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VIROLOGIA Manualdeapoioàs SessõesLaboratoriais Fevereiro,2017 CarlosSinogas www.ensino.uevora.pt/virol ÍNDICE PROCEDIMENTOSDESEGURANÇA..................................................................................................................................................................3 Riscoquímico........................................................................................................................................................................................................3 Riscoradiológico.................................................................................................................................................................................................3 Riscobiológico......................................................................................................................................................................................................3 Regras.......................................................................................................................................................................................................................3 Planeamento..........................................................................................................................................................................................................4 Procedimentosgerais........................................................................................................................................................................................4 REGISTOSERELATÓRIOS....................................................................................................................................................................................5 TécnicaslaboratoriaisbásicasemMicrobiologia/Virologia..................................................................................................................6 Meiosdecultura...................................................................................................................................................................................................6 Esterilização..........................................................................................................................................................................................................7 TubosdeculturaePlacasdePetri...............................................................................................................................................................7 Instrumentosparatransferênciadeculturas.........................................................................................................................................7 Câmarasdecultura.............................................................................................................................................................................................8 Frigorífico...............................................................................................................................................................................................................8 Métodosdeesterilização.......................................................................................................................................................................................9 Esterilizaçãopelocalor.....................................................................................................................................................................................9 Esterilizaçãoporgases...................................................................................................................................................................................10 Radiações.............................................................................................................................................................................................................10 Filtraçãoestéril.................................................................................................................................................................................................10 Desinfectanteseantissépticos....................................................................................................................................................................11 BACTERIÓFAGOS...................................................................................................................................................................................................12 PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS.....................................................................................................................................................................13 PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES..................................................................................................................................................13 CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO..............................................................................................................................................18 CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO-2.......................................................................................................................................20 PREPARAÇÃODESUSPENSÃOVIRALDEALTOTÍTULO...............................................................................................................23 ISOLAMENTODEPLACAVIRAL................................................................................................................................................................26 TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS–FORMAÇÃODEPLACAS...................................................................28 TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS–DILUIÇÃOLIMITE...............................................................................31 CURVADECRESCIMENTODEUMBACTERIÓFAGOLÍTICO.........................................................................................................33 REVELAÇÃODEVÍRUSVEGETAL(TMV)...............................................................................................................................................36 ISOLAMENTODEBACTERIÓFAGOSELVAGEM(trabalhofinalautónomo)...........................................................................38 APÊNDICE–Meiosdecultura(fórmulas)...................................................................................................................................................41 Virologia2016/17 2 PROCEDIMENTOSDESEGURANÇA OtrabalholaboratorialemVirologiaenvolvetrêstiposprincipaisderiscoqueimportaconsiderar.Oriscoquímico,o riscobiológicoeoriscoradiológico.Quasetodosospaísestêmregrasprópriasparaabordarestetipodequestõesque secolocamàexperimentaçãolaboratorial.Tambémoslaboratóriosondeotrabalhosedesenvolveadoptampráticas apropriadasaotipodetrabalhoqueaísedesenvolve. Nãosepretendendodiscutiremdetalheosprocedimentosdesegurançalegalmenteexigíveis,apontam-seapenas algumasregrasgeraisepráticaslaboratoriaisaseradoptadas. Apesardequalquerdostrêsriscosindicadoscolocaremproblemasespeciais,querequeremprecauçõesdetipo diferente,existeumconjuntodeprecauçõeseprocedimentosdesegurançaaplicáveisatodosequedeverãoser observadosnotrabalholaboratorialdoâmbitodaimunologia. Asregrasqueadianteselistamconstituemumquadrogeralnoqualosprocedimentosespecializados,decorrentesdas situaçõesparticularesqueseindicam,deverãoserenquadrados. RISCOQUÍMICO Osprodutosquímicosempreguesnosensaiosbiológicosdistribuem-sepordiversostiposassociadosadiferentes riscosparaooperador.Quandoapropriado,osriscosconhecidosdosreagentesaempregarserãoindicados,devendo entãoseradoptadasasregrasespecíficasmaisaconselhadas,comosejaousodeluvasouóculos,trabalhoemhotte, etc. Aspráticasprevistasnoâmbitodestadisciplinanãofarãousogeneralizadodereagentesperigososoudegranderisco conhecidoparaaSaúdeHumana. RISCORADIOLÓGICO Detodososriscosassociadoscomostrabalhosdevirologia,omaisemotivo,quenãonecessariamenteomaissério,éa radioatividade.Aocontráriodosoutrosreagentesquímicos,oscompostosradioativos,porestefato,nãopodemser vistosesãoisentosdecheiro,nãosemanifestandoosseusefeitosnoimediato.Asregrasparaamanipulaçãode produtosradioativossãobastantemaisrigorosasetornam-semuitomaisrestritivasaotrabalhoadesenvolver.