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VIROLOGIA
Manualdeapoioàs
SessõesLaboratoriais
Fevereiro,2017
CarlosSinogas
www.ensino.uevora.pt/virol
ÍNDICE
PROCEDIMENTOSDESEGURANÇA..................................................................................................................................................................3
Riscoquímico........................................................................................................................................................................................................3
Riscoradiológico.................................................................................................................................................................................................3
Riscobiológico......................................................................................................................................................................................................3
Regras.......................................................................................................................................................................................................................3
Planeamento..........................................................................................................................................................................................................4
Procedimentosgerais........................................................................................................................................................................................4
REGISTOSERELATÓRIOS....................................................................................................................................................................................5
TécnicaslaboratoriaisbásicasemMicrobiologia/Virologia..................................................................................................................6
Meiosdecultura...................................................................................................................................................................................................6
Esterilização..........................................................................................................................................................................................................7
TubosdeculturaePlacasdePetri...............................................................................................................................................................7
Instrumentosparatransferênciadeculturas.........................................................................................................................................7
Câmarasdecultura.............................................................................................................................................................................................8
Frigorífico...............................................................................................................................................................................................................8
Métodosdeesterilização.......................................................................................................................................................................................9
Esterilizaçãopelocalor.....................................................................................................................................................................................9
Esterilizaçãoporgases...................................................................................................................................................................................10
Radiações.............................................................................................................................................................................................................10
Filtraçãoestéril.................................................................................................................................................................................................10
Desinfectanteseantissépticos....................................................................................................................................................................11
BACTERIÓFAGOS...................................................................................................................................................................................................12
PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS.....................................................................................................................................................................13
PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES..................................................................................................................................................13
CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO..............................................................................................................................................18
CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO-2.......................................................................................................................................20
PREPARAÇÃODESUSPENSÃOVIRALDEALTOTÍTULO...............................................................................................................23
ISOLAMENTODEPLACAVIRAL................................................................................................................................................................26
TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS–FORMAÇÃODEPLACAS...................................................................28
TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS–DILUIÇÃOLIMITE...............................................................................31
CURVADECRESCIMENTODEUMBACTERIÓFAGOLÍTICO.........................................................................................................33
REVELAÇÃODEVÍRUSVEGETAL(TMV)...............................................................................................................................................36
ISOLAMENTODEBACTERIÓFAGOSELVAGEM(trabalhofinalautónomo)...........................................................................38
APÊNDICE–Meiosdecultura(fórmulas)...................................................................................................................................................41
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PROCEDIMENTOSDESEGURANÇA
OtrabalholaboratorialemVirologiaenvolvetrêstiposprincipaisderiscoqueimportaconsiderar.Oriscoquímico,o
riscobiológicoeoriscoradiológico.Quasetodosospaísestêmregrasprópriasparaabordarestetipodequestõesque
secolocamàexperimentaçãolaboratorial.Tambémoslaboratóriosondeotrabalhosedesenvolveadoptampráticas
apropriadasaotipodetrabalhoqueaísedesenvolve.
Nãosepretendendodiscutiremdetalheosprocedimentosdesegurançalegalmenteexigíveis,apontam-seapenas
algumasregrasgeraisepráticaslaboratoriaisaseradoptadas.
Apesardequalquerdostrêsriscosindicadoscolocaremproblemasespeciais,querequeremprecauçõesdetipo
diferente,existeumconjuntodeprecauçõeseprocedimentosdesegurançaaplicáveisatodosequedeverãoser
observadosnotrabalholaboratorialdoâmbitodaimunologia.
Asregrasqueadianteselistamconstituemumquadrogeralnoqualosprocedimentosespecializados,decorrentesdas
situaçõesparticularesqueseindicam,deverãoserenquadrados.
RISCOQUÍMICO
Osprodutosquímicosempreguesnosensaiosbiológicosdistribuem-sepordiversostiposassociadosadiferentes
riscosparaooperador.Quandoapropriado,osriscosconhecidosdosreagentesaempregarserãoindicados,devendo
entãoseradoptadasasregrasespecíficasmaisaconselhadas,comosejaousodeluvasouóculos,trabalhoemhotte,
etc.
Aspráticasprevistasnoâmbitodestadisciplinanãofarãousogeneralizadodereagentesperigososoudegranderisco
conhecidoparaaSaúdeHumana.
RISCORADIOLÓGICO
Detodososriscosassociadoscomostrabalhosdevirologia,omaisemotivo,quenãonecessariamenteomaissério,éa
radioatividade.Aocontráriodosoutrosreagentesquímicos,oscompostosradioativos,porestefato,nãopodemser
vistosesãoisentosdecheiro,nãosemanifestandoosseusefeitosnoimediato.Asregrasparaamanipulaçãode
produtosradioativossãobastantemaisrigorosasetornam-semuitomaisrestritivasaotrabalhoadesenvolver.Às
exigênciasparamanipulaçãodestesprodutosnotrabalho,acrescemprocedimentosparticularesparaaeliminação
dosresíduosemonitorizaçãodaspessoaseambientesenvolvidos.
Ostrabalhosaexecutarnoâmbitodestadisciplinanãofarãousodereagentesououtroscompostosradioativos.
RISCOBIOLÓGICO
Todasasamostrasdeprodutosbiológicosdevemserconsideradaspotencialmenteinfeciosas,emparticularasque
sãoprovenientesdoHomem,emqueumaeventualbarreiradeespécienatransmissãodosagentesinfeciososnão
existe.Asoutrasespéciesanimaismamíferospotencialmenteusadasnostrabalhoslaboratoriaisnãorepresentam
qualquerameaçasignificativaparaaspessoasquetrabalhamnoslaboratórios.
Emqualquerdoscasosconvémterpresentequeasprincipaisviasdetransmissãodeinfeçõesocorrememgolpes
abertosououtrassoluçõesdecontinuidadenapeledasmãosdooperador,porpicadacomagulhascontaminadasou
porinalaçãodeaerossóis.Époristoqueéfortementerecomendadoque,quandosetratedetrabalhodirectocom
amostrasbiológicas,nãoexistamgolpesnasmãosdooperadorquenãotenhamsidopreviamenteprotegidose
convenientementeimpermeabilizados.
Otrabalhoadesenvolvernaspráticasdadisciplinanãofaráusodesorosououtrosmateriaisbiológicosdeorigem
humana,casoemqueprecauçõesespeciaisteriamdesertomadasparaminimizaroriscodeassociadoaosagentes
infeciosostransmissíveispelosanguehumano,comoosagentesdaSIDAoudasHepatites.Emtodoocaso,ésempre
aconselhávelconsiderartodososmateriaisbiológicosaempregarcomopotencialmenteinfeciososparaooperadore
adoptaraspráticasmaisadequadasaocenáriodo"piorcaso".
AdicionalmenteháqueconsiderarqueotrabalhopráticodecorreránolaboratóriodeMicrobiologia,onde
microrganismosdediferentestipossãomanipuladosporoutraspessoas.Apossibilidadedecontaminaçãodas
superfícieseoutrosmateriaistambémdeveráserconsiderada.
REGRAS
Paraalémdosriscosparaooperador,queatrássereferem,asexperiênciasqueserealizarãosãocertamentenovidade
paraalgunsdosestudantes,comexperiêncialaboratoriallimitadaerotinasdeboaspráticaslaboratoriaisnão
estabelecidas.Importa,porisso,prevenir.
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Éboapráticaobservar,cumprirefazercumprirasregras,procedimentosecomportamentosqueseindicam:
Bata
Ousodeumabatacomprida,limpaedevidamenteajustadaaocorpoéindispensávelsemprequeseopereem
laboratório.Abataprotegeooperadoreoseuvestuáriodeeventuaisacidentes.Idealmenteabatadeveráserusada
apenasnolaboratório,sendovestidaàentradaedespidaàsaída.Destaforma,alémdeprotegeroexperimentador,a
bataminimizaotransportedepotenciaisagentesinfeciososparaoexteriordolaboratório.
Mãos
Àentradaeàsaídadolaboratórioéprecisolavarbemasmãoscomabundanteáguaesabão,tambémparaminimizar
potenciaiscontaminaçõescruzadas.Dependentedotipodeprodutosamanipular,ousodeluvasimpermeáveis,
máscarasououtrasproteções,poderáserexigível.Mesmoquandonormalmentenãorecomendado,ousodeluvas
poderásernecessárioemsituaçõesdesoluçãodecontinuidadenapeledasmãosdooperador.
Comerebeber
Éexpressamenteproibidocomer,beber,fumar,manipularlentesdecontatoouaplicarcosméticosduranteaexecução
deexperiênciaslaboratoriais.Usarsemprepipetasmecânicas,nuncapipetarcomaboca.Éaconselháveladquiriro
hábitodemanterasmãoslongedaboca.
Bancadadetrabalho
Olocaldetrabalhodeveráestarsempredevidamentelimpo,paraoqueseimpõeprocederàlimpezadabancadaantes
deiniciadosostrabalhos,paranãopermitiracontaminaçãodasprópriasexperiênciascommicrorganismosde
sessõesanteriores,edepoisdasmanipulaçõesterminadasparaminimizarapotencialpropagaçãodeagentes
infeciososcontaminantesdosmateriaisbiológicoscomqueseoperou.
Livrosecadernos
Sóépermitidolevarparaabancadaomaterialdeapoioestritamenteindispensávelàexecuçãodotrabalho,comoo
protocoloexperimental,umblocodenotasouumcadernoeumlápis.Todososrestantespertencesdooperador,
comopastas,casacosousacosdeverãoseracondicionadosemlocalpróprio,antesdeiniciadaaexperimentação.
Materiais
Todooequipamentoematerialdelaboratórioamovível,utilizadoduranteaexperimentação,deveráserrepostono
localindicadodepoisdeconcluídaasuautilização.Particularmenteosmateriaisquetenhamcontatadocomamostras
deorigembiológicaouinfeciosadeverãoserrejeitadosemlocalpróprioparadescontaminação.
