MINISTÉRIO DA SAÚDE FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ INSTITUTO

MINISTÉRIO DA SAÚDE
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
APOPTOSE E PERFIL DO REPERTÓRIO DA CADEIA VARIÁVEL
ΒETA DO RECEPTOR DE CÉLULAS T EM LINFÓCITOS T CD8+ DE
PACIENTES COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA
RAQUEL FERRAZ NOGUEIRA
Rio de Janeiro
2011
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
RAQUEL FERRAZ NOGUEIRA
APOPTOSE E PERFIL DO REPERTÓRIO DA CADEIA VARIÁVEL
ΒETA DO RECEPTOR DE CÉLULAS T EM LINFÓCITOS T CD8+ DE
PACIENTES COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA
Dissertação apresentada ao Programa de
Pósgraduação em Biologia Parasitária do Instituto
Oswaldo Cruz, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre,
área de concentração: Imunologia e Patogenia
Orientador: Dr. Álvaro Luiz Bertho dos Santos
Rio de Janeiro
2011
ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
APOPTOSE E PERFIL DO REPERTÓRIO DA CADEIA VARIÁVEL
ΒETA DO RECEPTOR DE CÉLULAS T EM LINFÓCITOS T CD8+ DE
PACIENTES COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA
AUTORA: RAQUEL FERRAZ NOGUEIRA
ORIENTADOR: DR. ÁLVARO LUIZ BERTHO DOS SANTOS
Banca Examinadora:
Dra. Alda Maria da Cruz
Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz, RJ
Dra. Andrea Henriques Pons
Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz, RJ
Dr. Jorge Clarêncio Souza Andrade
Centro de Pesquisa Gonçalo Muniz – Fiocruz, BA
Rio de Janeiro
2011
iii
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Dr. Álvaro Luiz Bertho dos Santos, grande influência para a minha
formação profissional e quem me deu a oportunidade e o privilégio de iniciar a carreira na
FIOCRUZ. Obrigada pelas aulas de imunologia, de leishmaniose e de citometria de citometria
de fluxo. Sua atenção, paciência e incentivo alimentaram a minha dedicação e envolvimento
neste trabalho que você me confiou. Gratidão e amizade eterna;
Agradeço à Clarissa Ferreira, fundamental em muitas etapas deste trabalho, sempre disposta a
ajudar. Ganhei a oportunidade de ensiná-la o pouco que sei e tive o privilégio de aprender
muito. Em pouco tempo se tornou uma grande companheira e amiga;
Aos meus pais, agradeço o amor e carinho incondicionais, a confiança, o incentivo constante e
o investimento de sempre na minha vida acadêmica. Agradeço a vocês e a minha irmã, Bianca
Ferraz, por compreenderem a minha ausência nestes últimos anos e por me encorajar nos
momentos difíceis;
Aos amigos da turma de mestrado em Biologia Parasitaria (2009-2011);
À Tatiana Cury, Renata Ferraz, Mariana Faria, Thais Miquelino, Raquel Sepulveda e Bianca
Ferraz, que moraram comigo e acompanharam de perto meu estudo;
Aos pacientes que aceitaram participar deste estudo e aos voluntários sadios: obrigada pela
doação das amostras de sangue periférico!
Agradeço à equipe do Centro de Referência de Leishmanioses e do Ambulatório do IPEC: Dr.
