análise fitoquímica e avaliação biológica de

Anais do IX Seminário de Iniciação Científica, VI Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação
e Semana Nacional de Ciência e Tecnologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
19 a 21 de outubro de 2011
ESTUDO FITOQUÍMICO E BIOLÓGICO DA RAÍZ DA CAEASALPINIA
PULCHERRIMA (FABACEAE) VARIAÇÃO DE COR VERMELHO-AMARELO
Marcos Danilo Borges Carvalhedo1, Maísa Borges Costa1, Luciana Machado Ramos1.
Universidade Estadual de Goiás – Unidade Universitária de Ciências Exatas e
Tecnológicas (UnUCET), 75110-390, Brasil
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[email protected]
Palavras-chave: Caesalpinia pulcherrima, barba-de-barata, Fabaceae.
1 Introdução
O uso de produtos naturais em busca de alívio e cura de doenças pela ingestão de folhas,
frutos, ervas e chá se dá desde tempos remotos, e talvez possa ser uma das primeiras fontes de
fármacos utilizados pelo homem como produtos naturais (BARREIRO, 2006).
Esse recurso foi bastante utilizado pela civilização como medicamentos e também para
auxílio e controle de pragas com inseticidas e veneno, destacando-se para o uso desses produtos
pelo povo oriental como, por exemplo, os chineses que desenvolveram de tal maneira e
eficiência sua medicina natural até hoje. Muitos medicamentos preparados pela sua medicina
popular são estudados a fim de descobrir suas ações e isolar princípios ativos dessas plantas
(BARREIRO, 2006).
O Brasil detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta não pode abrir
mão deste tipo de pesquisa com plantas para a extração e desenvolvimento de novos produtos
farmacêuticos, sendo que a química de produtos naturais é uma das linhas de pesquisas mais
antigas da química brasileira (BOLZANI, 2002).
Várias pesquisas vêm sendo desenvolvidas aproveitando esse recurso abundante no
Brasil, algumas instituições na área de plantas medicinais, vem utilizando plantas da flora
brasileira para fins terapêuticos com o auxílio da medicina popular, essas pesquisas tem como
objetivo principal a fabricação de fármacos a partir dessas plantas que possuem eventuais
compostos com princípios ativos, que futuramente serão usados para síntese de fármacos
(FILHO, 1999).
Esse crescente interesse por essa área de produtos naturais tem sido pelo fato de projetos
serem financiados por órgão públicos e privados. Nos anos 70 nenhuma das grandes empresas
farmacêuticas mundiais desenvolvia esse tipo de programa com essa linha de raciocínio.
Atualmente, tem sido prioridade para maiorias delas, isso se da ao fato da comprovada
eficiência de substâncias de origem vegetal (RODRIGUES, 2006).
Uma família que se destaca bastante em relação à atividade biológica ativa é a família das
Fabaceae, compreende o terceiro maior grupo da angiospermas com 19.325 espécies e dividida
em três subfamílias, Caesalpinioideae, Mimosoideae e Papilionoideae sendo que os três grupos
são extremamente diversos em morfologia (JUCHUM, 2007).
Economicamente para o homem esse grupo se destaca bastante por contribuir com
gêneros, alimentícios, medicinais, madeireiras, ornamentais, produtoras de fibras e óleos. Outra
característica também particular dessa família é a contribuição com a agricultura, já que essas
plantas são boas fixadoras de nitrogênio no solo. Esse comportamento é devido à simbiose em
suas raízes com rizóbios que permite a fixação do nitrogênio atmosférico (JUCHUM, 2007).
A C. pulcherrima é uma planta pouco estudada, mesmo sendo bastante utilizada na
medicina popular, alguns estudos anteriores sobre esta planta levou a identificação e isolamento
de vários metabólitos com atividade biológica acentuada como diterpenóides, flavonóides
chalconas entre outros (BISWANATH, 2009).
Caesalpinia pulcherrima Swartz (Fabaceae), também conhecida como flamboyazinho
ou barba de barata é uma planta ornamental, da família das leguminosas, originária da Índia e
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América central (VIEGAS, 2006). Na índia, estudos farmacológicos revelaram que a espécie
apresenta várias propriedades medicinais, das quais se destacam o uso no tratamento contra
úlcera, tumores, dermatites, emenagoga, disenteria, diversas infecções, além da ação abortiva
(PINTO, 2002). No Brasil, há poucas pesquisas científicas relacionadas com esta espécie. Este
trabalho teve por objetivo promover um estudo fitoquímico (CUNHA, 2005), da flor (variação
de cor amarela) da C. pulcherrima, a partir de extratos e frações.
Neste trabalho foram feitos diversos testes Fitoquímicos na tentativa em descobrir
novos metabólitos secundários diferente dos relatados na literatura. Também foram realizados
testes de letalidade com Artemias salinas a fim de estabelecer a toxicidade dos extratos.
