.1.2 Avaliação hematológica dos animais das fazendas FA e PA..............50 4.2 COLETAS DEZEMBRO-2007 E ABRIL-2008.....................................................52 4.2.1 As infecções.............................................................................................52 4.2.2 Avaliação hematológica dos animais da fazenda FA...........................55 4.3 A INFECÇÃO POR HELMINTOS........................................................................58 5 DISCUSSÃO.........................................................................................................................60 6 CONCLUSÕES....................................................................................................................66 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................67 8 APÊNDICES.........................................................................................................................80 9 ANEXO.................................................................................................................................91 Tabela de referência para os valores hematológicos de cavalos da raça Pantaneira. xviii 1 INTRODUÇÃO 1.1 INFECÇÕES CONCOMITANTES O fenômeno parasitismo era classicamente definido como uma condição na qual dois organismos de espécies distintas interagiam sempre com algum custo à saúde da espécie caracterizada como hospedeiro. Atualmente, entende-se o parasitismo como a resultante da interação interespecífica com diferentes graus de dependência metabólica por uma das espécies ou ambas (Lenzi & Vannier-Santos 2005; Araújo e cols. 2003; Rey 2003). Outra assertiva frequente refere que um parasito bem adaptado é aquele que colhe benefícios, completa seu ciclo de vida e não é fatal para seu hospedeiro. O conceito clássico de “parasito harmonioso” deixa, portanto, de ser paradoxal, na medida em que a baixa letalidade pode também ser um mecanismo para a manutenção ou modo de vida de um parasito. Na verdade, a evolução temporal de um sistema parasito-hospedeiro é imprevisível na medida em que é um sistema complexo e multivariável. Um dos fatores determinantes na resultante deste processo é a estratégia de dispersão do parasito na natureza. Atualmente reconhece-se que a virulência de um parasito pode ser e às vezes é, um fator favorável à sua manutenção na natureza (Ferreira 1973; Araújo e cols. 2003). É o caso dos parasitos ecléticos, que, certamente subsistirão mesmo que eliminem uma ou duas espécies de seu amplo espectro de hospedeiros. Ainda, parasitos menos virulentos resultam em um tempo mais longo para ambos, parasito e hospedeiro, se reproduzirem, garantindo assim a perpetuação dessa associação. As relações duradouras podem ser vistas como um sistema contrabalançado entre a persistência do parasito e a sobrevivência do hospedeiro tendo como resultante a evolução para um curso crônico (Pfaff & Candolfi 2003; McKay 2006). Durante todo seu tempo de vida, os seres vivos entram em contato com diferentes parasitos, de modo sequencial ou simultâneo e raramente a interação parasito-hospedeiro envolve somente um e outro. Podem existir situações em que ocorram concomitantemente infecções por diferentes amostras de uma mesma espécie, diferentes espécies de um mesmo gênero, ou ainda, parasitos de grupos taxonômicos distintos (Cox 2001; McKay 2006). Embora pouco considerado, este é um aspecto básico do fenômeno parasitismo uma vez que dependendo da dinâmica da associação, um ou outro parasito pode ser favorecido ou desfavorecido ou ainda, ambos podem não ser afetados nesta relação. Do mesmo modo, os parasitos co-ocorrendo podem causar prejuízo ou benefício ao hospedeiro (Graham 2008). 19 Parasitos têm uma notável competência para suprimir e/ou desviar a resposta imune do hospedeiro, com mecanismos tão diversos quanto os nichos que ocupam (Pfaff & Candolfi 2003). Ainda, as inter-relações são complexas e dependem de variáveis pertencentes ao meio, ao hospedeiro e ao parasito (Ferreira 1973, Araújo e cols. 2003). Assim, podemos observar que em algumas associações ocorre um sinergismo, como o que ocorre com vírus da imunodeficiência felina, que agrava o quadro da sarna causada por Demodex (Chalmers e cols. 1989) ou em caprinos infectados por T. brucei, os quais tornam-se mais susceptíveis ao desenvolvimento do Haemonchus contortus (Chiejina e cols. 2005). Entretanto, algumas relações de co-existência parasitária podem evoluir para um antagonismo, como na infecção por Babesia spp. que é suprimida em camundongos infectados experimentalmente com estágios larvais de Heligmosomoides polygyrus (Mzembe e cols. 1984). Porém, em outras relações podemos ter duas resultantes, é o caso da infecção pelo vírus da imunodeficiência dos felinos (FIV) que pode ou não reativar a infecção por Toxoplama gondii (Witt e cols. 1989; Lin & Bowman 1992). Também, a presença de dois ou mais agentes infecciosos pode originar uma condição patológica a qual pode não ter relação alguma com os patógenos, como é o caso de pacientes com o vírus Epstein Barr, quando expostos ao Plasmodium spp., que podem desenvolver linfoma de Burkitt (De The 1985). A eliminação de dois parasitos de um hospedeiro co-infectado pode também ocorrer, assim, os mecanismos imune-efetores que induzem a eliminação de Babesia microti do sangue de camundongos eliminam também a infecção concomitante por Plasmodium vinckei (Cox 1978). Existe também uma complexa relação entre o estado nutricional do hospedeiro, respostas imunológicas, intensidade da infecção e prevalência de doenças. Má nutrição (proteica/energética) é considerada a causa mais importante de imuno-deficiência secundária e de alta prevalência de infecções e doenças. Por outro lado, as infecções por si mesmas podem induzir a má nutrição através de anorexia, febre ou patologias diversas. Parasitos que causam imunossupressão favorecem a sobrevivência de um segundo organismo infectante em algumas situações, pelo menos temporariamente (Lloyd 1998). A ocorrência de múltiplas espécies de parasitos em um único hospedeiro pode ter importantes consequências para a trajetória coevolucionária de seus participantes (Buck e cols. 1978, Petney & Andrews 1998). Entretanto, as informações de campo disponíveis estão relacionadas principalmente ao estabelecimento de espécies de parasitos após a exposição (Dávila e cols. 2003, Herrera e cols. 2007 e 2008). Assim, a resultante da interação entre a infecção natural promovida por organismos distintos quanto à saúde do hospedeiro, bem como à sobrevivência de um ou outro patógeno constitui, ainda, uma lacuna no conhecimento das coinfecções (Grenfell & Dobson 1995; Cox 2001). 20 1.2 A INFECÇÃO POR Trypanosoma evansi 1.2.1 O parasito Trypanosoma evansi (Trypanosomatidae, Kinetoplastida) é um parasito protozoário hemoflagelado pertencente à seção Salivaria. É uma espécie monomórfica, extracelular, cuja transmissão ocorre mecanicamente de um mamífero para outro através de dípteros hematófagos (moscas das famílias Tabanidae e Stomoxydae), em todas as regiões tropicais e sub-tropicais do planeta. A capacidade de transmissão depende da sobrevivência dos parasitos nas peças bucais do vetor. Assim, quanto menor o intervalo de repasto sanguíneo do vetor entre um animal infectado e outro não-infectado, maior é o sucesso da transmissão (Hoare 1972; Woo 1977). Na América Latina, ainda, morcegos hematófagos (Desmodus rotundus) também podem transmitir T.evansi atuando tanto como vetores quanto como hospedeiros (Hoare 1965 e 1972; Urquhart e cols. 1996). Dezenas de espécies de mamíferos domésticos e silvestres são descritos como hospedeiros para Trypanosoma evansi (Stevens e cols. 1989; Nunes & Oshiro 1990; Franke e cols. 1994; Silva e cols. 1995a; Dávila 2003; Herrera 2005 e 2007) (Figura 1). No ambiente natural, a via oral também é considerada um mecanismo eficiente de infecção (Raina e cols. 1985) e assim, carnívoros podem se infectar através da predação (rede trófica) e da ingestão de carne de animais recentemente mortos com tripanossomíase (Losos 1980; Urquhart e cols. 1996; Herrera e cols. 2004). Embora a capivara seja reportada como o principal reservatório de T. evansi, bovinos e cães - respectivamente pela alta densidade e pelo amplo contato com equinos - devem ser também cuidadosamente considerados como potenciais hospedeiros em áreas enzoóticos (Franke e cols. 1994). T.evansi coloniza o sangue e fluidos tissulares e é vulnerável à resposta imune mediada por anticorpos. Os anticorpos são especialmente direcionados aos antígenos variáveis de superfície (VAT- variable antigen type). A ligação de anticorpos com a superfície dos parasitos facilita o reconhecimento e fagocitose pelos macrófagos. Essa cooperação conhecida como citotoxidade dependente de anticorpo é especialmente realizada em órgãos ricos em células do sistema monocítico fagocitário como baço e fígado. Entretanto, é uma característica dos Tripanosomas salivários a mudança regular e programada da variante glicoproteica expressa em sua superfície de modo que uma fração da sub-população circulante consegue evadir da resposta imune humoral. 21 22 7 6 8 1 5 4 2 3 Figura 1: Exemplos de mamíferos domésticos e silvestres que podem ser hospedeiros para Trypanosoma evansi. Onde: 1- Equus cabalus 2-Oecomys marmorae, 3- Canis familiaris, 4- Bos indicus, 5- Desmodus rotundus , 6- Gracilinanus agilis , 7- Hydrochoerus hydrochaeris, , 8- Nasua nasua. Deste modo, a enorme produção de anticorpos, por vezes, é prejudicial ao hospedeiro por contribuir para uma patologia conhecida como coagulação intravascular disseminada (CID) provocada pela precipitação de imuno-complexos na micro-circulação. Um dos mecanismos envolvidos na patogenia das infecções por tripanosomas do grupo brucei (incluindo T. evansi) é a capacidade de deprimir a resposta imune através da supressão da proliferação de células T auxiliares (CD4+) (Hoare 1972; Kierszenbaum e cols. 1991; Onah & Wakelin 1999). 1.2.2. Histórico Na África, tripanosomas salivários causam sérias doenças, como a “doença do sono em humanos” (T. brucei rhodisiense e T. brucei gambiense) e a nagana, em animais (T. brucei e T. congolenese, os mais importantes). No Brasil, a espécie representante desse grupo é T. evansi que foi a primeira espécie de tripanosoma patogênica descoberta. Na índia ele é o agente causador da doença em equinos conhecida como “surra”. A primeira descrição associando tripanosomas com doença foi feita na Índia por Griffith Evans em 1881, que descreveu tripanosomas (hoje identificados como T. evansi) no sangue de equinos e camelos, embora a doença já fosse observada há muitos séculos. Na época, Evans acreditou que a fonte primária da infecção para os animais fosse as águas poluídas. Mais tarde, Steel (1885) encontrou o mesmo agente no sangue de mulas de Burma . Mas somente em 1888 Balbiani classificou este flagelado como sendo do gênero Trypanosoma (Hoare 1972; Woo 1979). Especula-se que a espécie T. evansi tenha entrado no continente sul Americano juntamente com os colonizadores espanhóis no século XVI. No Brasil, a doença, conhecida como “mal de cadeiras”, foi inicialmente observada na Ilha de Marajó, entre 1827 e 1830, local onde se iniciaram epizootias graves entre os equinos da região (Lacerda 1885). Da Ilha de Marajó a doença se espalhou pela América do Sul, estendendo-se pelo Brasil, Guianas, Bolívia, Venezuela e Colômbia (Hoare 1972). Aqui, além da transmissão mecânica por moscas dos gêneros Tabanus e Stomoxys, o T. evansi se adaptou à transmissão mecânica por morcegos hematófagos (Hoare 1965). Entretanto, o estudo da infecção experimental e natural de T. evansi em mamíferos do Neotrópico, em conjunto com os fenômenos biogeográficos de deriva continental e com o período de surgimento dos tripanosomas salivários, sugerem fortemente que o T. evansi possa ter coevoluído na América do Sul juntamente com sua fauna. 23 De fato, sabe-se que roedores caviomorfos (como a capivara) entraram no continente Americano há 3,5milhões de anos, período em que os tripanosomatídeos já teriam se diversificado nas duas grandes seções (Stercoraria e Salivaria). Ainda, segundo Lenzi & Vannier-Santos (2006), parasitos frequentemente provocam maior letalidade nos hospedeiros recentes ou acidentais do que naqueles com os quais coevoluíram. Assim, o fato de que capivaras apresentam altas parasitemias (sem as ondas de remissão características das infecções por tripanosomas do grupo brucei) com ausência de anemia (uma constante na infecção por T. evansi), em infecções experimentais e naturais, pode sugerir que essa relação hospedeiro-parasito anteceda a colonização espanhola no continente sul-americano (Menezes 2002; Araújo e cols. 2003; Herrera e cols. 2004). Com relação ao Pantanal, há relatos de que surtos de tripanosomíase por T.evansi, regionalmente chamada de “Mal de Cadeiras”, têm ocorrido periodicamente desde o começo do século XIX (Wilcox 1992). “Relatamos que não tínhamos mais cavalos, todos vitimados na região de Miranda por uma epizootia do gênero da paralisia reflexa que a nós , tão cruelmente, viera provar... Faltava-nos o elemento primordial da guerra nestes terrenos, a cavalaria; e não havia quem com isto se não impressionasse.” A Retirada de Laguna (1868) Fonte:TAUNAY, Alfredo D'Escragnolle Taunay, Visconde de. A retirada da Laguna episódio da Guerra do Paraguai. São Paulo: Ediouro. (Prestígio) “A 15 de Novembro de 1894 foi a nossa chegada ao Firme. Trinta e três dias de viagem, incluindo alguns que falhamos, para fazer a travessia dos rios S. Lourenço e Taquari. Foi-nos muito custosa a passagem do rio S. Lourenço, quatro dias de luta fazendo o gado nadar. (...) O Nheco foi nos dar encontro no Corixão, levando cavalos e arreios para tôda a nossa comitiva: não queria que os animais da viagem entrassem em seus campos temendo estivessem afetados da peste de cadeira (20). Então ficou assentado que no dia seguinte, a nossa comitiva seria despachada para trás, como de fato aconteceu.” [Nota de rodapé: (20) Tripanosomose equina] José de Barros, "Lembranças", pág 34 Empresa Gráfica Carioca S.A., São Paulo, 1959 24 Os relatos oficiais sobre a ocorrência da tripanossomíase por T. evansi levam a crer que muitos casos não recebem notificação, e a parasitose deve manter-se em caráter enzoótico em muitas áreas (Oshiro e cols. 1989) afetando tanto animais domésticos como animais silvestres (Nunes e cols. 1993; Franke e cols. 1994; Silva e cols. 1995b). Hoje se estima que 70% dos equinos criados sem um manejo adequado no Pantanal são portadores desse flagelado (Herrera e cols. 2004). 