Acidentes
Qualqueracidentedeveráserdeimediatoreportadoaoresponsávelpelasessãodetrabalho.Líquidosououtro
materialbiológico,inadvertidamentetransferidosparaforadoscontentoresaquesedestinamdeverãoserde
imediatodesinfectadoscomoapoiodoresponsável.
PLANEAMENTO
Nãoiniciarqualquerexperiênciasemoconvenienteplaneamento.Oconhecimentoecompreensãopréviosdos
procedimentosexperimentais,grelhasadequadaspararegistodosresultadoseaefetivadisponibilidadedetodosos
recursosmateriaisnecessáriosconstituemelementosimportantesparaosucessodasexperiências.Otempo
"perdido"numplaneamentoinicialélargamentecompensadopeloníveldaaprendizagemconseguidoepela
prevençãodanecessidadederepetiçãodeexperiênciaseventualmentebloqueadas.
PROCEDIMENTOSGERAIS
Todososprocedimentosdeverãoserefetuadostendoemmenteaminimizaçãodacontaminaçãodomaterialemusoe
aformaçãodeaerossóisourespingos,numaperspectivadeproteçãodoprópriooperadoredeterceiros.Mais
importantequeumconjuntoderegrasaobedeceréapresençadebomsensonostrabalhosarealizar.Émuito
importanteusaracabeçaantesdasmãos.
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REGISTOSERELATÓRIOS
Éconvenienteusarumblocooucadernopararegistodetodasasocorrênciasedosresultadosdaexperimentação.
Sugere-seousodecadernodelaboratório,depreferênciacomfolhasnãoamovíveis,paraquenãosejameliminadas
notasouregistosconsideradosirrelevantesnaaltura,comosucedecomfrequênciaquandosepassamos
apontamentos"alimpo",masdegrandeutilidadeparaconsultafuturanaelaboraçãodorelatóriofinalouparaa
eventualrepetiçãodaexperiência.Origorepormenordosregistosefetuadosduranteaexecuçãodotrabalho
experimentalfacilitarãoaaprendizagemeainterpretaçãodosresultadosobtidos,emespecialquandoestessão
inesperados.
Umqualquerrelatóriodeumaexperiêncialaboratorialdeverádocumentardeformatãocompletaquantopossívelo
procedimentoexecutadoeosresultadosobtidos.Paraalémdissodeverásertambémobjetivodorelatorredigirum
documentocompreensívelparaoleitoresusceptíveldeapoiaraeventualrepetiçãodamesmaexperiênciaem
idênticascondições.Paraaelaboraçãodosrelatóriossugerem-se,comoorientação,asseguintesseções:
Título
Identificadordoconteúdodorelatório
Resumo
Pequenotextodequeconstemosobjetivosalmejadoseasconclusões
obtidas
Objetivo
Razãodeserdotrabalhorealizado
Introdução
Dadosconhecidosquejustificamarealizaçãodaexperiênciarelatada
Palavras-chave
Termosdiretamenterelacionadoscomotrabalho
Materialereagentes
Listagemexaustivadoequipamento,reagenteseoutromaterialusado
Protocolo
experimental
Marchageraldosprocedimentosaplicados.Deverãoserrelatadosos
procedimentosconcretosexecutados,comreferênciaaeventuaisdesvios
relativamenteaoprocedimentorecomendado/descrito
Resultados
Registodasobservaçõesefetuadasedosdadosrecolhidos
Discussão
Comentáriocríticoaosresultadosobtidos
Conclusão
Descriçãodocumprimentoouincumprimentodoobjetivo,decorrentedos
resultadosobtidos
Notacrítica
Comentárioàglobalidadedaexperiência,comrecomendaçõesparaasua
repetiçãoououtrasconsideradasadequadas
Bibliografia
Referênciasconsultadasouutilizadasparaarealizaçãodotrabalho
Dependentedotipodotrabalhoexecutado,daformadorelatórioedasensibilidadedorelator,
algumasdasseçõesdescritaspoderãoserfundidas,como"Resultadosediscussão"ou"Discussãoe
conclusões",porexemplo
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TÉCNICASLABORATORIAISBÁSICASEMMICROBIOLOGIA/VIROLOGIA
Osmicrorganismossãoubíquos.Podemencontrar-senosolo,noar,naágua,nacomida,nosesgotosenassuperfícies
corporais,entreoutroslocais.Ouseja,existemportodooladoànossavolta,onossoambienteestárepletode
microrganismos.Paraestudarqualquertipodemicrorganismoénecessáriosepararestaspopulaçõesmistas,de
formaamanipularnolaboratórioaschamadasculturaspuras,culturasdeumaúnicaestirpe.Nocasoparticulardos
estudosemvirologia,emqueosvírusprecisamde"meiosdeculturavivos",énecessáriodispordeculturaspurasdas
célulashospedeirasparaapropagaçãodeculturaspurasdeestirpesvirais.
Paraisolareestudarosvíruseosmicrorganismosemculturapura,oexperimentadornecessitadealguns
equipamentoslaboratoriaisbásicosedaaplicaçãodetécnicasespecíficasusandomateriaisparticulares.Naspráticas
queaplicaremosnodecursodestadisciplina,emqueestudaremosvírusinfeciososparabactérias(bacteriófagos),terse-áderecorreràstécnicasbasedemicrobiologia/bacteriologiacomutilizaçãodosequipamentosemateriais
específicosqueseindicam:
Equipamento
Materiais
Autoclaveedispositivosdefiltraçãoestéril
Ansaseagulhas.Pipetasemicropipetas
Banhosdeáguaeestufas
Frigorífico
Fluxolaminar(conveniente)
Águadestiladadequalidade
Meiosdecultura(bactérias)
Líquido
Semissólido
Sólido
Tubosparacultura
PlacasdePetri
MEIOSDECULTURA
Umadascaraterísticasexclusivasdosvírus,queosdiferenciamdosrestantesseresvivos,residenasuanecessidade
deinfectarcélulasvivasparasepropagarem.Osubstratoparaocrescimentodosvírusé,assim,umacélula
hospedeira.Osmeiosdeculturanecessáriosaotrabalhoemvirologiarespeitamàscélulasinfectadaspelosvírusem
estudo.
Asobrevivênciaeosuportedevidadosmicrorganismosdependemdofornecimentoadequadodenutrientese
convenientescondiçõesparaoseucrescimento.Quantoaosnutrientes,grandepartedosmicrorganismosapenas
necessitamdesubstânciasolúveisdebaixopesomolecular,usualmenteoriginadaspeladegradaçãoenzimáticade
outrosnutrientesmaiscomplexos.Umasoluçãocontendoestesnutrientesédesignadacomomeiodecultura.Em
geral,osmeiosdeculturasãolíquidos,semissólidosousólidos.Ummeiolíquidosemagentesolidificanteédesignado
porcaldonutritivo.Umcaldonutritivosuplementadocomumagentesolidificante,usualmenteoagar,originaum
meiosólidoousemissólido.Oagaréumextratodealgasmarinhas,umcarbo-hidratocomplexoquecontem
maioritariamentegalactoseepossuimuitopoucovalornutritivo.Oagarémuitoadequadocomoagentesolidificante
porqueseliquefazacercade100ºCesolidificaa40ºC.Devidoaestaspropriedades,osmicrorganismos,emespecial
ospatogénicos,podemsercultivadosatemperaturasdaordemdos37ºCsemreceiosdeliquefaçãodomeio
solidificado.Ummeiodeculturabemsolidificadoexigeumaconcentraçãodeagardaordemdos1,5a1,8%.Uma
concentraçãoinferiora1%resultanummeiosemissólido.
Agrandevantagemeutilidadedosmeiossólidosesemissólidosemestudosdevirologiaresidemnofatodeascélulas
hospedeiraspoderemserimobilizadas,mantendoasuaviabilidade,edeaspartículasviraisveremreduzidaasua
capacidadededifusãonomeio.Talcomoparaoisolamentodecolóniasdebactériasnasuperfíciedoagar,também
nosmeiossólidosesemissólidossepodemisolarindividualmenteasestirpesviraisempresença.
Paraalémdasnecessidadesnutritivas,váriosoutrosfatoresambientaisprecisamdesercontroladosparaosucesso
daculturadosmicrorganismosedesuportedasinfeçõesvirais,comosejamopH,atemperatura,oambientegasoso
ouapressãoosmótica.
Umoutroaspectorelevantedas"culturasdevírus"relaciona-secomasquantidadesrelativasdevírusecélulas
hospedeirasnoiníciodainfeçãoedacapacidadedoshospedeirosparasuportarapropagaçãoviral.Istoimplica,com
frequência,dispordecélulasemfasedecrescimentoexponencialparaqueainfeçãoviralpossaocorrercomsucesso.
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ESTERILIZAÇÃO
Aesterilizaçãoéumdospontos-chaveparaosucessodotrabalhoemvirologia.Paratrabalharemcondiçõesde
esterilidadeéfundamentalousodematerialestérileaaplicaçãodetécnicasadequadas.Aesterilizaçãoéprocesso
peloqualsãoeliminadastodasasformasdevidadequalquermeiooumaterial.Asprincipaistécnicasparaa
esterilizaçãoderotinaemlaboratóriosãoasseguintes:
Calor
Filtração
Produtos
químicos
Calorseco(arquente)
160ºCa180ºCdurante1/2horaa3horas
Materialdevidroemvazio
Calorhúmido(vapor)
Circulaçãodevapora100ºC.Esterilizaçãointermitente(soluçõestermo-lábeis)
Autoclave.Vaporsobpressão,temperaturasacimados100ºC(meiosdecultura,soluçõestermoestáveis)
Membranasfiltrantescomporosde0,05µma0.8µm
Remoçãodemicrorganismosdesoluçõestermo-lábeisporfiltração
Óxidodeetileno
Materialdeplástico
Beta-propiolactona
Tecidosvivos,materiaisbiológicos
TUBOSDECULTURAEPLACASDEPETRI
TubosdeensaioemvidroeplacasdePetriemvidroeplásticoconstituemosprincipaissuportesparao
desenvolvimentodasculturasdemicrorganismosquesuportamapropagaçãodosbacteriófagosautilizar.Ummeio
nutritivoadequadonaformadecaldonutritivooudeagaréusadoemtubosdeensaio,enquantonasplacasdePetri
apenasseusameiosólido.Umambienteestérilépreservadonostubosdeculturaporváriostiposdetampas.