Os testes de toxicidade com Artemia são ensaios biológicos rápidos de baixo custo e são
realizados sem a necessidade de utilizar equipamentos sofisticados (LIEBERMANN, 1999).
Estudos que envolvem compostos com alguma potencialidade biológica, são de fundamental
importância que se realize ensaios de letalidade o qual permitirá avaliar sua toxicidade
preliminar (DUSMANN, 2003). O ensaio com camarão marinho é uma ferramenta muito útil no
isolamento de compostos bioativos em extratos de plantas (KRISHNARAJU, 2005).
O fato de os testes de toxicidade ser realizados com Artemia salina deve-se a relação
feita por outros trabalhos já publicados da toxicidade sobre esta espécie de microcrustáceo com
atividades como antifúngica, antiviral, antimicrobiana, parasiticida, antitumoral entre outras
(DUSMANN, 2003).
Ensaios de letalidade com Artemia salina definem valores da dose letal média (DL50)
em µg/mL de compostos ou extratos, sendo que dezenas de substâncias ativas conhecidas
apresentam toxicidade ao realizar este teste (MEYER, 1982). A atividade é Considerada
significativa quando a estimação do valor da DL50 é menor que 1000 µg/mL (KRISHNARAJU,
2005).
A atividade biológica preliminar dos extratos no TAS são classificadas conforme os
seguintes critérios baseados nos níveis de DL50 em Artemia salina: DL50 ‹80 μg/ mL, altamente
tóxicos; entre 80 μg/ mL e 250 μg/ mL, moderadamente tóxico; e DL50 ›250 μg/ mL, com baixa
toxicidade ou não tóxico (KRISHNARAJU, 2005).
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 Materiais e reagentes utilizados
* Materiais cromatográficos:
Cromatofolhas de Alumínio de sílica gel 60 F254 MERCK, Sílica gel 60 (230 – 400 Mesh)
MERCK e Solventes P.A.
* Equipamentos
Evaporador rotativo (Quimis); Bomba à vácuo (Solab); Balança analítica (Gehaka); Estufa
(Solotest); Banho-maria (Marconi aparelho para laboratório), Câmara escura UV (CIENLAB).
2.2 Material botânico
A raiz da Caesalpinia pulcherrima foi colhida em um terreno residencial em Goiânia. A
chave (número 580.12) da planta foi realizada pela Agrônoma Juliana Machado Ramos.
2.2.1 Separação, Secagem e Moagem
Após a coleta, as raízes foram secas em temperatura ambiente longe da incidência da luz
solar. Com o material seco, o mesmo foi triturado com auxílio de um liquidificador doméstico.
A extração foi realizada a frio via maceração evitando a formação de artefatos.
2.2.2 Obtenção dos extratos brutos
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Após maceração, os extratos foram obtidos a partir de extração não-contínua com
solventes de diferentes polaridades, tais como etanol, clorofórmio e butanol, e, em seguida,
rotaevaporados em balões previamente tarados. Obtiveram-se os Extratos Brutos Etanólicos
(EBE), Extratos Brutos Butanóliocs (EBB) e Extratos Brutos Clorofórmicos (EBCl) da raíz da
planta.
2.2.3 Partição dos Extratos Brutos Etanólicos e Butanólicos
A partição é uma das metodologias que se baseiam no fracionamento de extratos com
solventes de polaridade crescente (LEITE, 2001).
Os extratos etanólico e butanólico foram particionados em extração líquido-líquido
descontínua com Hexano, Diclorometano e Acetato de Etila, obtendo-se, assim, as Frações
Hexânicas (F. Hx), Frações Diclorometânicas (F. DCM) e Frações de Acetato de Etila (F.
AcOET) dos Extratos Brutos Etanólicos das folhas e flores de C. pulcherrima.
2.3 Identificações dos Metabólitos Secundários de C. pulcherrima
A prospecção fitoquímica foi realizada para a identificação dos metabólitos secundários
presentes nos extratos e frações das raízes da C. pulcherrima, baseado no Manual para Análise
Fitoquímica de Extratos Vegetais (Barbosa, 2004).
Foram realizados os seguintes testes: saponina espumídica; ácidos orgânicos; açúcares
redutores; polissacarídeos; proteínas e aminoácidos; fenóis e taninos; flavonoides; alcaloides;
catequinas; sesquiterpenoslactonas e outras lactonas; esteróides e triterpenóides.
2.4 Cromatografia em Placa Preparativa
Os extratos brutos e frações que apresentaram boa separação dos componentes, ou seja,
Fatores de Retenção (Rf) relativamente distantes foram submetidos à Cromatografia Preparativa,
com eluente determinado pelos testes em Cromatografia em Camada Delgada.