1.2.3 A tripanossomíase por T. evansi A doença causada por T. evansi é comumente denominada “surra”, “derrengadera”, “mal das cadeiras” ou “peste quebra-bunda”, dependendo do local do mundo onde ocorre. O curso da infecção em equinos e cães por vezes é agudo e fatal se não tratado a tempo. Em equinos, a doença conhecida como “mal de cadeiras” costuma ocorrer sob formas de surtos epizoóticos com altas taxas de mortalidade (Silva e cols. 1995b; Conrado e cols. 2005). Anemia é uma característica comum e talvez a mais importante nas infecções por T. evansi (Losos 1980), porém, os mecanismos pelos quais ela se origina são ainda discutidos e controversos (Anosa & Kaneko 1983; Jenkins & Facer 1985; Rue e cols. 2000; Aquino e cols. 2002). Entretanto, a hemólise, como resultado da eritrofagocitose imune mediada, e a depressão da eritropoiese por captura de ferro nos macrófagos podem estar envolvidas (Seed & Hall 1985; Silva e cols. 1995b, Connor & Van Den Bossche 2004). Além da anemia, os cavalos podem apresentar outras sintomatologias inespecíficas como febre, conjuntivite, edema de membros e partes ventrais do corpo, perda de pelos, emagrecimento, inapetência e fraqueza (Levine 1973, Marques 2000, Rodrigues e cols. 2005). Os animais afetados de forma aguda podem morrer dentro de semanas ou poucos meses, mas infecções crônicas podem durar anos (Brun e cols. 1998). No Brasil, os casos mais graves ocorrem em equinos, enquanto casos crônicos são comumente observados em búfalos e bovinos, que podem não apresentar quaisquer sinais clínicos (Dávila 2003, Herrera 2005). Por outro lado, fatores de estresse como má nutrição e helmintoses, podem diminuir a resistência desses animais e exacerbar os sinais clínicos de tripanossomíase (Tuntasuvan & Luckins 1998). Sinais clínicos de distúrbios locomotores também podem ocorrer e caracterizam-se por relutância em se mover, ataxia, fraqueza, paresia e incoordenação dos 25 membros pélvicos e nesse caso, o equino pode assumir posição de cão-sentado (Seiler e cols. 1981; Marques e cols. 2000) (Figura 2). Figura 2: Sinais neurológicos encefálicos em cavalo com tripanossomíase. A ataxia dos membros pode ser observada pelos membros torácicos afastados e pelo cruzamento dos membros pélvicos. FONTE: Rodrigues e cols. 2005. Em geral, no hemograma de equinos infectados com T. evansi observa-se marcada diminuição no hematócrito, na concentração de hemoglobina, e no número de eritrócitos totais. A anemia intensa geralmente é seguida por um pico de parasitemia (Silva e cols. 1995b; Marques e cols. 2000; Conrado e cols. 2005). No entanto, as alterações leucocitárias associadas à tripanossomíase equina não são consistentes. A contagem dos linfócitos pode estar aumentada ou diminuída. A leucopenia observada é, em geral, em decorrência da diminuição no número de neutrófilos. Em geral, não há alterações significativas na contagem de monócitos, eosinófilos e basófilos (Marques e cols. 2000; Silva e cols. 1995b; Monzon e cols. 1991). 1.2.4 O Diagnóstico O diagnóstico parasitológico da tripanosomíase equina é rotineiramente realizado através da visualização do parasito em esfregaços sanguíneos corados pelo Giemsa, exame direto em lâmina/lamínula ou método do microematócrito (MHCT). Porém, nos casos onde a parasitemia é menor do que o limite de detecção dessas técnicas (devido à oscilação resultante da variação antigênica), o diagnóstico fica comprometido (Molyneux 1975; Woo 1977; Masake e cols. 1995). Em situações de suspeita clínica em que os flagelados não são 26 visualizados ao microscópio, a detecção da infecção pode ser realizada através de testes diagnósticos sorológicos, moleculares e/ou através da inoculação de sangue dos animais suspeitos em camundongos (Luckins 1977; Losos 1986; Monzon e cols. 1990). No caso de diagnósticos sorológicos, os métodos mais comumente utilizados são: imunofluorescência indireta, teste de aglutinação direta, teste de aglutinação indireta, ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) para detecção de antígenos circulantes (Ag-ELISA) ou para detecção de anticorpos circulantes (Ab-ELISA), teste da aglutinação em cartão para detecção do parasito (CATT) e teste de tripanólise (revisado por Silva e cols. 2002). Porém, essas técnicas devem ser realizadas com atenção porque a utilização de anticorpos policlonais pode fornecer resultados falsos positivos já que os tripanosomos salivários compartilham antígenos de superfície com outros kinetoplastidos (Uzcanga e cols. 2002). Além disso, embora as técnicas sorológicas detectem um grande número de animais infectados, os resultados positivos não refletem o status parasitológico. Mais recentemente, a reação em cadeia da polimerase (PCR) mostrou-se uma ferramenta bastante sensível e específica, detectando parasitemias tão baixas quanto 1 tripanosoma por mL de sangue (Penchenier e cols. 1996). O aumento da sensibilidade para a detecção do parasito, com grande impacto nos estudos epidemiológicos, é especialmente importante em áreas onde ocorrem infecções crípticas (Dávila e cols. 2003; Herrera e cols. 2005). 1.3 A INFECÇÃO PELO VÍRUS DA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA 1.3.1 O vírus da Anemia Infecciosa Equina (VAIE) O VAIE, é um RNA vírus, membro família Retroviridae, gênero Lentivirus, que afeta todos os membros da família Equidae e causa uma doença infecciosa crônica e recidivante. Está mundialmente distribuído e tem tido um papel especialmente importante em patologia comparada por ser relacionado filogeneticamente, imunologicamente e sorologicamente a outros lentivirus, incluindo o causador da síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS), sendo utilizado inclusive como modelo para o desenvolvimento de vacinas (Issel & Coggins 1979; Cook e cols. 2001; Leroux e cols. 2004; Tagmyer e cols. 2008) (Figura 3). 27 Figura 3: Estrutura esquemática do vírus da Anemia Infecciosa Equina. FONTE: Leroux e cols. 2004. A transmissão pode ser vertical (intra-uterina) ou horizontal, por meio de utensílios contaminados, leite materno, sêmen ou insetos hematófagos. Entretanto, a transmissão do VAIE é, geralmente, relacionada com a transferência mecânica de sangue e seus derivados entre animais infectados e não infectados. Esse processo ocorre naturalmente durante a alimentação interrompida de insetos hematófagos (Tabanus spp, Stomoxys spp), que, no entanto, são ineficientes em transmitir o VAIE de cavalos naturalmente infectados sem histórico de doença aguda e que estejam sem febre (Issel e cols. 1982). Nesse caso, a transmissão vetorial não é importante na geração de epizootias de AIE a menos que as condições sejam ótimas, ou seja: proximidade entre cavalos infectados e não infectados, abundância de vetores mecânicos, e também a rápida passagem do vírus do cavalo recentemente infectado para outros cavalos não infectados. Isso porque o VAIE possui uma estabilidade de menos de 4 horas no aparato bucal do inseto, perdendo assim sua infectividade (Foil & Issel 1991; Barros & Foil 2007). Embora a maioria das espécies de mutucas ocorra durante todo o ano no Pantanal, sua maior abundância na primeira metade da época chuvosa sugere que este período seja o de maior risco de transmissão (Barros & Foil 1999). A principal fonte de transmissão/infecção, no entanto, é atribuída ao homem através da utilização de agulhas e fômites infectados (Shen e cols. 1978; Silva e cols. 2001). Com relativa frequência, animais sadios são expostos a utensílios previamente contaminados, sendo particularmente importante a infecção pela utilização de uma mesma agulha quando da aplicação de medicamentos em vários animais. Vale frisar que, apesar de comum, o uso inadequado de agulhas não é a única forma de expor os cavalos à contaminação. Na verdade, um animal sadio pode se contaminar quando apresenta alguma lesão de continuidade e utilize qualquer utensílio contaminado (previamente em contato com o sangue de um animal infectado, como agulhas, esporas, freios,mantas/bacheiros). 28 A replicação do VAIE ocorre predominantemente em macrófagos durante os episódios febris, no baço, fígado, linfonodos, pulmões e rins (Sellon e cols. 1994) e o vírus persiste em animais infectados por toda vida, podendo ser seguramente diagnosticado por testes sorológicos que detectam anticorpos para a principal proteína estrutural do vírus (Cheevers & McGuire 1985). 1.3.2 Histórico A anemia infecciosa equina (AIE), também conhecida como “febre do pântano”, é uma doença cosmopolita que foi inicialmente descrita como entidade clínica na França, por Ligné (1843) e foi associada com um “agente filtrável” em 1904. Isso fez da AIE a primeira doença animal associada à etiologia viral. Mas, somente em 1976, com o desenvolvimento de sistemas in vitro e a produção de partículas virais, foi mostrado ser transmitida por um membro da família Retroviridae (McGuire e cols. 1990, Leroux e cols. 2004). No Brasil, a AIE foi diagnosticada pela primeira vez em 1968, nos estados do Rio Grande do Sul e Rio de Janeiro (Guerreiro e cols. 1968). A doença entrou na região do Pantanal Mato-grossense em meados dos anos 70 por introdução de cavalos descartados dos grandes centros, em programas iniciais de controle da AIE (César 1982). Nessa ocasião o VAIE causou grande mortalidade entre os equinos e rapidamente se disseminou pela região, principalmente devido ao desconhecimento de que a transferência do vírus poderia ocorrer através da reutilização de agulhas hipodérmicas. Atualmente aproximadamente 50% dos equídeos no Pantanal são portadores do vírus, sendo que 90% desses em fase ativa de trabalho. (Silva e cols. 2001; Abreu e cols. 2004). Hoje, o perfil epidemiológico da AIE no Brasil se apresenta sob dois padrões: a que ocorre no âmbito das entidades hípicas, facilmente controlável pela realização de exames e consequente eutanásia dos animais positivos, e a que ocorre no campo, que em virtude de características ambientais, sócio-econômicas e políticas é extremamente difícil de ser controlada. Ainda, de acordo com a Secretaria de Defesa Agropecuária do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), os animais negativos em um primeiro exame devem ser retestados com um intervalo de 30 dias. No entanto, isso é extremamente difícil de ser atendido em regiões como o Pantanal (devido à forma de manejo, dificuldade de armazenamento, transporte do material biológico e distância dos laboratórios credenciados). 29 1.3.3 A Anemia Infecciosa Equina A AIE é uma doença crônica, caracterizada por episódios recorrentes de febre, anemia, hemorragias, trombocitopenia, leucopenia, edema ventral, mioglobinúria, caquexia. Além disso, ocorre supressão transitória da resposta imunológica que não resulta em infecções oportunistas ou outras. A replicação periódica do vírus em macrófagos leva a uma doença aguda imunologicamente mediada caracterizada primariamente por severa anemia (McGuire e cols. 1990). A anemia é resultado tanto da diminuição do tempo de vida da hemácia (devido à hemólise e eritrofagocitose por macrófagos ativados), quanto da depressão da resposta da medula óssea (eritropoiese). Além disso, a diminuição do fluxo de ferro dos macrófagos para o plasma também responde pela patogenia da anemia na AIE (Cheevers & McGuire 1985; McGuire e cols. 1990). Os sinais clínicos aparecem dentro de 5 a 30 dias após a infecção, entretanto, a maioria dos cavalos infectados parece não demonstrar nenhuma sintomatologia clínica (Mcllwraith & Kitchen 1978; McClure e cols. 1982; Issel & Foil 1984; Newman e cols. 1991; Crawford e cols. 1996). O curso clínico depende da quantidade do inóculo e virulência da cepa viral, além da suscetibilidade do cavalo. Se a doença aguda não for fatal, o animal se torna portador inaparente por toda a vida, porém, tanto a frequência quanto a severidade dos episódios clínicos de AIE diminuem na maioria dos cavalos, levando a um estado de portador inaparente. Não há tratamento ou vacinas disponíveis para o VAIE. A infecção pelo VAIE é a única, do grupo dos lentivírus, em que muitos animais evoluem de um estado crônico, caracterizado por picos de viremia e febre, como resultado da variação antigênica do vírus, para um estado assintomático da infecção (Montelaro e cols. 1984; McGuire e cols. 2004). No entanto, a doença clínica também pode ser desencadeada por estresse ambiental ou induzido com corticoesteroides até mesmo depois de anos de quiescência (Cheevers & McGuire 1985). Além de infectar e destruir macrófagos, o VAIE induz, como também descrito nas infecções por HIV-1 em humanos, o surgimento de linfócitos T citotóxicos (CD8+CTL), que estão relacionadas ao controle inicial da viremia. Subsequente, os animais desenvolvem abundantes CD4+ e CD8+CTL de memória (CTLm), desenvolvendo assim uma resposta imune efetiva duradoura, capaz de manter a replicação viral abaixo do limiar para a indução da doença (Koup e cols. 1994, McGuire e cols. 1997, Zhang e cols, 1999, Hammond e cols. 2000). Na infecção pelo VAIE, bem como de outros lentivirus, os linfócitos B de memória não são afetados, desta forma o mecanismo de defesa contra agentes extracelulares pode não 30 ser fortemente prejudicado (Machado e cols 2004). O fim da forma clínica deve-se provavelmente, à habilidade dos animais infectados eventualmente atingirem um limiar de eficiência da resposta imune contra o epitopos antigênicos comuns às amostras/linhagens do VAIE (Cheevers & McGuire 1985). 1.3.4 O diagnóstico O teste preconizado pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) para o diagnóstico da AIE é o imunodifusão em gel de ágar (IDGA), de fácil execução, relativamente sensível e específico (Almeida e cols. 2006). Essa prova qualitativa, reconhecida mundialmente como o método de diagnóstico mais importante para AIE, detecta anticorpos contra a principal proteína do core viral, p26, entre 14 e 45 dias após a infecção (Coggins e cols. 1972). O ELISA competitivo (cELISA) tem sido utilizado nos Estados Unidos desde a década de 80 (Matsushita e cols. 1989), e tem a vantagem de ser menos subjetivo e mais rápido do que o IDGA (enquanto o resultado do IDGA ocorre em 48hs, o do cELISA é feito em 2hs). Já o Immunoblot tem sido utilizado somente como ferramenta de pesquisa (Issel & Cook 1993). De acordo com o MAPA, os animais soropositivos ao teste de IDGA devem ser sacrificados, uma vez que atuam como fonte de infecção e não há tratamento (Figura 4). Como no Pantanal Brasileiro a doença é extremamente difícil de ser controlada e os cavalos são fundamentais nas atividades relacionadas à pecuária e ao transporte, foi definida uma política diferenciada baseada na segregação de animais soropositivos e restrição do trânsito destes a locais próximos aos animais negativos (Silva e cols. 2001). Figura 4: Teste de IDGA. As linhas de precipitação indicam reações positivas relativas ao soro controle. Foto: Rodrigo Méxas. 31 1.4 A INFECÇÃO POR HELMINTOS 1.4.1 Os helmintos Helmintos gastrointestinais são universalmente conhecidos como os principais parasitos de equideos (Hodgkinson 2006). Os cavalos podem abrigar uma enorme quantidade de helmintos, tanto em números de indivíduos quanto de espécies, algumas vezes em torno de 100.000 vermes em um único animal (Linchtefels e cols. 2002; Pereira & Vianna 2006). A forma como os equídeos são criados em algumas localidades (soltos no pasto) favorece a grande incidência de infecções parasitárias, já nas primeiras semanas de vida (Molento 2005; Nielsen e cols. 2008). A fauna parasitária associada aos equinos é vasta e compreende vários gêneros e espécies, entre eles: Cyathostomum spp, Triodontophorus spp, Cylicostephanus spp (os pequenos estrôngilos ou cyathostomineos), Strongylus vulgaris, S. equinus, S. edentatus (grandes estrôngilos) e ainda, Parascaris equorum, Oxyuris equi, Strongyloides westeri, Trichostrongylus axei, Gasterophilus spp., Habronema spp., Dictyocaulus arnfield e Anoplocephala spp. Os estrongilídeos, membros da superfamília Strongyloidea, família Strongylidae, são os helmintos de maior importância sanitária em cavalos. Historicamente a classificação dos estrôngilos de cavalos, em pequenos e grandes, é baseada nas características morfológicas dos vermes adultos (Lichtenfels e cols. 2002). Possuem distribuição cosmopolita, embora algumas espécies de pequenos estrongilídeos sejam encontradas somente em algumas localidades (Marquardt e cols. 2000). No Brasil, os primeiros registros da ocorrência e identificação de vermes em equinos foram conduzidos por Travassos (1917, 1919), Chaves (1930) e Vaz (1930, 1931, 1934). Contudo, essas investigações somente identificaram as espécies de helmintos encontradas sem, no entanto, levar em consideração o aspecto quantitativo e a origem dos animais (Pereira & Vianna 2006). 