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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC
CURSO DE FISIOTERAPIA
ANDRÉ MILANEZ BAGIO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CICATRICIAL DO GEL EXTRATO
TINTURA DE MIKANIA LAEVIGATA ASSOCIADO OU NÃO
AO ULTRASSOM TERAPÊUTICO
CRICIÚMA, JUNHO DE 2009
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ANDRÉ MILANEZ BAGIO
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL CICATRICIAL DO GEL EXTRATO
TINTURA DE MIKANIA LAEVIGATA ASSOCIADO OU NÃO
AO ULTRASSOM TERAPÊUTICO
Trabalho de Conclusão do Curso, apresentado
para obtenção do grau de Fisioterapeuta no
Curso de Fisioterapia da Universidade do
Extremo Sul Catarinense, UNESC.
Orientador: Prof. M.S.c Tiago Petrucci de
Freitas
Co-orientador: Prof. Dr. Emilio L. Streck
CRICIÚMA, JUNHO DE 2009
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Dedico este trabalho aos meus pais
Cleir e Augustinho, e a minha
namorada Daniela, que estiveram
presentes do início ao fim desta
etapa da minha vida.
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a DEUS por ter me dado saúde para realizar os meus objetivos.
Aos meus pais pela educação que me deram e por me motivarem na minha
escolha.
A minha namorada Daniela pelo companheirismo e incentivo nesses 5 anos de
faculdade.
Agradeço pela ajuda e amizade do meu orientador Prof. Tiago Freitas.
As amizades que fiz dentro da faculdade. Amizades verdadeiras que vão durar para
sempre.
Ao Paulo Silveira pela ajuda em algumas partes do trabalho.
As pessoas dos laboratórios FISIOPAT e LAFIBE que me ajudaram de alguma
forma na pesquisa, especialmente ao Prof. Dr. Emílio Streck que nos cedeu o
espaço e alguns materiais.
E a banca examinadora.
Enfim, a todos que participaram de forma direta ou indiretamente na execução deste
trabalho.
Obrigado.
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RESUMO
A lesão epitelial é caracterizada pela interrupção da continuidade de um tecido do
corpo, causada por qualquer tipo de trauma, seja físico, químico, mecânico ou
desencadeada por uma afecção clínica. O processo de cicatrização ocorre para
restaurar a integridade anatômica e funcional do tecido lesado. Há evidências de
que o reparo tecidual pode ser estimulado por agentes físicos, entre eles o
ultrassom. O presente estudo analisa o processo de evolução cicatricial epitelial com
o uso do ultra-som terapêutico associado ao gel extrato tintura de Mikania laevigata.
Tendo, também, como objetivos específicos caracterizar a evolução da cicatriz
epitelial por medida de ferida, medidas de (TBARS), grupos carbonil e grupos
sulfidrila. Materiais e métodos: Na pesquisa foram utilizados 15 ratos Wistar
submetidos à lesão epitelial localizada no dorso e divididos em 3 grupos. Grupo
carbopol sem Ultrassom terapêutico, grupo extrato tintura sem Ultrassom terapêutico
e grupo extrato tintura associado ao Ultrassom terapêutico. Depois de efetuada a
lesão foram realizadas 10 (dez) aplicações em 10 (dez) dias seguidos, sendo que
logo após a última aplicação de cada grupo os animais foram decapitados e o tecido
irradiado em redor da ferida foi removido cirurgicamente para posteriores análises
bioquímicas. Também foi mensurado imediatamente após a incisão cirúrgica, no
quinto e décimo dia o diâmetro da ferida através de um paquímetro. Resultados: Nos
animais tratados com Ultra-som terapêutico associado ao gel extrato tintura de
Mikania laevigata houve diminuição na média do tamanho das feridas em relação
aos outros grupos no quinto e décimo dia, entretanto não foi considerado um
resultado significativo. Em relação à sulfidrila não houve resultado significativo em
comparação aos outros grupos. Quanto aos níveis de ácido tiobarbitúrico TBARS e
carbonil os resultados foram considerados significativos. Conclusão: Concluí-se que,
mesmo não sendo significativa na evolução do tamanho da ferida e em relação à
sulfidrila, a técnica ideal para acelerar o processo cicatricial do tecido epitelial é a
utilização do Ultrassom terapêutico associado ao gel extrato tintura de Mikania
laevigata.
Palavras chave: Processo de cicatrização. Ultrassom terapêutico. Gel Extrato
tintura de Mikania laevigata.
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ABSTRACT
The epithelial lesion is characterized by the interruption of the continuity of a tissue of
the body, caused by any type of injury, whether physical, chemical, mechanical or
triggered by a medical condition. The healing process occurs to restore anatomical
and functional integrity of the damaged tissue. There are evidences that the tissue
reparation can be stimulated by physical agents, including ultrasound. This study
examines the evolution process of epithelial healing with the use of therapeutic
ultrasound combined with tincture extract of Mikania laevigata. Having also, specific
objectives to characterize the evolution of the epithelial scar by the size of the wound,
(TBARS) measures, carbonyl groups and sulfhydryl groups. Materials and methods:
In the research were used 15 Wistar rats underwent located epithelial lesion in the
back and divided into 3 groups. Carbopol group without therapeutic ultrasound,
dyeing extract group without therapeutic ultrasound group and extract dye associated
with therapeutic ultrasound. After making the lesion were done 10 (ten) applications
in 10 (ten) days straight, and as soon after the last application of each group the
animals were sacrificed by decapitation and the irradiated tissue around the wound
was surgically removed for further biochemical analysis. It was also measured
immediately after the surgical incision in the fifth and tenth days, the diameter of the
wound using a caliper. Results: In animals treated with ultrasound therapy combined
with tincture extract of Mikania laevigata there was a decrease in the average size of
wounds in relation to other groups in the fifth and tenth day, however there was not
considered a significant results. Related to sulfhydryl, there were not significant
results comparing to other groups. However, the levels of thiobarbituric acid carbonyl
and TBARS results were considered significant. Conclusions: We conclude that,
although there were not significant evolution in the size of the wound and related to
sulfhydryl, the ideal technique to accelerate the healing process of epithelial tissue is
the use of therapeutic ultrasound combined with tincture extract of Mikania laevigata .
Keywords: Healing process. Therapeutic ultrasound. Tincture extract of Mikania
laevigata.
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LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Anatomia da Pele........................................................................................17
Figura 2. Folhas de Mikania laevigata........................................................................29
Figura 3. Estresse oxidativo.......................................................................................30
Figura 4. Modelo de lesão epitelial.............................................................................33
Figura 5. Tamanho da Ferida (cm).............................................................................38
Figura 6. Efeitos do ultrassom e do gel extrato tintura de Mikania laevigata sobre as
espécies reativas de ácido tiobarbitúrico....................................................................40
Figura 7. Efeitos do ultrassom e do extrato tintura de Mikania laevigata sobre o
carbonil.......................................................................................................................41
Figura 8. Efeitos do ultrassom e do extrato tintura de Mikania laevigata em relação a
sulfidrila......................................................................................................................42
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
DNA – Ácido desoxirribonucleico
MHz - Mega Hertz
FISIOPAT - Laboratório de Fisiopatologia.
SPSS - Statistical Package for the Social Sciences
TBARS – espécies reativas de ácido tiobarbitúrico
UNESC – Universidade do Extremo Sul Catarinense
UV – Ultra-violeta.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................11
2 REFERENCIAL TEÓRICO ....................................................................................16
2.1 Pele.....................................................................................................................16
2.2 Lesão epitelial..................................................................................................177
2.3 Processos da cicatrização..............................................................................188
2.3.1 Fase inflamatória ..........................................................................................199
2.3.2 Fase proliferativa..........................................................................................199
2.3.3 Fase de maturação e remodelamento...........................................................20
2.4 Ultrassom............................................................................................................21
2.4.1 Propriedades do ultrassom ...........................................................................22
2.4.2 Efeitos do ultrassom ....................................................................................244
2.4.3 Ultrassom no reparo das lesões .................................................................266
2.5 Fonoforese.......................................................................................................277
2.5.1 Mikania laevigata ..........................................................................................288
2.6 Estresse oxidativo...........................................................................................299
3 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................32
3.1 Caracterização da pesquisa .............................................................................32
3.2 Caracterização das amostras...........................................................................32
3.3 Instrumentos.....................................................................................................32
3.4 Procedimentos para coleta de dados...............................................................33
3.4.1 Preparação do Gel Extrato Tintura de Mikania laevigata............................34
3.4.2 Descrição da técnica de maceração..............................................................35
3.5 Procedimentos para análise.............................................................................36
4 APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DE DADOS .........................................................37
5 CONCLUSÃO ........................................................................................................43
6 PERSPECTIVAS.....................................................................................................44
REFERENCIAS.........................................................................................................45
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1 INTRODUÇÃO
O tecido epitelial é um conjunto de estruturas elásticas, ásperas e, em
condições normais, auto-regeneradora, sendo constituído por folhetos celulares
contínuos conhecidos como epitélios que recobrem a superfície externa do corpo e
quase todas as superfícies internas, juntamente com as glândulas que se
desenvolvem a partir deles (COMARCK, 1996. CORREA et al., 2003. CARVALHO,
2003). Tem, como principais funções, a de proteção de raios ultravioletas, regulação
da temperatura corpórea e sensorial, e é constituída por duas camadas principais:
derme e epiderme (CORREA et al., 2003).