Às exigênciasparamanipulaçãodestesprodutosnotrabalho,acrescemprocedimentosparticularesparaaeliminação dosresíduosemonitorizaçãodaspessoaseambientesenvolvidos. Ostrabalhosaexecutarnoâmbitodestadisciplinanãofarãousodereagentesououtroscompostosradioativos. RISCOBIOLÓGICO Todasasamostrasdeprodutosbiológicosdevemserconsideradaspotencialmenteinfeciosas,emparticularasque sãoprovenientesdoHomem,emqueumaeventualbarreiradeespécienatransmissãodosagentesinfeciososnão existe.Asoutrasespéciesanimaismamíferospotencialmenteusadasnostrabalhoslaboratoriaisnãorepresentam qualquerameaçasignificativaparaaspessoasquetrabalhamnoslaboratórios. Emqualquerdoscasosconvémterpresentequeasprincipaisviasdetransmissãodeinfeçõesocorrememgolpes abertosououtrassoluçõesdecontinuidadenapeledasmãosdooperador,porpicadacomagulhascontaminadasou porinalaçãodeaerossóis.Époristoqueéfortementerecomendadoque,quandosetratedetrabalhodirectocom amostrasbiológicas,nãoexistamgolpesnasmãosdooperadorquenãotenhamsidopreviamenteprotegidose convenientementeimpermeabilizados. Otrabalhoadesenvolvernaspráticasdadisciplinanãofaráusodesorosououtrosmateriaisbiológicosdeorigem humana,casoemqueprecauçõesespeciaisteriamdesertomadasparaminimizaroriscodeassociadoaosagentes infeciosostransmissíveispelosanguehumano,comoosagentesdaSIDAoudasHepatites.Emtodoocaso,ésempre aconselhávelconsiderartodososmateriaisbiológicosaempregarcomopotencialmenteinfeciososparaooperadore adoptaraspráticasmaisadequadasaocenáriodo"piorcaso". AdicionalmenteháqueconsiderarqueotrabalhopráticodecorreránolaboratóriodeMicrobiologia,onde microrganismosdediferentestipossãomanipuladosporoutraspessoas.Apossibilidadedecontaminaçãodas superfícieseoutrosmateriaistambémdeveráserconsiderada. REGRAS Paraalémdosriscosparaooperador,queatrássereferem,asexperiênciasqueserealizarãosãocertamentenovidade paraalgunsdosestudantes,comexperiêncialaboratoriallimitadaerotinasdeboaspráticaslaboratoriaisnão estabelecidas.Importa,porisso,prevenir. Virologia2016/17 3 Éboapráticaobservar,cumprirefazercumprirasregras,procedimentosecomportamentosqueseindicam: Bata Ousodeumabatacomprida,limpaedevidamenteajustadaaocorpoéindispensávelsemprequeseopereem laboratório.Abataprotegeooperadoreoseuvestuáriodeeventuaisacidentes.Idealmenteabatadeveráserusada apenasnolaboratório,sendovestidaàentradaedespidaàsaída.Destaforma,alémdeprotegeroexperimentador,a bataminimizaotransportedepotenciaisagentesinfeciososparaoexteriordolaboratório. Mãos Àentradaeàsaídadolaboratórioéprecisolavarbemasmãoscomabundanteáguaesabão,tambémparaminimizar potenciaiscontaminaçõescruzadas.Dependentedotipodeprodutosamanipular,ousodeluvasimpermeáveis, máscarasououtrasproteções,poderáserexigível.Mesmoquandonormalmentenãorecomendado,ousodeluvas poderásernecessárioemsituaçõesdesoluçãodecontinuidadenapeledasmãosdooperador. Comerebeber Éexpressamenteproibidocomer,beber,fumar,manipularlentesdecontatoouaplicarcosméticosduranteaexecução deexperiênciaslaboratoriais.Usarsemprepipetasmecânicas,nuncapipetarcomaboca.Éaconselháveladquiriro hábitodemanterasmãoslongedaboca. Bancadadetrabalho Olocaldetrabalhodeveráestarsempredevidamentelimpo,paraoqueseimpõeprocederàlimpezadabancadaantes deiniciadosostrabalhos,paranãopermitiracontaminaçãodasprópriasexperiênciascommicrorganismosde sessõesanteriores,edepoisdasmanipulaçõesterminadasparaminimizarapotencialpropagaçãodeagentes infeciososcontaminantesdosmateriaisbiológicoscomqueseoperou. Livrosecadernos Sóépermitidolevarparaabancadaomaterialdeapoioestritamenteindispensávelàexecuçãodotrabalho,comoo protocoloexperimental,umblocodenotasouumcadernoeumlápis.Todososrestantespertencesdooperador, comopastas,casacosousacosdeverãoseracondicionadosemlocalpróprio,antesdeiniciadaaexperimentação. Materiais Todooequipamentoematerialdelaboratórioamovível,utilizadoduranteaexperimentação,deveráserrepostono localindicadodepoisdeconcluídaasuautilização.Particularmenteosmateriaisquetenhamcontatadocomamostras deorigembiológicaouinfeciosadeverãoserrejeitadosemlocalpróprioparadescontaminação. Acidentes Qualqueracidentedeveráserdeimediatoreportadoaoresponsávelpelasessãodetrabalho.Líquidosououtro materialbiológico,inadvertidamentetransferidosparaforadoscontentoresaquesedestinamdeverãoserde imediatodesinfectadoscomoapoiodoresponsável. PLANEAMENTO Nãoiniciarqualquerexperiênciasemoconvenienteplaneamento.Oconhecimentoecompreensãopréviosdos procedimentosexperimentais,grelhasadequadaspararegistodosresultadoseaefetivadisponibilidadedetodosos recursosmateriaisnecessáriosconstituemelementosimportantesparaosucessodasexperiências.Otempo "perdido"numplaneamentoinicialélargamentecompensadopeloníveldaaprendizagemconseguidoepela prevençãodanecessidadederepetiçãodeexperiênciaseventualmentebloqueadas. PROCEDIMENTOSGERAIS Todososprocedimentosdeverãoserefetuadostendoemmenteaminimizaçãodacontaminaçãodomaterialemusoe aformaçãodeaerossóisourespingos,numaperspectivadeproteçãodoprópriooperadoredeterceiros.Mais importantequeumconjuntoderegrasaobedeceréapresençadebomsensonostrabalhosarealizar.Émuito importanteusaracabeçaantesdasmãos. Virologia2016/17 4 REGISTOSERELATÓRIOS Éconvenienteusarumblocooucadernopararegistodetodasasocorrênciasedosresultadosdaexperimentação. Sugere-seousodecadernodelaboratório,depreferênciacomfolhasnãoamovíveis,paraquenãosejameliminadas notasouregistosconsideradosirrelevantesnaaltura,comosucedecomfrequênciaquandosepassamos apontamentos"alimpo",masdegrandeutilidadeparaconsultafuturanaelaboraçãodorelatóriofinalouparaa eventualrepetiçãodaexperiência.Origorepormenordosregistosefetuadosduranteaexecuçãodotrabalho experimentalfacilitarãoaaprendizagemeainterpretaçãodosresultadosobtidos,emespecialquandoestessão inesperados. Umqualquerrelatóriodeumaexperiêncialaboratorialdeverádocumentardeformatãocompletaquantopossívelo procedimentoexecutadoeosresultadosobtidos.Paraalémdissodeverásertambémobjetivodorelatorredigirum documentocompreensívelparaoleitoresusceptíveldeapoiaraeventualrepetiçãodamesmaexperiênciaem idênticascondições.Paraaelaboraçãodosrelatóriossugerem-se,comoorientação,asseguintesseções: Título Identificadordoconteúdodorelatório Resumo Pequenotextodequeconstemosobjetivosalmejadoseasconclusões obtidas Objetivo Razãodeserdotrabalhorealizado Introdução Dadosconhecidosquejustificamarealizaçãodaexperiênciarelatada Palavras-chave Termosdiretamenterelacionadoscomotrabalho Materialereagentes Listagemexaustivadoequipamento,reagenteseoutromaterialusado Protocolo experimental Marchageraldosprocedimentosaplicados.Deverãoserrelatadosos procedimentosconcretosexecutados,comreferênciaaeventuaisdesvios relativamenteaoprocedimentorecomendado/descrito Resultados Registodasobservaçõesefetuadasedosdadosrecolhidos Discussão Comentáriocríticoaosresultadosobtidos Conclusão Descriçãodocumprimentoouincumprimentodoobjetivo,decorrentedos resultadosobtidos Notacrítica Comentárioàglobalidadedaexperiência,comrecomendaçõesparaasua repetiçãoououtrasconsideradasadequadas Bibliografia Referênciasconsultadasouutilizadasparaarealizaçãodotrabalho Dependentedotipodotrabalhoexecutado,daformadorelatórioedasensibilidadedorelator, algumasdasseçõesdescritaspoderãoserfundidas,como"Resultadosediscussão"ou"Discussãoe conclusões",porexemplo Virologia2016/17 5 TÉCNICASLABORATORIAISBÁSICASEMMICROBIOLOGIA/VIROLOGIA Osmicrorganismossãoubíquos.Podemencontrar-senosolo,noar,naágua,nacomida,nosesgotosenassuperfícies corporais,entreoutroslocais.Ouseja,existemportodooladoànossavolta,onossoambienteestárepletode microrganismos.Paraestudarqualquertipodemicrorganismoénecessáriosepararestaspopulaçõesmistas,de formaamanipularnolaboratórioaschamadasculturaspuras,culturasdeumaúnicaestirpe.Nocasoparticulardos estudosemvirologia,emqueosvírusprecisamde"meiosdeculturavivos",énecessáriodispordeculturaspurasdas