1.4.2 A helmintíase por estrongilídeos (estrongilose equina) A prevalência de infecção com uma ou mais espécies desses helmintos pode chegar a 100% em potros e a patogenia está diretamente relacionada à intensidade da infecção. Os helmintos podem causar desde um pequeno desconforto abdominal até episódios fulminantes 32 de cólicas e morte (Molento 2005). A sintomatologia inclui emagrecimento, pelo opaco, anemia, diarreia, desconforto abdominal. As espécies de estrôngilos têm diferentes ciclos de vida nos quais os adultos habitam o lúmen do ceco e cólon dos hospedeiros e os ovos são liberados nas fezes. Existem diferenças sazonais nas contagens de ovos nas fezes dos hospedeiros, sendo maiores durante o verão (Marquardt e cols. 2000, Nielsen e cols. 2007). A infecção do cavalo ocorre pela ingestão da larva de terceiro estádio (L3) juntamente com a pastagem (Figura 5). 1 2 3 4 5 Figura 5: Estágios de vida livre dos estrôngilos de equinos, onde: 1-ovo não embrionado, 2-ovo embrionado, 3-larva de 1º estádio (L1), 4-larva de 2º estádio (L2), 5-larva de 3º estádio (L3- forma infectante). FONTE: Nielsen e cols. 2007 Geralmente os estágios larvares são mais patogênicos do que os vermes adultos; encontram-se nos tecidos do intestino e, no caso de grandes estrongilídeos, também podem estar na artéria mesentérica, fígado e pâncreas, dependendo da espécie (Hodgkinson 2006). Os sintomas vão estar relacionados com os sítios por onde as larvas migram. As larvas de S. vulgaris, por exemplo, migram para a artéria mesentérica cranial onde causam arterite 33 associada a tromboembolismo e infarto intestinal (Duncan 1973). Vários tipos de cólicas em equinos são atribuídos à presença de um grande número de larvas de ciatostomíneos na mucosa intestinal, associada com perda de peso, diarreia, edema subcutâneo, pirexia e, consequentemente, menor tolerância ao esforço físico (Love e cols. 1999; Mair e cols. 2000). Infecções por helmintos podem modular as respostas imunes quando co-ocorre com outros patógenos e por isso, possuem fundamental importância em saúde pública (Jackson e cols. 2006). 1.4.3 Diagnóstico Tradicionalmente, o diagnóstico da infecção por estrôngilos é realizado através de métodos parasitológicos clássicos, tais como a detecção e posterior contagem de ovos nas fezes do animal através de técnicas de flutuação, por exemplo, em solução salina saturada de cloreto de sódio (Urquhart e cols. 1996). As espécies são diferenciadas pelas estruturas morfológicas, utilizando anatomia, em adultos recolhidos por ocasião de necropsias ou oriundos de culturas de larvas de 3º estádio, uma vez que os ovos são indistinguíveis por gênero ou espécie. No entanto, recentemente, ferramentas moleculares, como o PCR, têm sido utilizadas para a identificação e caracterização genética das espécies de estrôngilos (Lichtenfels e cols. 2002; Hodgkinson 2006). 1.5 O PANTANAL A região do Pantanal é uma imensa planície sedimentar (140.000 Km2) sazonalmente inundada localizada no centro da América do Sul. Sua fisionomia essencialmente plana é preenchida por vegetação de cerrado entremeada por campos limpos e gramíneas nativas, semelhante às savanas Africanas (Figura 6). O fenômeno ecológico mais importante no Pantanal é o pulso de inundação, uma vez que ora favorece as espécies animais e vegetais relacionadas à fase de seca, ora favorece as espécies relacionadas à fase de cheia. Deste modo, o caráter climático fortemente sazonal do Pantanal afeta o padrão de comportamento e distribuição espacial dos animais. Essa sazonalidade varia no tempo (anos mais cheios e anos mais secos) e no espaço (algumas regiões podem estar inundadas e outras não). No verão, período com maiores precipitações pluviométricas, a planície tem suas gramíneas renovadas e abundantes para os herbívoros. Entretanto, com o passar dos meses, as águas cobrem as pastagens nativas e os animais silvestres e domésticos ficam adensados em locais não 34 inundáveis. No final do período da cheia e início do período da seca ocorre uma diminuição na disponibilidade de alimentos para os animais. Durante o período de seca os animais ficam mais dispersos, as forrageiras nativas tornam-se fibrosas e a água fica extremamente escassa. De acordo com a duração e intensidade do período de cheia e da severidade do período da seca, os mamíferos do Pantanal, de um modo geral, podem ou não atravessar por períodos de estresse alimentar, o que influi diretamente na condição física e imunológica desses animais (Adamoli 1987 e 2000; Crispim e cols. 2006). A principal atividade econômica desenvolvida na região é a exploração extensiva da pecuária de corte, onde os cavalos constituem um elemento de grande importância para o manejo do rebanho. A comercialização envolve o transporte dos animais para mercados (leilões), portos fluviais e estradas de ferro, em lotes de cerca de 900 animais, gastando em torno de onze dias para cobrir 230 km (Cadavid Garcia 1985; Silva e cols. 2001). Nesse contexto, os equídeos são essenciais por constituírem parte fundamental no manejo com o gado, e em muitas situações têm importância vital como única forma de transporte na região (Figura 7). O número de equídeos no Brasil, no Estado do Mato Grosso do Sul e no município de Corumbá estão apresentados na Tabela 1. O município de Corumbá é o maior do Estado do Mato Grosso do Sul, com uma área de 64.961 Km² e 95% de seu território situado no Pantanal. Tabela 1. Efetivo de equídeos no Brasil, no Estado do Mato Grosso do Sul e no município de Corumbá. Brasil Mato Grosso do Sul Corumbá Equinos 5 602 053 357 315 29 802 Asininos 1 163 316 3 926 395 Muares 1 343 279 45 766 4 304 Total 8108648 407007 34501 Fonte : IBGE (2007) 35 Figura 6: O Pantanal 36 Figura 7: Importância dos equinos na criação extensiva de gado no Pantanal. 37 Segundo Cadavid Garcia (1985), as práticas de manejo do rebanho no Pantanal, especialmente manejo sanitário, podem estar aquém daquelas tecnicamente recomendáveis, devido às grandes extensões e condições peculiares da região, ao despreparo da mão-de-obra e a deficiente administração local. As informações sobre doenças infecciosas e parasitárias em equinos na região do Pantanal se restringem à tripanosomíase por Trypanosoma evansi, à Anemia Infecciosa Equina e à pitiose (Silva e cols. 1995a; Abreu 2004; Leal e cols. 2001). 1.6 O CAVALO PANTANEIRO O cavalo Pantaneiro possui porte baixo (média = 137,7 centímetros), é dócil e rústico, com características desenvolvidas ao longo de quatro séculos de seleção natural no Pantanal região de Mato Grosso, Brasil. A origem da raça está ligada à história de ocupação da parte central da América do Sul, quando cavalos foram levados pelos bandeirantes que chegavam para colonizar a região. O cavalo Pantaneiro é, provavelmente, oriundo de cruzamentos de eqüinos de origem lusitana (Céltico, Barba e Andaluz), do Árabe e do Crioulo Argentino, sob pressão da seleção natural. As características do cavalo Pantaneiro diferem dos de outras raças devido à necessidade de adaptar se ao ambiente do Pantanal. Durante a sua evolução, os cavalos Pantaneiros perderam sua beleza e estética e adquiriram características zootécnicas funcionais, inclusive tolerância à imersão em água por períodos prolongados. Historicamente, esta raça é utilizada para o trabalho com os bovinos, porém, atualmente, é também utilizada para esporte devido a notável capacidade física (Santos e cols. 1995). Os equinos destinados ao serviço são frequentemente submetidos ao estresse (ambiental e pelo homem) e a todos os tipos possíveis de veiculação e exposição ao T.evansi e ao VAIE. Santos e cols. (2005) relatam algumas formas de manejo utilizadas em propriedades no Pantanal. Nesses registros podemos observar técnicas rudimentares por ocasião da doma. “Com dois anos, inicia-se o adestramento. Nesta idade, faz-se o primeiro galope e a partir de então os animais são montados todos os dias por cerca de quinze minutos, durante uma semana. Após a montaria, os animais recebem água e são presos numa tora (pau pesado que o animal não consegue arrastar). Após este primeiro contato com os animais, são soltos e novamente trabalhados após um ano, sendo considerados como ”redomão“. Neste período eles andam a toque do lado da cerca. Após seis meses, eles são considerados um ”redomão corrente“ e já iniciam o “trabalho de gado”. Com aproximadamente 4,5 a 5 anos os animais são considerados “mansos de freio”. Descrição do Manejo Geral de Cavalos Pantaneiros na Região do Pantanal Sandra Aparecida Santos --Embrapa Pantanal Dezembro, 2005 38 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Estudar a coinfecção por T. evansi e VAIE em cavalos naturalmente infectados em duas fazendas do Pantanal do Mato Grosso do Sul. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS a) Estimar a incidência/prevalência das infecções e coinfecção; b) Investigar se equinos jovens e adultos, submetidos a diferentes formas de manejo, são igualmente suscetíveis às infecções; c) Avaliar a influencia das infecções e coinfecção por T. evansi e VAIE nos parâmetros hematológicos como forma de avaliar a saúde dos equinos; d) Avaliar se a infecção pelo VAIE pode ser um dos fatores responsáveis pelos surtos periódicos de T. evansi; e) Avaliar se a infecção por helmintos pode interferir na resultante da coinfecção por T. evansi e pelo VAIE. 39 3 METODOLOGIA 3.1 ÁREA DE ESTUDO O estudo foi conduzido na região sudeste do Pantanal (Nhecolândia), em duas propriedades: PA (18º 54’ 43,26’’ S e 56º 31’ 19,18’’ O) e FA (19º 08’ 35,99’’ S e 56º 47’ 45,87’’ O) , distantes 30 km. As fazendas tinham em média 20 mil hectares, e como única atividade econômica a pecuária extensiva. A fisionomia, tipo de solo, regime de chuvas e vegetação eram as mesmas para ambas as propriedades. Na fazenda FA, o rebanho era constituído de cavalos destinados ao trabalho com o gado (mais de 6 anos), éguas destinadas à reprodução e animais de recria (da desmama até 2 anos). Os animais destinados ao serviço eram manejados sob a forma de rodízio, de forma que aqueles que não seriam utilizados eram soltos temporariamente em uma área de aproximadamente mil hectares juntamente com os demais animais. O rebanho da fazenda PA incluía apenas cavalos machos adultos que eram submetidos ao serviço ao longo de todo o ano, mantidos sempre em uma área restrita próxima à sede da fazenda, não havendo sistema de rodízio. 3.2 OS CAVALOS Para a escolha dos animais a serem monitorados, foi realizada uma primeira excursão em janeiro de 2007 objetivando-se conhecer a prevalência das infecções por T. evansi e VAIE em duas propriedades. Foram obtidas amostras de 105 equinos machos, adultos, oriundos das fazendas PA (n=32) e FA (n=73), contando com a permissão dos proprietários. Por questões de logística (dificuldade de acesso e distância do laboratório de campo) excluímos a fazenda PA do monitoramento posterior dos animais. Assim, foram realizadas mais duas coletas apenas na fazenda FA - Dezembro de 2007 (final do período de seca) e Abril de 2008 (pico do período da cheia). Nessas duas coletas, foram amostrados 108 animais, que como descrito acima, eram criados soltos em grandes áreas de aproximadamente mil hectares, sendo aqueles destinados ao serviço da fazenda, submetidos a um rodízio. Mensalmente os cavalos eram reunidos para os cuidados de rotina (como tosa, controle de carrapatos, exame para pitiose, curativo de cortes e escoriações) e trabalho. Nessa ocasião os animais ficavam confinados a um espaço menor (150 ha) por um período de 3 a 7 dias. Esses cavalos monitorados em FA foram divididos em duas categorias em função do tipo de manejo que recebiam: Categoria A – 58 animais que não estavam na rotina de serviço da fazenda por 40 estarem sendo recriados (12 meses a 2 anos) e domados (3 a 5 anos) e Categoria B – 50 animais de serviço (acima de 6 anos). Os animais de serviço (categoria B) eram submetidos a um esforço físico maior em função das longas distâncias que percorriam (muitas vezes em áreas inundadas) e do manejo com os bovinos. Os animais jovens (categoria A) não eram utilizados no serviço da fazenda, não estando, portanto, submetidos a esse tipo de estresse. Já os cavalos da categoria B passam mais tempo próximos uns dos outros e permanecem por longo tempo em lugares restritos e, além disso, compartilham utensílios utilizados no manejo, como freios e selas. 3.3 COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO A identificação dos animais foi feita a partir da numeração a ferro quente, rotineiramente realizada como parte do manejo das fazendas, além da resenha (descrição da pelagem, manchas na face e membros) realizada no momento da coleta (Figura 8). Figura 8: Cavalos da fazenda FA organizados para a realização da coleta de sangue. Pantanal- Mato Grosso do Sul. Janeiro de 2007. Na primeira excursão apenas sangue foi coletado, enquanto que nas duas coletas posteriores, além de sangue também foram coletadas amostras de fezes para a contagem de ovos de helmintos. O sangue foi coletado via punção da veia jugular e acondicionado em duplicata: (i) 5 ml em tubos esterilizados contendo anti-coagulante (ácido etilenoamino tetracético di-sódico EDTA), na proporção de 1mg EDTA/ml de sangue, utilizado para a hematologia e (ii) 5 ml 41 em tubos esterilizados sem anti-coagulante para a obtenção de soro para realização dos testes sorológicos para T. evansi e o VAIE. Os soros foram congelados e mantidos a -4OC até a realização das provas sorológicas. As fezes foram coletadas diretamente da ampola retal, homogeneizadas e fixadas em formol 10% em tubos Falcon de 50 ml até a realização das análises. 3.4 HEMATOLOGIA No laboratório de campo, durante as primeiras 12 horas após a coleta do sangue com EDTA foram quantificados o volume globular (Ht%) pela técnica do micro-hematócrito, o número total de hemácias/µL (RBC) e de glóbulos brancos/µL (WBC), em câmaras de Neubauer. Esfregaços sanguíneos para as contagens diferenciais de leucócitos (%) foram confeccionados e fixados com metanol (Figura 9). 1 3 2 4 Figura 9: Hematologia. 1- tubos contendo sangue com EDTA; 2- leitura do microhematócrito; 3- confecção do esfregaço; 4- câmara de Neubauer. No Laboratório de Biologia de Tripanosomatídeos-IOC/FIOCRUZ, os esfregaços foram corados pela técnica de May-Gruenwald Giemsa. O índice hematimétrico absoluto Volume Corpuscular Médio (VGM) (fl) foi calculado a partir dos resultados obtidos nas contagens globais de hemácias e na quantificação dos volumes globulares (Ferreira Neto e 42 cols. 1981). Os resultados foram comparados com os valores hematológicos de cavalos da raça Pantaneira sadios obtidos por Ribeiro e cols. (2008). Nesse estudo, consideramos os índices de anemia, Ht e RBC, como indicadores de condição; as contagens de monócitos e neutrófilos como indicadores de resposta a infecções; e a contagem de linfócitos como indicadora de resposta imunológica ativa imunológico. 3.5 EXAME PARASITOLÓGICO PARA T. evansi A pesquisa de T. evansi foi realizada segundo a técnica do micro-hematócrito, descrita por Woo (1970). Cada amostra de sangue foi examinada no mesmo dia em que foi coletada. A técnica consiste em centrifugar o sangue em um capilar de micro-hematócrito, e após isso, esse capilar é quebrado na interface entre as hemácias e a camada de leucócitos (papa-leucocitária) e seu conteúdo colocado entre lâmina e lamínula. A pesquisa da presença das formas tripomastigotas é realizada em microscópio óptico (Figura 10). Figura 10: Técnica do micro-hematócrito. As setas indicam formas tripomastigotas. 