A derme é uma espessa camada de tecido conjuntivo onde se situam
muitas fibras colágenas e algumas fibras reticulares e elásticas, sendo suprida por
vasos linfáticos, vasos sanguíneos e nervos. A epiderme é a camada do tecido
epitelial avascular, constituída essencialmente por um epitélio estratificado
pavimentoso queratinizado. As células epiteliais, para manter o seu número, se
proliferam a partir da porção mais profunda da epiderme (GUIRRO e GUIRRO,
2002).
Quando ocorrem as lesões epiteliais, estas são caracterizadas pela
destruição da continuidade do tecido epitelial. A úlcera de pressão é um exemplo de
lesão epitelial que é secundária ao comprometimento do suprimento sanguíneo,
trombose capilar e anóxia tecidual que ocorre na sua maioria em pacientes
acamados devido às forças de compressão por um tempo prolongado (DINI et al.,
2006).
À partir da lesão epitelial ocorre uma série de eventos que objetivam
reestabelecer a estrutura anatômica e a funcionalidade da região afetada. De acordo
com MANDELBAUM et al., (2003), e CARVALHO (2003), a repavimentação e a
reconstituição do tecido ocorrem por uma perfeita e coordenada cascata de eventos
celulares e moleculares promovendo a cicatrização da ferida. Esses eventos podem
ser classificados em diferentes fases: a fase inflamatória, a fase de proliferação e a
fase de remodelagem.
A fase inflamatória é definida como uma reação do tecido vascularizado
vivo às agressões. Durante o processo inflamatório vão existir quatro componentes
principais que vão compor a ferida: as proteínas plasmáticas, que migram para o
local da inflamação; os fibroblastos, leucócitos, mastócitos e plaquetas, que chegam
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ao local da lesão pela corrente sanguínea; e as proteínas, lipídios, ácidos e aminas
vasoativas que são os mediadores da lesão (KISNER e COLBY, 2005).
Na
fase
de
proliferação
ocorre
a
ativação
de
macrófagos,
e
consequentemente a matriz extracelular pode começar a ser substituída por um
tecido conjuntivo mais elástico e mais resistente. O tecido conjuntivo maduro é
constituído de colágeno, o componente mais importante da cicatriz (KISNER e
COLBY, 2005).
Durante a fase de remodelagem a ferida adquire a sua máxima
resistência, que é atribuída pela deposição de colágeno e pela remodelagem das
fibrilas de colágeno. A fase de remodelagem é considerada a fase final de cura de
uma ferida (ROBBINS et al., 1996).
Ao longo do estágio inflamatório a terapia por ultrassom influência nas
atividades das células, mastócitos, macrófagos, plaquetas e neutrófilos, acelerando
o processo de cicatrização (KITCHEN e BAZIN, 2001; LOW e REED, 2003). Na fase
de proliferação a terapia com ultrassom está relacionada ao aumento de velocidade
de angiogênese e aumento na secreção de colágeno (MENETREY et al., 1999;
LOW e REED, 2003). Já no estágio de remodelamento a aplicação do ultrassom
fornece uma melhor elasticidade do colágeno maduro e uma melhor resistência
tênsil, quando o tratamento é realizado em todas as fases do processo de reparo
tecidual (KITCHEN e BAZIN, 2001; LOW e REED, 2003).
O ultrassom terapêutico é uma modalidade usada em fisioterapia no
tratamento de várias situações, incluindo distúrbios circulatórios, estimulação de
reparação de tecidos e, principalmente, processos inflamatórios de lesão tecidual.
Medicamentos antiinflamatórios não hormonais também são frequentemente
utilizados nessas condições, e tradicionalmente são ingeridos oralmente na forma de
cápsulas ou comprimidos, predispondo à danos no sistema gastro-intestinais. Por
esse fator pesquisadores estudam outras maneiras de aplicações desses
medicamentos. Em razão disso a fonoforese, técnica de inserir um antiinflamatório
através do ultrassom terapêutico tem sido estudada por profissionais da área da
saúde (YANG et al., 2005).
A energia do ultrassom pode ser utilizada para a liberação de substâncias
medicamentosas na corrente sanguínea, fazendo penetrar mais profundamente no
tecido
o
fármaco
utilizado.
Como
principais
fármacos
destacam-se
os
corticoesteróides, salicilatos e anestésicos. Estes fármacos devem possuir a
13
configuração de gel, independente da carga elétrica da medicação (STARKEY,
2002; YANG et al., 2005).
Devido às propriedades antiinflamatórias, analgésicas e antimicrobianas
da espécie de guaco (Mikania laevigata), a mesma já era utilizada na medicina
popular para o tratamento de diversas enfermidades (FERRO, 1991). Com a
possibilidade de formar gel de Mikania laevigata, a aplicação através de fonoforese é
disponível e promissora para tratamento de lesões epiteliais.
A espécie Mikania laevigata possui um subarbusto de hábito trepador,
volúvel, com o caule lenhoso e cilíndrico, de coloração castanho-acizentada e verde
claro nas pontas, suas folhas são opostas de contorno oval e oblongo-lanceoladas,
de base obtusa e ápice acuminado de até 15 cm de comprimento e 7 cm de largura,
com 3 nervuras bem evidentes, pecioladas, carnoso-coriáceas, verde brilhantes na
face superior, mas pálida na interior (OLIVEIRA et al., 1984).
As defesas antioxidantes, enzimáticas e não-enzimáticas, atuam contra a
toxicidade dos radicais livres, que são formados no metabolismo celular. Em
condições extremas ocorre o aumento da produção de radicais livres favorecendo o
aumento do estresse oxidativo (BONDY e LE BEL, 1993; CADENAS e DAVIES,
2000). De acordo com TOUMI E BEST (2006) o estresse oxidativo altera o
metabolismo das células, o que pode provocar perda da função celular.
Tendo em vista o pressuposto teórico definiu-se a seguinte questão
problema:
O ultrassom terapêutico associado ou não ao extrato tintura de
Mikania Laevigata acelera o processo cicatricial em lesão induzida por dano
epitelial em ratos?
Baseando-se na questão problema, definiram-se as seguintes questões a
investigar:
1) O uso do ultrassom com o antiinflamatório, gel extrato tintura de
Mikania Laevigata acelera o processo da cicatrização epitelial?
Hipótese: A fonoforese, que é um método onde se aumenta a permeação
cutânea de fármacos sob influência do ultrassom terapêutico, com o poder
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antiinflamatório da espécie Mikania laevigata, o resultado esperado com essa união
é que acelera o processo cicatricial.
2) O uso do antiinflamatório, gel extrato de tintura de Mikania Laevigata,
associado ao Ultrassom tem maior poder de resolução, quando comparado apenas
ao uso direto do extrato?
Hipótese: Estudos demonstraram que o ultrassom terapêutico acelera o
metabolismo
celular,
consequentemente
acelera
o
processo
cicatricial.
E
principalmente tem o poder de reorganizar a proliferação celular e a síntese de
colágeno presente na fase de remodelagem do processo de cicatrização, evitando a
hipertrofia da cicatriz, mas relatos de associação do gel extrato de tintura e do
extrato com Ultrassom não estão presentes na literatura científica.
3) O uso do Ultrassom terapêutico com gel extrato tintura de Mikania
laevigata, diminui o estresse oxidativo?
Hipótese: Vários estudos comprovaram a eficiência do uso do ultrassom
terapêutico na cicatrização tecidual, mas não se tem um estudo com o uso da
fonoforese associando o ultrassom com o gel de guaco. Acredita-se que o efeito
antiinflamatório do guaco unido às propriedades do ultrassom pode diminuir o
estresse oxidativo.