célulashospedeirasparaapropagaçãodeculturaspurasdeestirpesvirais. Paraisolareestudarosvíruseosmicrorganismosemculturapura,oexperimentadornecessitadealguns equipamentoslaboratoriaisbásicosedaaplicaçãodetécnicasespecíficasusandomateriaisparticulares.Naspráticas queaplicaremosnodecursodestadisciplina,emqueestudaremosvírusinfeciososparabactérias(bacteriófagos),terse-áderecorreràstécnicasbasedemicrobiologia/bacteriologiacomutilizaçãodosequipamentosemateriais específicosqueseindicam: Equipamento Materiais Autoclaveedispositivosdefiltraçãoestéril Ansaseagulhas.Pipetasemicropipetas Banhosdeáguaeestufas Frigorífico Fluxolaminar(conveniente) Águadestiladadequalidade Meiosdecultura(bactérias) Líquido Semissólido Sólido Tubosparacultura PlacasdePetri MEIOSDECULTURA Umadascaraterísticasexclusivasdosvírus,queosdiferenciamdosrestantesseresvivos,residenasuanecessidade deinfectarcélulasvivasparasepropagarem.Osubstratoparaocrescimentodosvírusé,assim,umacélula hospedeira.Osmeiosdeculturanecessáriosaotrabalhoemvirologiarespeitamàscélulasinfectadaspelosvírusem estudo. Asobrevivênciaeosuportedevidadosmicrorganismosdependemdofornecimentoadequadodenutrientese convenientescondiçõesparaoseucrescimento.Quantoaosnutrientes,grandepartedosmicrorganismosapenas necessitamdesubstânciasolúveisdebaixopesomolecular,usualmenteoriginadaspeladegradaçãoenzimáticade outrosnutrientesmaiscomplexos.Umasoluçãocontendoestesnutrientesédesignadacomomeiodecultura.Em geral,osmeiosdeculturasãolíquidos,semissólidosousólidos.Ummeiolíquidosemagentesolidificanteédesignado porcaldonutritivo.Umcaldonutritivosuplementadocomumagentesolidificante,usualmenteoagar,originaum meiosólidoousemissólido.Oagaréumextratodealgasmarinhas,umcarbo-hidratocomplexoquecontem maioritariamentegalactoseepossuimuitopoucovalornutritivo.Oagarémuitoadequadocomoagentesolidificante porqueseliquefazacercade100ºCesolidificaa40ºC.Devidoaestaspropriedades,osmicrorganismos,emespecial ospatogénicos,podemsercultivadosatemperaturasdaordemdos37ºCsemreceiosdeliquefaçãodomeio solidificado.Ummeiodeculturabemsolidificadoexigeumaconcentraçãodeagardaordemdos1,5a1,8%.Uma concentraçãoinferiora1%resultanummeiosemissólido. Agrandevantagemeutilidadedosmeiossólidosesemissólidosemestudosdevirologiaresidemnofatodeascélulas hospedeiraspoderemserimobilizadas,mantendoasuaviabilidade,edeaspartículasviraisveremreduzidaasua capacidadededifusãonomeio.Talcomoparaoisolamentodecolóniasdebactériasnasuperfíciedoagar,também nosmeiossólidosesemissólidossepodemisolarindividualmenteasestirpesviraisempresença. Paraalémdasnecessidadesnutritivas,váriosoutrosfatoresambientaisprecisamdesercontroladosparaosucesso daculturadosmicrorganismosedesuportedasinfeçõesvirais,comosejamopH,atemperatura,oambientegasoso ouapressãoosmótica. Umoutroaspectorelevantedas"culturasdevírus"relaciona-secomasquantidadesrelativasdevírusecélulas hospedeirasnoiníciodainfeçãoedacapacidadedoshospedeirosparasuportarapropagaçãoviral.Istoimplica,com frequência,dispordecélulasemfasedecrescimentoexponencialparaqueainfeçãoviralpossaocorrercomsucesso. Virologia2016/17 6 ESTERILIZAÇÃO Aesterilizaçãoéumdospontos-chaveparaosucessodotrabalhoemvirologia.Paratrabalharemcondiçõesde esterilidadeéfundamentalousodematerialestérileaaplicaçãodetécnicasadequadas.Aesterilizaçãoéprocesso peloqualsãoeliminadastodasasformasdevidadequalquermeiooumaterial.Asprincipaistécnicasparaa esterilizaçãoderotinaemlaboratóriosãoasseguintes: Calor Filtração Produtos químicos Calorseco(arquente) 160ºCa180ºCdurante1/2horaa3horas Materialdevidroemvazio Calorhúmido(vapor) Circulaçãodevapora100ºC.Esterilizaçãointermitente(soluçõestermo-lábeis) Autoclave.Vaporsobpressão,temperaturasacimados100ºC(meiosdecultura,soluçõestermoestáveis) Membranasfiltrantescomporosde0,05µma0.8µm Remoçãodemicrorganismosdesoluçõestermo-lábeisporfiltração Óxidodeetileno Materialdeplástico Beta-propiolactona Tecidosvivos,materiaisbiológicos TUBOSDECULTURAEPLACASDEPETRI TubosdeensaioemvidroeplacasdePetriemvidroeplásticoconstituemosprincipaissuportesparao desenvolvimentodasculturasdemicrorganismosquesuportamapropagaçãodosbacteriófagosautilizar.Ummeio nutritivoadequadonaformadecaldonutritivooudeagaréusadoemtubosdeensaio,enquantonasplacasdePetri apenasseusameiosólido.Umambienteestérilépreservadonostubosdeculturaporváriostiposdetampas. Historicamenteéorolhãodealgodãohidrófobo,desenvolvidoporSchroederevonDuschnoséculodezanove.Hoje emdia,amaiorpartedoslaboratóriosusamtampasemformademanga,emmetalouplásticoresistenteaocalor.A vantagemdestastampasresidenofatodenãoexigiremtantotrabalhonasuapreparaçãoeseremmaisfacilmente removidasereintroduzidasnostubosduranteamanipulação. AsplacasdePetridisponibilizamumamaiorsuperfícieparaculturaecrescimentodosmicrorganismos.São compostasporumabasecircularinferior,ondeécolocadoomeioeporumatampadomesmoformatoeligeiramente maiorqueseencaixanabase.ExistemplacasdePetrideváriasdimensõesparadiferentesexigênciaslaboratoriais.Na rotinasãousadasplacasdecercade10cmdediâmetro.Omeionutritivoestéril,contendoagar,numvolumede15a 20mLévertidonasplacasquandoaindaquenteapósfusãodoagaredeixadoarrefeceratemperaturainferiora40ºC. Depoisdeinoculadascomosmicrorganismosasplacassãoincubadasemposiçãoinvertidaparaevitarqueasgotasde condensação,formadasnatampaduranteoarrefecimentodoagar,caiamsobreasuperfíciedoagar. Aimobilizaçãodasbactériaseadificuldadededifusãodaspartículasviraisnosmeiossólidosassociadosàpequena espessuradosuportepermiteidentificareisolarbacteriófagosindividuais,comoseveránodecursodotrabalho experimental. INSTRUMENTOSPARATRANSFERÊNCIADECULTURAS Existeanecessidadedetransferirosmicrorganismosdeummeiodeculturaparaoutros,desdeculturasde armazenamentoemanutençãoparaculturasdeanálise,paraoisolamentodefagosouparaasuaexpansãoemmassa. Éoprocessodesubculturaquetemdenecessariamenteserefetuadocomtécnicaestérilparaevitarpotenciais contaminaçõesdassubculturas. Asansaseagulhas,usualmentefabricadascommetaisinertescomoaplatinaeinseridasemcabosprópriosparaa manipulação,sãoinstrumentosmuitoduráveisdefácilutilização.Sãofacilmenteesterilizáveisnomomentodasua utilizaçãoporincineraçãoàchama,numaposiçãoquaseverticalatéometalficaraorubro.Importarádepoisdeixar arrefecerentre10a20segundos,foradachama,masnasuaproximidade,ondeacargademicrorganismos ambientaisviáveiséinferior.Depoisdearrefecidos,paranãoinativarosmicrorganismosatransferir,podemser usadaspara"picar"umaculturasólidaoulíquidaeinocularoutromeio.Umavezesterilizada,aansadeveráserde imediatoutilizadaantesdeserdenovocolocadanabancada. Aspipetassãooutrosdosinstrumentosdetransferênciadeculturasdeusomuitogeneralizado.Sãocalibradase permitematransferênciadequantidadesdeculturaslíquidaspreestabelecidas.Sãodevidroouplástico,comuma extremidadeafiladaeoutraparaaaspiraçãoeexpulsãodolíquidoquecontenham.Podemseresterilizadasporcalor Virologia2016/17 7 secoouhúmido,conformeotipodematerialdequesãoconstituídas.Apesardetradicionalmentesereminstrumentos para"pipetaràboca"éproibidousarabocaparaaspirarmicrorganismos.Existemauxiliaresmecânicosdisponíveis paraoefeito,comoperasdeborrachaoucorposdeseringaqueseadaptamnaextremidadelargadapipeta. AspipetasPasteur,tubosdevidronãograduadoscomumadasextremidadesafiladassãotambémdeusomuito frequenteemestudosdevirologia,tambémpelasuafacilidadedeesterilizaçãoextemporânea. CÂMARASDECULTURA Dascondiçõesparacrescimentodosmicrorganismos,umadasmaisrelevanteséasuatemperaturaóptimade crescimento.Asestufassãousadasparaamanutençãodatemperaturaóptimadosmicrorganismosemcrescimento duranteoperíododecultura.Sãocâmarasemqueatemperaturaambienteinteriorécontroladaportermóstato,para queamesmasejamantidadentrodelimitesapropriadosparaocrescimentocelular.Usamemgeralumsistemade circulaçãodearaquecidoe,paraevitaradesidrataçãodosmeiosemincubação,deverãocontertambémumafontede vapordeágua(umrecipientecomáguanoseuinterior,quandonãovenhampreparadasparaoefeitodeorigem). Osbanhosdeágua(banho-maria)comáguaatemperaturacontroladaportermóstatoconstituemoutrodos instrumentosfrequentementeempreguesparaacriaçãodascondiçõesdetemperaturaóptimadecrescimentodos microrganismos.Oíntimocontatodaáguaatemperaturacontroladacomorecipienteondecrescemos