Historicamenteéorolhãodealgodãohidrófobo,desenvolvidoporSchroederevonDuschnoséculodezanove.Hoje
emdia,amaiorpartedoslaboratóriosusamtampasemformademanga,emmetalouplásticoresistenteaocalor.A
vantagemdestastampasresidenofatodenãoexigiremtantotrabalhonasuapreparaçãoeseremmaisfacilmente
removidasereintroduzidasnostubosduranteamanipulação.
AsplacasdePetridisponibilizamumamaiorsuperfícieparaculturaecrescimentodosmicrorganismos.São
compostasporumabasecircularinferior,ondeécolocadoomeioeporumatampadomesmoformatoeligeiramente
maiorqueseencaixanabase.ExistemplacasdePetrideváriasdimensõesparadiferentesexigênciaslaboratoriais.Na
rotinasãousadasplacasdecercade10cmdediâmetro.Omeionutritivoestéril,contendoagar,numvolumede15a
20mLévertidonasplacasquandoaindaquenteapósfusãodoagaredeixadoarrefeceratemperaturainferiora40ºC.
Depoisdeinoculadascomosmicrorganismosasplacassãoincubadasemposiçãoinvertidaparaevitarqueasgotasde
condensação,formadasnatampaduranteoarrefecimentodoagar,caiamsobreasuperfíciedoagar.
Aimobilizaçãodasbactériaseadificuldadededifusãodaspartículasviraisnosmeiossólidosassociadosàpequena
espessuradosuportepermiteidentificareisolarbacteriófagosindividuais,comoseveránodecursodotrabalho
experimental.
INSTRUMENTOSPARATRANSFERÊNCIADECULTURAS
Existeanecessidadedetransferirosmicrorganismosdeummeiodeculturaparaoutros,desdeculturasde
armazenamentoemanutençãoparaculturasdeanálise,paraoisolamentodefagosouparaasuaexpansãoemmassa.
Éoprocessodesubculturaquetemdenecessariamenteserefetuadocomtécnicaestérilparaevitarpotenciais
contaminaçõesdassubculturas.
Asansaseagulhas,usualmentefabricadascommetaisinertescomoaplatinaeinseridasemcabosprópriosparaa
manipulação,sãoinstrumentosmuitoduráveisdefácilutilização.Sãofacilmenteesterilizáveisnomomentodasua
utilizaçãoporincineraçãoàchama,numaposiçãoquaseverticalatéometalficaraorubro.Importarádepoisdeixar
arrefecerentre10a20segundos,foradachama,masnasuaproximidade,ondeacargademicrorganismos
ambientaisviáveiséinferior.Depoisdearrefecidos,paranãoinativarosmicrorganismosatransferir,podemser
usadaspara"picar"umaculturasólidaoulíquidaeinocularoutromeio.Umavezesterilizada,aansadeveráserde
imediatoutilizadaantesdeserdenovocolocadanabancada.
Aspipetassãooutrosdosinstrumentosdetransferênciadeculturasdeusomuitogeneralizado.Sãocalibradase
permitematransferênciadequantidadesdeculturaslíquidaspreestabelecidas.Sãodevidroouplástico,comuma
extremidadeafiladaeoutraparaaaspiraçãoeexpulsãodolíquidoquecontenham.Podemseresterilizadasporcalor
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secoouhúmido,conformeotipodematerialdequesãoconstituídas.Apesardetradicionalmentesereminstrumentos
para"pipetaràboca"éproibidousarabocaparaaspirarmicrorganismos.Existemauxiliaresmecânicosdisponíveis
paraoefeito,comoperasdeborrachaoucorposdeseringaqueseadaptamnaextremidadelargadapipeta.
AspipetasPasteur,tubosdevidronãograduadoscomumadasextremidadesafiladassãotambémdeusomuito
frequenteemestudosdevirologia,tambémpelasuafacilidadedeesterilizaçãoextemporânea.
CÂMARASDECULTURA
Dascondiçõesparacrescimentodosmicrorganismos,umadasmaisrelevanteséasuatemperaturaóptimade
crescimento.Asestufassãousadasparaamanutençãodatemperaturaóptimadosmicrorganismosemcrescimento
duranteoperíododecultura.Sãocâmarasemqueatemperaturaambienteinteriorécontroladaportermóstato,para
queamesmasejamantidadentrodelimitesapropriadosparaocrescimentocelular.Usamemgeralumsistemade
circulaçãodearaquecidoe,paraevitaradesidrataçãodosmeiosemincubação,deverãocontertambémumafontede
vapordeágua(umrecipientecomáguanoseuinterior,quandonãovenhampreparadasparaoefeitodeorigem).
Osbanhosdeágua(banho-maria)comáguaatemperaturacontroladaportermóstatoconstituemoutrodos
instrumentosfrequentementeempreguesparaacriaçãodascondiçõesdetemperaturaóptimadecrescimentodos
microrganismos.Oíntimocontatodaáguaatemperaturacontroladacomorecipienteondecrescemos
microrganismosapresentaavantagemdepermitirumamaisrápidaeeficaztransferênciadocalor.Alémdisso,os
banhoscomagitaçãofacilitamtambémoarejamentodasculturas,degrandeimportânciaparaocrescimentodos
microrganismosaeróbios.Adesvantagemdobanhodeáguaresidenofatodesópoderserusadoparaasculturasem
meiolíquido,aocontráriodasestufasdear,queservemtantoparaculturasemmeiolíquidocomoemmeiosólido.
Osvírusporquesópodemcresceremcélulasqueestejamemcrescimentorequerem,naturalmente,omesmotipode
câmarasdeculturausadasparaosrespectivoshospedeiros.
FRIGORÍFICO
Ofrigoríficoéoutradaspeçasfundamentaisemlaboratóriodevirologia.Oambientedebaixatemperaturaque
disponibilizaédamaiorrelevânciaparaamanutençãoearmazenamentodasculturascelularesemfasedenão
crescimentoentreosperíodosdesubcultura,paraamanutençãodassuspensõesviraiseparaaconservaçãodos
meiosesterilizadoseoutrosreagentes.Tambémassoluçõesecompostostermo-lábeistêmperíodosdeconservação
maisalargadosquandoarmazenadosabaixastemperaturas.
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MÉTODOSDEESTERILIZAÇÃO
Esterilizaçãoéumprocessoqueeliminatodososorganismosvivosqueseencontremàsuperfícieounointeriorde
ummaterial,podendoseralcançadopelaexposiçãodomaterialaagentesletaisfísicosouquímicosou,nocasodos
líquidos,pelaseparaçãomecânicadosorganismosatravésdefiltrações.Existemmuitasformasdeesterilizar
materiaisemeios,easuaescolhadependedanaturezadosmateriaisaseremesterilizadosbemcomoda
disponibilidadedemeiosdetrabalho.
Anoçãodeesterilidade(estéril=infecundo)encontra-sefrequentementeassociadaaduasoutras:adeassepsia
(ausênciadesepsis=putrefação)eadedesinfeção(livrardainfeção).Estessignificadosliteraiscorrespondem,de
fato,àsnoçõestécnicasdestasterminologias.Emmicrobiologiareferimo-nosaesterilizaçãoquandosepretende
impedirapropagaçãodemicrorganismos;aassepsiaquandosepretendetrabalharemambientedesprovidode
microrganismoseadesinfeçãoquandoseaplicamtécnicasdestinadasaeliminarmicrorganismospotencialmente
patogénicosparaooperador.Aformadeeliminaçãodainfecciosidadeviraldependedascaraterísticasdovírusem
causa.
Destasnoções,aadquirirnoexercíciodaexperimentaçãoquesedesenvolveránadisciplina,importaconsiderarem
particularastécnicasqueseutilizamemmicrobiologiaparaaeliminaçãodemicrorganismosviáveis:aesterilização.
ESTERILIZAÇÃOPELOCALOR
A.CalorHúmido
Oaparelhomaisusadoparaesterilizarmateriaisemeiosdeculturaéaautoclave.Asautoclavestrabalhamà
semelhançadepanelasdepressãodomésticas.Asautoclavesdelaboratóriooperamnormalmentesobumapressãode
1,02Baraumatemperaturade121ºC.Aautoclaveesterilizaamaioriadosmateriaisem15-30minutos,sendoa
variaçãodotempodeesterilizaçãodevidaàrelaçãosuperfície/volumedosmateriaisaseremesterilizados.
Aspectosdaesterilizaçãoporvapor-pressão
Temperatura
Osendoesporosdasbactériassãoasformasdevidamaisresistentesaocalor,easuadestruiçãopodeserconseguida
seforaplicadovaporsobrepressão.Umatemperaturade121ºCofereceumaboamargemdesegurançasefor
mantidaduranteumespaçodetempoapropriado.
Humidade
Acoagulaçãodoprotoplasmabacterianoemtemperaturasmoderadasrequerhumidadeehámedidaqueestaé
removidaatemperaturanecessáriaparahavercoagulaçãoaumentarapidamente.Seovaporforsobreaquecidoficará
mais"seco"oqueocasionaumaumentodatemperaturaedotempodeexposiçãoparaaesterilização,quenasituação
extremadeesterilizaçãoemcalorsecoseráde170ºCduranteumahora.Emconclusão,vaporexcessivamentequente
perdealgumadasuaeficáciacomoagenteletalparaalémdepoderserlesivoparaosmateriaisaseremtratados.