Este estudo tem como objetivo geral analisar o processo de evolução
cicatricial epitelial com o uso do ultrassom terapêutico associado ao extrato tintura
de Mikania Laevigata. Tendo, também, como objetivos específicos caracterizar a
evolução da cicatriz epitelial por medida de ferida; avaliar a medida de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), um marcador de lipoperoxidação;
determinar a técnica ideal para o reparo do tecido epitelial; analisar a medida de
grupos carbonil, medida de dano oxidativo em proteínas; e analisar a medida de
grupos sulfidrila, marcadores de oxidação de proteínas.
Sabe-se que a úlcera de decúbito é uma realidade hospitalar, pois para
cada milhão de pacientes internados 75.000 desenvolvem essa enfermidade, e
como agravante, as úlceras de pressão constituem uma via de entrada para
infecções, e que alguns pacientes evoluem para óbito, determinando uma
problemática de saúde pública.
É de fundamental importância que a equipe de
saúde conheça com clareza as condutas a serem tomadas no diagnóstico,
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tratamento, prognóstico e principalmente a cargo da fisioterapia, a prevenção dessa
enfermidade (GOMES, 2007).
Em tempos atuais Fisioterapeutas, médicos, farmacêuticos e cientistas
estão em uma constante procura de um melhor agente cicatrizador. E uma das
formas de tratamento de lesões epiteliais é a utilização do ultrassom, recurso próprio
dos Fisioterapeutas, que visa melhorar a qualidade de vida dos pacientes e diminuir
o tempo de reparação das lesões.
Os principais motivos para se querer reduzir o tempo da cicatrização
epitelial seriam a redução de custo e tempo de tratamento ao paciente, e a
intervenção precoce em casos de lesões associadas que dependem de uma
cicatrização completa da lesão epitelial para serem iniciadas. Uma outra razão a ser
considerada é a utilização de ratos como modelos de pesquisa, onde a o custo é
baixo e processo de cicatrização epitelial muito semelhante aos humanos. Também
foi utilizado gel de Mikania laevigata, popular “guaco”, produto com propriedades
antiinflamatórias que podem auxiliar na cicatrização da pele, que tem um baixo custo
comercial, e que tem a possibilidade de ser transformada em gel, considerado o
meio que melhor transmita a onda ultra-sônica, sendo, portanto, o agente de
acoplamento de Ultrassom terapêutico mais indicado (HAAR, 2007).
O presente estudo encontra-se dividido em cinco capítulos, sendo o
primeiro a introdução; capítulo II, referencial teórico; capítulo III, materiais e
métodos; capítulo IV análise e discussão dos dados; capitulo V, conclusão; capítulo
VI perspectivas; seguido das referencias, apêndices e anexos.
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2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Pele
A pele constitui o mais extenso órgão sensorial do corpo, responsável
pela recepção de estímulos táteis, térmicos e dolorosos. Tem importantes funções
para o organismo, por exemplo, a de barreira protetora contra agentes agressores e
reguladora da temperatura corpórea, sendo assim um componente importante para
o sistema imunológico (CARVALHO, 2003). Ela representa 12% do peso seco total
do corpo com peso de aproximadamente 4,5 quilos (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
Segundo COMARCK (1996), o tecido epitelial é constituído de folhetos
celulares contínuos e com glândulas que se desenvolvem a partir deles, revestindo
toda a superfície externa do corpo. Geralmente, as células epiteliais aderem
firmemente uma às outras, formando camadas celulares contínuas que revestem a
superfície externa e as cavidades do corpo. Quanto ao número de camadas, dividem
os epitélios em epitélio simples (escamoso), onde a membrana epitelial é formada
por uma única camada de células; epitélio estratificado (pavimentoso ou cilíndrico),
formado por duas ou mais camadas de células e epitélio pseudo-estratificado. Essas
camadas de células epiteliais constituem dois extratos que se superpõem: a
epiderme, e a derme (CARVALHO, 2003; GUIRRO e GUIRRO, 2002; JUNQUEIRA e
CARNEIRO, 1995).
A epiderme é a camada mais superficial, avascular, e é composta de 5
camadas: córnea , lúcida, granulosa , espinhosa e germinativa. As várias camadas
de queratinócitos interligados uns aos outros fornecem uma barreira contra a
penetração de microorganismos e água. A camada córnea, mais superficial,
proporciona proteção contra traumas físicos e químicos, pois é constituída por
células escamosas, cheias de queratina. A camada mais profunda, que faz limite
com a derme, é a camada germinativa (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
A derme é a segunda camada do tegumento, nesta camada situam-se os
anexos da pele, muitos vasos sangüíneos, vasos linfáticos e nervos, e representa
aproximadamente 90% da espessura total da pele, formando uma base firme para a
epiderme (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 1995).
17
Figura 1 - Anatomia da Pele
Fonte: www.nursingcenter.com.
2.2 Lesão epitelial
Uma lesão epitelial é caracterizada pela interrupção da continuidade da
pele, em maior ou em menor extensão, causada por qualquer tipo de trauma físico,
químico, mecânico ou desencadeada por uma afecção clínica (CESARETTI, 1998).
As lesões epiteliais são classificadas, de acordo com o tempo, em agudas
e crônicas. As feridas agudas são causadas por traumas ou cirurgias, e sua
cicatrização ocorre sem complicações. As feridas crônicas são aquelas que não são
reparadas no tempo esperado, apresentando complicações (SANTOS, 2000).
As úlceras de decúbito são exemplos de lesões epiteliais, que devido à
pressão prolongada exercida sobre alguma parte do corpo, vai ocasionar o
comprometimento do suprimento sangüíneo, trombose capilar e anóxia tecidual do
local, caracterizando a destruição da continuidade do tecido epitelial (DINI et al,
2006).
Um fator relevante na lesão epitelial é a profundidade da ferida,
classificada como ferida superficial (envolvendo somente a epiderme), ferida com
perda parcial (envolvendo a epiderme e porção superior da derme), e a perda total -
18
destruição da epiderme, derme, tecido subcutâneo, podendo invadir músculos,
tendões e osso (SANTOS, 2000).
2.3 Processos da cicatrização
O processo de cicatrização é caracterizado pelo preenchimento de
determinado espaço e selado pela cicatriz. Entretanto, este quadro pode ser
alterado. A evolução do fenômeno da cicatrização envolve uma série de eventos que
representam uma tentativa de restabelecer a função normal do tecido lesado e a
estrutura anatômica envolvida. Para que um ferimento tenha uma boa cicatrização
esses eventos devem se suceder numa seqüência normal e apropriada. Durante
este processo, vários fatores fisiológicos estão envolvidos e o desequilíbrio ou
ausência de alguns elementos, principalmente a formação de colágeno, pode
comprometer
o
resultado
final,
alterando
o
quadro
de
regeneração
consequentemente influenciando na funcionalidade e/ou a estética da região
(OLSSON et al., 2008).
O processo da cicatrização acontece basicamente no tecido conjuntivo,
no qual diversos fatores interferem na ordem geral ou local em sua constituição e
função, como por exemplo, pela presença ou ausência de bactérias, grau de
suprimento sanguíneo, se a ferida é de característica aberta ou fechada, o tipo de
tecido lesado, a dieta e a idade do indivíduo (GUIRRO e GUIRRO, 2002).
A regeneração das células parenquimais repara as lesões do organismo,
seguida de uma cicatrização mais ou menos acentuada do tecido conjuntivo. A
cicatriz consiste na substituição do tecido lesado por conjuntivo recém formado
(GUIRRO e GUIRRO, 2002).
Os principais componentes celulares do processo de reparo são:
plaquetas, mastócitos, leucócitos polimorfonucleares, macrófagos, linfócitos T,
fibroblastos, e células endoteliais. Estas células migram até o local lesionado através
da corrente sanguínea, numa seqüência bem organizada, controlada por fatores
solúveis da lesão (KITCHEN e BAZIN, 2001).
19
Os eventos celulares bioquímicos na cicatrização das feridas podem ser
divididos em três fases conseqüentes: inflamação, fase de maturação e fase de
remodelamento (KISNER e COLBY, 2005).
2.3.1 Fase inflamatória
A inflamação é um pré-requisito para que o processo de reparo aconteça.
Por isso, a inflamação inicia-se imediatamente após a lesão, sendo uma resposta
natural do organismo ao trauma lesivo (JÓZSA e KANNUS, 1997).