microrganismosapresentaavantagemdepermitirumamaisrápidaeeficaztransferênciadocalor.Alémdisso,os banhoscomagitaçãofacilitamtambémoarejamentodasculturas,degrandeimportânciaparaocrescimentodos microrganismosaeróbios.Adesvantagemdobanhodeáguaresidenofatodesópoderserusadoparaasculturasem meiolíquido,aocontráriodasestufasdear,queservemtantoparaculturasemmeiolíquidocomoemmeiosólido. Osvírusporquesópodemcresceremcélulasqueestejamemcrescimentorequerem,naturalmente,omesmotipode câmarasdeculturausadasparaosrespectivoshospedeiros. FRIGORÍFICO Ofrigoríficoéoutradaspeçasfundamentaisemlaboratóriodevirologia.Oambientedebaixatemperaturaque disponibilizaédamaiorrelevânciaparaamanutençãoearmazenamentodasculturascelularesemfasedenão crescimentoentreosperíodosdesubcultura,paraamanutençãodassuspensõesviraiseparaaconservaçãodos meiosesterilizadoseoutrosreagentes.Tambémassoluçõesecompostostermo-lábeistêmperíodosdeconservação maisalargadosquandoarmazenadosabaixastemperaturas. Virologia2016/17 8 MÉTODOSDEESTERILIZAÇÃO Esterilizaçãoéumprocessoqueeliminatodososorganismosvivosqueseencontremàsuperfícieounointeriorde ummaterial,podendoseralcançadopelaexposiçãodomaterialaagentesletaisfísicosouquímicosou,nocasodos líquidos,pelaseparaçãomecânicadosorganismosatravésdefiltrações.Existemmuitasformasdeesterilizar materiaisemeios,easuaescolhadependedanaturezadosmateriaisaseremesterilizadosbemcomoda disponibilidadedemeiosdetrabalho. Anoçãodeesterilidade(estéril=infecundo)encontra-sefrequentementeassociadaaduasoutras:adeassepsia (ausênciadesepsis=putrefação)eadedesinfeção(livrardainfeção).Estessignificadosliteraiscorrespondem,de fato,àsnoçõestécnicasdestasterminologias.Emmicrobiologiareferimo-nosaesterilizaçãoquandosepretende impedirapropagaçãodemicrorganismos;aassepsiaquandosepretendetrabalharemambientedesprovidode microrganismoseadesinfeçãoquandoseaplicamtécnicasdestinadasaeliminarmicrorganismospotencialmente patogénicosparaooperador.Aformadeeliminaçãodainfecciosidadeviraldependedascaraterísticasdovírusem causa. Destasnoções,aadquirirnoexercíciodaexperimentaçãoquesedesenvolveránadisciplina,importaconsiderarem particularastécnicasqueseutilizamemmicrobiologiaparaaeliminaçãodemicrorganismosviáveis:aesterilização. ESTERILIZAÇÃOPELOCALOR A.CalorHúmido Oaparelhomaisusadoparaesterilizarmateriaisemeiosdeculturaéaautoclave.Asautoclavestrabalhamà semelhançadepanelasdepressãodomésticas.Asautoclavesdelaboratóriooperamnormalmentesobumapressãode 1,02Baraumatemperaturade121ºC.Aautoclaveesterilizaamaioriadosmateriaisem15-30minutos,sendoa variaçãodotempodeesterilizaçãodevidaàrelaçãosuperfície/volumedosmateriaisaseremesterilizados. Aspectosdaesterilizaçãoporvapor-pressão Temperatura Osendoesporosdasbactériassãoasformasdevidamaisresistentesaocalor,easuadestruiçãopodeserconseguida seforaplicadovaporsobrepressão.Umatemperaturade121ºCofereceumaboamargemdesegurançasefor mantidaduranteumespaçodetempoapropriado. Humidade Acoagulaçãodoprotoplasmabacterianoemtemperaturasmoderadasrequerhumidadeehámedidaqueestaé removidaatemperaturanecessáriaparahavercoagulaçãoaumentarapidamente.Seovaporforsobreaquecidoficará mais"seco"oqueocasionaumaumentodatemperaturaedotempodeexposiçãoparaaesterilização,quenasituação extremadeesterilizaçãoemcalorsecoseráde170ºCduranteumahora.Emconclusão,vaporexcessivamentequente perdealgumadasuaeficáciacomoagenteletalparaalémdepoderserlesivoparaosmateriaisaseremtratados. Pressão Apressão,nosvaloresusadosnaautoclave,porsisónãoexercequalquerefeitonaesterilização,sendoútilpara elevaratemperaturadovaporacimados100°C. Tempo Otempoénecessárioparaqueovaportenhaaoportunidadedepenetrareaquecerosmateriaisaseremesterilizados. Mesmoquandoastemperaturasdeesterilizaçãosãoatingidas,osagentesviraisoumicrobianosnãosãotodosmortos deumavez.Avelocidadedemorteéumaconstanteaumadadatemperaturaeporcadaunidadedetempode exposiçãoaoagenteletal,umaproporçãoqueéconstanteparaumadadapopulação.Normalmentedemora11a12 minutosa121°C(calorhúmido)paramatarosendoesporosdasbactériastermofílicas,osagentesmaisresistentes nasmanipulaçõesdodia-a-dia. Purga Oarrelativamentefrionacâmaradeesterilizaçãoémuitomaispesadoqueovaporàtemperaturadeesterilização.Se nãoforpermitidaasaídadoarcria-seumaestratificaçãonaautoclavequeconduzaumafaltadeuniformizaçãodas temperaturasdesenvolvidas.Umavezqueoareovaporsãolentosamisturarem-se,asdiferençasdetemperatura entrecamadaspodesermuitogrande,porissoanecessidadedesesubstituirtodooarporvapor(purga). Virologia2016/17 9 Natureza do carregamento Geralmente,osmateriaismaisvolumososrequeremummaiortempodeesterilização,sendopreferívelesterilizar pequenosvolumesdecadavez,porexemploépreferívelesterilizar5balõesdelitrodecadavezdoqueesterilizar apenasumbalãocomcincolitros.Osfrascosdevemsertapadoscomalgodãooupapel.Sefornecessáriousartampas roscadas,devemirpoucoapertadasparaaautoclavedemodoapermitiremasaídadeareentradadevapor, evitando-seassimorebentamentodefrascosnaautoclave. B.Calorseco Ocalorsecoéusadoparaesterilizarmaterialdevidro,outrosmateriaissólidostermoestáveisealgunscomponentes demeiosoualimentosqueficariamimprópriosseexpostosaovapor.Trata-setambémdeumdosmétodosde esterilizaçãomaisusadosedemuitofácilaplicação.Oequipamentoindispensáveléapenasumaestufadealta temperatura(160–200ºC).Paraalémdeterdesertidaemcontaaresistênciatérmicadosmateriaisaesterilizarpor estatécnica,aoutraprecauçãoaconsiderarprende-secomaminimizaçãodapossibilidadedecontaminaresses materiaisdepoisdaesterilização. ESTERILIZAÇÃOPORGASES Orecenteincrementodousodematerialdeplásticodeutilizaçãoúnica("disposable")comoseringas,caixasdePetri, tubosdecultura,filtros,etc.,levouaodesenvolvimentodeumanovaformadeesterilizaçãoqueusagasestóxicospara aeliminaçãodosmicrorganismosdemateriaistermo-sensíveis.Aaplicaçãodestatécnicarequerautilizaçãode equipamentosprópriosqueforcemacirculaçãodogástóxicoatravésdetodasassuperfíciesdosmateriais,oquea tornadedifícilutilizaçãoemlaboratóriosdetiponãoindustrial. Oóxidodeetilenoéogásusadocommaiorfrequêncianestetipodeesterilizações.Estegás,aocontráriodemuitos produtosquímicostóxicos,époucocorrosivoenãoalteraosmateriaisaseremesterilizados,sendofacilmente removidoporarejamento.Assuasdesvantagensincluemanecessidadedelongosperíodosdeexposiçãoparaseobter aesterilização(váriashoras),areatividadecomcomponentesdosmeiosecertostiposdeplásticoseanecessidadede equipamentosprópriosedisponibilidadedogás,comosereferiu. RADIAÇÕES Algunsprocessoscomerciaisusamasradiaçõesparaaesterilizaçãoafriodecertosmateriaiscomoprodutos farmacêuticos,porexemplo.Airradiaçãoéousoderadiaçõesionizantesdealtaenergiaqueincluemraiosgama produzidosapartirdecobalto-60oucésio-139ederaioscatódicosproduzidosemgeradoreseaceleradoresde electrões. Airradiaçãocomluzultravioletanãoéumaformamuitosatisfatóriadeesterilizaçãodadaasuafracacapacidadede penetraçãonosmateriaiseprodutosaesterilizar.É,contudo,deutilizaçãofrequentenadiminuiçãodonívelde contaminaçãodeespaçosconfinados,comosalasestéreisoupequenosambientes,sendoparticularmenteúteis tambémparaareduçãodainfecciosidadeviraldevidoàsalteraçõesinduzidasnomaterialgenéticodaspartículas viraisexpostas. FILTRAÇÃOESTÉRIL Oprincipalmétodoparaaesterilizaçãodelíquidosquecontenhamcomponentestermo-sensíveistaiscomovitaminas, proteínasséricaseantibióticos,porexemplo,éafiltração.Tradicionalmenteosmicrobiologistasesterilizavamestes produtosrecorrendoafiltrosfeitosapartirdeterradediatomáceasefibrasdeasbesto,previamenteesterilizadosem autoclave.Presentementeestesfiltrosforamsubstituídosporfiltrosdeacetatodeceluloseoupolicarbonatosnos quaisostiposdeporosdesenvolvidospermitemfiltraçõescomelevadosgrausdeprecisão.Existematualmente disponíveisnomercadofiltrosesterilizantesdeváriosporosecapacidadesfiltrantes.Osmaisfrequentese,porisso, maisacessíveissãofiltrosdeporosde0,45µmou0,2µmdediâmetro,queretêmosmicrorganismospresentesnas soluções. Paraesterilizarumasoluçãoporfiltração,nãohámaisquepassaressasoluçãoatravésdeumdestesfiltrospela aplicaçãodeumapressãopositivanolíquidoafiltrar(filtrosdeseringa,porexemplo)ounararefaçãodoarno contentorquerecebeofiltrado.Emqualquerdoscasosestatécnicarequerarecolhadofiltradoemcondiçõesde