43 3.6 SOROLOGIA 3.6.1 Reação de imunofluorescência indireta (RIFI) A prevalência da infecção por T. evansi, nos animais estudados foi realizada através da pesquisa de anticorpos da classe IgG a partir da reação de imunofluorescência indireta de acordo seguindo a técnica descrita por Camargo (1964). O antígeno para T. evansi foi obtido através de cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE celulose (Lanhan & Godfrey 1970) a partir de material criopreservado e ampliado em ratos (Figura 11). Aproximadamente 108 parasitos foram inoculados em ratos “Wistar” via intraperitoneal. A parasitemia era monitorada diariamente e quando atingia cerca de 109, era realizada a sangria total. Todos os procedimentos de manipulação dos animais contou com a permissão do Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) do Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, RJ, Brazil (número de registro: P0292-06). O sangue era coletado em tubos contendo salina citratada. Foi adicionado ao volume final de sangue, 10% de PSG pH 8,0 e o material passado em coluna de troca iônica DEAE celulose. Os parasitos foram centrifugados e lavados a 3000 rpm a 4°C, por 20 minutos, em PBS pH 7,2 0,15M, e diluídos em solução de PBS e formol 1%. O antígeno foi então colocado em geladeira para ser utilizado no momento da realização da RIFI. Figura 11: Coluna de troca iônica DEAE-celulose. 44 Os soros controles positivos da reação foram oriundos dos animais positivos ao exame parasitológico do microematócrito e com título de 1/640. Os controles negativos foram obtidos de cavalos criados no Rio de Janeiro (CECAL/FIOCRUZ), área livre para T. evansi. O antígeno era distribuído em lâminas de microscopia próprias para imunofluorescência e, após secagem por 10-12 hs, 10µL dos soros a serem testados eram diluídos em PBS pH 7,2 (1/10; 1/20; 1/40; 1/80; 1/160 e 1/320; 1/640 e 1/1280) e então colocados nas cavidades correspondentes a partir da mais concentrada para a mais diluída. As lâminas eram incubadas em câmara úmida a 37°C por 40 minutos e, a seguir, submetidas a três lavagens com PBS pH 7,2, 30 segundos cada vez. Após secagem, as cavidades das lâminas eram recobertas com 10 µL do conjugado anti IgG (anti-horse) obtido comercialmente (SIGMA®) diluído a 1/120 em solução de PBS, contendo Azul de Evans fornecido no Kit Farmanguinhos para RIFI. As lâminas eram novamente incubadas a 37°C em câmara úmida por 40 minutos e submetidas a três lavagens por 30 segundos em PBS de pH 7,2. Após secagem, as lâminas eram tamponada montadas com lamínula, utilizando-se glicerina do Kit Farmanguinhos. Posteriormente, as lâminas eram observadas em microscópio equipado para fluorescência (Zeiss, modelo ST 44) com luz ultra-violeta. Foram consideradas como positivas as reações que mostraram fluorescência em pelo menos metade do campo observado ao microscópio equipado pra fluorescência. O ponto de corte utilizado foi de 1/40 porque somente foram encontrados animais positivos ao teste do micro-hematócrito a partir desse título. 3.6.2 Imunodifusão em gel de ágar (IDGA) A prevalência da infecção pelo VAIE nos animais estudados foi realizada através da técnica de IDGA segundo Coggins (1972), utilizando kit para diagnóstico comercializado pelo Laboratório Brush (fabricado em agosto/2007, número de partida 005/07) obtido através de colaboração do Laboratório de Viroses Veterinárias da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. A IDGA foi realizada em lâminas de microscopia ótica (25x75 mm), seladas na véspera com uma solução fundida de agarose a 1,2% em tampão borato pH 8,6 e deixadas em temperatura ambiente até o momento da realização do exame. A partir daí, foram seguidas as recomendações do kit : as lâminas foram recobertas com 4,5 ml de uma solução fundida de ágar nobre a 1% em tampão borato pH 8,6. Após o resfriamento e endurecimento do gel foram feitas sete cavidades em roseta com um perfurador apropriado . Na cavidade central da 45 roseta, 25µL do antígeno fornecido no kit foi depositado e 25µL dos soros controles positivos (também fornecidos no kit) bem como os soros dos cavalos a serem testados foram depositados alternadamente nas cavidades periféricas da roseta (Figura 12). As lâminas foram deixadas em câmara úmida por 48 horas, quando foram feitas as leituras. São consideradas positivas as reações que apresentam linha de precipitação visualizada sob uma fonte de luz intensa com foco reduzido, contra um fundo escuro, após 48 horas. 1 6 2 Ag 5 3 4 Figura 12: Lâmina para IDGA mostrando as 7 cavidades no gel de Agar. As cavidades contém: Ag = Antígeno; 1, 3, 5 = soro-controle; 2, 4, 6 = soro testado. Podem ser observadas 1 reação negativa (cavidade 2) e 2 positivas (cavidades 4 e 6). FOTO: Rodrigo Méxas. 3.7 ANÁLISES DAS FEZES As análises das fezes foram realizadas no laboratório de Biologia de Tripanosomatídeos do IOC/FIOCRUZ segundo técnica descrita por Monteiro e cols. (2007) modificada. Os tubos contendo as fezes foram pesados em balança digital e então, o conteúdo foi homogeneizado e filtrado através de gaze dobrada em 3 partes. O filtrado retornou pra o mesmo tubo e foi pesado novamente. O peso de fezes foi obtido pela diferença dos dois pesos. Os filtrados foram, então, centrifugados a 1,250 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi imediatamente desprezado e o sedimentado foi resuspendido com 2,5 mL de água destilada mais 2,5 mL de éter sulfúrico. O conteúdo foi centrifugado a 450 x g por 2 minutos. O sobrenadante foi imediatamente removido e o pellet restante foi resuspendido em formol 46 10% para o volume final de 1 mL. Para a leitura, foram colocados 60µL da solução do concentrado fecal em lâmina de microscopia cobertos com lamínula 24x24 mm. Todos os ovos de helmintos encontrados ao microscópio óptico foram contados e identificados seguindo Sloss e cols. 1999. Foram realizadas três leituras para cada amostra. A contagem final em ovos por grama para cada amostra foi calculada, segundo a fórmula: OPG= (100 x CO) / (6 x PF), onde: -OPG= ovos por grama de fezes -CO= contagem de ovos (média das 3 leituras em 60µL) -PF= peso de fezes 3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA Para as análises estatísticas foram utilizados os dados brutos, com exceção da variável hematócrito na qual trabalhamos com arcoseno. Os testes utilizados foram não paramétricos, já que através do teste D’Agostino-Pearson, a maioria das variáveis não apresentou distribuição normal. Para avaliar a influência das infecções por T. evansi e pelo vírus da AIE, os animais foram agrupados conforme a presença das infecções, onde: -NN animais negativos para ambas as infecções -PN animais positivos somente para o T. evansi -NP animais positivos somente para o VAIE -PP animais co-infectados com T. evansi e VAIE 3.8.1 Coleta Janeiro/2007 As médias das variáveis entre as localidades foram testadas pelo teste de MannWhitney. Para testar se a infecção por T.evansi poderia favorecer a ocorrência do VAIE e viceversa foi utilizado o teste do Qui-quadrado. A influência das infecções nos parâmetros hematológicos e no número de OPG foi avaliada pela análise de variância Teste de Kruskal-Wallis, para cada fazenda. 47 3.8.2 Coletas de Dezembro/2007 e Abril/2008 As médias dos parâmetros hematológicos e OPG, de todos os animais entre as categorias de manejo foram testadas pelo teste de Mann-Whitney, em cada coleta. Isso foi feito com o intuito de verificarmos se as alterações hematológicas poderiam estar relacionadas à idade/ manejo dos animais, independentemente das infecções. O teste de Wilcoxon foi utilizado para verificar se as variáveis diferiam temporal e/ou sazonalmente. Esse teste também foi utilizado para verificar a influência das categorias entre as estações. Para testar se a infecção por T.evansi poderia favorecer a ocorrência do VAIE e viceversa foi utilizado o teste do Qui-quadrado. O coeficiente Phi foi utilizado para testar se existe correlação entre a categoria do animal com cada uma das infecções. Para verificar se houve diferença significativa na prevalência de infecção por Trypanosoma evansi entre as coletas foi utilizado o Teste Kappa. A influência das infecções nas variáveis estudadas foi testada por análise de variância através do Teste de Kruskal-Wallis para a população como um todo e para cada categoria. Todas as análises foram realizadas com o Programa Bioestat 5,0. 48 4 RESULTADOS 4.1 COLETA DE JANEIRO DE 2007 4.1.1 As infecções As prevalências das infecções por Trypanosoma evansi e pelo Vírus da Anemia Infecciosa Equina (VAIE) encontradas nas duas fazendas amostradas em Janeiro de 2007 estão apresentadas nas Figuras 13 e 14 e nos apêndices 1 e 2. Considerando os grupos de animais de acordo com a presença ou ausência das infecções por T.evansi e pelo VAIE, foi observado que na fazenda FA o grupo dos animais negativos para ambas as infecções (NN) agregava maior número de animais do que os outros três grupos (37%). Ao contrário, na fazenda PA, o grupo NN era o menor deles (19%). A fazenda PA (56%) ainda apresentou prevalência para o VAIE muito maior do que a fazenda FA (38%). Não foi observada parasitemia patente detectada pelo teste do micro-hematócrito em nenhum dos animais e nem sintomatologia clínica que pudesse sugerir qualquer uma das infecções. As análises mostraram que as infecções por T.evansi e pelo VAIE ocorrem de forma aleatória nas fazendas FA (p=0,2354) e PA (p=0,9644). Figura 13: Percentual de equinos infectados/co-infectados por Trypanosoma evansi e pelo Vírus da Anemia Infecciosa Eqüina (VAIE) da fazenda FA do Pantanal sulmatogrossense em janeiro de 2007. Os valores absolutos estão nos topos das colunas. Equinos da fazenda FA (%) Jan/2007 60 50 40 30 27 T. evansi 18 16 12 20 10 0 Negativo Positivo para o VAIE para o VAIE 49 Negativo Positivo Figura 14: Percentual de equinos infectados/co-infectados por Trypanosoma evansi e pelo Vírus da Anemia Infecciosa Eqüina (VAIE) da fazenda PA do Pantanal sulmatogrossense em janeiro de 2007. Os valores absolutos estão nos topos das colunas. Equinos da fazenda PA (%) Jan/07 60 50 40 30 20 8 9 9 6 T.evansi Negativo Positivo 10 0 Negativo para o VAIE Positivo para o VAIE 4.1.2 Avaliação hematológica dos animais das fazendas FA e PA Todos os parâmetros hematológicos avaliados,foram comparados com os resultados reportados por Ribeiro e cols. (2008) para a raça de cavalos Pantaneiros e podem ser observados na Tabela 2 e Apêndices 3 e 3.1. As análises hematológicas da fazenda FA mostraram que apenas a variável Ht foi significativamente diferente entre os animais agrupados de acordo com a presença ou não das infecções. A média de Ht do grupo dos animais positivos apenas para o T.evansi (PN) foi significativamente menor que nos grupos dos animais negativos para ambas as infecções (NN) (p=0,0169) e positivos somente para o VAIE (NP) (p=0,0416). Os grupos dos animais PN e co-infectados (PP) apresentaram tendência a anemia caracterizada pela média de Ht muito próxima ao mínimo esperado. Quando comparados aos valores para a raça Pantaneira (Ribeiro e cols. 2008), observamos contagens elevadas de linfócitos em todos os grupos. Os animais NN e NP eram os que apresentavam as melhores condições de saúde, uma vez que os demais parâmetros avaliados estavam dentro da normalidade e não foi observada tendência a anemia. 50 Tabela 2 : Médias das variáveis entre os perfis de infecção na fazenda FA do Pantanal sulmatogrossense. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskall-Wallis. FA Ht (%) RBC (x 106/µL) VGM (ft) WBC (x 103/µL) LINF (x 103/µL) NEUT (x 103/µL) EOS (/µL) MON (/µL) NN(n=27) PN(n=18) NP(n=12) PP(n=16) p-valor 34 7.731.851 46,2 12.251 8.230 3.275 435 308 29 6.628.888 47,0 11.861 7.657 3.339 557 296 33 7.004.166 49,4 11.712 7.129 3.713 513 329 30 7.073.750 45,4 13.515 8.321 4.332 550 311 0,0477 0,4270 0,7309 0,2799 0,7389 0,1544 0,4167 0,9677 Já na fazenda PA, diferenças significativas entre os grupos de acordo com a presença das infecções só foram observadas com relação aos neutrófilos. A contagem dessa variável foi significativamente menor nos animais infectados apenas por T.evansi (PN) e ainda estava abaixo dos valores reportados para a raça Pantaneira (Ribeiro e cols. 2008). (Tabela 3 e Apêndice 4). Tabela 3: Médias das variáveis entre os perfis de infecção na fazenda PA do Pantanal sulmatogrossense. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskall-Wallis. PA Ht (%) RBC (x 106/µL) VGM (ft) WBC (x 103/µL) LINF (x 103/µL) NEUT (x 103/µL) EOS (/µL) MON (/µL) NN(n=6) PN(n=9) NP(n=8) PP(n=9) p-valor 31 4.905.000 65,4 10.550 4.363 5.106 610 414 31 5.982.500 53,9 8.344 4.566 2.951 534 294 30 5.803.333 55,2 10.461 5.259 4.208 512 470 30 5.352.222 58,3 11.489 5.609 4.670 570 591 0,9250 0,4087 0,5497 0,1427 0,5271 0,0529 0,9525 0,3755 Ao comparar os parâmetros hematológicos entre as populações dos equinos de cada fazenda amostrada, observamos que as contagens de RBC, WBC e linfócitos foram significativamente menores na fazenda PA, bem como VGM e monócitos maiores (Tabela 4 e Apêndice 5.). Apesar de as médias das variáveis estarem dentro da normalidade para a raça pantaneira, com exceção da média de linfócitos ligeiramente acima do esperado na fazenda FA, os resultados mostram que os animais da fazenda PA, embora aparentemente saudáveis, estavam mais debilitados do que os animais da fazenda FA (Tabela 4 e Apêndice 5). 51 Tabela 4: Variáveis hematológicas comparadas entre as fazendas FA e PA do Pantanal sulmatogrossense. FA(n=73) PA(n=32) p-valor 31 30 0,3563 7.196.027 5.552.812 < 0,0001 46,8 57,6 0,0004 WBC (x 10 /µL) 12.343 10.237 0,0006 LINF (x 103/µL) 7.928 5.016 < 0,0001 3.594 4.192 0,1026 EOS (/µL) 503 552 0,3315 MON (/µL) 309 449 0,0565 Ht (%) 6 RBC (x 10 /µL) VGM (ft) 3 3 NEUT (x 10 /µL) 4.2 COLETAS DEZEMBRO-2007 E ABRIL-2008 4.2.1 As infecções A prevalência das infecções na fazenda FA durante as coletas de Dezembro de 2007 e Abril de 2008 são apresentadas nas Figuras 15 e 16 e nos apêndices 6 e 7, onde observamos que agrupando os animais de acordo com a presença ou ausência das infecções, as maiores prevalências foram de animais infectados apenas com T.evansi (PN) em ambas as coletas, sendo 41% em dez/07 e alcançando a maioria do rebanho (53%) em abr/08. Já as menores, foram de animais infectados apenas pelo VAIE (NP) (14% e 9%). As análises mostraram que, conforme a coleta de jan/07, a infecção por T. evansi e a infecção pelo VAIE são eventos que ocorrem de forma independente na localidade estudada tanto em dez/07 quanto em abr/08 (p=0,8511 e p=0,6323, respectivamente). 52 Figura 15: Prevalência das infecções por Trypanosoma evansi e pelo Vírus da Anemia Infecciosa Equina (VAIE) nos equinos da fazenda FA do Pantanal sulmatogrossense em Dezembro de 2007. Os valores absolutos estão nos topos das colunas. 60 50 Equinos (%) 44 40 30 T. evansi 31 Negativo 20 15 18 Positivo 10 0 Negativo Positivo para o VAIE para o VAIE Figura 16: Prevalência das infecções por Trypanosoma evansi e pelo Vírus da Anemia Infecciosa Equina (VAIE) nos equinos da na fazenda FA do Pantanal sulmatogrossense em Abril de 2008. Os valores absolutos estão nos topos das colunas. 