Armando Schubach, Dra. Claudia Valete, Dr. Marcelo Rosandisk, à equipe de Coleta do ambulatório,
à Ginelza Perez, à Michelle Moreira, e em especial à Dra. Maria Inês Pimentel por disponibilizar o
acesso às informações clínicas e epidemiológicas dos pacientes;
À pós-Graduação em Biologia Parasitária e sua equipe;
À Plataforma de Citometria de Fluxo do IOC, à Dra. Andrea Henriques Pons e ao Alessandro
Marins;
À Plataforma de Citometria de Fluxo do PDTIS, à Dra Íris Marins Peixoto e ao Dr. Geraldo
Pereira;
A todos que fazem, ou fizeram, parte do laboratório de imunoparasitologia do IOC,
pesquisadores, alunos e técnicos. A convivência com estas pessoas alimentou a minha alegria
em trabalhar aqui;
Ao Dr. Sérgio Mendonça, pela atenção, incentivo e pelas sugestões;
iv
À Dra Léa Cysne pelas palavras amorosas de sempre e à Dra Fátima Conceição pelas
sugestões e apoio antes das minhas apresentações;
À Rosa Plácido agradeço pelo material necessário para a execução dos experimentos; e à Vera
e à Rose, sempre bem humoradas. Obrigada pela atenção e disponibilidade em ajudar;
À Thalita e a Simone, que foram tão atenciosas em, muitas vezes, trazer as amostras de
sangue pra mim;
À Simone agradeço ainda pela coleta das amostras de sangue dos voluntários sadios, assim
como ao Ricardo Nogueira e à Dra Joseli Ferreira;
Agradeço ao Juan Camilo que sempre trazia uma solução simples para os problemas que eu
achava difíceis; à Amanda e à Elisângela, companheiras na alegria e no desespero;
Aos integrantes do laboratório interdisciplinar de pesquisas médicas (LIP-MED), as primeiras
pessoas que conheci quando iniciei o estágio curricular. Agradeço a convivência cordial, a
cooperação e descontração.
À Dra. Alda Maria Da-Cruz, pelas revisões, correções e sugestões, que tanto me ajudaram ao
longo da elaboração deste trabalho; e ao Adriano Gomes e a Joanna Reis, pela colaboração,
atenção, artigos e anticorpos monoclonais.
Aos integrantes da Banca examinadora que aceitaram o convite para a avaliação do presente
estudo
À Dra. Marize Nunes, à Dra. Paula de Lucca, à Dra Roberta Olmo pela contribuição com os
reagentes que precisei durante a execução deste trabalho.
À Rosângela, à Sylvia e ao Ricardo pelo serviço de secretariado.
À Beckman Coulter, pela doação do kit IOTest Beta Mark que possibilitou o estudo do
repertório Vβ, e pelo financiamento das inscrições em congressos.
À Fundação Oswaldo Cruz, meu endereço mais fixo no Rio de Janeiro.
Ao IOC pelo financiamento de passagens aéreas para que eu pudesse participar de congressos.
À CAPES pela concessão da bolsa de estudos.
v
“Não é o mais forte que sobrevive, nem o mais inteligente, mas o
que melhor se adapta às mudanças.” (Charles Darwin)
vi
SUMÁRIO
Lista de Abreviaturas ................................................................................................................ix
Resumo .....................................................................................................................................xi
Abstract ....................................................................................................................................xii
Lista de Tabelas ......................................................................................................................xiii
Lista de Figuras .......................................................................................................................xiv
1. Introdução ...........................................................................................................................18
1.1 Epidemiologia das leishmanioses ......................................................................................18
1.2 Agentes etiológicos e ciclo de vida ....................................................................................20
1.3 Formas clínicas da leishmaniose tegumentar .....................................................................22
1.3.1 Leishmaniose subclínica ................................................................................................ 22
1.3.2 Leishmaniose cutânea (LC) ............................................................................................23
1.3.3 Leishmaniose mucosa (LM) ............................................................................................23
1.3.4 Leishmaniose cutânea disseminada (Ldiss) ....................................................................24
1.3.5 Leishmaniose cutânea difusa (LCD) ...............................................................................24
1.4 Diagnóstico da leishmaniose tegumentar Americana ........................................................25
1.5 Tratamento da leishmaniose tegumentar Americana .........................................................26
1.6 Imunopatogenia da leishmaniose tegumentar Americana .................................................26
1.6.1 Resposta imune inata .....................................................................................................27
1.6.2 Resposta imune adaptativa .............................................................................................28
1.6.2.1 O repertório de linfócitos T ..........................................................................................29
1.6.2.2 Reconhecimento antigênico e ativação de clones específicos ....................................33
1.6.2.3 Os linfócitos T de memória ..........................................................................................38
1.6.2.4 A apoptose de linfócitos T na LTA ..............................................................................40