assepsiaparaimpediracontaminaçãodolíquidoesterilizado. Virologia2016/17 10 Salvorarasexceções,afiltraçãoestérilnãoretémaspartículasvirais.Nãopodendoserconsideradocomométodode "esterilizaçãodevírus".Afiltraçãoestérilémesmoumatécnicafrequentementeusadaemvirologiaparaapurificação desuspensõesviraispelaeliminaçãodebactériaspotencialmentecontaminantes. DESINFECTANTESEANTISSÉPTICOS Múltiplosreagentesquímicossãodiariamenteutilizadosparacontrolodadisseminaçãodemicrorganismos.Os produtosusadosna"limpeza"deutensíliosdiversos,frequentementedemasiadotóxicosparaserusadosdiretamente noHomem,sãochamadosdedesinfectantes.Osprodutosqueaplicamosnapele,comomesmoobjetivodeeliminar eventuaismicrorganismos,sãoantissépticos. Particularmenteeficazemuitoútilnolaboratório,paraeliminaçãodevírusemicrorganismoséasoluçãode hipocloritodesódio(lixívia)comquesetratamosmateriaisdelaboratórioapósexposiçãoaagentesinfeciosos. Virologia2016/17 11 BACTERIÓFAGOS Osvírusdiferemdasbactériasporseremmuitomaispequenos,deconstituiçãonãocelulareparasitasintracelulares. Adicionalmentenãosãocapazesdecresceremmeiosdeculturanãovivos.Apesardissoépossívelestudá-losno laboratório,detectandoasuapresençapelosefeitosqueprovocamnascélulasqueinfectam. Existemvíruscomespecificidadeparadiversostiposdecélulas,tantoeucarióticascomoprocarióticas.Aestrita dependênciadecélulashospedeirasdeve-seàsuaincapacidadeparasintetizarasenzimasnecessáriasaos mecanismosdasuapropagação.Aopenetraremnascélulassãocapazesdeusarasenzimasdohospedeiroemseu próprioproveito. Oestudosdevírusqueparasitamcélulasvegetaisouanimaisexigerecursosespecíficosparaculturadetecidos,sendo estastécnicasemgeraldemasiadodemoradasparaexecuçãoemaulaspráticasdonívelqueaquisepretendem desenvolver.Paraalémdissoeapesardaespecificidadeparacertoshospedeirosautilizaçãodevírusdeeucariotas exigecuidadosdecontençãobiológicabastanteapertados. Osvírusqueparasitamasbactérias,osbacteriófagosousimplesmentefagossãodemaisfácilmanipulação,exigema aplicaçãodetécnicasgeraisdemicrobiologia,menosdemoradasporviadasrápidastaxasdecrescimentodas bactériasusadas.Oscuidadosparaoconfinamentobiológicodasexperiênciastambémnãoprecisadesertão apertadocomoparaousodevíruseucarióticos. Quandoumfagoinfectaumabactériareceptivaumadeduascoisasacontecerá:aliseoualisogeniadabactéria. QuandoocorrealiseometabolismodabactériaéreorientadoparaasíntesedoDNAgenómicodovírusedas proteínasparaproduziraspartículasfágicasmaduras.Usadoomaterialcelulardisponível,acélularebentaeliberta osviriõesmaduros,capazesdereinfectarnovasbactériasqueencontrem. Osbacteriófagosqueprovocamalisedabactériasãochamadosdevirulentosoulíticos.Quandoainfeçãonãoconduz àmortedabactéria,estabelece-seentreestaeovírusumrelacionamentodesignadoporlisogeniaeofagoé denominadodetemperadooulisogénico.NestescasosoDNAdofagoéintegradonocromossomadabactériaeesta crescenormalmente.Ocasionalmenteumadestasbactériasentraemciclolíticoelibertaviriõescapazesdeinfetar outrascélulas. Aevidênciavisualdalisedeumabactériaéconseguidapelaculturadabactériaemmeiosólido,emcamadauniforme einfeçãodealgumascélulascomobacteriófago.Acamadadebactérias,naturalmenteopaca,apresentacírculosclaros correspondentesaoslocaisemqueumfagoinfetouedestruiuapopulaçãodecélulasvizinhas.Sãoasplacasvirais. Noscasosdefagoslisogénicos,comosóalgumasdasbactériasentramemciclolítico,estasplacassãotranslúcidas. Virologia2016/17 12 PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES Introdução Origornasdiluiçõesaefetuarcomalgunsmateriaisbiológicosereagentes,nocontextodeváriosdostrabalhos experimentaisqueaquiseincluem,écríticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados. Porqueseobservacomfrequênciaalgumainabilidadeinicialdosestudantesparaamanipulaçãoadequadadas micropipetas,paraumraciocíniooperacionalsobrediluições(emespecialquandoexpressasempotênciasde10)e nasformasdeprepararsoluçõestituladas,introduz-seestetrabalhopreliminar. Materialereagentes ¾ Soluçãosaturadadeazul-de-metileno ¾ Águadestilada ¾ Micropipetasdiversas ¾ Microtubos ¾ Espectrofotómetro Procedimento(porgrupo) Diluiçõesdecimais 1. 2. Marquemicrotubosde1a8 Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais: Tubo Solvente(mL) Corante(mL) Soluçãoprecedente(mL) Diluição(10x) 1 0 1,5 0 2 1,35 0,15 0 3 1,35 0 0,15 4 1,35 0 0,15 5 1,35 0 0,15 6 1,35 0 0,15 7 1,35 0 0,15 8 1,5 0 0 3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo. 4. Verifiqueosvolumesrelativoseregisteasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos 5. Determineaabsorvênciadassoluçõesa600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,namesma cuvete.Últimaamostra:controlo). Diluiçõescentesimal 1. Marquetubosdeensaiode1a6 2. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais: Tubo 1 2 3 4 5 6 Solvente(µL) 0 1500 1500 1500 1500 1500 Corante(µL) 1500 15 0 0 0 0 Soluçãoprecedente(µL) 0 0 15 15 15 0 Diluição(10x) 3. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo. 4. Verifiqueosvolumesrelativoseregisteasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos 5. Determineaabsorvênciadassoluçõesdostuboscomnúmeropara600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamais concentrada,namesmacuvete.Últimaamostra:controlo) Virologia2016/17 13 Diluiçõesdetrêsemtrês 6. Marquetubosdeensaiode1a10) 7. Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Solvente(mL) 0 1 1 1 1 1 1 1 1 Corante(mL) 1,5 0,5 0 0 0 0 0 0 0 Soluçãoprecedente(mL) 0 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Diluição(10x) 8. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo. 9. Registeasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos 10 1,5 0 0 10. Determineaabsorvênciadassoluçõesdostuboscomnúmeropara600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamais concentrada,namesmacuvete) Diluiçãoúnica(TPC) ¾ Considerandosotrabalhosanteriores,desenheumprotocoloparaarealizaçãodetesteadiluiçõesmilesimais. ¾ Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenofaçaoscálculosparaprocederàpreparaçãode5mLdecada umadasseguintessoluções,indicandoosvolumesausar: a. Diluiçãode5x102 b. Diluiçãode5x10-2 Preparaçãodesoluções(TPC) ¾ Pretendendo-seobter100mLdecadaumadassoluçõesqueselistam,indiqueasquantidadesdeprodutosa misturarparaasuapreparaçãonolaboratório: a. NaOH0,1N b. SO4H20,1N c. NaCl0,1M d. NaCl100mM e. Glicerol10%(fórmulaC3H8O3) f. Glucose10%(fórmulaC6H12O6) g. Etanol70%(fórmulaC2H6O2) Pesosatómicos:H=1;C=12;O=16;Na=23;S=32;Cl=35. Virologia2016/17 14 RegistodeobservaçõeseResultados PIPETAGENSEDILUIÇÕES Operador: Data: ____/____/____ Diluiçõesdecimais Tubo Amostra DO600nm/mL Concentraçãocalculada Observações 1 2 3 4 5 6 Tubo Amostra DO600nm/mL Concentraçãocalculada Observações 1 2 3 4 5 6 Tubo Amostra DO600nm/mL Concentraçãocalculada Observações 1 2 3 4 5 6 Diluiçõescentesimais Diluiçõesúnicas Diluiçõesdetrêsemtrês Amostra DO600nm/mL Concentraçãocalculada Observações 5x102 5x10-2 Virologia2016/17 15 Gráficos Notas: SOLUÇÕES Virologia2016/17 16 Operador: Data: ____/____/____ Componentes NaOH0,1N (100mL) Peso/volume Componentes SO4H20,1N (100mL) Peso/volume Componentes NaCl0,1M(100 mL) Peso/volume Componentes NaCl100mM (100mL) Peso/volume Componentes Glicerol10% (100mL) Peso/volume Componentes Glucose10% (100mL) Peso/volume Componentes Etanol70% (100mL) Peso/volume Notas: Virologia2016/17 17 CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO Introdução Comosesabe,asbactériasmultiplicam-seporprocessosdefissãobinária.Umabactériaemcrescimentometaboliza osnutrientesdisponíveisnomeio,aumentaoseutamanhoedivide-seemduas.Otempoparaumabactériasereplicar eformardoisindivíduoséotempodegeração,caraterísticodaestirpenascondiçõesdeculturaaplicadas. Umvírusparasepropagarprecisadeinfectarumhospedeirometabolicamenteativoparapoderutilizarosseus mecanismosdereplicaçãodogenomaedesíntesedasproteínasviraisconstitutivasdosviriões. Particularmentenosbacteriófagoslíticos,oseuestudoimpõeautilizaçãodebactériashospedeirasemfasede crescimento.Importa,porisso,conheceroperfildascurvasdecrescimentodestasbactériasparadeterminaro momentoemqueainfeçãocomovírusdeveráserdesencadeada. Nestetrabalhodeterminar-se-áexperimentalmenteacurvadecrescimentodeumabactériaE.coliautilizarno desenvolvimentodostrabalhossubsequentes. Materialereagentesespecíficos ¾ CulturarecentedeE.coli(ATCC25250)emmeionutritivo(culturadediaanterior) ¾ Sorofisiológicoestéril ¾ PlacasdePetricomagarnutritivo ¾ Tubosdeensaio,contendo5mLdeagarnutritivosemissólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC ¾ Tubosdeensaioesterilizados(10mLmínimo) ¾ Tubosdecentrífugaesterilizados(cercade10mL) ¾ PipetasPasteuresterilizadas ¾ Microtuboseppendorfesterilizados ¾ Micropipetas(200e1000)erespectivaspontasesterilizadas ¾ Espectrofotómetrodovisível(600nm) Procedimento(porgrupo) 1. AvaliaraDO600nmdasuspensãobacterianafornecida 2. Inocular100mLdemeionutritivo,previamenteaquecido,comasuspensãobacterianaàconcentraçãofinalde DO600nm=0.05 3. Incubara37ºCembanhooucâmaracomagitação(cercade120rpm) 4. Homogeneizarasuspensão 5. Tomaramostrade4mL.AvaliaraDO600nm(diluircommeiosenecessário) 6. Tomar2X0.1mLdesuspensão 7. Espalharumadasamostrasnasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivo 8. Diluiraoutraamostra1:10eespalhar0.1mLnasuperfíciedeoutraplacadeagarnutritivo 9. Incubarasplacasemestufaa37ºCduranteumanoite 10. Repetirpassos5a10,dehoraahoraatéàsoitohorasdeincubação 11. Observarasplacasdeagarnutritivoecontarascolóniasdesenvolvidas 12. FazergráficoquerelacioneasleiturasdaDOcomotempodeincubação 13. Calcularaconcentraçãodebactérias,determinadapelonúmerodecolóniasreveladas,pormLdecadasuspensão 14. Fazergráficoquerelacioneaconcentraçãodebactériascomotempodeincubação 15. RelacionarasDO600nmdeterminadascomaconcentraçãobacterianadassuspensõesanalisadas Virologia2016/17 18 RegistodeobservaçõeseResultados CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO Operador: Data: ____/____/____ Tempo (horas) DO600nm/mL Bactérias/mL Observações 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Notas: Virologia2016/17 19 CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO-2 Introdução Dadoqueasduashorasdasessãolaboratorialformalnãosãosuficientesparaarealizaçãointegraldacurvade crescimentobacteriano,propõe-searealizaçãodestetrabalhoparailustraraformadeestabelecerumacurvade crescimentoetomarosdadosnecessáriosàprossecuçãodetrabalhosfuturos. Materialereagentesespecíficos (idênticoaanterior) Procedimento(porgrupo) 1. AvaliaraDO600nmdasuspensãobacterianafornecida(culturarecente“overnight”) 2. Inocular20mLdemeionutritivo,previamenteaquecido,comasuspensãobacterianaàconcentraçãofinalde DO600nm=0.05 3. Homogeneizarasuspensão 4. Tomaramostrade2mL.Separar a. 5. AvaliaraDO600nm(diluircommeiosenecessário).Registarvalor Tomar2X0.2mLdesuspensão a. Espalharumadasamostrasnasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivo b. Diluiraoutraamostra1:10(adicionar1,8mLSF)eespalhar0.2mLnasuperfíciedeoutraplacadeagar nutritivo 6. Incubara37ºCemestufacomagitação(cercade120rpm) 7. Repetirpassos3a5demeiaemmeiahora. 8. Continuaraincubaçãodetodasasplacasinoculadasemestufacomagitaçãoa37ºCduranteumanoite 9. Observarasplacasdeagarnutritivoecontarascolóniasdesenvolvidas 10. FazergráficoquerelacioneasleiturasdaDOcomotempodeincubação 11. Calcularaconcentraçãodebactérias,determinadapelonúmerodecolóniasreveladas,pormLdecadasuspensão 12. Fazergráficoquerelacioneaconcentraçãodebactériascomotempodeincubação 13. RelacionarasDO600nmregistadascomaconcentraçãobacterianadassuspensõesanalisadas 14. Calcularaabsorçãoespecíficadaculturabacteriana. Virologia2016/17 20 RegistodeobservaçõeseResultados CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO-2 Operador: Data: ____/____/____ Tempo (minutos) DO600nm/mL Bactérias/mL Observações 0 30 60 90 Notas: Virologia2016/17 21 Gráficos Notas: Virologia2016/17 22 PREPARAÇÃODESUSPENSÃOVIRALDEALTOTÍTULO Introdução Todososvírussãoparasitasintracelularesobrigatóriosesãoincapazesdesepropagaremmeiosnutritivoscomo acontececomgrandenúmerodebactériaseoutrascélulas.Cadatipodevírusrequerumhospedeiroadequadopara sereplicar.Hávírusqueconsegueminfectardiferentestiposdehospedeiroseoutrosdemaiorespecificidadeparaum tipoparticulardecélulas. Porqueosvírusnãopossuemasatividadesenzimáticasnecessáriasàsdiferentesfasesdosseusciclosdereplicação, estãodependentesdaatividademetabólicadohospedeiroparasepropagarem.Acélulainfectadadeveencontrar-se emcrescimentoativocomainerenteproduçãodeenergiaemacromoléculasutilizáveispelovírusaquandodainfeção, paraqueestapossaserprodutiva. Nocasodosbacteriófagos(="comedoresdebactérias"),oshospedeirosnosquaissepodemmultiplicarsãobactérias. Énecessárioqueabactériaseencontreemcrescimentoexponencialparaaefetividadedainfeção.Seocrescimento bacterianonãoéóptimonaalturadainfeção,areplicaçãoviralpoderánãoocorrerousermuitoreduzida. Materialereagentesespecíficos ¾ SuspensãodebacteriófagolíticodeE.coli ¾ Tubosdeensaioesterilizados(10mLmínimo) ¾ CulturarecentedeE.coliemmeionutritivo(fase exponencial) ¾ Tubosdecentrífugaesterilizados(12mL) ¾ ¾ PipetasPasteuresterilizadas Sorofisiológicoestéril ¾ ¾ Microtuboseppendorfesterilizados PlacasdePetricomagarnutritivo ¾ ¾ Tubosdeensaiocontendo5mLdeagarnutritivo semissólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC Micropipetas(200e1000)erespectivaspontas esterilizadas Procedimento NB Cadagrupoexecutaoensaiocomduasdiluiçõesdevírus 1. 2. Identificaromaterialautilizarnotrabalho: a. 2X7Tuboseppendorf(de1a7) b. 7PlacasdePetricomagarnutritivo(de1a7)eidentificar:nomedogrupo,dataeexperiência Nosmicrotubospreparardiluiçõesdecimaisseriadasdaamostradobacteriófagoaamplificar,umaamostranão diluídaeumcontrolonegativo,conformeaoesquema: Tubo# Amostrainicial Diluiçãoanterior Sorofisiológico Diluiçãofinal Virologia2016/17 1 200µL - - 100 2 100µL - 900µL 10-1 3 - 100µL 900µL 10-2 4 - 100µL 900µL 10-3 5 - 100µL 900µL 10-4 6 - 100µL 900µL 10-5 7 - 900µL 0 23 3. Emmicrotuboesterilizadomisturar: a. 0,3mLdeculturabacterianaemcrescimentoexponencial b. 0,1mLdecadadiluiçãodebacteriófago 4. Misturarnovortexeincubarembanho-mariaa37ºCdurante5minutos 5. Adicionaroconteúdoa5mLdeagarsemissólidonoestadolíquidoa50ºC 6. Misturareverterdeimediatonasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivo 7. Homogeneizaredeixarsolidificaràtemperaturaambiente(15a20minutos) 8. Incubaremestufaa37ºCdurante24horas(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte) 9. Repetirpassos3a8paracadadiluição. 10. Observarasplacaseregistarasobservações 11. Escolheraprimeiraculturaquecontenhaasplacasdovírusconfluentes 12. ComauxíliodeumapipetaPasteurdobradaremoveracamadadeagarsemissólidoparatubodecentrífuga 13. Adicionar5mLdesorofisiológicoehomogeneizarporaspiraçãocompipeta 14. Repartirasuspensãopormicrotubos 15. Centrifugar5minutos. a. Repetircentrifugaçãoseosobrenadantenãoestiverlímpido 16. Tomarosobrenadanteeconservaremfrigoríficoa4ºC a. Senecessárioprocederafiltraçãoestéril-0,22nmou0.45nm NB Estaamostraseráafontedevírusparaostrabalhossubsequentes. Cadagruporesponsabiliza-sepeloseumaterial. Virologia2016/17 24 RegistodeobservaçõeseResultados PREPARAÇÃODESUSPENSÃOVIRALDEALTOTÍTULO Operador: Data: ____/____/____ Placa Amostra Observação #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 Notas: Virologia2016/17 25 ISOLAMENTODEPLACAVIRAL Introdução Nostrabalhosdevirologia,emparticularquandosemanipulamagentesresultantesderecolhasdoambiente,nãoé garantidoqueestejapresenteapenasumaespécieviral.Éfrequentenestetipodetrabalhosobservar-seaformação deplacasviraisdecaraterísticasdiferentes(dimensão,transparência,p.ex.)correspondendoaestirpesviraisdetipo diferente. Nestetrabalhopreparar-se-áumasuspensãouniformedevírus,isolandoumtipodosrestantes. Materialereagentesespecíficos ¾ PlacadePetricomplacasviraisisoladas ¾ PipetasPasteuresterilizadas ¾ CulturarecentedeE.coliemmeionutritivo(fase exponencial) ¾ Microtuboseppendorfesterilizados ¾ ¾ Sorofisiológicoestéril Micropipetas(200e1000)erespectivaspontas esterilizadas ¾ CaixasdePetricomagarnutritivo Procedimento 1. DeumacaixadePetricomplacasviraisselecionarumabemisoladaemarcarposiçãonacaixa. 