60 57 Eqüinos (%) 50 40 T. evansi 30 20 24 17 10 10 0 Negativo Positivo para o VAIE para o VAIE 53 Negativo Positivo Como pode ser observado na Figura 17 e nos apêndices 8 e 9, ao agrupar os animais por categorias de manejo/idade, vimos que a maior prevalência de T.evansi ocorreu em abril/08 tanto para a categoria A (animais jovens) quanto para a B (animais em serviço). Nossos resultados sugerem que os animais são infectados por T.evansi principalmente quando ainda são jovens, no entanto, a infecção pode ocorrer em qualquer época da vida do animal. Assim, em dez/07 encontramos uma correlação positiva entre a categoria A e a infecção por T.evansi (p=0,0049). Porém, isso não se repetiu em abril /08, provavelmente devido a 19 animais, os quais soroconverteram de uma coleta para outra, o que correspondeu a 17% dos 108 animais sob estudo e a 41,3% dos 46 animais soro-negativos em dezembro (p=0,0031) (Apêndices 8 e 9). Nenhum animal apresentou sintomatologia clínica e apenas um animal, pertencente à categoria A, em dez/07, apresentou parasitemia patente detectada pelo teste do microhematócrito. Figura 17: Prevalência da infecção por Trypanosoma evansi nos equinos da fazenda FA do Pantanal sul-matogrossense em Dezembro de 2007 e Abril de 2008 de acordo com as categorias de idade/manejo. A categoria A engloba animais jovens e a B animais já submetidos ao serviço de rotina da fazenda. Os valores absolutos estão nos topos das colunas. Eqüinos da fazenda FA (%) Trypanosoma evansi 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 47 41 34 21 dez/07 abr/08 categoria A 54 categoria B Com relação ao VAIE, podemos observar a prevalência em cada categoria na Figura 18 e nos apêndices 10 e 11. Os resultados mostraram correlação positiva entre a infecção pelo VAIE e os animais da categoria B, em ambas as coletas. Apenas um animal da categoria A soroconverteu para o vírus de dez/07 para abr/08 e nenhum apresentava sintomatologia clínica no momento da coleta. Figura 18: Prevalência da infecção pelo Vírus da Anemia Infecciosa Equina nos equinos da fazenda FA do Pantanal sul-matogrossense em Dezembro de 2007 e Abril de 2008 de acordo com as categorias de idade/manejo. A categoria A engloba animais jovens e a B animais já submetidos ao serviço de rotina da fazenda. Os valores absolutos estão nos topos das colunas. Eqüinos da fazenfda FA (%) Vírus da AIE 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 24 24 9 10 dez/07 abr/08 Categoria A Categoria B 4.2.2 Avaliação hematológica dos animais da fazenda FA Quando avaliamos a saúde dos animais sem considerarmos as infecções, com o intuito de verificarmos alterações hematológicas relacionadas à idade e ao manejo, observamos diferenças entre as médias das variáveis hematológicas, que se reproduziram em ambas as coletas (Tabela 5 e Apêndice 12). Em dez/07, a média das variáveis Ht, RBC, WBC e linfócitos foram significativamente maiores no grupo dos animais da categoria A, enquanto VGM foi menor (p<0,01). Em abril/08, o resultado praticamente se repetiu, no entanto, a média de monócitos passou a ser significativamente maior nos animais da categoria A (p<0,01). Assim, com exceção da monocitose e da neutrofilia observada nos animais dessa categoria em abr/08, todos os valores estavam dentro do esperado para a raça e idade dos 55 animais (inclusive a média de Ht acima do máximo esperado para a Raça Pantaneira) (Ribeiro e cols. 2008) observada em ambas as coletas (Tabela 5 e Apêndice 12). Tabela 5: Médias das variáveis hematológicas entre as categorias A e B, nas coletas de dez/07 e abr/08. Os valores de p referem-se ao teste de Mann-Whitney. Dezembro/07 Ht (%) RBC (x 106/µL) VGM (ft) WBC (x 103/µL) LINF (x 103/µL) NEUT (x 103/µL) EOS (/µL) MON (/µL) Abril/08 A(n=58) B(n=50) p-valor A(n=58) B(n=50) p-valor 39 8.737.586 45,2 14.366 8.563 4.660 620 524 34 7.188.600 48,8 12.336 6.292 4.968 628 448 <0,0001 <0,0001 0,0027 0,0015 <0.0001 0,5962 0,9044 0,2782 38 8.872.241 44,3 17.984 8.019 7.748 775 1.584 35 7.050.800 51,7 11.848 3.965 6.410 646 788 0,0025 <0,0001 <00001 <0,0001 <0,0001 0,209 0,8198 <0,0001 As médias dos valores hematológicos da população total e das categorias A e B comparadas entre as coletas de dez/07 e abr/08 estão apresentados na tabela 6 e nos apêndices 13, 14 e 15. Observamos que os valores de WBC, neutrófilos, monócitos foram significativamente maiores em abr/08 (p<0,05), tanto para a população como um todo, quanto para a categoria A. As médias de neutrófilos e monócitos dos animais da categoria B também foram maiores em abril (p<0,05). E ainda, as médias de linfócitos da população total e da categoria B foram maiores em dez/07 (p<0,05). Não observamos diferenças significativas nas variáveis hematológicas da série vermelha entre os períodos estudados. Tabela 6: Médias das variáveis hematológicas da população total e das categorias A e B, entre as coletas. Os valores de p referem-se ao teste de Wilcoxon. Dezembro/07 Ht (%) RBC (x 106/µL) VGM (ft) WBC (x 103/µL) LINF (x 103/µL) NEUT (x 103/µL) EOS (/µL) MON (/µL) Abril/08 Total (n=108) A (n=58) B (n=50) Total (n=108) A (n=58) B (n=50) 37 8.020.463 46,8 13.426 7.512 4.802 624 489 39 8.737.586 45,2 14366 8.563 4.660 620 524 34 7.188.600 48,8 12.336 6.292 4.968 628 448 37 8.028.981 47,8 15.143 6.107 7.117 714 1.209 38 8.872.241 44,3 17.984 8.019 7.748 775 1.584 35 7.050.800 51,7 11.848 3.965 6.410 646 788 Os resultados estatisticamente significativos (p<0,05) encontram-se em negrito, pareados para população total, categoria A e categoria B. 56 Quando consideramos a presença ou ausência das infecções por T.evansi e pelo VAIE na saúde da população de animais estudados, as análises dos parâmetros hematológicos de cada coleta podem ser observadas nas Tabelas 7 e 8 e Apêndices 16,16.1, 17, 17.1, 18 e19. Em dez/07, apenas a contagem de RBC diferiu estatisticamente entre os grupos, sendo a média do grupo dos animais positivos apenas para o VAIE (NP) significativamente menor que nos grupos dos animais negativos para ambas as infecções (NN) (p=0,0181) e positivos apenas para T.evansi (PN) (p=0,0021). O grupo dos animais co-infectados (PP) também apresentou a média de RBC menor que o grupo PN (p= 0,0274) (Tabela 7 e apêndices 16 e 16.1). Os resultados hematológicos da população, portanto, parecem refletir aqueles encontrados para os animais da categoria B agrupados de acordo com a presença ou ausência das infecções (Apêndice 19). Os animais dos grupos NN e PN apresentaram médias de Ht e RBC acima do máximo esperado (Ribeiro e cols. 2008) provavelmente por influência dos resultados dos animais da categoria A agrupados pelo perfil de infecção (Apêndice 18). Da mesma forma a contagem de RBC ligeiramente acima do esperado no grupo dos animais co-infectados (PP) e o aumento discreto do número de linfócitos nos grupos dos animais infectados (PN, NP e PP) também são reflexos dos resultados da categoria A (Apêndice 18). Tabela 7: Médias das variáveis hematológicas comparadas entre os animais agrupados de acordo com os perfis de infecção em dezembro/07. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskall-Wallis. Ht (%) RBC (x 106/µL) VGM (ft) WBC (x 103/µL) LINF (x 103/µL) NEUT (x 103/µL) EOS (/µL) MON (/µL) NN(n=31) PN(n=44) NP(n=15) PP(n=18) p-valor 37 8.182.581 46,8 12.452 7.030 4.449 547 426 38 8.440.682 45,5 13.608 7.643 4.873 629 463 35 7.100.000 49,2 13.090 7.648 4.302 638 502 36 7.481.111 48,4 14.942 7.906 5.655 733 648 0,0647 0,0074 0,2395 0,3881 0,8647 0,1570 0,6548 0,3220 Já na coleta de abril/08, observamos que as variáveis Ht, RBC e neutrófilos apresentaram diferenças significativas entre os animais agrupados de acordo com a presença ou não das infecções. A média de Ht do grupo NP foi significativamente menor que nos grupos NN (p=0,0048) e PN (p=0,0291) e sua média de RBC foi menor que no grupo PN (p= 0,0348). A média de Ht do grupo PP também foi menor que do grupo NN (p=0,0115), bem como sua média de RBC foi menor que no grupo PN (p=0,0134) (Tabela 8 e Apêndice 17 e 57 17.1). Na categoria A o grupo NP possuiu a média de Ht mais baixa que dos outros grupos, enquanto na categoria B foi igual aos co-infectados (Apêndices 20 e 21). Os animais NP apresentaram ainda neutrofilia com valores significativamente maiores que dos grupos PN (p=0,0066) e PP (0,0091) (Apêndice 17.1). Assim como em dez/07, os animais dos grupos NN e PN apresentaram médias de Ht e RBC acima do máximo esperado (Ribeiro e cols. 2008), refletindo os resultados dos animais da categoria A (Tabela 8 e Apêndices 17 e 18). Observamos monocitose nos grupos NN, PN e NP e acompanhada de leucocitose em PN e NP (sendo discreta nesse último). O grupo PN ainda apresentou linfocitose. Os animais do grupo PP apresentaram os valores hematológicos normais para a espécie. Tabela 8: Médias das variáveis hematológicas comparadas entre os perfis de infecção em abril/08. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskall-Wallis. Ht (%) RBC (x 106/µL) VGM (ft) WBC (x 103/µL) LINF (x 103/µL) NEUT (x 103/µL) EOS (/µL) MON (/µL) NN(n=17) PN(n=57) NP(n=10) PP(n=24) p-valor 40 8.485.294 48,0 14.982 5.906 7.221 576 1.232 38 9.100.000 42,6 18.930 8.862 7.917 773 1.744 33 7.196.000 46,6 15.830 5.253 8.411 596 1.436 35 7.228.750 51,1 13.217 4.920 6.580 855 847 0,0105 0,0216 0,7127 0,3225 0,3323 0,0368 0,2216 0,4496 4.3 A INFECÇÃO POR HELMINTOS Com relação à investigação da prevalência de helmintos nos equinos, foram encontrados ovos de quatro grupos: estrongilídeos (est), ascarídeos (asc), oxiurídeos (oxy) e cestoides (cest), conforme a Figura 19. 58 Figura 19: Percentual de equinos infectados por estrongilídeos, ascarídeos, oxiurídeos e cestóides na fazenda FA do Pantanal sul-matogrossense em dezembro de 2007 e abril de 2008. 120 Equinos (%) 100 98 86 80 60 dez/07 40 abr/08 15 20 2 3 2 3 0 asc. oxy. cest 0 estr. Famílias de helmintos Diante do fato dos ovos de estrongilídeos serem os mais prevalentes e dos ovos dos demais grupos compreenderem menos de um ovo por grama de fezes, para as análises de OPG, consideramos apenas os ovos de estrongilídeos. Assim, quanto ao número de OPG, observamos um padrão agregado, onde a maioria dos animais apresentou baixo número de OPG, enquanto poucos animais apresentaram número mais elevado (Figura 20). Figura 20: Número de equinos de acordo com o número de ovos por grama de fezes em Dezembro de 2007 e Abril de 2008. 120 nº de equinos 100 100 88 80 60 dez/07 40 abr/08 20 3 8 2 2 51 - 100 > 100 0 ≤ 50 nº de ovos de helmintos 59 5 DISCUSSÃO Em um ambiente natural, a presença de um agente infeccioso em um determinado hospedeiro pode ou não influenciar o surgimento de outro agente não relacionado (Rohani e cols. 2008). Nossos resultados mostraram claramente que nas fazendas e períodos estudados, as infecções por T. evansi e/ou pelo vírus da AIE ocorreram de forma independente, ou seja, a ocorrência de uma não favorece nem prejudica o estabelecimento da outra. Esse resultado corrobora a assertiva de McGuire (1990) de que a imunossupressão provocada pelo VAIE não resulta em suscetibilidade a outras infecções. De fato, a presença de um parasito pode não predispor à ocorrência de outros, como nas infecções por Plasmodium spp. e helmintos no parasitismo concomitante que leva a malária e filariose linfática respectivamente (Tshikuka e cols. 1996, Ravindran e cols. 1998, Chadee e cols. 2003). Quando a coinfecção ocorre por organismos de natureza similar, a presença de um parasito em uma população suscetível pode suprimir o surgimento de outro agente semelhante por ocorrer uma reação cruzada entre os agentes infecciosos. O que é bem menos conhecido são as numerosas interações que organismos distintos podem resultar quando coocorrem em um mesmo hospedeiro (Rohani e cols. 2008). No nosso caso, se procurarmos uma justificativa na imunobiologia das infecções por T. evansi e pelo VAIE, poderemos encontrar subsídios que suportariam a hipótese de que, uma vez os cavalos do Pantanal co-infectados, a presença do VAIE poderia facilitar o desenvolvimento dos flagelados no micro-ambiente do hospedeiro. Tripanosomas salivários desencadeiam uma emaranhada rede de citocinas e moléculas efetoras que estimulam e inibem o próprio crescimento e desenvolvimento em um eficiente mecanismo de auto-regulação (Hammadien e cols. 2000). Esse mecanismo envolve a secreção, por parte dos flagelados, de produtos que atuam em células do sistema imune do hospedeiro, como o fator de estimulação de linfócitos e o fator de ativação de macrófagos. Os linfócitos ativados produzem IFN-γ, que estimula o crescimento dos tripanosomas e a atividade macrofágica. Por sua vez, os macrófagos ativados produzem prostaglandinas (PG) e óxido nítrico (NO), que inibem a atividade linfocitária e consequentemente a produção de IFN-γ (Bakhiet e cols. 1996; Kaye 1999; Hamadien e cols. 2000). Como o VAIE infecta macrófagos, a produção de PG e NO ficaria extremamente comprometida, não havendo assim a inibição da atividade linfocitária, o que poderia levar a um contínuo estímulo para a multiplicação do T.evansi. As diferenças nas prevalências das infecções e coinfecção observadas entre as fazendas, muito provavelmente refletem o manejo a que os cavalos são submetidos. Enquanto na fazenda FA ocorre um rodízio entre os animais que estão em serviço, na fazenda PA os 60 cavalos são utilizados ininterruptamente ao longo do ano. Deste modo, em janeiro de 2007, considerando os quatro grupos em que os animais foram dispostos de acordo com a presença ou ausência das infecções, vimos que na fazenda FA o maior grupo era o de animais negativos para ambas as infecções (NN), enquanto na fazenda PA, esse grupo agregava o menor número de cavalos. As diferenças no trato com os animais e principalmente os cuidados na utilização de fômites são evidenciadas também pelas diferenças de prevalência do VAIE entre as fazendas FA e PA (38% e 56% respectivamente). Os cuidados a que são submetidos os cavalos nas diferentes propriedades constituem um fator que influencia também no estado de saúde. Isso porque vimos que na fazenda FA, mesmo com 57% dos cavalos infectados com T. evansi e com uma indicação de anemia (expressa por uma queda no valor de Ht nesses animais), encontramos um quadro geral de saúde melhor do que na fazenda PA. Curioso notar que na fazenda PA não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros hematológicos entre os animais infectados e não infectados. Esse fato pode ser indicativo de que os animais dessa fazenda estavam muito debilitados, ao ponto de não conseguirmos distinguir o perfil de saúde entre os grupos, mesmo os animais negativos para ambas as infecções (NN). A neutropenia observada no grupo dos animais PN da fazenda PA, pode não estar necessariamente associada à infecção por T.evansi, já que a diminuição no número de neutrófilos pode ter causas variadas como algumas infecções bacterianas e estados debilitantes (Feldman e cols. 2000). Ainda que todos os cavalos coletados estivessem, aparentemente, em bom estado clínico, na fazenda FA a infecção por T. evansi poderia ser a responsável pela tendência à anemia observada nos animais infectados por esse parasito (PN e PP) na coleta de janeiro de 2007. Achados hematológicos de cavalos infectados por T. evansi são amplamente variáveis e dependem do estágio da doença, porém a anemia é o achado mais consistente (Losos 1980, Silva e cols. 1995b, Marques e cols. 2000). Já em relação às coletas de dez/07 e abr/08 da fazenda FA, quando então dividimos os animais em dois grupos de acordo com a idade/manejo, a maior prevalência para T. evansi observada nos animais mais jovens (categoria A) pode estar associada ao caráter enzoótico que esse flagelado apresenta na região. De fato T. evansi infecta uma ampla gama de hospedeiros silvestres e domésticos no Pantanal (Nunes & Oshiro 1990, Silva e cols. 1995a, Herrera e cols. 2007 e 2008), e durante o verão, época em que ocorre a maior abundância de tabanídeos (Barros & Foil 1999; Barros e cols. 2003), os animais ficam restritos em áreas não inundáveis. Assim, as chances dos cavalos jovens serem alvos do repasto sanguíneo de um vetor infectado estão garantidas e quanto menor o tempo entre os repastos sanguíneos, melhor é o sucesso de transmissão do T. evansi (Hoare 1972). Portanto, a distribuição espaçada dos 61 animais em grandes