Pressão
Apressão,nosvaloresusadosnaautoclave,porsisónãoexercequalquerefeitonaesterilização,sendoútilpara
elevaratemperaturadovaporacimados100°C.
Tempo
Otempoénecessárioparaqueovaportenhaaoportunidadedepenetrareaquecerosmateriaisaseremesterilizados.
Mesmoquandoastemperaturasdeesterilizaçãosãoatingidas,osagentesviraisoumicrobianosnãosãotodosmortos
deumavez.Avelocidadedemorteéumaconstanteaumadadatemperaturaeporcadaunidadedetempode
exposiçãoaoagenteletal,umaproporçãoqueéconstanteparaumadadapopulação.Normalmentedemora11a12
minutosa121°C(calorhúmido)paramatarosendoesporosdasbactériastermofílicas,osagentesmaisresistentes
nasmanipulaçõesdodia-a-dia.
Purga
Oarrelativamentefrionacâmaradeesterilizaçãoémuitomaispesadoqueovaporàtemperaturadeesterilização.Se
nãoforpermitidaasaídadoarcria-seumaestratificaçãonaautoclavequeconduzaumafaltadeuniformizaçãodas
temperaturasdesenvolvidas.Umavezqueoareovaporsãolentosamisturarem-se,asdiferençasdetemperatura
entrecamadaspodesermuitogrande,porissoanecessidadedesesubstituirtodooarporvapor(purga).
Virologia2016/17
9
Natureza do carregamento
Geralmente,osmateriaismaisvolumososrequeremummaiortempodeesterilização,sendopreferívelesterilizar
pequenosvolumesdecadavez,porexemploépreferívelesterilizar5balõesdelitrodecadavezdoqueesterilizar
apenasumbalãocomcincolitros.Osfrascosdevemsertapadoscomalgodãooupapel.Sefornecessáriousartampas
roscadas,devemirpoucoapertadasparaaautoclavedemodoapermitiremasaídadeareentradadevapor,
evitando-seassimorebentamentodefrascosnaautoclave.
B.Calorseco
Ocalorsecoéusadoparaesterilizarmaterialdevidro,outrosmateriaissólidostermoestáveisealgunscomponentes
demeiosoualimentosqueficariamimprópriosseexpostosaovapor.Trata-setambémdeumdosmétodosde
esterilizaçãomaisusadosedemuitofácilaplicação.Oequipamentoindispensáveléapenasumaestufadealta
temperatura(160–200ºC).Paraalémdeterdesertidaemcontaaresistênciatérmicadosmateriaisaesterilizarpor
estatécnica,aoutraprecauçãoaconsiderarprende-secomaminimizaçãodapossibilidadedecontaminaresses
materiaisdepoisdaesterilização.
ESTERILIZAÇÃOPORGASES
Orecenteincrementodousodematerialdeplásticodeutilizaçãoúnica("disposable")comoseringas,caixasdePetri,
tubosdecultura,filtros,etc.,levouaodesenvolvimentodeumanovaformadeesterilizaçãoqueusagasestóxicospara
aeliminaçãodosmicrorganismosdemateriaistermo-sensíveis.Aaplicaçãodestatécnicarequerautilizaçãode
equipamentosprópriosqueforcemacirculaçãodogástóxicoatravésdetodasassuperfíciesdosmateriais,oquea
tornadedifícilutilizaçãoemlaboratóriosdetiponãoindustrial.
Oóxidodeetilenoéogásusadocommaiorfrequêncianestetipodeesterilizações.Estegás,aocontráriodemuitos
produtosquímicostóxicos,époucocorrosivoenãoalteraosmateriaisaseremesterilizados,sendofacilmente
removidoporarejamento.Assuasdesvantagensincluemanecessidadedelongosperíodosdeexposiçãoparaseobter
aesterilização(váriashoras),areatividadecomcomponentesdosmeiosecertostiposdeplásticoseanecessidadede
equipamentosprópriosedisponibilidadedogás,comosereferiu.
RADIAÇÕES
Algunsprocessoscomerciaisusamasradiaçõesparaaesterilizaçãoafriodecertosmateriaiscomoprodutos
farmacêuticos,porexemplo.Airradiaçãoéousoderadiaçõesionizantesdealtaenergiaqueincluemraiosgama
produzidosapartirdecobalto-60oucésio-139ederaioscatódicosproduzidosemgeradoreseaceleradoresde
electrões.
Airradiaçãocomluzultravioletanãoéumaformamuitosatisfatóriadeesterilizaçãodadaasuafracacapacidadede
penetraçãonosmateriaiseprodutosaesterilizar.É,contudo,deutilizaçãofrequentenadiminuiçãodonívelde
contaminaçãodeespaçosconfinados,comosalasestéreisoupequenosambientes,sendoparticularmenteúteis
tambémparaareduçãodainfecciosidadeviraldevidoàsalteraçõesinduzidasnomaterialgenéticodaspartículas
viraisexpostas.
FILTRAÇÃOESTÉRIL
Oprincipalmétodoparaaesterilizaçãodelíquidosquecontenhamcomponentestermo-sensíveistaiscomovitaminas,
proteínasséricaseantibióticos,porexemplo,éafiltração.Tradicionalmenteosmicrobiologistasesterilizavamestes
produtosrecorrendoafiltrosfeitosapartirdeterradediatomáceasefibrasdeasbesto,previamenteesterilizadosem
autoclave.Presentementeestesfiltrosforamsubstituídosporfiltrosdeacetatodeceluloseoupolicarbonatosnos
quaisostiposdeporosdesenvolvidospermitemfiltraçõescomelevadosgrausdeprecisão.Existematualmente
disponíveisnomercadofiltrosesterilizantesdeváriosporosecapacidadesfiltrantes.Osmaisfrequentese,porisso,
maisacessíveissãofiltrosdeporosde0,45µmou0,2µmdediâmetro,queretêmosmicrorganismospresentesnas
soluções.
Paraesterilizarumasoluçãoporfiltração,nãohámaisquepassaressasoluçãoatravésdeumdestesfiltrospela
aplicaçãodeumapressãopositivanolíquidoafiltrar(filtrosdeseringa,porexemplo)ounararefaçãodoarno
contentorquerecebeofiltrado.Emqualquerdoscasosestatécnicarequerarecolhadofiltradoemcondiçõesde
assepsiaparaimpediracontaminaçãodolíquidoesterilizado.
Virologia2016/17
10
Salvorarasexceções,afiltraçãoestérilnãoretémaspartículasvirais.Nãopodendoserconsideradocomométodode
"esterilizaçãodevírus".Afiltraçãoestérilémesmoumatécnicafrequentementeusadaemvirologiaparaapurificação
desuspensõesviraispelaeliminaçãodebactériaspotencialmentecontaminantes.
DESINFECTANTESEANTISSÉPTICOS
Múltiplosreagentesquímicossãodiariamenteutilizadosparacontrolodadisseminaçãodemicrorganismos.Os
produtosusadosna"limpeza"deutensíliosdiversos,frequentementedemasiadotóxicosparaserusadosdiretamente
noHomem,sãochamadosdedesinfectantes.Osprodutosqueaplicamosnapele,comomesmoobjetivodeeliminar
eventuaismicrorganismos,sãoantissépticos.
Particularmenteeficazemuitoútilnolaboratório,paraeliminaçãodevírusemicrorganismoséasoluçãode
hipocloritodesódio(lixívia)comquesetratamosmateriaisdelaboratórioapósexposiçãoaagentesinfeciosos.
Virologia2016/17
11
BACTERIÓFAGOS
Osvírusdiferemdasbactériasporseremmuitomaispequenos,deconstituiçãonãocelulareparasitasintracelulares.
Adicionalmentenãosãocapazesdecresceremmeiosdeculturanãovivos.Apesardissoépossívelestudá-losno
laboratório,detectandoasuapresençapelosefeitosqueprovocamnascélulasqueinfectam.
Existemvíruscomespecificidadeparadiversostiposdecélulas,tantoeucarióticascomoprocarióticas.Aestrita
dependênciadecélulashospedeirasdeve-seàsuaincapacidadeparasintetizarasenzimasnecessáriasaos
mecanismosdasuapropagação.Aopenetraremnascélulassãocapazesdeusarasenzimasdohospedeiroemseu
próprioproveito.
Oestudosdevírusqueparasitamcélulasvegetaisouanimaisexigerecursosespecíficosparaculturadetecidos,sendo
estastécnicasemgeraldemasiadodemoradasparaexecuçãoemaulaspráticasdonívelqueaquisepretendem
desenvolver.Paraalémdissoeapesardaespecificidadeparacertoshospedeirosautilizaçãodevírusdeeucariotas
exigecuidadosdecontençãobiológicabastanteapertados.
Osvírusqueparasitamasbactérias,osbacteriófagosousimplesmentefagossãodemaisfácilmanipulação,exigema
aplicaçãodetécnicasgeraisdemicrobiologia,menosdemoradasporviadasrápidastaxasdecrescimentodas
bactériasusadas.Oscuidadosparaoconfinamentobiológicodasexperiênciastambémnãoprecisadesertão
apertadocomoparaousodevíruseucarióticos.
Quandoumfagoinfectaumabactériareceptivaumadeduascoisasacontecerá:aliseoualisogeniadabactéria.
QuandoocorrealiseometabolismodabactériaéreorientadoparaasíntesedoDNAgenómicodovírusedas
proteínasparaproduziraspartículasfágicasmaduras.Usadoomaterialcelulardisponível,acélularebentaeliberta
osviriõesmaduros,capazesdereinfectarnovasbactériasqueencontrem.
Osbacteriófagosqueprovocamalisedabactériasãochamadosdevirulentosoulíticos.Quandoainfeçãonãoconduz
àmortedabactéria,estabelece-seentreestaeovírusumrelacionamentodesignadoporlisogeniaeofagoé
denominadodetemperadooulisogénico.NestescasosoDNAdofagoéintegradonocromossomadabactériaeesta
crescenormalmente.Ocasionalmenteumadestasbactériasentraemciclolíticoelibertaviriõescapazesdeinfetar
outrascélulas.