2. CompipetaPasteuraspirarum“plug”deagarcontendoaplacaviralselecionada 3. Transferiro“plug”deagarparadentrode500µLdeSFemmicrotubo 4. Homogeneizarcommicropipetaaspirandoeexpirandoo“plug” 5. Identificaremarcar5X2microtubosecincoplacasdeagarcontendomeionutritivo 6. Nosmicrotubospreparardiluiçõesdecimaisseriadasdaamostradobacteriófago,conformeaoesquema: Tubo# Amostrainicial Diluiçãoanterior Sorofisiológico Diluiçãofinal 1 200µL - - 100 2 100µL - 900µL 10-1 3 - 100µL 900µL 10-2 4 - 100µL 900µL 10-3 5 - 900µL 0 7. Nooutroconjuntodemicrotubosesterilizadosmisturar: a. 0,3mLdeculturabacterianaemcrescimentoexponencial b. 0,1mLdecadadiluiçãodebacteriófago 8. Misturarnovortexeincubarembanho-mariaa37ºCdurante5minutos 9. Transferiratotalidadedoconteúdodecadatuboparaasuperfíciedoagardarespetivacaixa 10. Comespalhador(pipetaPasteurduasvezesdobrada)espalharuniformeecompletamenteatéàabsorção completa. 11. Repetirparatodasasdiluições 12. Incubaremestufaa37ºCdurante24horas(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte) 13. ObservarasplacasdePetrieregistarasobservações a. Ocontrolovalidaoensaio(ausênciadeplacasvirais) b. ObservarcaixadePetricomplacasviraisisoladaseregistarpresençaounãodeplacasdetipos diferentes Virologia2016/17 26 RegistodeobservaçõeseResultados ISOLAMENTODEPLACAVIRAL Operador: Data: ____/____/____ Placa Amostra Observação(existênciadeplacasviraisdetiposdiferentes) #1 #2 #3 #4 #5 Notas: Virologia2016/17 27 TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS –FORMAÇÃODEPLACAS Introdução Diversastécnicasemvirologiarequeremoconhecimentopreliminardaconcentraçãoviraldassuspensõesausar. Importaconheceronúmerodeunidadesinfeciosasporunidadedevolumedasuspensão. Emcadaciclodeumainfeçãocombacteriófagolítico,cadabactériainfectadaproduzváriaspartículasviraisquese libertamparaomeioexteriornasequênciadamortedohospedeiro.Cadaumadestaspartículasviraisterácapacidade parainfectarumanovabactériaaqueseligue. Quandoainfeçãoocorreemmeiosemissólido,aspartículasviraisqueselibertamapenaspodeminfectarasbactérias vizinhasdevidoàsuadifusãoretardadapelomeiogelificado.Porcadabactériainicialmenteinfectadaobservar-se-á, apósculturaadequada,umespaçonaculturaconfluentedebactérias,correspondenteaoslocaisemqueasbactérias foramdestruídaspelosvírus(placadelise). Aconcentraçãodevírusnasuspensãooriginal,determinadapelonúmerodeunidadesformadorasdeplacas(pfu, plaque-formingunits),podesercalculadausandoaseguintefórmula: Concentraçãoviral= Númerototaldeplacasvirais VolumeusadoXFatordediluição Materialereagentesespecíficos ¾ SuspensãodebacteriófagolíticodeE.coli(T4)preparadonotrabalhoanterior ¾ CulturarecentedeE.coliemmeionutritivo(diaanterior) ¾ Sorofisiológicoestéril ¾ PlacasdePetricomagarnutritivo ¾ Tubosdeensaiocontendo5mLdeagarnutritivosemissólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC ¾ Tubosdeensaioesterilizados(10mLmínimo) ¾ Microtuboseppendorfesterilizados ¾ Micropipetas(200e1000)erespectivaspontasesterilizadas Virologia2016/17 28 Procedimento 1. Emmicrotubosestéreis,identificadosde1a9,prepararasseguintesdiluiçõesdecimaisdofago: Tubo# 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Amostrainicial 100µL - - - - - - - - Diluiçãoanterior - 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL 100µL - Sorofisiológico 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL 900µL Diluiçãofinal 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 Controlo 2. 3. Emmicrotuboesterilizadomisturar: a. 0,3mLdeculturabacterianaemcrescimentoexponencial b. 0,1mLdecadadiluiçãodebacteriófago c. Misturarnovortexeincubarembanho-mariaa37ºCdurante5minutos Adicionaratotalidadedoconteúdoa5mLdeagarsemissólidonoestadolíquidoa50ºC a. Misturareverterdeimediatonasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivo b. Homogeneizaredeixarsolidificaràtemperaturaambiente(15a20minutos) c. Incubaremestufaa37ºCdurante24horas(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte) 4. ObservarasplacasdePetriecontaronúmerodeplacasviraisemtrêsplacasdePetriconsecutivascomplacas viraiscontáveis a. Registarasobservaçõeseosresultados. 5. Calcularotítulodasuspensãoinicialempfu/mLparacadadiluiçãoavaliada a. Estabelecerotítulodasuspensãoviralinicialpormédiadosvaloresencontrados Virologia2016/17 29 RegistodeobservaçõeseResultados TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS–FORMAÇÃODEPLACAS Operador: Data: ____/____/____ Placa Amostra Númerodeplacas contadas Títulodasuspensão inicial Observações #X #X+1 #X+2 Média Notas: Virologia2016/17 30 TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS –DILUIÇÃOLIMITE Introdução Inoculandodiversasculturaslíquidasdebactériashospedeirascomdiluiçõescrescentesdasuspensãoviralem estudo,atinge-seumpontoapartirdoqualnãomaisépossíveldetectarpartículasvirais.Determinandoadiluiçãoda suspensãoqueaindacontempelomenosumapartículaviralépossívelcalcularaconcentraçãodasuspensãoinicial. Materialereagentesespecíficos ¾ SuspensãodebacteriófagolíticodeE.coli(T4) ¾ CulturarecentedeE.coliemmeionutritivo(diaanterior) ¾ Sorofisiológicoestéril ¾ Tubosdeculturacontendo5mLdeagarnutritivolíquido ¾ Microtuboseppendorfesterilizados ¾ Micropipetas(200e1000)erespectivaspontasesterilizadas Procedimento 1. Emmicrotubosestéreis,identificadosde1a12,prepararasseguintesdiluiçõesdecimais: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Tubo# 150 100 - - - - - - - - - Amostrainicial(µL) - 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Diluiçãoanterior(µL) - 900 900 900 900 900 900 900 900 900 900 Sorofisiológico(µL) Diluiçãofinal 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 12 - - 900 cont rolo 2. 3. Emmicrotuboesterilizadomisturar: a. 0,3mLdeculturabacterianaemcrescimentoexponencial b. 0,1mLdecadadiluiçãodebacteriófago c. Misturarnovortexeincubarembanho-mariaa37ºCdurante5minutos Marcaradequadamenteostubosdeensaiocontendo5mLdemeiodeculturalíquido a. Inocularcadatubocomatotalidadedecadasuspensãobacterianainfectada. b. Misturarnovortex. c. Incubarembanho-mariacomagitação(ouemincubadoracomagitação)a37ºCdurante24horas (conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte) 4. Observaraturvaçãodasculturas 5. Calcularotítulodasuspensãoinicial a. a. Registarasobservações Compararcriticamentecomotítulocalculadopelatécnicadeformaçãodeplacas Virologia2016/17 31 RegistodeobservaçõeseResultados TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS–DILUIÇÃOLIMITE Operador: Data: ____/____/____ Tubo Amostra Turvação(+/-) Observações #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 Títulodasuspensãoviralinicial: Notas: Virologia2016/17 32 CURVADECRESCIMENTODEUMBACTERIÓFAGOLÍTICO Introdução Oaspectotípicodeumacurvadecrescimentodebactériasmostraumcrescimentoconstantedonúmerode indivíduosnafaseexponencial,quedecorreduranteumdeterminadoperíododetempocorrespondenteagerações sucessivasdeindivíduos.Poresgotamentodosnutrientesnomeiooupelodesenvolvimentodeoutrascondições adversas(pH,acumulaçãodeprodutostóxicos,etc.),ocrescimentobacterianoéinibido. Areplicaçãodeumvíruslíticonabactériadesenvolve-senumúnicopassoconducenteàmortedohospedeiroe libertaçãodosfagosparaomeioenvolvente.Estefenómenoqueocorrenumaúnicacélulainfectadapodeser demonstradonumapopulaçãodemicrorganismossetodososindivíduosforeminfectadosaomesmotempo. Amultiplicidadedeinfeção–MOI(multiplicityofinfection)éumconceitoquerelacionaonúmerodepartículasvirais infeciosasusadasparainfetarumdeterminadonúmerodecélulashospedeiras.UmaMOIde1.0correspondeauma situaçãodeumapartículaviralinfeciosaporcélula. Nestetrabalhodetermina-seoperfildecrescimentodeumbacteriófagolítico. Materialereagentesespecíficos ¾ SuspensãodebacteriófagolíticodeE.coli(T4)preparadonotrabalhoanterior ¾ CulturarecentedeE.coli(ATCC25250)emmeionutritivo(diaanterior) ¾ Sorofisiológicoestéril ¾ PlacasdePetricomagarnutritivo ¾ Tubosdeensaiocontendo5mLdeagarnutritivosemissólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC ¾ Tubosdecentrífuga(10mLmínimo),Microtuboseppendorf,Micropipetas(200e1000)epontasesterilizadas Procedimento(culturadevírus) 1. Inocularfrascoerlenmeyerscontendo50mLdemeionutritivocom2mLdeculturabacterianarecente. 2. Incubara37ºC,sobagitação,atécrescimentoexponencial(Oprocessodemoraentre3a5horasatéqueacultura comeceaduplicarasuadensidade–crescimentoexponencial.Faceàslimitaçõesdetempodeduraçãodeuma aulaprática,usaremalternativaumaculturadebactériasdodiaanterior). 