áreas do Pantanal, como ocorre com os animais da categoria A, parece não representar um fator desfavorável à transmissão por este parasito aos cavalos. Podemos também dizer que a infecção ocorre em qualquer época da vida do animal já que observamos a soroconversão de dez/07 para abril/08, para T.evansi, de 17% dos animais, dos quais 68% estavam em serviço (categoria B). Também, a soroconversão vem reforçar que o período da cheia seria a época de maior risco para a infecção por T. evansi nos cavalos, como anteriormente reportado por Silva e cols. 1995a. Os resultados das coletas de dez/07 e abr/08 da fazenda FA, para o VAIE, sugerem que a disposição espacial dos animais jovens (categoria A) não favorece a transmissão vetorial, uma vez que, diferentemente do que foi registrado com o T. evansi, somente cerca de 15% dos animais dessa categoria mostraram-se positivos ao vírus e apenas um animal soroconverteu. Isso se justifica porque o VAIE perde sua infectividade em menos de 4 horas no aparato bucal do inseto (Issel & Foil 1984; Foil & Issel 1991) e, ao contrário da multipicidade de hospedeiros que o T. evansi apresenta na região, o VAIE é restrito somente aos equídeos. A soroprevalência para o VAIE de mais de 70% encontrada nos cavalos em serviço (categoria B), indica que a ação humana constitui um fator de risco à infecção na região estudada. De fato, os tabanídeos são ineficientes em transmitir o vírus de cavalos assintomáticos sem histórico de doença aguda (Issel e cols. 1982), dificultando assim a transmissão vetorial, mesmo nos períodos em que os cavalos estão próximos uns dos outros, como na época da cheia e por ocasião do trabalho com os bovinos. Diante disso, poderíamos atribuir a transmissão do vírus às condições de tratamento empregadas, como o compartilhamento de fômites contaminados (selas, freios, agulhas, esporas e outros). Portanto, no Pantanal sul-matogrossense, embora ocorra uma grande diversidade e abundância de vetores tabanídeos (Barros & Foil 2003), a transmissão do VAIE é amplamente facilitada pela atividade humana, como anteriormente descrito por Silva e cols. (2001) e Santos e cols. (2005). Deste modo, embora T. evansi e VAIE sejam transmitidos naturalmente pelos mesmos vetores dípteros picadores/sugadores, nossos resultados indicam que, na área estudada, a transmissão vetorial é fundamental para a infecção do T. evansi nos equinos, porém não está exercendo um papel importante na transmissão do VAIE. Com relação à saúde dos animais da fazenda FA nos períodos de dez/07 e abr/08, as diferenças significativas encontradas nos parâmetros hematológicos entre as duas categorias de idade/manejo (A e B) são características fisiológicas esperadas. De fato, o hematócrito (Ht), as contagens de hemácias (RBC), de leucócitos (WBC) e de linfócitos são valores 62 influenciados pela idade e condição de manejo. Assim, animais mais jovens, que ainda não estão sob o estresse do trabalho (categoria A), comumente apresentam os indicadores de condição (Ht e RBC) e de resposta imunológica ativa (linfócitos) mais altos do que adultos (categoria B) (Feldman e cols. 2000; Ribeiro e cols. 2008). Um alto número de linfócitos em animais jovens decorre da intensa atividade imunogênica nessa fase, podendo estar relacionado tanto a infecções virais quanto a doenças por protozoários (Feldman e cols. 2000). Do mesmo modo, quando avaliamos todos os animais, independente das categorias A e B), observamos que as médias de Ht e RBC acima do esperado para a raça Pantaneira nos animais dos grupos NN, PN e até PP, a monocitose observada nos grupos NN, PN e NP, bem como a linfocitose e leucocitose no grupo PN, não devem ser interpretadas como sendo indicativa de prejuízo a saúde, e sim como reflexo de características fisiológicas dos animais jovens (categoria A). As infecções pelos helmintos parecem não influenciar a saúde dos animais nem a resultante da coinfecção por T.evansi e o VAIE. De fato, o número de OPG encontrado nos dois períodos estudados estava bem abaixo dos recomendados para tratamento (Marquardt e cols. 2000). Além disso, somente dois cavalos apresentaram mais de 100 OPG de fezes nos dois períodos estudados. Shaw & Dobson (1995) reportaram que o perfil de agregação é quase que universal entre populações de parasitos metazoários. Poulin (2007) vai mais além e se reporta a esse fenômeno como a primeira lei geral da ecologia parasitária: uma população macroparasitária está distribuída de uma forma agregada entre os indivíduos de uma população de hospedeiros. Os indicadores de resposta a infecções (neutrófilos e monócitos) mostraram-se significativamente mais altos no período da cheia e podem estar associados ao estresse a que os animais são submetidos nesse período. Isso porque devido à forma de criação extensiva dos equinos no Pantanal, o estado nutricional dos cavalos fica diretamente sujeito à disponibilidade sazonal das forrageiras nativas de boa qualidade. Assim, ao fim da estação chuvosa (abril) os campos estão inundados e fatores como o adensamento dos animais e a menor disponibilidade de forrageiras nativas (Crispim e cols. 2006) podem contribuir para a diminuição da condição física dos cavalos. Uma vez que a predisposição a infecções e doenças parasitárias é consequência comum em casos de deficiência nutricional (Nelson & Demas 1996; Tompkins & Begon 1999), as contagens elevadas de monócitos e neutrófilos registradas no final do período da cheia muito provavelmente não estariam relacionadas ao T. evansi nem ao VAIE, e sim à maior suscetibilidade dos cavalos a infecções oportunistas, como as infecções bacterianas (Streptococcus equi) ou por vírus (influenza equina, encefalite equina), comuns nesse período em equinos da região (Herrera HM comunicação pessoal). 63 Ainda, podemos supor que a infecção por T.evansi e/ou pelo VAIE não estaria afetando de forma significativa a higidez dos cavalos estudados já que as médias dos valores hematológicos encontravam-se sempre dentro dos intervalos reportados por Ribeiro e cols. (2008) para os cavalos da raça pantaneira. De fato, infecções e doenças parasitárias nem sempre estão associadas, sendo a doença um resultado da associação parasito, hospedeiro e meio ambiente e, ainda, patogenicidade não é caráter obrigatório dos parasitos, que podem se mostrar indiferentes sob esse aspecto (Ferreira 1973; Araújo e cols. 2003; Lenzi & VannierSantos 2005). Embora nossos resultados não forneçam informações claras de que as infecções por T. evansi e pelo VAIE, bem como a coinfecção, possam estar interferindo na saúde dos animais, como dito acima, o VAIE poderia estar contribuindo para o quadro de anemia nos cavalos da região. Isso se deve ao fato de que, nas coletas de dez/07 e abr/08, os animais infectados pelo VAIE (NP e PP) apresentaram menores valores de Ht e RBC. Portanto, uma vez que os cavalos em serviço são os mais infectados pelo VAIE, é necessário um cuidado especial no manejo destinado a esses animais. Ainda, quando olhamos para as médias das variáveis da série vermelha dos quatro grupos de animais, observamos que os animais de serviço, coinfectados (PP), apresentaram o quadro de saúde pior do que aqueles com infecções únicas ou negativos. Portanto, a associação entre T. evansi e o VAIE pode vir a resultar em um agravamento do quadro clínico (sinergismo), como visto na coinfecção por tripanosomatídeos com HIV/AIDS em humanos (Da-Cruz e cols. 1992; Rocha e cols. 1994; Alvar e cols.1997; Pacheco e cols 1998; Sartori 2002). Além disso, os animais apresentaram tendência a anemia, associada à infecção por T.evansi no verão de 2007 e à infecção pelo VAIE no verão de 2008. Essa diferença observada entre os verões sugere que complexas inter-relações ambientais, fisiológicas e parasitárias interferem na saúde dos equinos nessa região. De fato, os tipos de relações ecológicas entre os seres vivos não são estáticas, mas dinâmicas no tempo e no espaço, não devendo, portanto, serem aceitos de forma absoluta e/ou imutável (Lenzi & Vannier-Santos, 2005). Como já mencionado, o regime de inundações e secas na região têm influência direta na disponibilidade das forrageiras nativas, e consequente estado nutricional e imunológico dos equinos. Também o surgimento de amostras mais ou menos virulentas de T.evansi associado com períodos de reagudização do VAIE e a presença de outros agentes infecciosos pode resultar em situações em que, ora o T. evansi , ora o VAIE, possa estar influenciando na saúde dos cavalos. Assim, em áreas endêmicas para tripanosomas salivários, como é o caso do Pantanal sul mato-grossense, onde as infecções se caracterizam por apresentar altas soroprevalências, com baixas parasitemias, durante vários anos, sem causar a doença, 64 podemos observar uma assimetria epidemiológica, isto é, a re-emergência de severos surtos a intervalos irregulares de tempo (Silva e cols. 1995; Dávila e cols. 2003; Herrera e cols. 2004; Osório e cols. 2008). 65 6 CONCLUSÕES As infecções por T. evansi e/ou pelo vírus da AIE ocorreram de forma independente nos eqüinos das fazendas estudadas durante os períodos avaliados; Na região estudada, os equinos são infectados por T. evansi principalmente ainda jovens, devido ao caráter enzoótico do parasito; Na área de estudo, a transmissão vetorial é fundamental para que os eqüinos se infectem por T. evansi, porém não está exercendo um papel importante na transmissão do VAIE; A transmissão pelo VAIE é facilitada pela atividade humana uma vez que o manejo dos animais adultos na fazenda estudada inclui o compartilhamento de fômites entre os cavalos.; No Pantanal sul mato-grossense a infecção por helmintos não foi relevante na saúde dos animais nem na resultante da coinfecção por T.evansi e o VAIE, uma vez que observamos um padrão agregado no que diz respeito ao número de ovos de helmintos liberados pelos cavalos. 66 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Abreu UGP, Silva RAMS, Barros ATM. Avaliação do controle da anemia infecciosa equina em fazendas na Sub-região da Nhecolândia, Pantanal Sul-Mato-grossense. IV Simpósio sobre Recursos Naturais e Sócio-econômicos do Pantanal. Corumbá. Nov. 2004. Adamoli J. Fisiografia do Pantanal. In: Allem, A.C., Valls, J.F.M. (Eds.), Recursos Forrageiros Nativos do Pantanal Matograssense. DDT-EMBRAPA, Brasília, 23–25, 1987. Adamoli J. As terras alagáveis do Chaco e do Pantanal. In: Simpósio sobre recursos naturais e sócio-econômicos do Pantanal, 3, Corumbá: Embrapa Pantanal, 33-34. 2000. Almeida VMA, Gonçalves VSP, Martins MF, Haddad JPA, Dias RA, Leite RC, Reis JKP. Anemia infecciosa equina: prevalência em equídeos de serviço em Minas Gerais. Arq Bras Med Vet Zootec. 2006, 58 (2):141-8. Alvar J, Cañavate C, Gutiérrez-Solar B, Jiménez M, Laguna F, López-Vélez R, Molina R, Moreno J. Leishmania and human immunodeficiency virus coinfection: the first 10 years. Clin Microbiol Rev. 1997, 10 (2):298-319. Anosa VO, Kaneko JJ. Pathogenesis of Trypanosoma brucei infection in deer mice (Peromyscus maniculatus): light and electron microscopic studies on erythrocyte pathologic changes and phagocytosis. Am J Vet Res. 1983, 44(4): 645-651. Aquino LPCT, Machado RZ, Alessi, AC, Santana AE, Castro MB, Marques LC, Malheiros EB. Hematological, biochemical and anatomopathological aspects of the experimental infection with Trypanosoma evansi in dogs. Arq Bras Med Vet Zootec. 2002, 54: 8-18. Araújo A, Jansen AM, Bouchet F, Reinhard K, Ferreira LF. Parasitism, the Diversity of Life, and Paleoparasitology. Men Inst Oswaldo Cruzi. 2003, 98 (suppl.I):5-11. Bakhiet M, Buscher P, Harris RA, Kristensson K, Wigzell H, Olsson T. Different trypanozoan species possess CD8 dependent lymphocyte triggering Immunol Lett. 1996, 50(1-2):71-80. 67 factor-like activity. Barros ATM, Foil LD. The influence of distance on movement of tabanids (Diptera: Tabanidae) between horses. Vet Parasitol. 2007, 144:380-4. Barros T, Foil L. Seasonal occurrence and relative abundance of Tabanidae (Diptera) from the Pantanal region. Mem Entomol Internal. 1999, 14:387-396. Barros ATM, Foil LD, Vazquez SAS. Mutucas (Diptera: Tabanidae) do Pantanal: Abundância Relativa e Sazonalidade naSub-região da Nhecolândia. Corumbá: Embrapa Pantanal, 20p. 2003. Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento, 48. Brun R, Hecker H, Lun Z. Trypansosoma evansi and T. equiperdum: distribution, biology, treatment and phylogenetic relationship (a review). Vet Parasitol. 1998, 79: 95-107. Buck AA, Anderson RI, MacRae AA.Epidemiology of poly-parasitism. IV. Combined effects on the state of health. Tropenmed Parasitol. 1978, 29 (3): 253-68. Cadavid Garcia EA. Comercialização do gado bovino do Pantanal Mato-Grossense; município de Corumbá, MS. Corumbá: EMBRAPA-CPAP. 1985. Circular Técnica 16, 45p. Camargo ME. Improved technique of indirect immunofluorescence for serological diagnosis for toxoplasmosis. Rev Inst Med Trop. 1964, 3: 117–8. César AM. Anemia Infecciosa Equina In: Simpósio Internacional de Anemia Infecciosa Equina. Anais. São Paulo, Instituto biológico de São Paulo, 1982, 13-15. Chadee DD, Rawlins SC, Tiwari TS. Short communication: concomitant malaria and filariasis infections in Georgetown, Guyana. Trop Med Int Health. 2003, 8 (2):140-3. Chalmers S, Schick RO, Jeffers J. Demodicosis in two cats seropositive for Feline Immunodeficiency virus. J Am Vet Med Ass.1989, 194:256-7. Cheevers W, McGuire TC. Equine infectious Anemia Virus: Immunopathogenesis and Persistence. Rev Infect Dis. 1985, 7:83-8. Chiejina SN, Musongong GA, Fakae BB, Behnke JM, Ngongeh LA, Wakelin D. The modulatory influence of Trypanosoma brucei on challenge infection with Haemonchus contortus in Nigerian West African Dwarf goats segregated into weak and strong responders to the nematode. Vet Parasitol. 2005, 128:29–40. 68 Coggins L, Norcross NL, Nusbaum SR. Diagnosis of equine infectious anemia by immunodiffusion test. Am J Vet Res. 1972, 33:11-8. Conrado, AC, Lopes STA, Oliveira LSS, Monteiro SG, Vargas DLB, Bueno A. Infecção natural por Trypanossoma evansi em cavalos na região central do Estado do Rio Grande do Sul. Cienc Rural. 2005, 35: 928-931. Cook SJ, Cook RF, Montelaro RC, Issel CJ. Differencial responses of Equus caballus and Equus asinus to infection with two pathogenic strains of equine infectious anemia virus. Vet Microbiol. 2001, 79: 93-109. Connor RJ, Van Den Boosche P. African animal trypanosomoses. In: Coetzer, Jaw, Tustin, RC (Eds.). Infectious diseases of livestock. 2nd ed. South Africa: Oxford University Press. v. 1. cap. 12, p. 251-296. 2004. Cox FEG. Concomitant infections. In: Rodent Malaria. Ed. Killick-Kendrick, R. & Peters, W. 309-42. London:Academic Press. 1978. Cox FEG. Concomitant infections, parasites and immune responses. Parasitol. 2001,122: S23-S38. Crawford TB, Wardrop KJ, Tornquist SJ, Reilich E, Meyers KM, McGuire TC. A primary production defict in the throbocytopenia of equine infectious anemia. J Virol. 1996, 70 (11):7842-7850. Crispim SMA, Cardoso EL,Santos SA, Soriano BMA, Branco OD. Efeito da Cheia Fluvial na Dinâmica das Pastagens, Pantanal da Nhecolândia, MS. Corumbá, MS Dezembro, 2006. ISSN 1517-1965. Da-Cruz AM, Machado ES, Menezes JA, Rutowitsch MS, Coutinho SG.Cellular and humoral immune responses of a patient with American cutaneous leishmaniasis and AIDS. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1992, 86 (5):511-2. Dávila AM, Herrera HM, Schlebinger T, Souza SS, Traub-Cseko YM. Using PCR for unraveling the cryptic epizootiology of livestock trypanosomosis in the Pantanal, Brazil. Vet Parasitol. 2003, 3;117 (1-2):1-13. 