As amostras submetidas à cromatografia preparativa foram: EBCl; Fr. Hexânica, e Clorofórmica
(EBB); Fr. Hexânica, Acetato de etila e Clorofórmica (EBE); Fr. Hexânica e Acetato de etila
(EBE); Fr. Hexânica e Fr. Acetato de Etila (EBB).
As placas foram preparadas com aplicação da suspensão de sílica para placas preparativas
MACHEREY- NAGEL e água destilada em placas de vidro de dimensões 20 cm x 20 cm. Após
aplicação, as placas foram ativadas em estufa a 100°C por 1 hora.
Pesaram-se 200 mg de cada amostra, que, em seguida, foram aplicadas nas Placas
Preparativas com ajuda de capilar e eluídas em cuba contida do eluente já definido por CCD.
Após eluição, as placas foram reveladas em Câmara UV com comprimento de onda igual
a 254 nm, raspada conforme revelação e lavada com o respectivo eluente. As frações obtidas,
com Rfs calculados, foram pesadas, submetidas à Cromatografia em Camada Delgada e reunidas
conforme a proximidade do fator de retenção.
3. Resultados e discussões
3.1 Classe de metabólitos secundários identificados
Após realizado os testes descritos acima foram identificados metabólitos secundários
para os extratos brutos e frações. Para o extrato bruto clorofórmico e para as FrH, FrCHCl3 e
FrAcOEt do fracionamento do EBE e do EBB. Em todos os testes qualitativos foram
encontrados os seguintes metabólitos: Saponina espumídica, ácidos orgânicos, açúcares
redutores, fenóis e taninos, flavonóides, flavonóis, flavononas, flavononóis, xantonas,
esteróides, triterpenóides, catequinas e derivados de cumarina.
3.2 Cromatografia em Camada Delgada das Frações Obtidas da Cromatografia em Placas
Preparativas
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Através da realização da CCD foi possível observar as frações com eluição semelhante
para que fossem reunidas.
Logo, todos os produtos obtidos das frações em que se realizou a cromatografia em placas
preparativas foram reunidos, pois apresentaram eluição semelhante.
Todas as frações foram pesadas para que fosse analisado com quais frações seria feito o
bioensaio com Artemia salina e seus Rf’s foram calculados.
3.2 Avaliação citotóxica
A análise de toxicidade dos extratos frente à Artemia salina demonstrou, após o tempo de
24 horas de incubação, a sobrevivência de todos os microcrustáceos no branco, e a mortalidade
da A. salina em alguns extratos, confirmando o potencial biológico dos mesmos. Os dados de
DL50 foram obtidos a partir do cálculo estatístico PROBITO.
Os extratos brutos da flor da C. pulcherrima foram preparados via dissolução em solução
salina de pH variando entre 8,4 e 8,6. Entretanto, extratos foram pouco solúveis, motivo pelo
qual foi adicionado o solvente DMSO, a fim de auxiliar na solubilização destes extratos.
Os dados de DL50 evidenciaram que as frações hexânica (Rf 2 – 34,9788ppm; Rf 3 –
33,0301ppm; Rf 4 – 36,8602 ppm )e clorofórmica (Rf 3 – 37,9040 ppm) do EBE, as frações
hexânica (Rf 1 - 159,4928ppm; Rf 2 – 77,6113 ppm; Rf 3 – 104,5485 ppm) e clorofórmica (Rf
1,2,3,4 – 65,41217 ppm) do EBB e a fração hexânica do EBCl (Rf 4,5 – 11,2070 ppm)
apresentaram atividade frente à Artemia salina.
Empregando outro critério de classificação dos extratos com base nos níveis de CL 50, a
saber: CL50 < 80 μg/ mL, altamente tóxicos; entre 80 μg/ mL e 250 μg/ mL, moderadamente
tóxico; e CL50 > 250 μg/ mL, com baixa toxicidade ou não tóxico (PEREIRA, 2006)
São necessários estudos de maior precisão para que seja possível elucidar qual o tipo de
atividade biológica, ou as possíveis estruturas químicas dos agentes responsáveis por tais
atividades.
4. Conclusões
A prospecção fitoquímica realizada com o extrato bruto Hexânico, Clorofórmico e
Etanólico da flor da Caesalpinia pulcherrima, revelou a presença apenas de esteróides. Porém, a
aplicação de técnicas de identificação pode ser empregada afim de que a estruturas desses
compostos sejam elucidadas.
Das frações obtidas da raiz da planta estudada, foi observada que algumas possuíam
atividade citotóxica referente ao bioensaio de Artemia salina por apresentarem DL50 menor que
1000 μg/mL tendo atividade citotóxica.
Diante desses resultados, observa-se a importância e a necessidade de ser realizado um
estudo aprofundado da espécie C. pulcherrima, visando avaliar outras atividades, isolar e
elucidar os possíveis compostos presentes na planta.
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