3. AvaliaraDOdasuspensãobacteriana 4. Avaliaraquantidadedebactériasexistentesem10mldesuspensão 5. Tomar10mLdeculturaparacadaumdedoistubosdecentrífugaestéreis(Tubos1e2) 6. AdicionarsuspensãoviralsuficienteparaatingirumaMOIde5a10notubo1 7. AdicionarigualvolumedemeiodeculturaLBaotubo2 8. Incubar37ºCdurante5minutos 9. Centrifugar1500rpmX5minutos.Decantarossobrenadantesparatubosestéreis 10. Preservarsobrenadantedetubo1econservara4ºC 11. Conservarosedimentobacterianosecoa4ºCparaaaulaseguinte(Necessárioporfaltadetemponaaula) 12. Ressuspenderosedimentodecadatubocom20mLdemeiodeculturapré-aquecido. 13. TransferirasuspensãodecadatuboparafrascosErlenmeyer 14. Incubara37ºCsobagitação 15. Tomarassepticamenteasamostrasseguintesaotempo0(zero): a. b. Daculturabacterianainoculadacomvírus(tubo1): i. Amostrade1mLdesuspensão.LeraDO600.Registarleitura. ii. Amostrade0,5mLdesuspensão.Conservara4ºC Daculturabacteriananãoinoculadacomvírus(tubo2): i. Amostrade1mLdesuspensão.LeraDO600.Registarleitura. 16. Repetirpasso15decada15minutosatéaofimdaaula Virologia2016/17 33 Procedimento(revelação) 1. Materialbiológiconecessárioconservadoa4ºC: a. Sobrenadantedaculturainicialdosvírus b. Umaamostradesuspensãobacterianadetempo0(zero) c. Umaamostradesuspensãobacterianadecadatemporecolhido 2. Faceàquantidadedevírusebactériasinicialmenteutilizadoscalcularasdiluiçõesafazerparacadacaso 3. Procederàdiluiçãodecadaamostraaestudardeacordocomoseguinteesquemaeemfunçãodadiluição máximanecessária: Tubo# Sorofisiológico Sobrenadante(sessãoanterior) Diluiçãoanterior 1 900µL 100µL - 2 900µL - 100µL 2 900µL - 100µL 2 900µL - 100µL 2 900µL - 100µL ... 900µL - 100µL N 900µL - - 4. Selecionardecadaamostraastrêsdiluiçõesparainocularnasbactérias 5. Emeppendorfsesterilizados: a. 300µLdesuspensãobacterianarecente b. 100µLdadiluiçãodasuspensãoviralemestudo c. Homogeneizar 6. Repetirpasso5paratodasasamostrasatestar 7. Incubarostubosa37ºCdurante5minutos 8. Pipetaratotalidadedoconteúdodecadaeppendorfparatubodeensaiocontendoagarsemissólidoliquefeitoe aquecidoa50ºC 9. Rolarotuboentreasmãosparahomogeneizar 10. Verterdeimediatonasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivopreviamentemarcada 11. Homogeneizaredeixarsolidificaràtemperaturaambiente(15a20minutos) 12. Incubaremestufaa37ºCdurante24horas(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte) 13. Repetirprocedimentosde8a12paratodasasamostrasselecionadas. 14. ObservarasplacasdePetriecontaronúmerodeplacasvirais 15. Registarasobservaçõeseosresultados 16. CalcularamédiadonúmerodepartículasviraispormLdecadasobrenadanteinicial 17. Prepararacurvadecrescimentodobacteriófago. 18. Determinaroperíododeexplosão(burstsize) Virologia2016/17 34 RegistodeobservaçõeseResultados CURVADECRESCIMENTODEUMBACTERIÓFAGOLÍTICO Operador: Data: Sobrenadante ____/____/____ Amostra Contagensdeplacasvirais (Diluições) Tempode infeção Inicial - 0 PlacadePetriX-1 PlacadePetriX PlacadePetriX+1 (____________) 1 (____________) 2 (____________) 3 (____________) 4 (____________) 5 (____________) 6 (____________) Notas: Virologia2016/17 35 REVELAÇÃODEVÍRUSVEGETAL(TMV) Introdução OTMV(TobaccoMosaicVírus)éumvírussimpleshelicoidal,degenomaaRNAdecadeiasimplesqueinfectaas plantasdotabacoedotomateiroalémdeoutrostiposdeplantas.Foioprimeirovírusaseridentificado,purificadoe cristalizadoeédosvírusmaisestudados.Ainfeçãoviralcausalesõeslocalizadasnasfolhas,dando-lhesumaspecto heterogéneo(mosaico),podendotambémcausarinfeçãosistémicasetransmitidoàplantainteira.Devidoàexistência deumaparedecelularrígida(celulósica)nascélulasvegetais,ainfeçãosópodeestabelecer-sequandoocorrerotura nessaparede,napresençadovírusinfecioso. Nestetrabalhopretende-sepesquisarapresençadeTMVemprodutoscomerciaisdetabacoporabrasãodasfolhasda planta. Materialereagentesespecíficos ¾ Vasoscomplantasdotabacoemcrescimento(1porgrupo) ¾ Produtosdetabacocomerciais(cigarros,charutos,tabacodecachimbo),dediferentesfabricantes. ¾ Almofarizepistão ¾ Sorofisiológico ¾ Areiafina ¾ Algodãoesterilizado(bolas) Procedimento 1. Identificarovasodecadagrupo 2. Pendurarumapequenaetiquetaemcadaumdedoisramosdaplanta,marcadascomcontroloeteste 3. “Pisar”umaporçãodetabaco(umcigarrodesfeito)noalmofarizcomumapequenaporçãodesorofisiológico 4. Aspergirsorofisiológiconumadasfolhasdoramomarcadocomocontrolo. 5. Espelharumapequenaporçãodeareiamuitofinasobreafolhamolhada 6. Embeberumaboladealgodãocomsorofisiológico 7. Esfregarligeiramenteafolhadaplantacomoalgodão 8. Repetirospassos4.e5.numafolhadoramomarcadocomoteste 9. Embeberumaboladealgodãocomomaceradodetabacopreparado 10. Esfregarligeiramenteafolhadaplantacomoalgodão 11. Cuidardamanutençãodaplanta 12. Observarsemanalmenteasfolhasutilizadasnoensaio 13. Registarasobservaçõesefetuadas Virologia2016/17 36 RegistodeobservaçõeseResultados REVELAÇÃODEVÍRUSVEGETAL(TMV) Operador: Data: ____/____/____ Observações Data Folhacontrolo Folhateste Conclusão: Notas: Virologia2016/17 37 ISOLAMENTODEBACTERIÓFAGOSELVAGEM(TRABALHOFINALAUTÓNOMO) Introdução Comoparasitasintracelularesobrigatórios,osvírusencontrar-se-ãonosmesmosecossistemasnaturaisondese desenvolvemosseushospedeiros. Oscoliformessãobactériasqueseencontramemgrandesquantidadesnotratointestinaldosmamíferos,peloqueé deesperarencontrarbacteriófagosdeE.colinamatériafecalnãotratadaoueminsectosqueapovoem. ÉobjetivodestaexperiênciademonstrarapresençadefagoslíticosdeE.coli,emdejetosdemamíferosecapacitaros estudantesparaarealizaçãodeumtrabalhoautónomoemVirologia. Materialereagentesespecíficos ¾ Matériafecal,maceradodemoscas,etc. ¾ Estufadeincubaçãoa37ºC ¾ MeiodeculturaTYG(1%triptona;0.5% extratodelevedura;0,2%glucose) ¾ Sorofisiológicoestéril ¾ ¾ PlacasdePetricomagaremTYG CulturarecentedeE.coli(JF335)emmeioTYG (diaanterior) ¾ ¾ Tubosdeensaiocontendo5mLdeagarnutritivo semi-sólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC CulturarecentedeE.coli(JF417)emmeioTYG (diaanterior) ¾ Tubosdeensaioesterilizados(10mLmínimo) ¾ Banho-mariaa50ºCea42ºC ¾ Microtuboseppendorfesterilizados ¾ Micropipetas(200e1000)erespectivaspontas esterilizadas Procedimentosugerido Enriquecimento 1. Tomar“umanoz”dematériafecal,50mLdefluidorecolhidodoesgotonãotratado(doméstico,deexploração pecuáriaououtro)ouumadúziademoscasdomésticas.1 2. Homogeneizaremaceraromaterialsólidoem25mLdesorofisiológico. Tomaramostradecercade25mLdemateriallíquidooupastoso 3. Centrifugar5000rpmX10minutos.Recuperarsobrenadante. 4. Repetircentrifugaçãoatésobrenadantelímpido. 5. A20mLdesuspensãolímpidaadicionar: 6. a. 2,5mLdeLB10Xconcentrado b. 2,5mLdeculturadeE.colirecente Incubara37ºCdurante24horas(guardarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte,senecessário) Clarificação 1. Centrifugar20mLdesuspensãoa5000rpmX10minutos.Recuperarosobrenadante 2. Repetiracentrifugaçãoatéàclarificaçãodosobrenadante 3. Esterilizarsobrenadante,porfiltração(usarseringaefiltrode0,22nm)atécolmataçãodofiltro 4. Homogeneizartodasasamostras 5. Conservara4ºC 1 Tratar o material recolhido do esgoto como potencialmente infecioso para o homem. Usar luvas e evitar o contato direto. Virologia2016/17 38 Amplificaçãodevírus Prepararumasuspensãoviraldealtotítulo Isolamentodevírus Seàobservaçãoforevidenteaexistênciadediferentestiposdeplacasvirais(opacidadeedimensões),selecionar apenasumtipoeamplificar Titulação Titularassuspensõesobtidas,tentandoreportaraosníveisdecontaminaçãodomaterialbiológicoinicialmente utilizado. Curvadecrescimentodovírus Estabeleceracurvadecrescimentodovírusisolado. Virologia2016/17 39 RegistodeobservaçõeseResultados ISOLAMENTODEBACTERIÓFAGOSELVAGEM Operador: Data: ____/____/____ Enriquecimento Clarificação Titulação/Isolamento Amplificação Titulaçõesespecíficas Curvadecrescimento Notas: Virologia2016/17 40 APÊNDICE–MEIOSDECULTURA(FÓRMULAS) MeiodeculturaLB(stock) LB10X: Bacto-triptona 100g Extratodelevedura 50g NaCl 100g H2Odestiladaaté 1000mL pH7,5. Autoclavar.Conservarestérila4°C. MeioLBlíquido MeioLB10X Águadestiladaestéril 100mL 900mL Conservarestérila4ºC. AgarLBsemi-sólido MeioLBlíquido 1000mL Agar 7,5g Autoclavar.DistribuirassepticamenteporplacasdePetri.Conservara4ºC. AgarLBnutritivo MeioLBlíquido 1000mL Agar 7,5g Autoclavar.DistribuirassepticamenteporplacasdePetri.Conservara4ºC. CarlosSinogas Virologia2016/17 41