Aevidênciavisualdalisedeumabactériaéconseguidapelaculturadabactériaemmeiosólido,emcamadauniforme
einfeçãodealgumascélulascomobacteriófago.Acamadadebactérias,naturalmenteopaca,apresentacírculosclaros
correspondentesaoslocaisemqueumfagoinfetouedestruiuapopulaçãodecélulasvizinhas.Sãoasplacasvirais.
Noscasosdefagoslisogénicos,comosóalgumasdasbactériasentramemciclolítico,estasplacassãotranslúcidas.
Virologia2016/17
12
PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS
PIPETAGENS,SOLUÇÕESEDILUIÇÕES
Introdução
Origornasdiluiçõesaefetuarcomalgunsmateriaisbiológicosereagentes,nocontextodeváriosdostrabalhos
experimentaisqueaquiseincluem,écríticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados.
Porqueseobservacomfrequênciaalgumainabilidadeinicialdosestudantesparaamanipulaçãoadequadadas
micropipetas,paraumraciocíniooperacionalsobrediluições(emespecialquandoexpressasempotênciasde10)e
nasformasdeprepararsoluçõestituladas,introduz-seestetrabalhopreliminar.
Materialereagentes
¾
Soluçãosaturadadeazul-de-metileno
¾
Águadestilada
¾
Micropipetasdiversas
¾
Microtubos
¾
Espectrofotómetro
Procedimento(porgrupo)
Diluiçõesdecimais
1.
2.
Marquemicrotubosde1a8
Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:
Tubo
Solvente(mL)
Corante(mL)
Soluçãoprecedente(mL)
Diluição(10x)
1
0
1,5
0
2
1,35
0,15
0
3
1,35
0
0,15
4
1,35
0
0,15
5
1,35
0
0,15
6
1,35
0
0,15
7
1,35
0
0,15
8
1,5
0
0
3.
Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.
4.
Verifiqueosvolumesrelativoseregisteasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos
5.
Determineaabsorvênciadassoluçõesa600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamaisconcentrada,namesma
cuvete.Últimaamostra:controlo).
Diluiçõescentesimal
1.
Marquetubosdeensaiode1a6
2.
Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:
Tubo
1
2
3
4
5
6
Solvente(µL)
0
1500
1500
1500
1500
1500
Corante(µL)
1500
15
0
0
0
0
Soluçãoprecedente(µL)
0
0
15
15
15
0
Diluição(10x)
3.
Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.
4.
Verifiqueosvolumesrelativoseregisteasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos
5.
Determineaabsorvênciadassoluçõesdostuboscomnúmeropara600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamais
concentrada,namesmacuvete.Últimaamostra:controlo)
Virologia2016/17
13
Diluiçõesdetrêsemtrês
6.
Marquetubosdeensaiode1a10)
7.
Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenoproceda,àsseguintesdiluiçõessequenciais:
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Solvente(mL)
0
1
1
1
1
1
1
1
1
Corante(mL)
1,5
0,5
0
0
0
0
0
0
0
Soluçãoprecedente(mL)
0
0
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Diluição(10x)
8.
Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiçõesemcadatubo.
9.
Registeasintensidadesdecorobserváveisnosdiferentestubos
10
1,5
0
0
10. Determineaabsorvênciadassoluçõesdostuboscomnúmeropara600-660nm(lerdamaisdiluídaparaamais
concentrada,namesmacuvete)
Diluiçãoúnica(TPC)
¾
Considerandosotrabalhosanteriores,desenheumprotocoloparaarealizaçãodetesteadiluiçõesmilesimais.
¾
Apartirdasoluçãoconcentradadeazul-de-metilenofaçaoscálculosparaprocederàpreparaçãode5mLdecada
umadasseguintessoluções,indicandoosvolumesausar:
a.
Diluiçãode5x102
b.
Diluiçãode5x10-2
Preparaçãodesoluções(TPC)
¾
Pretendendo-seobter100mLdecadaumadassoluçõesqueselistam,indiqueasquantidadesdeprodutosa
misturarparaasuapreparaçãonolaboratório:
a.
NaOH0,1N
b.
SO4H20,1N
c.
NaCl0,1M
d.
NaCl100mM
e.
Glicerol10%(fórmulaC3H8O3)
f.
Glucose10%(fórmulaC6H12O6)
g.
Etanol70%(fórmulaC2H6O2)
Pesosatómicos:H=1;C=12;O=16;Na=23;S=32;Cl=35.
Virologia2016/17
14
RegistodeobservaçõeseResultados
PIPETAGENSEDILUIÇÕES
Operador:
Data:
____/____/____
Diluiçõesdecimais
Tubo
Amostra
DO600nm/mL
Concentraçãocalculada
Observações
1
2
3
4
5
6
Tubo
Amostra
DO600nm/mL
Concentraçãocalculada
Observações
1
2
3
4
5
6
Tubo
Amostra
DO600nm/mL
Concentraçãocalculada
Observações
1
2
3
4
5
6
Diluiçõescentesimais
Diluiçõesúnicas
Diluiçõesdetrêsemtrês
Amostra
DO600nm/mL
Concentraçãocalculada
Observações
5x102
5x10-2
Virologia2016/17
15
Gráficos
Notas:
SOLUÇÕES
Virologia2016/17
16
Operador:
Data:
____/____/____
Componentes
NaOH0,1N
(100mL)
Peso/volume
Componentes
SO4H20,1N
(100mL)
Peso/volume
Componentes
NaCl0,1M(100
mL)
Peso/volume
Componentes
NaCl100mM
(100mL)
Peso/volume
Componentes
Glicerol10%
(100mL)
Peso/volume
Componentes
Glucose10%
(100mL)
Peso/volume
Componentes
Etanol70%
(100mL)
Peso/volume
Notas:
Virologia2016/17
17
CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO
Introdução
Comosesabe,asbactériasmultiplicam-seporprocessosdefissãobinária.Umabactériaemcrescimentometaboliza
osnutrientesdisponíveisnomeio,aumentaoseutamanhoedivide-seemduas.Otempoparaumabactériasereplicar
eformardoisindivíduoséotempodegeração,caraterísticodaestirpenascondiçõesdeculturaaplicadas.
Umvírusparasepropagarprecisadeinfectarumhospedeirometabolicamenteativoparapoderutilizarosseus
mecanismosdereplicaçãodogenomaedesíntesedasproteínasviraisconstitutivasdosviriões.
Particularmentenosbacteriófagoslíticos,oseuestudoimpõeautilizaçãodebactériashospedeirasemfasede
crescimento.Importa,porisso,conheceroperfildascurvasdecrescimentodestasbactériasparadeterminaro
momentoemqueainfeçãocomovírusdeveráserdesencadeada.
Nestetrabalhodeterminar-se-áexperimentalmenteacurvadecrescimentodeumabactériaE.coliautilizarno
desenvolvimentodostrabalhossubsequentes.
Materialereagentesespecíficos
¾
CulturarecentedeE.coli(ATCC25250)emmeionutritivo(culturadediaanterior)
¾
Sorofisiológicoestéril
¾
PlacasdePetricomagarnutritivo
¾
Tubosdeensaio,contendo5mLdeagarnutritivosemissólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC
¾
Tubosdeensaioesterilizados(10mLmínimo)
¾
Tubosdecentrífugaesterilizados(cercade10mL)
¾
PipetasPasteuresterilizadas
¾
Microtuboseppendorfesterilizados
¾
Micropipetas(200e1000)erespectivaspontasesterilizadas
¾
Espectrofotómetrodovisível(600nm)
Procedimento(porgrupo)
1.
AvaliaraDO600nmdasuspensãobacterianafornecida
2.
Inocular100mLdemeionutritivo,previamenteaquecido,comasuspensãobacterianaàconcentraçãofinalde
DO600nm=0.05
3.
Incubara37ºCembanhooucâmaracomagitação(cercade120rpm)
4.
Homogeneizarasuspensão
5.
Tomaramostrade4mL.AvaliaraDO600nm(diluircommeiosenecessário)
6.
Tomar2X0.1mLdesuspensão
7.
Espalharumadasamostrasnasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivo
8.
Diluiraoutraamostra1:10eespalhar0.1mLnasuperfíciedeoutraplacadeagarnutritivo
9.
Incubarasplacasemestufaa37ºCduranteumanoite
10. Repetirpassos5a10,dehoraahoraatéàsoitohorasdeincubação
11. Observarasplacasdeagarnutritivoecontarascolóniasdesenvolvidas
12. FazergráficoquerelacioneasleiturasdaDOcomotempodeincubação
13. Calcularaconcentraçãodebactérias,determinadapelonúmerodecolóniasreveladas,pormLdecadasuspensão
14. Fazergráficoquerelacioneaconcentraçãodebactériascomotempodeincubação
15. RelacionarasDO600nmdeterminadascomaconcentraçãobacterianadassuspensõesanalisadas
Virologia2016/17
18
RegistodeobservaçõeseResultados
CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO
Operador:
Data:
____/____/____
Tempo
(horas)
DO600nm/mL
Bactérias/mL
Observações
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Notas:
Virologia2016/17
19
CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO-2
Introdução
Dadoqueasduashorasdasessãolaboratorialformalnãosãosuficientesparaarealizaçãointegraldacurvade
crescimentobacteriano,propõe-searealizaçãodestetrabalhoparailustraraformadeestabelecerumacurvade
crescimentoetomarosdadosnecessáriosàprossecuçãodetrabalhosfuturos.
Materialereagentesespecíficos
(idênticoaanterior)
Procedimento(porgrupo)
1.
AvaliaraDO600nmdasuspensãobacterianafornecida(culturarecente“overnight”)
2.