69 De The G. Epstein-Barr virus and Burkitt's lymphoma worldwide; the causal relationship revisited. In: Burkitt's Lymphoma: A Human Cancer Model. Ed. Lenoir, G. M., O'Conor, G. T. & Olweny,C. L. M., pp. 165±176. Lyon: IARC Scientic Publications No. 60. 1985. Duncan JL. The life cycle, pathogenesis and epidemiology of Strongylus vulgaris in the horse. Equine Vet J. 1973, 5: 20-25. Feldman BF, Zinkl JG, Jain NC. Schalm’s Veterinary Hematology. Lippincot, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA. 2000. Ferreira LF. O fenômeno parasitismo. Rev Soc Bras Med Trop.1973, 4:261-277. Ferreira Neto JM, Viana ES, Magalhães LM 1881. Patologia Clínica Veterinária. Belo Horizonte: Rabelo. Foil LD, Issel CJ. Transmission of retrovirusis by arthropods. Ann Rev Entomol. 1991, 36,355-381. Franke CR, Greiner M, Mehlitz D. Investigations on naturally occurring Trypanosoma evansi infections in horses, cattle, dogs and capybaras (Hydrochaeris hydrochaeris) in Pantanal de Pocone (Mato Grosso, Brazil). Acta Tropica. 1994, 58:159-69. Graham AL. Ecological rules governing helminth–microparasite coinfection. PNAS. 2008, 105 (2): 566–570. Guerreiro MG, Bauer AG, Gloss RM, Vidor T, Farias MT, Trein E, Mancuso PC. Simpósio sobre anemia infecciosa equina. Boletim do Instituto de Pesquisa Veterinária "Desidério Finamor", Porto Alegre, n.1/2, p.3-4. 1968. Grenfell BT, Dobson AP. Ecology of Infectious Diseases in Natural Populations. Cambridge: Cambridge University Press.(eds). 1995. Hammond SA, Li F, McKeon BMS, Cook SJ, Issel CJ, Montelaro RC. Immune responses and viral replication in long-term inapparent carrier ponies inoculated with equine infectious anemia virus. J Virol. 2000, 74:5968-5981. Hamadien M, Bakhiet M, Harris RA. Interferon- γ induces secretion of tripanosoma lynphocyte triggering factor via tyrosine protein kinases. Parasitol. 2000, 120:281-287 70 Herrera HM, Dávila AMR, Norek A, Abreu UG, Souza SS, D’andrea PS, Jansen AM.. Enzootiology of Trypanosoma evansi in Pantanal, Brazil. Vet Parasitol. 2004, 125:263–275. Herrera HM, Norek A, Freitas TPT, Rademaker V, Fernandes O, Jansen AM. Domestic and wild mammals infection by Trypanosoma evansi in a pristine area of the Brazilian Pantanal region. Parasitol Res. 2005, 96: 121–126. Herrera HM, Rademaker V, Abreu UG, D'Andrea PS, Jansen AM. Variables that modulate the spatial distribution of Trypanosoma cruzi and Trypanosoma evansi in the Brazilian Pantanal. Acta Trop. 2007, 102 (1):55-62. Herrera HM, Abreu UG, Keuroghlian A, Freitas TP, Jansen AM. The role played by sympatric collared peccary (Tayassu tajacu), white-lipped peccary (Tayassu pecari), and feral pig (Sus scrofa) as maintenance hosts for Trypanosoma evansi and Trypanosoma cruzi in a sylvatic area of Brazil. Parasitol Res. 2008, Aug; 103(3):619-24. Hoare CA. Vampire bats as vectors and hosts of equine and bovine trypanosomes. Acta Trop. 1965, 22: 204-16. Hoare CA. The Trypanosomes of Mammals: A Zoological Monograph. Oxford: Blackwell. 749p. 1972. Hodgkinson JE. Molecular diagnosis and equine parasitology. Vet Parasitol. 2006, 15; 136(2):109-16. IBGE (2007). Economia-Pecuária Municipal-Tabelas. Endereço eletrônico: ftp://ftp.ibge.gov.br/Producao_Pecuaria/Producao_da_Pecuaria_Municipal_%5Banual%5D/2 007/ . Acessado em 3 e fevereiro de 2009. Issel CJ, Adams WV, Meek L, Ochoa R. Transmission of equine infectious anemia virus from horses without clinical signs of disease. J Am Vet Med Assoc. 1982, 180:272-5. Issel CJ, CogginS L. Equine infectious anemia: current knowledge. J Am Vet Med Assoc. 1979, 174:727-33. Issel CJ, Cook RF. A review of techniques for serologic diagnosis of equine infectious anemia. J Vet Diagn Invest. 1993, 5:137-41. 71 Issel CJ, Foil LD. Studies on equine infectious anemia virus transmission by insects. J Am Vet Med Assoc. 1984, 184:293-7. Jackson JA, Turner JD, Kamal M, Wrigth V,Bickle Q, Else KJ, Ramsan M, Bradley. Gastrointestinal nematode infection is associated with variation in innate immune responsiveness. Microbes and Infect. 2006, 8, 487-92. Jenkins GC, Facer CA. Hematology of African Trypanosomiasis. In: Immunology and Pathogenesis of Trypanosomiasis. Boca Raton: CRC Press, p.13-44. 1985. Kaye P. Parasite derivery immunoregulatory molecules. Parasitol Immunol.1999, 21:595-6. Kierszenbaum F, Muthukkumar S, Beltz LA, Szteinn MB. Suprpression by Trypanosoma brucei rhodesiense of the capacities of human T lynphocytes to express interleukin-2 receptors and proliferate after mitogenic stimulation. Infect Immun. 1991, 59:3518-22. Koup RA, Safrit JT, Cao Y, Andrews CA, McLeod G, Borkowsky W, Farthing C, Ho DD. Temporal association of cellular immune responses with the initial control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 syndrome. J Virol. 1994, 68: 4650–5. Lacerda JB. Peste de cadeiras ou epizootia de Marajó. Suas analogias com o beriberi. Rio de Janeiro: Lombaerts. 1885. Lanham SM, Godfrey DG. Isolation of salivarian trypanosomes from man and other mammals using DEAE-cellulose. Exp Parasitol. 1970, 28: 521-34. Leal ABM, Leal AT, Santurio JM, Kommers GD, Catto JB. Pitiose equina no Pantanal brasileiro: aspectos clínicopatológicos de casos típicos e atípicos. Pesq Vet Bras. 2001, 21(4):151-6. Lenzi HL, Vannier-Santos MA. Interface Parasito-hospedeiro: Coabitologia-Uma Visão Diferente do Fenômeno Parasitismo. In: Dinâmica das Doenças Infecciosas e Parasitárias. José Rodrigues Coura, 1ª ed. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan, v. 01, p. 19-44. 2005. Leroux C, Cadoré JL, Montelaro RC. Equine Infectious Anemia Virus (EIAV): what has HIV’s country cousin got to tell us? Vet Res. 2004, 35: 485–512. 72 Levine ND. Protozoan parasites if Domestic Animals and of Man. 2nd ed. Minneapolis: Burgess Publishing Company. 406 p. 1973. Lin DS, Bowman DD. Macrophage functions in cats experimentally infected with feline immunodeficiency virus and Toxoplasma gondii.Vet Immunol Immunopathol. 1992, 33: 6978. Lichtenfels JR, Gibbons LM, Krecek RC 2002. Recommended terminology and advances in the systematics of the Cyathostominea (Nematoda: Strongyloidea) of horses. Vet Parasitol, 22; 107 (4):337-42. Lloyd S. Environmental Influences on Host Immunity. In: Ecology of Infectious Diseases in Natural Populations, Grenfell & Dobson, (eds). 1995. Losos GJ. Diseases caused by T. evansi. A review. Vet Res Commun. 1980, 4 :165-81. Losos GJ. Infectious tropical diseases of domestic animals. Essex, Longman Scientific & Technical, 1986. 938p. Love S, Murphy D, Mellor D. Pathogenicity of cyathostome infection. Vet Parasitol. 1999, 85: 113-21. Luckins AG. Detection of antibodies in trypanosome-infected cattle by means of a microplate enzyme-linked immunoabsorbent assay. Trop Anim Health Prod. 1977, 9 (52): 53-62. Machado PRL, Araújo MIAS, Carvalho L, Carvalho EM. Mecanismos de resposta imune às infecções. An Bras Dermatol. 2004, 79 (6): 647-664. Mair TS, Pearson GR, Multifocal non-strangulating intestinal infarction associated with cyathostomiasis in a pony. Equine Vet. 1995, 27: 154-5. Marquardt WC, Demaru RS Grieve RB. Parasitology and vector biology. 2nd ed.London. Academic Press. 2000. Marques LC, Machado, RZ, Alessi AC. Experimental infection with Trypanosoma evansi in horses: clinical and hematological observations. Rev Bras Parasitol Vet. 2000, 9(1): 11-15. Masake RA, Moloo SK, Nantulya VM, Minja SH, Makau JM, Njuguna JT. Comparative sensitivity of antigen-detection enzyme immunosorbent assay and the microhaematocrit 73 centrifugation technique in the diagnosis of Trypanosoma brucei infections in cattle. Vet Parasitol. 1995, 56:37-46. Matsushita T, Hesterberg L K, Porter JP, Smith BJ, Newman LE. Comparison of diagnostic tests for the detection of equine infectious anemia antibody. J Vet Diagn Invest. 1989, 1:5052. McClure JJ, Lindsay WA, Taylor W, Ochoa R, Issel CJ, Coulter SJ. Ataxia in four horses with equine infectious anemia. J Am Vet Med Assoc. 1982, 180 (3):279-83. McGuire TC, O’Rourke KI, Perryman LE. Immunopathogenesis of Equine Infectious Anemia Lentivirus Disease. Dev Biol Stand. 1990, 72: 31-7. McGuire TC, Zhang W, Hines MT, Henney PJ, Byrne KM. Frequency of memory cytotoxic T lymphocytes to equine infectious anemia virus proteins in blood from carrier horses. Virology. 1997, 238: 85–93. McGuire TC, Fraser DG, Mealey RH. Cytotoxic T lymphocytes in protection against equine infectious anemia virus. Anim Health Res Rev. 2004, 5(2):271-6. McKay D M. The beneficial helminth parasite? Parasitol. 2006, 132: 1–12. Mcllwraith CW, Kitchen DN. Neurologic signs and neuropathology associated with a case of equine infectious anemia. Cornell Vet. 1978, 68 (2):238-49. Menezes VT. Heterogeneidade Biológica e Molecular de Isolados de Trypanosoma evansi (Steel 1885) Balbiani 1888, oriundos do Pantanal Matogrossense. 2002.52 f. Tese (Mestrado). Instituto Oswaldo Cruz. FIOCRUZ. Molento MB. Resistência parasitária em helmintos de equídeos e propostas de manejo. Cienc Rural. 2005, 35 (6): 1469-77. Molyneux DH. Diagnostic methods in animal trypanosomiases. Vet Parasitol. 1975, 1:5-17. Montelaro RC, Parekhn B, Orrego A, Issel CJ. Antigenic Variation during Persistent Infection by Equine Infectious Anemia Virus, a Retrovirus. J Biol Chem. 1984, 259(16):1539-44. Monteiro RV, Dietz JM, Raboy B, Beck B, Vleeschower KD, Baker A, Martins A, Jansen AM. Parasite community interactions: Trypanosoma cruzi and intestinal helminths infecting 74 wild golden lion tamarins Leontopithecus rosalia and golden-headed lion tamarins L. chrysomelas (Callitrichidae, L., 1766). Parasitol Res. 2007, 101(6):1689-99. Monzon CM, Mancebo OA, Roux JP . Comparison between six parasitological methods for diagnosis of Trypanosoma evansi in the subtropical area of Argentina. Vet Parasitol. 1990, 36: 141-6. Monzon CM, Villavicencio VJ, Roux JP, Mancebo, OA. Estúdios hematológicos en cobaios y equinos infectados com el Trypanosoma evansi (Steel, 1885). Vet Argent. 1991, 8: 668-76. Mzembe SA, Lloyd S, Soulsby EJ. Macrophage mediated resistance to Babesia microti in Nematospiroides dubius - infected mice. Z Parasitenkd. 1984, 70 (6):753-61. Nelson RJ, Demas GE. Seasonal changes in immune function. Q Rev Biol. 1996, 71: 551-48. Newman MJ, Issel CJ, Truax RE, Powell MD, Horohov DW, Montelaro RC. Transient suppression of equine immuno responses by equine infectious anemia virus (EIAV). Virology. 1991, 184 (1):55-66. Nielsen MK, Kaplan RM , Thamsborg SM, Monrad J, Olsen SN 2007. Climatic influences on development and survival of free-living stages of equine strongyles: Implications for worm control strategies and managing anthelmintic resistance. Vet J , 174: 23–32. Nielsen MK, Peterson DS, Monrad J, Thamsborg SM, Olsen SN, Kaplan RM . Detection and semi-quantification of Strongylus vulgaris DNA in equine faeces by real-time quantitative PCR. Int J Parasitol. 2008, 38 (3-4): 443-53. Nunes VLB, Oshiro ET. Trypanosoma (Trypanozoon) evansi in the coati from the Pantanal region of Mato Grosso do Sul State, Brazil. Trans Royal Soc Trop Med. 1990, 84: 692. Nunes VLB, Oshiro ET, Dorval MEC, Garcia LAM, Silva AAP, Bogliolo AR. Investigação epidemiológica sobre Trypanosoma (Trypanozoon) evansi no Pantanal Sul-Mato-Grossense. Estudo de reservatórios. Rev Bras Parasitol Vet. 1993, 2: 41-4. Onah DN, Wakelin D. Trypanosome-induced suppression of responses to Trichinella spiralis in vaccinated mice. Int J Parasitol. 1999, 29: 1017–26. 75 Oshiro ET, Rodrigues M, Nunes VLB, Ribeiro OC. Trypanosoma (Trypanozoon) evansi (Steel, 1885) Balbiani, 1888, infecção experimental em equino com amostra isolada de capivara, Hydrochaeris hydrochaeris (Linnaeus, 1766) (Rodentia: HYDROCHAERIDAE). Semina. 1989, 10 (1): 51-55. Osório ALAR, Madruga CR, Desquesnes M, Soares CO, Ribeiro L R R, Costa S CG. Trypanosoma (Duttonella) vivax: its biology, epidemiology, pathogenesis, and introduction in the New World - A Review. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2008, 103(1): 1-13. Pacheco RS, Ferreira MS, Machado MI, Brito CM, Pires MQ, Da-Cruz AM, Coutinho SG. Chagas' disease and HIV co-infection: genotypic characterization of the Trypanosoma cruzi strain. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1998, 93(2): 165-9. Penchenier L, Dumas V, Grebaut P, Reifenberg JM, Cuny G. Improvement of blood and fly gut processing for PCR diagnosis of trypanosomosis. Parasite. 1996, 3(4): 387-9. Pereira JR, Vianna SS. Gastrointestinal parasitic worms in equines in the Paraíba Valley, State of São Paulo, Brazil. Vet Parasitol. 2006, 10; 140(3-4):289-95. Petney TN, Andrews RH. Multiparasite communities in animals and humans: frequency, structure and pathogenic significance. Int J Parasitol. 1998, 28(3):377-93. Pfaff AW, Candolfi E. Immune responses to protozoan parasites and its relevance to dianosis in immunocompromised patients. Europ J Protitol. 2003, 39: 428-34. Poulin R. Are there general laws in parasite ecology?. Parasitol. 2007, 134: 763–76. Raina AK, Kumar R, Rajora VS, Singh RP. Oral transmission of Trypanosoma evansi infection in dogs and mice. Vet Parasitol. 1985, 18 (1): 67-9. Ravindran B, Sahoo PK, Dash AP. Lymphatic filariasis and malaria: concomitant parasitism in Orissa, India. Trans R Soc Trop Med Hyg. 1998, 92(1): 21-3. Rey L. Dicionário de Termos Técnicos de Medicina e Saúde. Rio de Janeiro; Guanabara Koogan. 2003. Ribeiro CR, Fagliari JJ, Galera PD, Oliveira AR. Hematological profile of healthy Pantaneiro horses. Arq Bras Med Vet Zootec. 2008, 60(2): 492-5. 76 Rocha A, de Meneses AC, da Silva AM, Ferreira MS, Nishioka SA, Burgarelli MK, Almeida E, Turcato Júnior G, Metze K, Lopes ER. Pathology of patients with Chagas' disease and acquired immunodeficiency syndrome. Am J Trop Med Hyg. 1994, 50(3): 261-8. Rodrigues A, Fighera RA, Souza TM, Schild AL, Soares MP, Milano J, Barros CSL. Surtos de tripanossomíase Trypanosoma evansi em equinos no Rio Grande do Sul: aspectos epidemiológicos, clínicos, hematológicos e patológicos. Pesq Vet Bras. 2005, 25 (4):239-249. Rohani P, Wearing HJ, Vasco DA, Huang Y. Understanding Host-Multipathogen Systems: Modeling the Interaction between Ecology and Immunology. In: Infectious Disease Ecology: The Effects of Ecosystems on Disease and of Disease on Ecosystems. Richard Ostfeld, Felicia Keesing, Valerie T. Eviner. Princeton University Press. 2008. Rue, ML Silva, RAMS, Carli, G. Leucocyte and reticulocytes counts in acute infection of dogs with Trypanosoma evansi (Steel, 1885) Balbiani, 1888. Rev Lat Am Microbiol. 2000, 42: 163-6. Santos SA, Mazza MCM. Descrição do Manejo Geral de Cavalos Pantaneiros na Região do Pantanal ISSN 1517-1981 Dezembro, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Centro de Pesquisa Agropecuária do Pantanal, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. 2005, Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento 63. Santos AS, Mazza MCM , Sereno JRB, Abreu UGP, SILVA JA. Avaliação e conservação do cavalo Pantaneiro. Corumbá: Embrapa Pantanal, 1995. Circular Técnica, 21. 40 p. Sartori AM, Neto JE, Nunes EV, Braz LM, Caiaffa-Filho HH, Oliveira O C Jr, Neto VA, Shikanai-Yasuda MA. Trypanosoma cruzi parasitemia in chronic Chagas disease: comparison between human immunodeficiency virus (HIV)-positive and HIV-negative patients. J Infect Dis. 2002, 15;186(6):872-5. Seed JR, Hall JE. Pathophisiology of African Trypanosomiasis. Tizard IR (ed) Immunology and pathogenesis of trypanosomiasis, Boca Raton. 1985. Seiler RJ, Omar S, Jackson ARB. Meningoencephalitis in naturally ocurring Trypanosoma evansi infection (Surra) of horses. Vet Pathol. 1981, 18(1): 120-2. 77 Sellon CD, Fuller FJ, Mc Guire TC. The immunopathogenesis of equine infectious anemia virus. Virus Res. 1994, 32: 111-38. Shaw DJ, Dobson AP. Patterns of macroparasite abundance and aggregation in wildlife populations: a quantitative review. Parasitol. 