Segundo o mesmo autor o trauma lesivo provoca uma ruptura dos vasos
sanguíneos ocorrendo extravasamento de sangue, plasma e fluidos teciduais para a
área lesada.
Os eventos iniciais no processo de cura são direcionados para a perda
subseqüente de sangue, sendo que logo após o trauma lesivo ocorre uma
vasoconstrição reflexa de 5 a 10 minutos propiciando o fechamento dos vasos
sanguíneos lesados e que imediatamente promove a formação dos coágulos e a
exsudação das células e dos solutos dos vasos sanguíneos ativando a cascata de
coagulação. Nesse período, os neutrófilos, primeiras células sangüíneas a ingressar
ao local da lesão, têm a função de neutralizar os irritantes químicos e de eliminar
partículas estranhas. Os macrófagos ingressam logo em seguida aos neutrófilos,
com a função de realizar a limpeza do tecido morto (fagocitose), e de produzir
fatores da lesão, que orientam diretamente a formação do tecido de granulação
(KISNER e COLBY, 2005).
2.3.2 Fase proliferativa
A síntese e a deposição de colágeno promovem a reparação do tecido
conjuntivo e do epitélio, caracterizando a fase proliferativa. Os estímulos nocivos são
removidos pelos macrófagos e ocorre a formação de leitos capilares (angiogênese).
20
Há um aumento da atividade fibroblástica, da formação de colágeno e o
desenvolvimento da cicatriz (KISNER e COLBY, 2005).
Segundo MAXWELL (1992), o surgimento e o aumento da atividade dos
fibroblastos ocorrem por volta do segundo e terceiro dia após o trauma, estes são
liberados através das plaquetas e dos macrófagos, acompanhando a retração
vascular no processo de reparo tecidual e são responsáveis pela síntese de
colágeno e sua deposição na matriz extracelular.
Essa fase pode ser definida como processo pelo qual ocorre uma redução
do tamanho da ferida em decorrência da retração da cicatriz (GUIRRO e GUIRRO,
2002). Durante esse estágio, o tecido conjuntivo produzido é fino e desorganizado.
O macrófago é uma das fontes mais importantes para que ocorram todos estes
eventos na fase proliferativa (KISNER e COLBY, 2005).
2.3.3 Fase de maturação e remodelamento
A maturação e a remodelagem representam a fase final da cura de uma
ferida. É nesta fase que a cicatriz atinge a sua forma e adquire sua máxima
resistência tênsil, mas é um processo demorado que pode levar muitos meses ou
até anos para adquirir sua resistência final, mesmo assim a cicatriz cutânea
totalmente matura tem apenas 70% da resistência de uma pele normal. O processo
de remodelagem da cicatriz envolve a contínua produção, digestão, agregação e
orientação das fibras de colágeno (KISNER e COLBY, 2005).
Com a maturação e a remodelagem do tecido ocorrem a melhora da
qualidade (orientação e força tensiva) do colágeno, redução do tamanho da ferida e
o tecido de granulação é gradualmente substituído por uma cicatriz, que é um tecido
relativamente acelular e avascular. A maturação e o remodelamento do tecido
cicatricial ocorrem à medida que as fibras de colágeno se tornam mais espessas e
se reorientam em resposta às sobrecargas colocadas sobre o tecido conjuntivo
(KISNER e COLBY, 2005; BALBINO et al., 2005).
Logo após ocorrer a síntese de colágeno (colágeno imaturo), elas podem
ser facilmente remodeladas com um tratamento suave e persistente. Já, se a cicatriz
não for tratada, em 14 semanas o tecido cicatricial não responde mais ao processo
de remodelamento, consequentemente, uma cicatriz antiga não tratada tem uma
resposta ruim ao alongamento (KISNER e COLBY, 2005; BALBINO et al., 2005).
21
2.4 Ultrassom
Visando a aceleração do processo cicatricial em diversos tecidos lesados,
buscam-se alternativas à terapia convencional que interajam com o processo
reparativo criando um microambiente ideal para sua ocorrência. Dentre as inúmeras
técnicas e benefícios aplicáveis à medicina regenerativa, o uso do ultrassom
terapêutico é alternativa cada vez mais freqüente. As experiências de terapia sonora
em animais têm propiciado informações relevantes para o tratamento de vários tipos
de lesões; todavia, apesar de serem muito utilizados, ainda existem controvérsias
em relação aos seus potenciais biológicos de acordo com a modalidade e a
dosimetria utilizadas para cada tipo de lesão. Os efeitos biofísicos do ultrassom
sobre o reparo tecidual são pouco compreendidos, sendo seu uso muitas vezes
negligenciado na experiência prática, o que resulta em procedimentos imprecisos
(OLSSON et al. 2008).
O ultrassom é uma forma de energia mecânica não audível transmitida
para os tecidos por ondas acústicas de alta freqüência em organismos biológicos. É
um dos recursos mais utilizados na Fisioterapia e tem como objetivo o tratamento
das mais diversas disfunções teciduais, circulatórias e neurais. As ondas ultrasônicas vão ocorrer no modo contínuo, onde não ocorre interrupção na propagação
da energia, havendo uma acentuada produção de calor ou no modo pulsado, onde
apresentam breves interrupções na propagação de energia evitando, assim, os
efeitos térmicos, permitindo seu uso na fase aguda de uma lesão (GAM e
JOHANNEN, 1995).
Os efeitos do ultrassom no modo contínuo, onde há uma produção de
calor, podem produzir um aumento na extensibilidade das estruturas ricas em
colágeno, na deposição de colágeno e no fluxo sangüíneo. No modo pulsado, sob a
ação de efeitos não-térmicos ou mecânicos, o ultrassom aumenta a permeabilidade
vascular, reduz edema, auxilia na regeneração dos tecidos, e influencia nas
atividades das células acelerando o processo de cicatrização (HAAR, 2007).
A onda mecânica produzida pelo ultrassom é a energia transmitida por
vibrações de moléculas do meio em que estão se propagando, fazendo-as
oscilarem, quer o meio seja sólido, líquido ou gasoso. A quantidade de energia que
incide em uma determinada superfície é chamada de potência, expressa em watts
22
(W). Essa energia é dependente de algumas características do ultrassom
(freqüência, intensidade, amplitude, foco e uniformidade do feixe) e do tipo de tecido
em que ocorre a propagação da onda (TER HARR, 1987).
Para que as ondas ultra-sônicas sejam transmitidas para os tecidos é
necessário um meio acoplador, que tem a função de excluir o ar da região entre o
transdutor e o tecido (DOCKER, 1982; WILLIAMS, 1987). Com isso o transdutor,
com o auxilio de uma pastilha de material piezoelétrico e do meio acoplador, vai
gerar ondas ultra-sônicas que são propagadas através do tecido biológico. A
piezoeletricidade é um fenômeno natural, encontrado em certos cristais, tais como o
germânio e o quartzo, que têm a capacidade de transformar energia mecânica em
elétrica e vice-versa (HOOGLAND, 1986; KANH, 1991).
O ultrassom terapêutico vem sendo empregado há mais de 40 anos no
tratamento de diversas patologias e uma quantidade considerável de trabalhos
laboratoriais têm sido realizados com os objetivos de provar seus efeitos sobre os
tecidos e de interagi-lo com outros materiais para potencializar esses efeitos
(KITCHEN e PARTRIDGE, 1990).
2.4.1 Propriedades do ultrassom
Segundo KOEKE (2003), a propagação das ondas ultra-sônicas pode
sofrer diferentes comportamentos ao entrar em contato com determinado meio. São
eles:
A redução de energia da onda ultra-sônica nos tecidos é denominada de
atenuação (TER HARR, 1987; LOW e REED, 2003).
Segundo FUIRINI e LONGO (1996), a amplitude e a intensidade
diminuem à medida que as ondas de ultrassom, sobre sua forma de feixe, se
propagam através de um meio. À medida que o feixe de ultrassom segue sua
trajetória através dos tecidos ocorre a queda de intensidade, essa diminuição de
energia é conhecido como queda exponencial (HAAR, 2007). Essa diminuição de
intensidade é causada pela reflexão, pela refração nas interfaces, pela absorção do
meio, e pela difusão do som em um meio heterogêneo (FUIRINI e LONGO, 1996).
23
A reflexão ocorre quando uma onda não consegue atravessar a próxima
densidade, devido a uma diferença da impedância acústica dos meios. Essa reflexão
pode ser parcial ou completa (STARKEY, 2002).