Inocular20mLdemeionutritivo,previamenteaquecido,comasuspensãobacterianaàconcentraçãofinalde
DO600nm=0.05
3.
Homogeneizarasuspensão
4.
Tomaramostrade2mL.Separar
a.
5.
AvaliaraDO600nm(diluircommeiosenecessário).Registarvalor
Tomar2X0.2mLdesuspensão
a.
Espalharumadasamostrasnasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivo
b.
Diluiraoutraamostra1:10(adicionar1,8mLSF)eespalhar0.2mLnasuperfíciedeoutraplacadeagar
nutritivo
6.
Incubara37ºCemestufacomagitação(cercade120rpm)
7.
Repetirpassos3a5demeiaemmeiahora.
8.
Continuaraincubaçãodetodasasplacasinoculadasemestufacomagitaçãoa37ºCduranteumanoite
9.
Observarasplacasdeagarnutritivoecontarascolóniasdesenvolvidas
10. FazergráficoquerelacioneasleiturasdaDOcomotempodeincubação
11. Calcularaconcentraçãodebactérias,determinadapelonúmerodecolóniasreveladas,pormLdecadasuspensão
12. Fazergráficoquerelacioneaconcentraçãodebactériascomotempodeincubação
13. RelacionarasDO600nmregistadascomaconcentraçãobacterianadassuspensõesanalisadas
14. Calcularaabsorçãoespecíficadaculturabacteriana.
Virologia2016/17
20
RegistodeobservaçõeseResultados
CURVADECRESCIMENTOBACTERIANO-2
Operador:
Data:
____/____/____
Tempo
(minutos)
DO600nm/mL
Bactérias/mL
Observações
0
30
60
90
Notas:
Virologia2016/17
21
Gráficos
Notas:
Virologia2016/17
22
PREPARAÇÃODESUSPENSÃOVIRALDEALTOTÍTULO
Introdução
Todososvírussãoparasitasintracelularesobrigatóriosesãoincapazesdesepropagaremmeiosnutritivoscomo
acontececomgrandenúmerodebactériaseoutrascélulas.Cadatipodevírusrequerumhospedeiroadequadopara
sereplicar.Hávírusqueconsegueminfectardiferentestiposdehospedeiroseoutrosdemaiorespecificidadeparaum
tipoparticulardecélulas.
Porqueosvírusnãopossuemasatividadesenzimáticasnecessáriasàsdiferentesfasesdosseusciclosdereplicação,
estãodependentesdaatividademetabólicadohospedeiroparasepropagarem.Acélulainfectadadeveencontrar-se
emcrescimentoativocomainerenteproduçãodeenergiaemacromoléculasutilizáveispelovírusaquandodainfeção,
paraqueestapossaserprodutiva.
Nocasodosbacteriófagos(="comedoresdebactérias"),oshospedeirosnosquaissepodemmultiplicarsãobactérias.
Énecessárioqueabactériaseencontreemcrescimentoexponencialparaaefetividadedainfeção.Seocrescimento
bacterianonãoéóptimonaalturadainfeção,areplicaçãoviralpoderánãoocorrerousermuitoreduzida.
Materialereagentesespecíficos
¾
SuspensãodebacteriófagolíticodeE.coli
¾
Tubosdeensaioesterilizados(10mLmínimo)
¾
CulturarecentedeE.coliemmeionutritivo(fase
exponencial)
¾
Tubosdecentrífugaesterilizados(12mL)
¾
¾
PipetasPasteuresterilizadas
Sorofisiológicoestéril
¾
¾
Microtuboseppendorfesterilizados
PlacasdePetricomagarnutritivo
¾
¾
Tubosdeensaiocontendo5mLdeagarnutritivo
semissólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC
Micropipetas(200e1000)erespectivaspontas
esterilizadas
Procedimento
NB
Cadagrupoexecutaoensaiocomduasdiluiçõesdevírus
1.
2.
Identificaromaterialautilizarnotrabalho:
a.
2X7Tuboseppendorf(de1a7)
b.
7PlacasdePetricomagarnutritivo(de1a7)eidentificar:nomedogrupo,dataeexperiência
Nosmicrotubospreparardiluiçõesdecimaisseriadasdaamostradobacteriófagoaamplificar,umaamostranão
diluídaeumcontrolonegativo,conformeaoesquema:
Tubo#
Amostrainicial
Diluiçãoanterior
Sorofisiológico
Diluiçãofinal
Virologia2016/17
1
200µL
-
-
100
2
100µL
-
900µL
10-1
3
-
100µL
900µL
10-2
4
-
100µL
900µL
10-3
5
-
100µL
900µL
10-4
6
-
100µL
900µL
10-5
7
-
900µL
0
23
3.
Emmicrotuboesterilizadomisturar:
a.
0,3mLdeculturabacterianaemcrescimentoexponencial
b.
0,1mLdecadadiluiçãodebacteriófago
4.
Misturarnovortexeincubarembanho-mariaa37ºCdurante5minutos
5.
Adicionaroconteúdoa5mLdeagarsemissólidonoestadolíquidoa50ºC
6.
Misturareverterdeimediatonasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivo
7.
Homogeneizaredeixarsolidificaràtemperaturaambiente(15a20minutos)
8.
Incubaremestufaa37ºCdurante24horas(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte)
9.
Repetirpassos3a8paracadadiluição.
10. Observarasplacaseregistarasobservações
11. Escolheraprimeiraculturaquecontenhaasplacasdovírusconfluentes
12. ComauxíliodeumapipetaPasteurdobradaremoveracamadadeagarsemissólidoparatubodecentrífuga
13. Adicionar5mLdesorofisiológicoehomogeneizarporaspiraçãocompipeta
14. Repartirasuspensãopormicrotubos
15. Centrifugar5minutos.
a.
Repetircentrifugaçãoseosobrenadantenãoestiverlímpido
16. Tomarosobrenadanteeconservaremfrigoríficoa4ºC
a. Senecessárioprocederafiltraçãoestéril-0,22nmou0.45nm
NB
Estaamostraseráafontedevírusparaostrabalhossubsequentes.
Cadagruporesponsabiliza-sepeloseumaterial.
Virologia2016/17
24
RegistodeobservaçõeseResultados
PREPARAÇÃODESUSPENSÃOVIRALDEALTOTÍTULO
Operador:
Data:
____/____/____
Placa
Amostra
Observação
#1
#2
#3
#4
#5
#6
#7
Notas:
Virologia2016/17
25
ISOLAMENTODEPLACAVIRAL
Introdução
Nostrabalhosdevirologia,emparticularquandosemanipulamagentesresultantesderecolhasdoambiente,nãoé
garantidoqueestejapresenteapenasumaespécieviral.Éfrequentenestetipodetrabalhosobservar-seaformação
deplacasviraisdecaraterísticasdiferentes(dimensão,transparência,p.ex.)correspondendoaestirpesviraisdetipo
diferente.
Nestetrabalhopreparar-se-áumasuspensãouniformedevírus,isolandoumtipodosrestantes.
Materialereagentesespecíficos
¾
PlacadePetricomplacasviraisisoladas
¾
PipetasPasteuresterilizadas
¾
CulturarecentedeE.coliemmeionutritivo(fase
exponencial)
¾
Microtuboseppendorfesterilizados
¾
¾
Sorofisiológicoestéril
Micropipetas(200e1000)erespectivaspontas
esterilizadas
¾
CaixasdePetricomagarnutritivo
Procedimento
1.
DeumacaixadePetricomplacasviraisselecionarumabemisoladaemarcarposiçãonacaixa.
2.
CompipetaPasteuraspirarum“plug”deagarcontendoaplacaviralselecionada
3.
Transferiro“plug”deagarparadentrode500µLdeSFemmicrotubo
4.
Homogeneizarcommicropipetaaspirandoeexpirandoo“plug”
5.
Identificaremarcar5X2microtubosecincoplacasdeagarcontendomeionutritivo
6.
Nosmicrotubospreparardiluiçõesdecimaisseriadasdaamostradobacteriófago,conformeaoesquema:
Tubo#
Amostrainicial
Diluiçãoanterior
Sorofisiológico
Diluiçãofinal
1
200µL
-
-
100
2
100µL
-
900µL
10-1
3
-
100µL
900µL
10-2
4
-
100µL
900µL
10-3
5
-
900µL
0
7.
Nooutroconjuntodemicrotubosesterilizadosmisturar:
a.
0,3mLdeculturabacterianaemcrescimentoexponencial
b.
0,1mLdecadadiluiçãodebacteriófago
8.
Misturarnovortexeincubarembanho-mariaa37ºCdurante5minutos
9.
Transferiratotalidadedoconteúdodecadatuboparaasuperfíciedoagardarespetivacaixa
10. Comespalhador(pipetaPasteurduasvezesdobrada)espalharuniformeecompletamenteatéàabsorção
completa.
11. Repetirparatodasasdiluições
12. Incubaremestufaa37ºCdurante24horas(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte)
13. ObservarasplacasdePetrieregistarasobservações
a.
Ocontrolovalidaoensaio(ausênciadeplacasvirais)
b.
ObservarcaixadePetricomplacasviraisisoladaseregistarpresençaounãodeplacasdetipos
diferentes
Virologia2016/17
26
RegistodeobservaçõeseResultados
ISOLAMENTODEPLACAVIRAL
Operador:
Data:
____/____/____
Placa
Amostra
Observação(existênciadeplacasviraisdetiposdiferentes)
#1
#2
#3
#4
#5
Notas:
Virologia2016/17
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TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS
–FORMAÇÃODEPLACAS
Introdução
Diversastécnicasemvirologiarequeremoconhecimentopreliminardaconcentraçãoviraldassuspensõesausar.
Importaconheceronúmerodeunidadesinfeciosasporunidadedevolumedasuspensão.
Emcadaciclodeumainfeçãocombacteriófagolítico,cadabactériainfectadaproduzváriaspartículasviraisquese
libertamparaomeioexteriornasequênciadamortedohospedeiro.Cadaumadestaspartículasviraisterácapacidade
parainfectarumanovabactériaaqueseligue.