1995, 111 Suppl: S111-27. Shen DT, Gorham JR, Jones RH, Crawford TB. Failure to propagate equine infectious anemia virus in mosquitoes and Culicoides variipennis. Am J Vet Res. 1978, 39:875-6. Silva RAMS, Arosemena NAE, Herrera HM, Sahib CA, Ferreira MSJ. Outbreak of trypanosomosis due to Trypanosoma evansi in horses of Pantanal Matogrossense, Brazil. Vet Parasitol. 1995a, 60:167-171. Silva RAMS, Herrera HM, Domingos LBS, Ximenes FA, Dávila AMR. Pathogenesis of Trypanosoma evansi infection in dogs and horses: hematological and clinical aspects. Cienc Rural. 1995b, 25: 223-38. Silva RAMS, Abreu UGP, Barros ATM. Anemia Infecciosa Equina: Epizootiologia, Prevenção e Controle no Pantanal. Corumbá: Embrapa Pantanal. 2001, Circular Técnica 29, 30p. Silva, RAMS, Seidl A, Ramirez L, Dávila AMR. Trypanosoma evansi e Trypanosoma vivax: biologia, diagnóstico e controle. Corumbá: Embrapa Pantanal, 2002, 141 p. Sloss MW, Zajac AM, Kemp RL. Parasitologia Clínica Veterinária - São Paulo: Editora Manole Ltda. 1999. Stevens JR, Nunes VL, Lanham SM, Oshiro ET. Isoenzyme characterization of Trypanosoma evansi isolated from capybaras and dogs in Brazil. Acta Trop. 1989, 46: 213-22. Tagmyer TL, Craigo JK, Cook SJ, Even DL, Issel CJ, Montelaro RC. Envelope Determinants of Equine Infectious Anemia Virus Vaccine Protection and the Effects of Sequence Variation on Immune Recognition. J Virol. 2008, 82(8): 4052-63. Tompkins DM, Begon. Parasites can regulate wildlife populations. Parasitol Today. 1999, 15: 311-313. 78 Tshikuka JG, Scott ME, Gray-Donald K, Kalumba ON. Multiple infection with Plasmodium and helminths in communities of low and relatively high socio-economic status. Ann Trop Med Parasitol. 1996, 90(3):277-93. Tuntasuvan D, Luckins, AG. Status of Surra in Thailand. J Trop Med Parasitol. 1998, 21 (2):1-8. Urquhart GM, Armour J, Duncan JL, Dunn AM , Jennings FW. Veterinary protozoology. In: Veterinary Parasitology. 2nd ed. Oxford: Blackwell Science, p. 207-255. 1996. Uzcanga G, Mendoza M, Aso PM, Bubis J. Purification of a 64 kDa antigen from Trypanosoma evansi that exhibits cross-reactivity with Trypanosoma vivax. Parasitol. 2002, 124:287-99. Wilcox R 1992. Cattle and environment in the Pantanal of Mato Grosso, Brazil, 1870–1970. Agricult Hist, 66: 232–256. Witt CJ, Moench TR, Gittelsohn AM, Bishop BD, Childs JE. Epidemiologic observations on feline immunodeficiency virus and Toxoplasma gondii coinfection in cats in Baltimore, Md. J Am Vet Med Assoc. 1989, 15; 194(2):229-33. Woo PTK. The haematocrit centrifuge technique for the diagnosis of African trypanosomiasis. Acta Trop. 1970, 27, 384-386. Woo PTK. The African trypanosomiasis. Geneva, Thecnical report for diagnosis of the African trypanosomiasis. Acta Trop. 1977, 27:384-386. Woo PTK. Salivarian Trypanosomes producing disease in livestock outside of sub-gaharan Africa. In: Parasitic Protozoa. KREIER, JP. New York: Academic Press, v.1, p. 270-295. 1979. Zhang W, Auyong DB, Oaks JL, McGuire TC. Natural variation of equine infectious anemia virus Gag protein cytotoxic T lymphocyte epitopes. Virology. 1999, 261: 242–52. 79 8 APÊNDICES Apêndice 1: Prevalência das infecções por T. evansi e pelo VAIE na fazenda FA em janeiro de 2007. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Fazenda FA T.evansi VAIE Positivo Negativo Total Positivo 16(22) 12(16) 28(38) Negativo 18(25) 27(37) 45(62) Total 34(47) 39(53) 73(100) Apêndice 2: Prevalência das infecções por T. evansi e pelo VAIE na fazenda PA em janeiro de 2007. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Fazenda PA T.evansi VAIE Positivo Negativo Total Positivo 9(28) 9(28) 18(56) Negativo 8(25) 6(19) 14(44) 80 17(53) 15(47) 32(100) Apêndice 3 : Médias e desvios-padrão das variáveis entre os perfis de infecção na fazenda FA em janeiro de 2007. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskall-Wallis. FA 81 NN(n=27) PN(n=18) NP(n=12) PP(n=16) p-valor Ht (%) 33,8 (± 5,7) 29,6 (± 3,6) 33,3 (± 4,1) 29,8 (± 5,7) 0,0477 RBC (x 106/µL) 7,73 (± 2,68) 6,62 (± 1,62) 7,00 (± 1,40) 7,07 (± 2,05) 0,4270 VGM (ft) 46,2 (± 10,7) 47,0 (± 12,2) 49,4 (± 11,7) 45,4 (± 15,5 ) 0,7309 WBC (x 103/µL) 12,25 (± 4,03) 11,8(± 2,52) 11,71 (± 1,89) 13,55 (± 3,20) 0,2799 LINF (x 103/µL) 8,23 (± 2,50) 7,65 (± 2,87) 7,12 (± 2,31) 8,32 (± 3,97) 0,7389 NEUT (x 103/µL) 3,27 (± 3,00) 3,33 (± 1,54) 3,71 (± 2,25) 4,33 (± 1,62) 0,1544 EOS (/µL) 435 (± 478) 557 (± 318) 513 (± 420) 550 (± 347) 0,4167 MON (/µL) 308 (± 248) 296 (± 181) 329 (± 346) 311 (± 301) 0,9677 Apêndice 3.1: Teste de Kruskal-Wallis para a variável Ht na fazenda FA em Janeiro/07. Variável Ht NN x x x PN x NP PP x x x x x x 81 x x p valor 0,0169 0,9258 0,094 0,0416 0,5631 0,1421 Apêndice 4 : Médias e desvios -padrão das variáveis entre os perfis de infecção na fazenda PA em janeiro de 2007. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskall-Wallis. PA 82 NN(n=6) PN(n=9) NP(n=8) PP(n=9) p-valor Ht (%) 31,1 (±2,3) 31,3(±3,5) 30,3(±2,0) 29,7(±5,7) 0,9250 RBC (x 106/µL) 4,90(±0,77) 5,98(±1,03) 5,80(±1,68) 5,35(±1,59) 0,4087 VGM (ft) 65,4(±14,6) 53,9(±10,9) 55,2(±12,2) 58,3(±15,4) 0,5497 WBC (x 103/µL) 10,55(±1,65) 8,34(±1,54) 10,46(±3,47) 11,48(±3,02) 0,1427 LINF (x 103/µL) 4,36(±1,31) 4,56(±1,46) 5,25(±1,71) 5,60(±1,73) 0,5271 NEUT (x 103/µL) 5,10(±1,63) 2,95(±0,78) 4,20(±2,01) 4,67(±2,07) 0,0529 EOS (/µL) 610(±341) 534(±381) 512(±221) 570(±381) 0,9525 MON (/µL) 414(±282) 294(±258) 470(±105) 591(±420) 0,3755 82 Apêndice 5: Variáveis hematológicas comparadas entre as fazendas FA e PA. FA(n=73) PA(n=32) p-valor 31,8 (± 5,3) 30,5 (±3,7) 0,3563 RBC (x 10 /µL) 7,19 (± 2,14) 5,55 (±1,37) < 0,0001 VGM (ft) 46,8( ±12,2 ) 57,6 (±13,4) 0,0004 12,34 (±3,23) 10,23 (±2,80) 0,0006 7,92 (±2,92) 5,01 (±1,60) < 0,0001 NEUT (x 10 /µL) 3,59 (±2,31) 4,19 (±1,83) 0,1026 EOS (/µL) 503 (±402) 552 (±321) 0,3315 MON (/µL) 309 (±259) 449 (±358) 0,0565 Ht (%) 6 3 WBC (x 10 /µL) 3 LINF (x 10 /µL) 3 Apêndice 6: Prevalência das infecções por Trypanosoma evansi e pelo vírus da Anemia Infecciosa Equina na fazenda FA em Dezembro de 2007. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Dezembro/07 T.evansi VAIE positivo negativo Total positivo negativo 18(16) 15(14) 44(41) 31(29) 62(57) 46(43) Total 33(30) 75(70) 108(100) Apêndice 7: Prevalência das infecções por Trypanosoma evansi e pelo vírus da Anemia Infecciosa Equina na fazenda FA em Abril de 2008. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Abril/08 T.evansi VAIE positivo negativo Total positivo 24(22) 57(53) 81(75) negativo 10(9) 17(16) 27(25) Total 34(31) 74(69) 108(100) 83 Apêndice 8: Correlação entre as categorias de manejo/idade e a infecção por T. evansi na fazenda FA em Dezembro de 2007. Os valores de p referem-se ao teste de correlação do coeficiente Phi. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Trypanosoma evansi Dezembro/07 Categoria negativo positivo Total p-valor A 17(29) 41(71) 58(100) 0.0049 B 29(58) 21(42) 50(100) Total 46(43) 62(57) 108(100) Apêndice 9: Correlação entre as categorias de manejo/idade e a infecção por T. evansi na fazenda FA em Abril de 2008. Os valores de p referem-se ao teste de correlação do coeficiente Phi. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Trypanosoma evansi Abril/08 Categoria negativo positivo Total p-valor A 11(19) 47(81) 58(100) 0.1812 B 16(32) 34(68) 50(100) Total 27(25) 81(75) 108(100) Apêndice 10: Correlação entre as categorias e a infecção pelo VAIE na fazenda FA em Dezembro de 2007. Os valores de p referem-se ao teste de correlação do coeficiente Phi. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Dezembro/07 Vírus da AIE Categoria negativo positivo Total p-valor A B 49(84) 26(52) 9(16) 24(48) 58(100) 50(100) 0,0006 Total 75 33 108 Apêndice 11: Correlação entre as categorias e a infecção pelo VAIE na fazenda FA em Abril de 2008.Os valores de p referem-se ao teste de correlação do coeficiente Phi. A tabela mostra os números absolutos seguidos dos percentuais entre parênteses. Abril/08 Vírus da AIE Categoria negativo positivo Total p-valor A B 48(83) 26(52) 10(17) 24(48) 58(100) 50(100) 0,0013 Total 74 34 108 84 Apêndice 12: Médias das variáveis hematológicas entre as categorias A e B, nas coletas de Dezembro /07 e Abril/08. Os valores de p referem-se ao teste de Mann-Whitney. Dezembro/07 Abril/08 85 A(n=58) B(n=50) p-valor A(n=58) B(n=50) p-valor Ht (%) 38,8 (± 3,3) 34,4 (± 5,4) <0,0001 38,3 (± 3,7) 35,3 (±6,1) 0,0025 RBC (x 106/µL) 8,73 (± 1,29) 7,18 (± 1,53) <0,0001 8,87(± 1,51) 7,05 (± 1,68) <0,0001 VGM (ft) 45,2 (± 6,2) 48,8 (± 6,1) 0,0027 44,3 (± 7,7) 51,7 (± 10,8) <00001 14,36 (± 1,53) 12,33 (± 2,52) 0,0015 17,98 (± 6,21) 11,84 (± 3,27) <0,0001 8,56 (± 3,52) 6,29 (± 2,55) <0.0001 8,01 (± 3,97) 3,96 (± 1,74) <0,0001 NEUT (x 10 /µL) 4,66 (± 2,25) 4,96 (± 2,38) 0,5962 7,74 (± 4,63) 6,41 (± 1,82) 0,2090 EOS (/µL) 620 (± 432) 628 (± 387) 0,9044 775 (± 686) 646 (± 354) 0,8198 MON (/µL) 524 (± 459) 448 (± 409) 0,2782 1,58 (± 1,22) 788 (± 741) <0,0001 3 WBC (x 10 /µL) 3 LINF (x 10 /µL) 3 85 Apêndice 13: Médias das variáveis hematológicas da população de cavalos da fazenda FA entre as coletas de dez/07 e abr/08. Os valores de p referem-se ao teste de Wilcoxon. Dez/07 (n=108) Abr/08 (n=108) p-valor 36,8 (± 4,9) 36,9 (± 5,2) 0.8389 RBC (x 10 /µL) 8,02 (± 1,60) 8,02 (± 1,83) 0.7968 VGM (ft) 46,8 (± 6,4) 47,8 (± 9,9) 0.9195 WBC (x 10 /µL) 13,4 (± 3,86) 15,14 (± 5,90) 0.0093 LINF (x 103/µL) 7,51 (± 3,30) 6,10 (± 3,71) <0.0001 NEUT (x 103/µL) 4,80 (± 2,30) 7,11 (± 6,63) <0.0001 EOS (/µL) 624 (± 410) 714 (± 556) 0.3002 MON (/µL) 489 (± 436) 1,20 (± 1,13) <0.0001 Ht (%) 6 3 Apêndice 14: Médias das variáveis hematológicas da categoria A da fazenda FA entre as coletas de dez/07 e abr/08. Os valores de p referem-se ao teste de Wilcoxon. Dez/07(n=58) Categoria A Abr/08(n=58) p-valor Ht (%) 38,8 (± 3,3) 38,3 (± 3,7) 0,3736 RBC (x 106/µL) 8,73 (± 1,29) 8,87(± 1,51) 0,6423 VGM (ft) 45,2 (± 6,2) 44,3 (± 7,7) 0,5230 WBC (x 103/µL) 14,36 (± 1,53) 17,98 (± 6,21) <0.0001 LINF (x 103/µL) 8,56 (± 3,52) 8,01 (± 3,97) 0,3609 NEUT (x 10 /µL) 4,66 (± 2,25) 7,74 (± 4,63) <0.0001 EOS (/µL) 620 (± 432) 775 (± 686) 0,2518 MON (/µL) 524 (± 459) 1,58 (± 1,22) <0.0001 3 Apêndice 15: Médias das variáveis hematológicas da categoria B da fazenda FA entre as coletas de dez/07 e abr/08. Os valores de p referem-se ao teste de Wilcoxon. Categoria B Ht (%) 6 RBC (x 10 /µL) VGM (ft) Dez/07(n=50) Abr/08(n=50) p-valor 34,4 (± 5,4) 35,3 (±6,1) 0,4175 7,18 (± 1,53) 7,05 (± 1,68) 0,6834 48,8 (± 6,1) 51,7 (± 10,8) 0,1975 WBC (x 103/µL) 12,33 (± 2,52) 11,84 (± 3,27) 0,3627 LINF (x 103/µL) 6,29 (± 2,55) 3,96 (± 1,74) <0.0001 NEUT (x 103/µL) 4,96 (± 2,38) 6,41 (± 1,82) 0,0012 EOS (/µL) 628 (± 387) 646 (± 354) 0,7832 MON (/µL) 448 (± 409) 788 (± 741) 0,0005 86 Apêndice 16: Médias das variáveis hematológicas comparadas entre os animais da fazenda FA agrupados de acordo com os perfis de infecção em Dezembro/07. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskal-Wallis. 87 NN(n=31) PN(n=44) NP(n=15) PP(n=18) p-valor Ht (%) 37,2(±5,1) 37,8(±4,3) 34,7(±3,7) 35,6(±6,2) 0,0647 RBC (x 106/µL) 8,18(±1,79) 8,44(±1,39) 7,10(±0,91) 7,48(±1,85) 0,0074 VGM (ft) 46,8(±7,1) 45,5(±5,9) 49,2(±5,0) 48,4(±6,9) 0,2395 WBC (x 103/µL) 12,45(±2,72) 13,60(±2,69) 13,09(±3,02) 14,94(±7,10) 0,3881 LINF (x 103/µL) 7,03(±2,67) 7,64(±2,84) 7,64(±3,26) 7,90(±5,11) 0,8647 NEUT (x 103/µL) 4,44(±2,42) 4,87(±2,30) 4,30(±1,88) 5,65(±2,35) 0,1570 EOS (/µL) 547(±338) 629(±424) 638(±488) 733(±425) 0,6548 MON (/µL) 426(±385) 463(±351) 502(±554) 648(±579) 0,3220 Apêndice 16.1: Teste de Kruskal-Wallis para a variável RBC em dezembro/07. Variável RBC NN x x x PN x NP PP x x x x x x 87 x x p valor 0.4481 0.0181 0.1383 0.0021 0.0274 0.3840 Apêndice 17: Médias das variáveis hematológicas comparadas entre os perfis de infecção em abril/08. Os valores de p referem-se ao teste de Kruskall-Wallis. NN(n=17) PN(n=57) NP(n=10) PP(n=24) p-valor 39,6 (±4,4) 37,6(±4,5) 33,3 (±6,2) 35,0(±5,5) 0,0105 RBC (x 10 /µL) 8,48(±1,78) 9,10(±1,82) 7,19(±1,12) 7,22(±1,84) 0,0216 VGM (ft) 48,0(±8,2) 42,6(±8,7) 46,6(±6,9) 51,1(±13,8) 0,7127 14,98(±4,80) 18,93(±6,83) 15,83(±5,16) 13,21(±4,08) 0,3225 LINF (x 10 /µL) 5,90(±3,56) 8,86(±4,30) 5,25(±3,08) 4,92(±1,99) 0,3323 NEUT (x 103/µL) 7,22(±2,32) 7,91(±4,53) 8,41(±1,67) 6,58(±2,52) 0,0368 EOS (/µL) 576(±641) 773(±540) 596(±2,84) 855(±607) 0,2216 MON (/µL) 1,23(±1,35) 1,74(±1,21) 1,43(±1,14) 847(±676) 0,4496 Ht (%) 6 WBC (x 103/µL) 3 Apêndice 17.1: Teste de Kruskal-Wallis para as variáveis Ht, RBC e neutrófilos em abril/08. Variável 88 Ht NN x x x PN x NP x x x x x x RBC x x x x x x x NEUT x x x x x x x x PP x x x x x x x x x x x p valor 0.175 0.0048 0.0115 0.0291 0.0798 0.3922 0.9606 0.0643 0.0523 0.0348 0.0134 0.7456 0.3246 0.0972 0.3115 0.0066 0.8461 0.0091 Apêndice 18: Variáveis hematológicas entre os grupos de perfis de infecção da categoria A em dezembro/07. Dezembro/07 categoria A NN(n=15) PN(n=34) NP(n=2) PP(n=7) p-valor 39,7(±2,5) 38,4(±3,5) 36,6(±3,5) 39,3(±3,4) 0.2528 RBC (x 10 /µL) 9,05(±1,33) 8,69(±1,23) 7,52(±0,56) 8,63(±1,62) 0.4061 VGM (ft) 44,7(±6,5) 44,9(±5,9) 48,5(±1,0) 46,7(±8,6) 0.8289 13,18(±2,52) 13,90(±2,73) 17,07(±4,34) 18,36(±10,51) 0.2616 8,06(±2,31) 8,27(±2,74) 11,11(±1,66) 10,29(±7,53) 0.5006 NEUT (x 10 /µL) 4,09(±1,88) 4,54(±2,18) 4,46(±1,95) 6,47(±2,87) 0.2624 EOS (/µL) 495(±312) 590(±418) 1,42(±830) 803(±415) 0.1001 MON (/µL) 527(±430) 494(±384) 70(±98) 791(±773) 0.1357 Ht (%) 6 3 WBC (x 10 /µL) 3 LINF (x 10 /µL) 3 Apêndice 19: Variáveis hematológicas entre os grupos de perfis de infecção da categoria B em dezembro/07. 89 Dezembro/07 categoria B NN(n=16) PN(n=10) NP(n=13) PP(n=11) p-valor 34,9(±5,9) 35,5(±5,8) 34,4(±3,8) 32,9(±6,4) 0.4272 RBC (x 10 /µL) 7,36(±1,81) 7,58(±1,62) 7,03(±0,95) 6,74(±1,65) 0.4988 VGM (ft) 48,7(±7,3) 47,5(±5,7) 49,3(±5,4) 49,6(±5,8) 0.8728 11,76(±2,80) 12,59(±2,44) 12,47(±2,45) 12,76(±2,43) 0.6438 6,06(±2,69) 5,48(±2,07) 7,11(±3,14) 6,38(±1,96) 0.5355 NEUT (x 10 /µL) 4,77(±2,87) 5,98(±2,44) 4,27(±1,95) 5,13(±1,91) 0.3189 EOS (/µL) 596(±364) 760(±441) 516(±317) 689(±446) 0.5382 MON (/µL) 331(±323) 358(±176) 568(±567) 557(±433) 0.3099 Ht (%) 6 3 WBC (x 10 /µL) 3 LINF (x 10 /µL) 3 Apêndice 20: Variáveis hematológicas entre os grupos de perfis de infecção da categoria A em abril/08. Abril/08 categoria A NN(n=10) PN(n=38) NP(n=1) PP(n=9) p-valor 40,2 (±3,3) 38,1(±3,7) 33(±) 38,1(±3,7) * RBC (x 10 /µL) 9,25(±1,47) 8,96(±1,48) 8,18(±) 8,15(±1,49) * VGM (ft) 44,4(±6,91) 43,5(±7,2) 40,3(±) 48,4(±10,4) * 17,71(±4,39) 18,36(±6,95) 23,9(±) 16,03(±4,45) * 7,55(±3,84) 8,57(±4,32) 11,47(±) 5,94(±1,43) * NEUT (x 10 /µL) 7,72(±2,66) 7,66(±5,43) 7,88(±) 8,07(±3,17) * EOS (/µL) 657(±820) 773(±621) 717(±) 922(±866) * MON (/µL) 1,70(±1,60) 1,61(±1,28) 3,82(±) 1,06(±628) * Ht (%) 6 3 WBC (x 10 /µL) 3 LINF (x 10 /µL) 3 Apêndice 21: Variáveis entre os hematológicas entre os grupos de perfis de infecção da categoria B em abril/08. 90 Abril/08 categoria B NN(n=7) PN(n=19) NP(n=9) PP(n=15) p-valor 38,5(±5,7) 36,7(±5,8) 33,3(±6,5) 33,2(±5,7) 0.1068 RBC (x 10 /µL) 7,39(±1,68) 7,20(±1,89) 7,08(±1,13) 6,67(±1,75) 0.8587 VGM (ft) 53,2(±7,6) 52,6(±8,6) 47,3(±7,0) 52,6(±15,7) 0.5128 11,07(±1,65) 10,92(±2,60) 14,93(±4,58) 11,52(±2,81) 0.0262 3,55(±0,93) 3,56(±1,35) 4,56(±2,30) 4,30(±2,06) 0.5806 NEUT (x 10 /µL) 6,50(±1,66) 5,97(±1,45) 8,47(±1,76) 5,68(±1,54) 0.0031 EOS (/µL) 461(±252) 609(±327) 583(±298) 814(±415) 0.1773 MON (/µL) 561(±326) 750(±827) 1,17(±827) 714(±690) 0.2857 Ht (%) 6 3 WBC (x 10 /µL) 3 LINF (x 10 /µL) 3 9 ANEXO Tabela de referência para valores hematológicos para cavalos da raça Pantaneira (Ribeiro e cols. 2008). 91