Assim, quando a onda encontra uma interface, com propriedades
acústicas diferentes, parte dela é refletida e parte é transmitida. A onda refletida na
interface retorna através do meio incidente com a mesma velocidade com que se
aproximou da mesma. Na terceira reflexão de uma onda ela recebe a denominação
de onda estacionária (GUIRRO et al., 1996).
A refração é um desvio da onda de som nas várias interfaces dos tecidos.
A onda de som penetrará no tecido em certo ângulo, chamado de ângulo de
incidência, e sai desse tecido em uma direção contrária ao trajeto inicial da onda,
formando o ângulo de refração. A aplicação do ultrassom deverá ocorrer sempre
perpendicularmente ao plano da superfície de tratamento, pois um desvio maior que
15º com a superfície provoca um ângulo de refração, ocasionando uma reflexão de
uma parte da onda e o restante refratado em direção paralela a interface, tornando o
tratamento improdutivo (FUIRINI e LONGO, 1996).
O fenômeno de absorção é considerado como a capacidade do tecido em
armazenar energia, quando a energia vibracional é transformada em energia
molecular. As ondas ultra-sônicas são absorvidas pelos tecidos e transformadas em
calor (MACHADO, 1991)
A absorção das ondas produzidas pelo ultrassom depende da impedância
acústica do tecido, densidade do tecido e suas interfaces, freqüência do ultrassom,
quantidade de proteína do tecido, quantidade de água ou gordura, ângulo de
incidência, viscosidade do fluido, reflexão, refração e ondas transversais.
(MACHADO, 1991; FUIRINI e LONGO, 1996)
Segundo FUIRINI E LONGO (1996), as ondas são melhores absorvidas
por proteína em tecido nervoso, ligamentos, cápsulas intra-articulares, tendões com
alta concentração de colágeno, proteína no músculo, hemoglobina, não obtendo
uma boa absorção pela pele e gordura.
24
2.4.2 Efeitos do ultrassom
Um grande número de variáveis, de natureza física e biológica, interfere
nos efeitos do ultrassom. Por exemplo, o tempo de exposição, a estrutura espacial e
temporal do campo ultra-sônico e estado fisiológico do objeto, e também a
intensidade. Esses vários fatores complicam a compreensão exata do mecanismo
de ação do ultrassom e da qualidade na interação com os tecidos biológicos
(RICHARDSON, 1989; ROBERTSON, 2002; GANN, 2003).
A interação do ultrassom com os tecidos biológicos provoca alterações
fisiológicas que podem tanto ser benéficas ou maléficas (FERRARI, 1987; HAAR,
2007).
Por exemplo, aumentar a intensidade pode elevar excessivamente a
temperatura do tecido, e conseqüentemente ter efeitos indesejáveis, como
desvitalização da região irradiada (PAULA, 1994). E o aumento da intensidade não
pode compensar a diminuição do tempo de tratamento, porque o efeito produzido
pelas duas variedades é diferente. Os mecanismos do ultrassom são geralmente
classificados em térmico, não térmico ou mecânico (DYSON,1987).
Com relação aos efeitos mecânicos, ao penetrarem no tecido, as ondas
ultra-sônicas criam pressões positivas e negativas, obrigam as células a mover-se
de forma alternada, provocando um efeito de micro-massagem que aumenta o fluxo
sangüíneo, acelera a velocidade de difusão de íons através da membrana celular,
acelerando o intercâmbio de fluidos, favorecendo o processo de difusão e
melhorando o metabolismo celular e a conseqüente melhora do suprimento de
oxigênio às mesmas. Regula o desequilíbrio, auxilia a liberação de aderências, pela
separação das fibras colágenas (SILVA, 1987; MACHADO, 1991). Com o aumento
das trocas e da vasodilatação, teremos mais anticorpos, leucócitos e eletrólitos na
área,
o
que
concorrerá
para
uma
maior
defesa,
além
de
aumentar
consideravelmente o retorno venoso e linfático, facilitando a absorção de edemas
(MACHADO, 1991).
Já os efeitos térmicos são decorrentes da absorção das ondas ultrasônicas pelo tecido que se transforma em calor (YOUNG, 1998). A vibração celular e
de suas partículas provoca um atrito entre elas, produzindo assim o efeito térmico
(DYSON,1987).
25
O efeito térmico só ocorre no ultrassom no modo contínuo, o que não
ocorre com o feixe ultra-sônico pulsátil ou intermitente, promovendo ação
analgésica, antiinflamatória ou antiespasmódica na zona tratada (SILVA, 1987;
MACHADO, 1991; KITCHEN e BAZIN, 2001; LOW e REED, 2003).
A estimulação do plexo terminal nervoso pelo ultrassom promove
vasodilatação em extremidades, e com isso provoca uma vasodilatação reflexa
aumentando o fluxo sanguíneo nos capilares e arteríolas (DYSON,1987; KITCHEN e
BAZIN, 2001; LOW e REED, 2003).
Quando uma onda ultra-sônica atravessa um tecido biológico, este é
aquecido ao absorver a energia mecânica ultra-sônica (BASSOLI, 2001). O tipo de
tecido e o fluxo sanguíneo que irriga o local (uma vez que o calor produzido pode ser
dissipado por corrente sanguínea) alteram o aquecimento local produzido pelo
ultrassom no modo contínuo. Tecidos com elevado conteúdo protéico absorvem
mais rapidamente que os com maior conteúdo de gordura, e quanto maior a
freqüência, maior o calor local (YOUNG, 1998).
Se a temperatura local é elevada para algo entre 40 e 45°, ocorre
hiperemia. Temperaturas acima de 45° são destrutivas (LOW e REED, 2003).
Um outro efeito do ultrassom é o efeito químico, que acontece através dos
fatores
mecânicos
e
térmicos
acelerando
as
reações
e
aumentando
a
condutibilidade das ações, como a liberação de substâncias vasodilatadoras,
facilitando a dispersão dos líquidos e a desagregação de moléculas complexas
(MACHADO, 1991).
Também
consideramos
o
efeito
antiflogístico
que
o
Ultrassom
proporciona, onde com o aumento da vasodilatação e consequentemente da
circulação sangüínea, teremos mais anticorpos, leucócitos e eletrólitos na área, o
que ocasionará uma maior defesa e limpeza da ferida no estagio inicial da lesão,
além de aumentar consideravelmente o retorno venoso e linfático, facilitando a
absorção de edemas (MACHADO, 1991).
26
2.4.3 Ultrassom no reparo das lesões
A escolha da melhor maneira de tratamento para as lesões epiteliais
depende de uma inspeção acurada da lesão, identificando-se o estágio do processo
cicatricial. Para auxiliar no processo reparativo, são utilizados alguns fármacos como
forma de tratamento nesse tipo de lesão, mas nem sempre são eficazes e o custo
desse tipo de tratamento os torna inviáveis. “Dentre os recursos disponíveis para o
tratamento de lesões, a utilização de terapias alternativas não invasivas na
cicatrização tecidual têm se mostrado de fundamental importância para o estímulo
da preservação das funções fisiológicas, da estrutura celular e para a melhora na
qualidade do tecido neoformado” (OLSSON et al. 2008).
É fato conhecido que o ultrassom interage com os tecidos biológicos por
meio de mecanismos térmicos e não térmicos ou mecânicos, que ocorrem
simultaneamente prevalecendo de acordo com o modo de propagação da onda
(contínua ou pulsada) (DYSON, 1987), mas é possível potencializar um ou outro
efeito alterando o tipo de onda utilizada, o tempo e a técnica de aplicação (BAKER et
al., 2001; DYSON, 1987).
Têm-se atribuído ao ultrassom, durante as três fases da cicatrização, um
aumento na síntese de colágeno, aumento da velocidade do processo de
cicatrização, uma maior resistência da cicatriz, maior capacidade de absorção
energia, na diminuição de células inflamatórias por aceleração do metabolismo
celular, e na facilitação na proliferação de fibroblastos e a síntese de proteínas.
Cada processo acontecendo em seu tempo de atuação, de acordo com as fases de
inflamação, maturação e remodelamento (ENWEMEKA, 1989; JACKSON et al.,
1991).
Assim, o ultrassom terapêutico tem um papel terapêutico importante na
reparação tecidual, sobretudo à baixa intensidade, o que minimiza inclusive o risco
de lesões teciduais, que podem ocorrer com a superdosagem (FRENKEL et al.,
1999; KITCHEN e PARTRIDGE, 1990).
As evidências dos efeitos benéficos da irradiação ultrassônica sobre o
tegumento cutâneo foram pesquisadas em algumas situações clínicas (KITCHEN e
PARTRIDGE, 1990).