Quandoainfeçãoocorreemmeiosemissólido,aspartículasviraisqueselibertamapenaspodeminfectarasbactérias
vizinhasdevidoàsuadifusãoretardadapelomeiogelificado.Porcadabactériainicialmenteinfectadaobservar-se-á,
apósculturaadequada,umespaçonaculturaconfluentedebactérias,correspondenteaoslocaisemqueasbactérias
foramdestruídaspelosvírus(placadelise).
Aconcentraçãodevírusnasuspensãooriginal,determinadapelonúmerodeunidadesformadorasdeplacas(pfu,
plaque-formingunits),podesercalculadausandoaseguintefórmula:
Concentraçãoviral=
Númerototaldeplacasvirais
VolumeusadoXFatordediluição
Materialereagentesespecíficos
¾
SuspensãodebacteriófagolíticodeE.coli(T4)preparadonotrabalhoanterior
¾
CulturarecentedeE.coliemmeionutritivo(diaanterior)
¾
Sorofisiológicoestéril
¾
PlacasdePetricomagarnutritivo
¾
Tubosdeensaiocontendo5mLdeagarnutritivosemissólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC
¾
Tubosdeensaioesterilizados(10mLmínimo)
¾
Microtuboseppendorfesterilizados
¾
Micropipetas(200e1000)erespectivaspontasesterilizadas
Virologia2016/17
28
Procedimento
1.
Emmicrotubosestéreis,identificadosde1a9,prepararasseguintesdiluiçõesdecimaisdofago:
Tubo#
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Amostrainicial
100µL
-
-
-
-
-
-
-
-
Diluiçãoanterior
-
100µL
100µL
100µL
100µL
100µL
100µL
100µL
-
Sorofisiológico
900µL
900µL
900µL
900µL
900µL
900µL
900µL
900µL
900µL
Diluiçãofinal
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
Controlo
2.
3.
Emmicrotuboesterilizadomisturar:
a.
0,3mLdeculturabacterianaemcrescimentoexponencial
b.
0,1mLdecadadiluiçãodebacteriófago
c.
Misturarnovortexeincubarembanho-mariaa37ºCdurante5minutos
Adicionaratotalidadedoconteúdoa5mLdeagarsemissólidonoestadolíquidoa50ºC
a.
Misturareverterdeimediatonasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivo
b.
Homogeneizaredeixarsolidificaràtemperaturaambiente(15a20minutos)
c.
Incubaremestufaa37ºCdurante24horas(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte)
4.
ObservarasplacasdePetriecontaronúmerodeplacasviraisemtrêsplacasdePetriconsecutivascomplacas
viraiscontáveis
a.
Registarasobservaçõeseosresultados.
5.
Calcularotítulodasuspensãoinicialempfu/mLparacadadiluiçãoavaliada
a.
Estabelecerotítulodasuspensãoviralinicialpormédiadosvaloresencontrados
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29
RegistodeobservaçõeseResultados
TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS–FORMAÇÃODEPLACAS
Operador:
Data:
____/____/____
Placa
Amostra
Númerodeplacas
contadas
Títulodasuspensão
inicial
Observações
#X
#X+1
#X+2
Média
Notas:
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30
TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS
–DILUIÇÃOLIMITE
Introdução
Inoculandodiversasculturaslíquidasdebactériashospedeirascomdiluiçõescrescentesdasuspensãoviralem
estudo,atinge-seumpontoapartirdoqualnãomaisépossíveldetectarpartículasvirais.Determinandoadiluiçãoda
suspensãoqueaindacontempelomenosumapartículaviralépossívelcalcularaconcentraçãodasuspensãoinicial.
Materialereagentesespecíficos
¾
SuspensãodebacteriófagolíticodeE.coli(T4)
¾
CulturarecentedeE.coliemmeionutritivo(diaanterior)
¾
Sorofisiológicoestéril
¾
Tubosdeculturacontendo5mLdeagarnutritivolíquido
¾
Microtuboseppendorfesterilizados
¾
Micropipetas(200e1000)erespectivaspontasesterilizadas
Procedimento
1. Emmicrotubosestéreis,identificadosde1a12,prepararasseguintesdiluiçõesdecimais:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Tubo#
150 100 -
-
-
-
-
-
-
-
-
Amostrainicial(µL)
-
100 100 100 100 100 100 100 100 100
Diluiçãoanterior(µL) -
900 900 900 900 900 900 900 900 900 900
Sorofisiológico(µL)
Diluiçãofinal
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
10-10
10-11
12
-
-
900
cont
rolo
2.
3.
Emmicrotuboesterilizadomisturar:
a.
0,3mLdeculturabacterianaemcrescimentoexponencial
b.
0,1mLdecadadiluiçãodebacteriófago
c.
Misturarnovortexeincubarembanho-mariaa37ºCdurante5minutos
Marcaradequadamenteostubosdeensaiocontendo5mLdemeiodeculturalíquido
a.
Inocularcadatubocomatotalidadedecadasuspensãobacterianainfectada.
b.
Misturarnovortex.
c.
Incubarembanho-mariacomagitação(ouemincubadoracomagitação)a37ºCdurante24horas
(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte)
4.
Observaraturvaçãodasculturas
5.
Calcularotítulodasuspensãoinicial
a.
a.
Registarasobservações
Compararcriticamentecomotítulocalculadopelatécnicadeformaçãodeplacas
Virologia2016/17
31
RegistodeobservaçõeseResultados
TITULAÇÃODESUSPENSÃODEBACTERIÓFAGOS–DILUIÇÃOLIMITE
Operador:
Data:
____/____/____
Tubo
Amostra
Turvação(+/-)
Observações
#1
#2
#3
#4
#5
#6
#7
#8
#9
#10
#11
#12
Títulodasuspensãoviralinicial:
Notas:
Virologia2016/17
32
CURVADECRESCIMENTODEUMBACTERIÓFAGOLÍTICO
Introdução
Oaspectotípicodeumacurvadecrescimentodebactériasmostraumcrescimentoconstantedonúmerode
indivíduosnafaseexponencial,quedecorreduranteumdeterminadoperíododetempocorrespondenteagerações
sucessivasdeindivíduos.Poresgotamentodosnutrientesnomeiooupelodesenvolvimentodeoutrascondições
adversas(pH,acumulaçãodeprodutostóxicos,etc.),ocrescimentobacterianoéinibido.
Areplicaçãodeumvíruslíticonabactériadesenvolve-senumúnicopassoconducenteàmortedohospedeiroe
libertaçãodosfagosparaomeioenvolvente.Estefenómenoqueocorrenumaúnicacélulainfectadapodeser
demonstradonumapopulaçãodemicrorganismossetodososindivíduosforeminfectadosaomesmotempo.
Amultiplicidadedeinfeção–MOI(multiplicityofinfection)éumconceitoquerelacionaonúmerodepartículasvirais
infeciosasusadasparainfetarumdeterminadonúmerodecélulashospedeiras.UmaMOIde1.0correspondeauma
situaçãodeumapartículaviralinfeciosaporcélula.
Nestetrabalhodetermina-seoperfildecrescimentodeumbacteriófagolítico.
Materialereagentesespecíficos
¾
SuspensãodebacteriófagolíticodeE.coli(T4)preparadonotrabalhoanterior
¾
CulturarecentedeE.coli(ATCC25250)emmeionutritivo(diaanterior)
¾
Sorofisiológicoestéril
¾
PlacasdePetricomagarnutritivo
¾
Tubosdeensaiocontendo5mLdeagarnutritivosemissólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC
¾
Tubosdecentrífuga(10mLmínimo),Microtuboseppendorf,Micropipetas(200e1000)epontasesterilizadas
Procedimento(culturadevírus)
1.
Inocularfrascoerlenmeyerscontendo50mLdemeionutritivocom2mLdeculturabacterianarecente.
2.
Incubara37ºC,sobagitação,atécrescimentoexponencial(Oprocessodemoraentre3a5horasatéqueacultura
comeceaduplicarasuadensidade–crescimentoexponencial.Faceàslimitaçõesdetempodeduraçãodeuma
aulaprática,usaremalternativaumaculturadebactériasdodiaanterior).
3.
AvaliaraDOdasuspensãobacteriana
4.
Avaliaraquantidadedebactériasexistentesem10mldesuspensão
5.
Tomar10mLdeculturaparacadaumdedoistubosdecentrífugaestéreis(Tubos1e2)
6.
AdicionarsuspensãoviralsuficienteparaatingirumaMOIde5a10notubo1
7.
AdicionarigualvolumedemeiodeculturaLBaotubo2
8.
Incubar37ºCdurante5minutos
9.
Centrifugar1500rpmX5minutos.Decantarossobrenadantesparatubosestéreis
10. Preservarsobrenadantedetubo1econservara4ºC
11. Conservarosedimentobacterianosecoa4ºCparaaaulaseguinte(Necessárioporfaltadetemponaaula)
12. Ressuspenderosedimentodecadatubocom20mLdemeiodeculturapré-aquecido.
13. TransferirasuspensãodecadatuboparafrascosErlenmeyer
14. Incubara37ºCsobagitação
15. Tomarassepticamenteasamostrasseguintesaotempo0(zero):
a.
b.
Daculturabacterianainoculadacomvírus(tubo1):
i.
Amostrade1mLdesuspensão.LeraDO600.Registarleitura.
ii.
Amostrade0,5mLdesuspensão.Conservara4ºC
Daculturabacteriananãoinoculadacomvírus(tubo2):
i.
Amostrade1mLdesuspensão.LeraDO600.Registarleitura.
16. Repetirpasso15decada15minutosatéaofimdaaula
Virologia2016/17
33
Procedimento(revelação)
1.
Materialbiológiconecessárioconservadoa4ºC:
a.
Sobrenadantedaculturainicialdosvírus
b.
Umaamostradesuspensãobacterianadetempo0(zero)
c.
Umaamostradesuspensãobacterianadecadatemporecolhido
2.
Faceàquantidadedevírusebactériasinicialmenteutilizadoscalcularasdiluiçõesafazerparacadacaso
3.
Procederàdiluiçãodecadaamostraaestudardeacordocomoseguinteesquemaeemfunçãodadiluição
máximanecessária:
Tubo#
Sorofisiológico
Sobrenadante(sessãoanterior)
Diluiçãoanterior
1
900µL
100µL
-
2
900µL
-
100µL
2
900µL
-
100µL
2
900µL
-
100µL
2
900µL
-
100µL
...
900µL
-
100µL
N
900µL
-
-
4.
Selecionardecadaamostraastrêsdiluiçõesparainocularnasbactérias
5.
Emeppendorfsesterilizados:
a.
300µLdesuspensãobacterianarecente
b.
100µLdadiluiçãodasuspensãoviralemestudo
c.
Homogeneizar
6.
Repetirpasso5paratodasasamostrasatestar
7.
Incubarostubosa37ºCdurante5minutos
8.
Pipetaratotalidadedoconteúdodecadaeppendorfparatubodeensaiocontendoagarsemissólidoliquefeitoe
aquecidoa50ºC
9.
Rolarotuboentreasmãosparahomogeneizar
10. Verterdeimediatonasuperfíciedeumaplacadeagarnutritivopreviamentemarcada
11. Homogeneizaredeixarsolidificaràtemperaturaambiente(15a20minutos)
12. Incubaremestufaa37ºCdurante24horas(conservarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte)
13. Repetirprocedimentosde8a12paratodasasamostrasselecionadas.
14. ObservarasplacasdePetriecontaronúmerodeplacasvirais
15. Registarasobservaçõeseosresultados
16. CalcularamédiadonúmerodepartículasviraispormLdecadasobrenadanteinicial
17. Prepararacurvadecrescimentodobacteriófago.
18. Determinaroperíododeexplosão(burstsize)
Virologia2016/17
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RegistodeobservaçõeseResultados
CURVADECRESCIMENTODEUMBACTERIÓFAGOLÍTICO
Operador:
Data:
Sobrenadante
____/____/____
Amostra
Contagensdeplacasvirais
(Diluições)
Tempode
infeção
Inicial
-
0
PlacadePetriX-1
PlacadePetriX
PlacadePetriX+1
(____________)
1
(____________)
2
(____________)
3
(____________)
4
(____________)
5
(____________)
6
(____________)
Notas:
Virologia2016/17
35
REVELAÇÃODEVÍRUSVEGETAL(TMV)
Introdução
OTMV(TobaccoMosaicVírus)éumvírussimpleshelicoidal,degenomaaRNAdecadeiasimplesqueinfectaas
plantasdotabacoedotomateiroalémdeoutrostiposdeplantas.Foioprimeirovírusaseridentificado,purificadoe
cristalizadoeédosvírusmaisestudados.Ainfeçãoviralcausalesõeslocalizadasnasfolhas,dando-lhesumaspecto
heterogéneo(mosaico),podendotambémcausarinfeçãosistémicasetransmitidoàplantainteira.Devidoàexistência
deumaparedecelularrígida(celulósica)nascélulasvegetais,ainfeçãosópodeestabelecer-sequandoocorrerotura
nessaparede,napresençadovírusinfecioso.
Nestetrabalhopretende-sepesquisarapresençadeTMVemprodutoscomerciaisdetabacoporabrasãodasfolhasda
planta.
Materialereagentesespecíficos
¾
Vasoscomplantasdotabacoemcrescimento(1porgrupo)
¾
Produtosdetabacocomerciais(cigarros,charutos,tabacodecachimbo),dediferentesfabricantes.
¾
Almofarizepistão
¾
Sorofisiológico
¾
Areiafina
¾
Algodãoesterilizado(bolas)
Procedimento
1.
Identificarovasodecadagrupo
2.
Pendurarumapequenaetiquetaemcadaumdedoisramosdaplanta,marcadascomcontroloeteste
3.
“Pisar”umaporçãodetabaco(umcigarrodesfeito)noalmofarizcomumapequenaporçãodesorofisiológico
4.
Aspergirsorofisiológiconumadasfolhasdoramomarcadocomocontrolo.
5.
Espelharumapequenaporçãodeareiamuitofinasobreafolhamolhada
6.
Embeberumaboladealgodãocomsorofisiológico
7.
Esfregarligeiramenteafolhadaplantacomoalgodão
8.
Repetirospassos4.e5.numafolhadoramomarcadocomoteste
9.
Embeberumaboladealgodãocomomaceradodetabacopreparado
10. Esfregarligeiramenteafolhadaplantacomoalgodão
11. Cuidardamanutençãodaplanta
12. Observarsemanalmenteasfolhasutilizadasnoensaio
13. Registarasobservaçõesefetuadas
Virologia2016/17
36
RegistodeobservaçõeseResultados
REVELAÇÃODEVÍRUSVEGETAL(TMV)
Operador:
Data:
____/____/____
Observações
Data
Folhacontrolo
Folhateste
Conclusão:
Notas:
Virologia2016/17
37
ISOLAMENTODEBACTERIÓFAGOSELVAGEM(TRABALHOFINALAUTÓNOMO)
Introdução
Comoparasitasintracelularesobrigatórios,osvírusencontrar-se-ãonosmesmosecossistemasnaturaisondese
desenvolvemosseushospedeiros.
Oscoliformessãobactériasqueseencontramemgrandesquantidadesnotratointestinaldosmamíferos,peloqueé
deesperarencontrarbacteriófagosdeE.colinamatériafecalnãotratadaoueminsectosqueapovoem.
ÉobjetivodestaexperiênciademonstrarapresençadefagoslíticosdeE.coli,emdejetosdemamíferosecapacitaros
estudantesparaarealizaçãodeumtrabalhoautónomoemVirologia.
Materialereagentesespecíficos
¾
Matériafecal,maceradodemoscas,etc.
¾
Estufadeincubaçãoa37ºC
¾
MeiodeculturaTYG(1%triptona;0.5%
extratodelevedura;0,2%glucose)
¾
Sorofisiológicoestéril
¾
¾
PlacasdePetricomagaremTYG
CulturarecentedeE.coli(JF335)emmeioTYG
(diaanterior)
¾
¾
Tubosdeensaiocontendo5mLdeagarnutritivo
semi-sólido(0,75%)fundidoeembanhoa50ºC
CulturarecentedeE.coli(JF417)emmeioTYG
(diaanterior)
¾
Tubosdeensaioesterilizados(10mLmínimo)
¾
Banho-mariaa50ºCea42ºC
¾
Microtuboseppendorfesterilizados
¾
Micropipetas(200e1000)erespectivaspontas
esterilizadas
Procedimentosugerido
Enriquecimento
1.
Tomar“umanoz”dematériafecal,50mLdefluidorecolhidodoesgotonãotratado(doméstico,deexploração
pecuáriaououtro)ouumadúziademoscasdomésticas.1
2.
Homogeneizaremaceraromaterialsólidoem25mLdesorofisiológico.
Tomaramostradecercade25mLdemateriallíquidooupastoso
3.
Centrifugar5000rpmX10minutos.Recuperarsobrenadante.
4.
Repetircentrifugaçãoatésobrenadantelímpido.
5.
A20mLdesuspensãolímpidaadicionar:
6.
a.
2,5mLdeLB10Xconcentrado
b.
2,5mLdeculturadeE.colirecente
Incubara37ºCdurante24horas(guardarnofrigoríficoatéàsessãoseguinte,senecessário)
Clarificação
1.
Centrifugar20mLdesuspensãoa5000rpmX10minutos.Recuperarosobrenadante
2.
Repetiracentrifugaçãoatéàclarificaçãodosobrenadante
3.
Esterilizarsobrenadante,porfiltração(usarseringaefiltrode0,22nm)atécolmataçãodofiltro
4.
Homogeneizartodasasamostras
5.
Conservara4ºC
1
Tratar o material recolhido do esgoto como potencialmente infecioso para o homem. Usar luvas e evitar o contato direto.
Virologia2016/17
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Amplificaçãodevírus
Prepararumasuspensãoviraldealtotítulo
Isolamentodevírus
Seàobservaçãoforevidenteaexistênciadediferentestiposdeplacasvirais(opacidadeedimensões),selecionar
apenasumtipoeamplificar
Titulação
Titularassuspensõesobtidas,tentandoreportaraosníveisdecontaminaçãodomaterialbiológicoinicialmente
utilizado.
Curvadecrescimentodovírus
Estabeleceracurvadecrescimentodovírusisolado.
Virologia2016/17
39
RegistodeobservaçõeseResultados
ISOLAMENTODEBACTERIÓFAGOSELVAGEM
Operador:
Data:
____/____/____
Enriquecimento
Clarificação
Titulação/Isolamento
Amplificação
Titulaçõesespecíficas
Curvadecrescimento
Notas:
Virologia2016/17
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APÊNDICE–MEIOSDECULTURA(FÓRMULAS)
MeiodeculturaLB(stock)
LB10X:
Bacto-triptona
100g
Extratodelevedura
50g
NaCl
100g
H2Odestiladaaté 1000mL
pH7,5.
Autoclavar.Conservarestérila4°C.
MeioLBlíquido
MeioLB10X
Águadestiladaestéril
100mL
900mL
Conservarestérila4ºC.
AgarLBsemi-sólido
MeioLBlíquido
1000mL
Agar
7,5g
Autoclavar.DistribuirassepticamenteporplacasdePetri.Conservara4ºC.
AgarLBnutritivo
MeioLBlíquido
1000mL
Agar
7,5g
Autoclavar.DistribuirassepticamenteporplacasdePetri.Conservara4ºC.
CarlosSinogas
Virologia2016/17
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