27
DYSON (1987) e MAXWELL (1992), e concluíram que o ultrassom causa
o aumento do fluxo sanguíneo para a ferida, a liberação dos mediadores da
inflamação, a migração de leucócitos, a angiogênese, a síntese de colágeno e a
formação do tecido cicatricial. Evidenciando um aumento significativo no número de
células em proliferação na epiderme e neoformação vascular.
2.5 Fonoforese
Durante as últimas décadas, muitos trabalhos têm sido realizados no
sentido de esclarecer a permeabilidade cutânea a diferentes substâncias ativas.
Esse tem sido um assunto de profundo interesse para as áreas de Fisioterapia,
farmacologia e dermatologia.
Uma variedade de pesquisas tem sugerido que, para aumentar a
permeabilidade da pele acelerando o transporte das drogas, podem-se utilizar, entre
outros recursos, as correntes elétricas e a aplicação de ultrassom (MITRAGOTRI et
al., 1995), pois a ação de uma força física externa melhora a permeabilidade da pele
(UEDA, 1996). Para isso estão sendo usados métodos como a fonoforese, na
tentativa de aumentar a permeação cutânea de fármacos (MACHET et al., 1998).
Segundo LOW E REED (2001) Algumas drogas aplicadas diretamente na
pele são absorvidas muito lentamente, onde a vibração sonora de alta freqüência
pode acelerar esse processo. De acordo com GUIRRO E GUIRRO (2002), “existem
várias vantagens na utilização dessa modalidade de tratamento, entre elas a ação
localizada da droga, com conseqüente ausência de efeitos colaterais decorrente de
ações sistêmicas, caso a droga não tenha esse tipo de ação.”
Os efeitos não-térmicos do ultrassom terapêutico que influenciam na
penetração dos fármacos incluem cavitação e microfluxo acústico.
A cavitação
resulta na formação de microbolhas gasosas na camada externa da pele, que
podem romper-se violentamente, e possivelmente permitir a passagem da droga. O
microfluxo acústico é um movimento unidirecional do fluido em um campo de
pressão ultrassônica. A microagitação permite o movimento das partículas pelas
membranas das células, provocando o aumento da permeabilidade celular (LOW e
REED, 2001).
28
Poucos produtos apresentam as características apropriadas para a
fonoforese, sendo o gel o tipo mais apropriado de formulação para essa terapia
(GUIRRO e GUIRRO 2002).
2.5.1 Mikania Laevigata
No Brasil, além da cultivação das tradições indígenas, os conhecimentos
trazidos pelos escravos e imigrantes representam uma atuação relevante para o
surgimento de uma medicina natural rica e original, utilizando as plantas medicinais
para tratamento de várias enfermidades, como diabetes, doenças do coração,
desordens psiquiátricas, entre outros (FREITAS, 2006).
Em várias partes do mundo essas plantas medicinais são utilizadas para
curar várias doenças, e são usadas sob diversas formas, tais como infusões,
emplastos ou extratos (FERRO, 1991).
Um exemplo de planta medicinal é a Mikania laevigata, conhecida
popularmente como guaco, cultivada principalmente no sul do Brasil, e que pode ser
encontrada entre São Paulo e o Rio Grande do Sul, onde é mais cultivada
(FREITAS, 2006).
Devido
às
suas
propriedades
antiinflamatórias,
analgésicas
e
antimicrobianas, a mesma já era utilizada na medicina popular para o tratamento de
diversas enfermidades como asma, bronquite, tosse entre outros sintomas
relacionados a gripe e resfriados (FERRO, 1991).
29
Figura 2 - folhas de Mikania laevigata
Fonte: SILVA JÚNIOR (2006).
A espécie Mikania Laevigata possui um subarbusto de hábito trepador,
volúvel, com o caule lenhoso e cilíndrico, de coloração castanho-acizentada e verde
claro nas pontas, suas folhas são opostas de contorno oval e oblongo-lanceoladas,
de base obtusa e ápice acuminado de até 15 cm de comprimento e 7 cm de largura,
com 3 nervuras bem evidentes, pecioladas, carnoso-coriáceas, verde brilhantes na
face superior, mas pálida na interior (OLIVEIRA et al., 1984). Suas flores são
hermafroditas, reunidas em número de quatro, iguais entre si, de papus branco e
corola tubulosa, de cor branco-creme. Possui frutos do tipo aquênio. (SIMÕES et al.,
1998).
Com relação à ação antiinflamatória, analgésicas e antimicrobianas da
Mikania laevigata, segundo FREITAS, 2006, concluiu que a administração do extrato
hidroalcoólico de Mikania laevigata mostrou-se efetiva na prevenção do dano
oxidativo pulmonar causado pelo carvão.
2.6 Estresse oxidativo
“Um radical livre é definido como qualquer átomo, grupo de átomos ou
molécula com um elétron não-pareado ocupando uma órbita externa. O ânion
superóxido (O²-), o radical hidroxila (OH) e o óxido nítrico (NO) são exemplos de
radicais livres” (VANCINI et al., 2005).
30
Os radicais livres são produzidos no metabolismo celular e participam da
fagocitose, na síntese e regulação de algumas proteínas e nos processos de
sinalização celular, tendo uma grande importância nas funções do organismo
(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999). Essa produção de radicais livres é um
processo fisiológico normal do organismo, o problema é quando os níveis totais de
espécie radioativa de oxigênio forem maiores que a capacidade de defesa, podendo
ocorrer o aumento do stress oxidativo e consequentemente danos celulares
(MATSUO e KANEKO, 2001).
Hábitos de vida inadequados, como o consumo de fumo, álcool e dieta
descontrolada; poluição; temperatura elevada e alta umidade relativa do ar;
exposição a radiações não ionizantes UV e ondas curtas; o estresse emocional e o
exercício realizado de forma extrema estão relacionados à quantidade de produção
de radicais livres (VANCINI et al., 2005).
Deste modo, particularmente quando as espécies radioativas de oxigênio
presentes em elevadas concentrações, eles podem induzir alterações severas na
estrutura de moléculas fundamentais para a manutenção da homeostasia celular,
resultando numa possível perda de funcionalidade ou até mesmo na perda de
viabilidade da célula (CADENAS e DAVIES, 2000).
Figura 3 - Estresse oxidativo
Fonte: (Adaptado de Marks et al., 1996).
31
Para ocorrer o equilíbrio entre a produção e a eliminação de radicais
livres, o organismo humano sofre a ação das defesas antioxidantes, enzimáticas e
não-enzimáticas (BONDY e LE BEL, 1993; CADENAS e DAVIES, 2000).
Quando não há homeostase entre a produção e eliminação de radicais
livres, ocorre o estresse oxidativo, que pode provocar perda da função celular
(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).
32
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Caracterização da pesquisa
O presente estudo é caracterizado como sendo de natureza aplicada,
qualitativo, quantitativo e experimental (Vieira & Hossne, 2001). Tendo como objetivo
analisar o processo de cicatrização epitelial em ratos Wistar, e seus possíveis danos
oxidativos, através da utilização do ultrassom terapêutico e do gel extrato tintura de
Mikania laevigata.
3.2 Caracterização das amostras
O estudo foi realizado no Laboratório de Fisiopatologia – FISIOPAT,
localizado na UNESC e vinculado ao programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde desta instituição. Preliminarmente, o projeto foi aceito junto ao Comitê de
Ética, com o protocolo número 620/07.
Amostra: foram utilizados 15 ratos Wistar (200-250g). Os animais foram
agrupados em gaiolas específicas, temperatura ambiente controlada em 22oC, ciclo
claro-escuro 12:12h e com livre acesso à água e à comida.
3.3 Instrumentos
Para realização das feridas foi utilizada uma tesoura cirúrgica esterilizada,
um molde de papel para padronização das incisões cirúrgicas;
- Máquina para tricotomia da marca General Eletric;
- Espectrofotômetro para analise das amostras bioquímicas;
- O processo evolutivo da cicatrização foi documentado através de fotos com
máquina fotográfica marca SONY, 7.2 Mega Pixels, Optical 3x;
- As feridas foram medidas com o auxilio de um paquímetro da marca Cardiomed no
1º, 5º e 10º dias de tratamento;
- O tratamento foi efetuado por Ultrassom terapêutico da marca Medicir;
- Freezer a –80 graus para acondicionamento das amostras;
- Homogenizador para preparação das amostras Bioquímicas;
33
- Kits Bioquímicos para análise Biotest; e tubos de ensaio.
3.4 Procedimentos para coleta de dados
Laceração epitelial: todos os animais foram anestesiados com Cetamina
(80mg/kg peso corporal, i.p.) após a sedação foi feita uma única incisão circular,
com bisturi cirúrgico, medindo aproximadamente 2 cm na porção medial do dorso de
cada animal, conforme modelo proposto por (PESSOA et al, 2004).
Figura 4 - Modelo de lesão epitelial
Fonte: adaptado de PESSOA et al, 2004.
Após o procedimento cirúrgico os animais foram divididos randomicamente
em 3 grupos:
Grupo 1 (n=5): controle 10 dias: tratados com gel carbopol, com
movimentos circulares por três minutos durante 10 dias.
Grupo 2 (n=5): tratados com extrato tintura de Mikania laevigata, com
movimentos circulares por três minutos durante 10 dias.
Grupo 3 (n=5): tratados com ultrassom pulsado terapêutico e extrato
tintura de Mikania Laevigata : 10 aplicações com dose de 0,8 w/cm 2 consecutivas.
Foi mensurado imediatamente após a incisão cirúrgica e no quinto e
décimo dia o diâmetro da ferida através de um paquímetro.
34
No presente experimento, o grupo 3, tratados com ultrassom terapêutico
na forma pulsada e extrato tintura de Mikania Laevigata, o ultrassom terapêutico foi
aplicado diretamente sobre a ferida e o extrato foi usado como meio acoplador entre
o cabeçote e uma película de filme plástico e, também, diretamente sobre a ferida. O
aparelho de ultrassom terapêutico foi calibrado e submetido à dosimetria antes do
início do tratamento, para evitar erros de dosagem, e o cabeçote do próprio aparelho
foi adaptado para pequenas áreas (YOUNG, 1998).
A densidade de energia aplicada de 0,8 w/cm² utilizada no presente
estudo foi determinada de acordo com GOMES, (2007) que concluiu que a dose
ideal de Ultrassom terapêutico para a regeneração do tecido cicatricial foi de 0,8
w/cm², sendo a mesma mais satisfatória quando comparadas a demais dosagens. A
freqüência utilizada foi de 1 MHz. (GUIRRO et al., 1996; YOUNG, 1998).
Nos grupos que não houve uso do ultrassom terapêutico foi realizada a
aplicação do gel carbopol ou gel extrato tintura de Mikania laevigata com contato
manual do pesquisador, diretamente na lesão, de forma circular, durante 3 minutos
para cada aplicação. Toda a ferida epitelial foi previamente limpa com água
destilada, para que pudéssemos retirar possíveis restos de palha das caixas de
acondicionamento dos animais ali contidas.
Observação: Antes do processo de irradiação os animais foram
anestesiados com Cetamina (80mg/kg de peso corporal, i.p.).
Logo após a última aplicação de cada grupo os animais foram decapitados
e o tecido irradiado em redor da ferida foi removido cirurgicamente. Parte do tecido
foi imediatamente congelado a –80o C para posteriores análises bioquímicas.
Ensaios Bioquímicos:
Espécies Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS): Como índice de
peroxidação de lipídeos foi verificado a formação de substâncias reativas ao
aquecimento do Ácido Tiobarbitúrico medido espectrofotometricamente (532nm),
conforme descrito por DRAPER e HADLEY (1990).
Os danos oxidativos em proteínas foram mensurados pela determinação
de grupos carbonil baseados na reação com dinitrofenilhidrazina como previamente
descrito por Levine et al. (1990).
O conteúdo de carbonil foi determinado
espectrofotometricamente em 370nm usando um coeficiente 22.0000 Molar.
35
Medida de grupos sulfidrila: o ensaio é baseado na redução de 5,5'-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) pelos tióis, que se tornam por sua vez oxidados, gerando
um derivado amarelo cuja absorção é medida por espectrofotômetro em 412 mm
(AKSENOV e MARKESBERY, 2001).
Determinação da Proteína: a quantidade de proteína nos ensaios
bioquímicos foi mensurada usando a técnica de LOWRY et al (1951).
3.4.1 Preparação do Gel Extrato Tintura de Mikania laevigata
Gel Extrato Tintura de Mikania laevigata:
Para o preparo do 100ml extrato tintura foi utilizado como solvente álcool
60% e 20g de farmacógeno seco (partes aéreas), na proporção de 1:5, a técnica de
extração utilizada foi maceração por um período de 21 dias. O rendimento em teor
de extrativos (sólidos totais = extrativos sólidos) deste extrato foi de 1,98%
3.4.2 Descrição da técnica de maceração:
- Macerar em recipiente fechado o farmacógeno seco, na proporção indicada
(farmacógeno previamente pesado e verter sobre o farmacógeno o solvente
indicado)
- Em temperatura ambiente
- Durante 7 a 10 dias
- Coe, espremendo fortemente.
- Filtre, se necessário complete o volume conforme a proporção indicada.
Após a finalização do extrato o mesmo foi incorporado em um base (gel
carbobol) na concentração de 6%, (6ml de tintura mais 94g de gel carbopol) sendo
que agora, em 100g de gel temos um teor de extrativos sólidos de 0,1188g e
conseqüentemente cada grama de gel terá 0,00188g de teor de extrativos
36
3.5 Procedimentos para análise
Tratamento Estatístico: Os dados foram expressos em média e erro
padrão médio e analisados estatisticamente pela análise de variância (ANOVA) twoway, seguido pelo teste post hoc Tukey. O nível de significância estabelecido para o
teste estatístico foi de p<0,05. Foi utilizado o SPSS (Statistical Package for the
Social Sciences) versão 12.0 como pacote estatístico.
37
4 APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DOS DADOS
O ultrassom é um recurso terapêutico de utilização universal usado,
principalmente, onde há necessidade de reparação tecidual, seja em uma
reabilitação pós-traumática ou pós-operatória do aparelho locomotor (DYSON,
1987).
Na literatura atual tem-se algumas evidências sobre a ação do Ultrassom
terapêutico no reparo do tecido epitelial, pois a terapia atua na interação com os
tecidos biológicos provocando alterações fisiológicas com o recrutamento de células
proliferativas, plaquetas, mastócitos, macrófagos, neutrófilos e síntese de proteínas
que auxiliam no remodelamento da cicatriz epitelial, acelerando a migração de
fribloblastos para o local da lesão; uma importante célula para no processo de
reparo tecidual (GOMES, 2007).
DYSON (1987) observou a regeneração tecidual em feridas experimentais
de coelhos, demonstrando que o uso de ultrassom pulsado aumentou o processo de
regeneração em 30% quando comparado ao controle não estimulado. Em estudos
que investigaram a ação do Ultrassom terapêutico na forma pulsada em úlceras
varicosas, foi verificada uma redução significativa das ulcerações quando
comparadas ao controle o que permitiu concluir que o Ultrassom terapêutico pode
estimular o processo de reparação tecidual.
Na fisioterapia já é comum a utilização do ultrassom terapêutico
associado à antiinflatórios tópicos na forma de gel em determinadas situações
clínicas, com o objetivo e a justificativa de que o ultrassom terapêutico favorece a
penetração transcutânea do antiinflamatório tópico. Esta prática terapêutica ficou
conhecida como fonoforese (KOEKE, 2003).
Segundo KOEKE (2003) o ultrassom terapêutico na modalidade pulsada a
100 Hz e regime de pulsação de 20%, e associada à hidrocortisona promove um
efeito positivo no processo de reparação do tendão, pois há indícios de que o
ultrassom terapêutico induz a penetração transcutânea da hidrocortisona.
Segundo BYL et al., (1993), de acordo com uma revisão bibliográfica,
aproximadamente 75% dos estudos de fonoforese relatam um efeito positivo da
fonoforese, enquanto que outros obtiveram resultados negativos.
38
De acordo com GUIRRO E GUIRRO (2002), existem várias vantagens na
utilização dessa modalidade de tratamento, entre elas a ação localizada da droga,
com conseqüente ausência de efeitos colaterais decorrente de ações sistêmicas,
caso a droga não tenha esse tipo de ação.
Alguns estudos mencionados demonstram o poder reparador da
fonoforese, mas nenhum estudo realizado utilizou, especificamente, como meio
acoplador, gel extrato tintura de Mikania laevigata, o que motivou a realização da
presente investigação, cujo objetivo principal foi analisar se o ultrassom terapêutico
associado ou não ao extrato tintura de Mikania Laevigata acelera o processo
cicatricial em lesão induzida por dano epitelial em ratos.
De acordo com o método estipulado, o tamanho das feridas foi
mensurado imediatamente após a incisão cirúrgica, no quinto e no décimo dia de
aplicação e feito a média dos mesmos que pode ser observado no gráfico abaixo:
Figura 5 - Tamanho da Ferida (cm)
3,5
3
cm
2,5
Carbopol s/US
2
Tintura s/US
1,5
Tintura c/ US
1
0,5
0
Lesão
5 Dias
10 dias
A figura 5 demonstra a média das feridas cutâneas no primeiro, quinto e
décimo dias, onde foram, conforme a legenda, os animais tratados com gel de
carbopol sem a utilização de Ultrassom, uso tópico de extrato tintura de Mikania
laevigata e extrato tintura de Mikania laevigata associado ao Ultrassom terapêutico.
39
Como podemos verificar não houve diferença significativa na evolução do
tamanho das feridas entre as formas de tratamento, levando apenas uma forte
tendência para a diminuição da ferida cirúrgica no grupo extrato tintura de Mikania
laevigata com a adição de Ultrassom terapêutico, no quinto e décimo dia, porém,
também é demonstrado que não houve tendência da diminuição entre o quinto e
décimo dia. Estes resultados demonstram que o uso tópico de gel extrato de tintura
de Mikania laevigata e gel carbopol não demonstram tendências efetivas para a
redução da ferida, entretanto com a presença do Ultrassom terapêutico acredita-se
que possa levar a uma diminuição significativa se a terapia for realizada por mais de
dez dias.
A Mikania laevigata, através de um estudo sobre a ação antiinflamatória
realizado por SUYENAGA et al., 2002, demonstrou que a ação antiinflamatória sobre
o edema em patas de ratos, diminui significativamente a migração dos leucócitos ao
local da lesão. Com o incremento das ondas Utrassônicas pulsáteis, o efeito estará
mais presente, segundo os relatos de AGNE, (2004) que relata que as forças
geradas pelas correntes acústicas alteram a permeabilidade da membrana da
plaqueta, levando à liberação de serotonina, incluindo a liberação de histamina dos
mastócitos. Em que o ultrassom apresenta um potencial de aceleração da resolução
normal da inflamação desde que o estímulo inflamatório seja removido. Causando
um aumento do cálcio iônico que funcionam como um sinal intracelular para
resposta metabólica apropriada.
40
Figura 6 - Efeitos do Ultrassom e do extrato tintura de Mikania Laevigata sobre as
espécies reativas de ácido tiobarbitúrico.
A figura 6 mostra o efeito do TBARs sobre as feridas cutâneas nos 3
grupos.
Os animais foram tratados com gel de carbopol sem a utilização de
Ultrassom, gel extrato tintura de Mikania laevigata sem a utilização de ultrassom e
gel extrato tintura de Mikania laevigata associado ao ultrassom terapêutico.
A figura demonstra que a produção de espécies reativas ao ácido
tiobarbitúrico TBARS, um marcador de lipoperoxidação, demonstrou uma diferença
significativa no grupo gel extrato tintura sem Ultrassom e no grupo gel extrato tintura
com Ultrassom em relação ao grupo carbopol sem Ultrassom.
Este resultado demonstra que o gel extrato tintura de Mikania laevigata
em associação ou não com o Ultrassom terapêutico diminuem o tempo da fase
inflamatória e por conseqüência o estresse oxidativo.
Através da figura observa-se que o Ultrassom terapêutico associado ao
gel extrato tintura de Mikania laevigata tem um efeito protetor muito semelhante
quando utilizamos apenas o extrato tintura de Mikania laevigata.
41
Figura 7 - Efeitos do Ultrassom e do gel extrato tintura de Mikania laevigata
sobre o carbonil.
A Figura 7 mostra mostra a produção de grupos carbonil sobre as feridas
cutâneas nos 3 grupos, onde foram, os animais tratados com gel de carbopol sem a
utilização de Ultrassom, extrato tintura de Mikania laevigata sem a utilização de
Ultrassom e extrato tintura de Mikania laevigata associado à utilização de Ultrassom.
Como podemos observar na figura, a proteína carbonil, com a utilização
do ultrassom terapêutico associado ao extrato tintura de Mikania laevigata
demonstrou uma diferença significativa em relação ao grupo extrato tintura sem
Ultrassom terapêutico e carbopol sem Ultrassom terapêutico.
Através destes achados o Ultrassom terapêutico com a Mikania Laevigata
diminui o acúmulo de formas oxidadas de proteína, como também inibiu a sua
habilidade de degradar proteínas em sua forma oxidada, dados estes que vão de
encontro com trabalhos realizados em nosso laboratório (GOMES, 2007; FREITAS
et al.; 2006).
42
Figura 8 - Efeitos do Ultrassom e do gel extrato tintura de Mikania laevigata
em relação à sulfidrila.
A figura 8 demonstra a quantidade de grupos sulfidrila sobre as feridas
cutâneas nos 3 grupos, onde os animais foram tratados com gel de carbopol sem a
utilização de Ultrassom terapêutico, o uso tópico de gel extrato tintura de Mikania
laevigata e gel extrato tintura de Mikania laevigata associado ao ultrassom
terapêutico.
A figura demonstra que em relação à sulfidrila, o gel extrato tintura de
Mikania laevigata sem a utilização do ultrassom terapêutico apresentou uma
diferença significativa em relação ao grupo carbopol sem Ultrassom. Com este
resultado constatou-se que a utilização do Ultrassom terapêutico não protegeu de
maneira efetiva o dano oxidativo no processo cicatricial. Também pode-se observar
que o uso tópico do gel extrato tintura de Mikania laevigata protegeu efetivamente o
dano oxidativo da ferida.
43
5 CONCLUSÃO
A
cicatrização
de
feridas
é
um
evento
complexo
que
ocorre
espontaneamente, sem intervenções externas, mas que, quando tratada através de
artifícios, tende a ocorrer de forma mais rápida e com melhores resultados funcionais
e estéticos. O Ultrassom terapêutico é uma dessas técnicas que colaboram com
esses resultados e a sua prática opcional é cada vez mais freqüente.
Novas pesquisas sobre a utilização da fonoforese nos processos
cicatriciais estão sendo realizadas, mas poucos estudos comparam o efeito do uso
tópico e da fonoforese de um fármaco específico. O estudo de Koeke (2003)
comparou a eficácia da fonoforese e da aplicação tópica de Hidrocortisona no reparo
tecidual de tendão de rato, mas não foram encontrados os mesmos testes realizados
em feridas epiteliais abertas.
No presente estudo, foram encontrados resultados que demonstram que
a fonoforese com a utilização do antiinflamatório Mikania Laevigata não acelerou de
maneira significativa o processo de cicatrização epitelial, apenas foi constatado uma
tendência ao aumento da cicatrização epitelial no quinto e décimo dias.
O gel extrato tintura de Mikania laevigata associado ao ultrassom
terapêutico não demonstrou de modo significativo à eficácia na resolução da ferida
operatória conforme figuras 5 e 8.
A utilização do extrato tintura diminuiu o estresse oxidativo quando
associado ao Ultrassom terapêutico, mas tal dado não se refletiu quando analisados
a sulfidrila, a qual indica a modificação estrutural da proteína e a perda de
importantes propriedades biológicas, conforme figura 8.
De acordo com os resultados, mesmo não sendo significativos na
evolução do tamanho da ferida e em relação à sulfidrila, conclui-se que a técnica
ideal para acelerar o processo cicatricial do tecido epitelial é a utilização do
Ultrassom terapêutico associado ao gel extrato tintura de Mikania laevigata.
O
modelo
animal
é
importante
para
as
futuras
investigações,
particularmente porque através dele, várias patologias estão sendo estudadas e
progressos têm sido alcançados para amenizar a enfermidade da população.
44
6 PERSPECTIVAS
As perspectivas propostas estarão sendo realizadas, na especialização,
com um modelo de estudo semelhante, no laboratório de Fisiopatologia
Experimental da UNESC (FISIOPAT).
•
Teste cometa, marcador de dano ao DNA;
•
A atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase, catalase e
glutationa peroxidase;
•
A produção de superóxido mitocondrial;
•
A atividade dos complexos I, II, III e IV da cadeia respiratória mitocondrial;
•
A
atividade
da
citrato
sintase,
isocitrato
desidrogenase
desidrogenase, enzimas reguladoras do ciclo de Krebs;
•
Medida de hidroxiprolina, para avaliar a quantidade de colágeno;
e
malato
45
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