1.7 Citometria de Fluxo ...........................................................................................................43
2. Justificativa .........................................................................................................................45
3. Objetivo geral .....................................................................................................................47
3.1 Objetivos específicos .........................................................................................................47
4. Metodologia ........................................................................................................................48
4.1 Casuística ...........................................................................................................................48
4.2 Coleta do material biológico ..............................................................................................49
4.3 Obtenção de células mononucleares de sangue periférico .................................................49
4.4 Ensaio ex vivo para avaliação fenotípica das subpopulações de linfócitos
T CD8+, repertório Vβ e apoptose ...........................................................................................50
4.5 Preparo de antígenos particulados de Leishmania (Viannia) braziliensis .........................53
4.6 Ensaio in vitro para avaliação fenotípica das subpopulações de linfócitos T CD8+
e apoptose .................................................................................................................................53
4.7 Citometria de Fluxo ...........................................................................................................55
4.7.1 Definição de Regiões e Compensação de Cores .............................................................55
4.7.2 Análise Citofluorimétrica das Amostras Obtidas Ex vivo ...............................................57
4.7.3 Análise Citofluorimétrica das Amostras Obtidas Após Estimulação In vitro com
Antígenos de Leishmania .........................................................................................................60
4.8 Análise Estatística ..............................................................................................................61
5. Resultados ...........................................................................................................................62
5.1 Características clínicas e epidemiológicas dos indivíduos avaliados ................................62
5.2 Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+ obtidos ex vivo e in vitro... .......................64
vii
5.3 Perfil de distribuição das subpopulações de linfócitos T CD8+..........................................66
5.4 Análise comparativa das subpopulações de linfócitos T CD8+ entre os grupos
estudados ..................................................................................................................................68
5.5 Avaliação do percentual dos linfócitos T CD8+ em apoptose ............................................73
5.6 Distribuição das subpopulações de linfócitos T CD8+ em apoptose ..................................75
5.7 Análise comparativa das subpopulações de linfócitos T CD8+ em apoptose entre os grupos
estudados ..................................................................................................................................77
5.8 Avaliação do perfil do repertório Vβ de linfócitos T CD8+................................................83
5.9 Comparação do repertório Vβ de linfócitos T CD8+..........................................................85
5.10 Alterações do repertório Vβ das subpopulações de linfócitos T CD8+ durante e após o
tratamento da leishmaniose cutânea .........................................................................................86
5.10.1 Alteração da frequência de Vβ 12, Vβ 21.3 e/ou Vβ 22, em linfócitos T CD8+
efetores .....................................................................................................................................87
5.10.2 Alteração da frequência de Vβ2, Vβ 3, Vβ 5.3, Vβ 9, Vβ 13.2 e/ou Vβ 23, em
linfócitos T CD8+ naïve ...........................................................................................................88
5.10.3 Alteração da frequência de Vβ 2, Vβ 5.2, Vβ 9, Vβ 18 e/ou Vβ 22, em linfócitos T
CD8+ de memória efetora .........................................................................................................90
5.10.4 Alteração da frequência de Vβ 2, Vβ 9, Vβ 13.2, Vβ 18 e/ou Vβ 23, em linfócitos T
CD8+ de memória central em pacientes ...................................................................................92
6. Discussão .............................................................................................................................96
7. Conclusões .........................................................................................................................108
8. Referências Bibliográficas ...............................................................................................109
Anexo I ...................................................................................................................................129
viii
Lista de Abreviaturas
7-AAD
7-aminoactinomicina D
APC
Antigen Presenting Cell - Célula apresentadora de antígeno
Ag-Lb
Antígeno de Leishmania Braziliensis
AICD
Activated Induced Cell Death - Morte Celular Induzida por Ativação
CD
Cluster of Differentiation
CDR
Complementarity-determining region – Região determinante de
complementariedade
Cols.
Colaboradores
CMSP
Células mononucleares do sangue periférico
ConA
Concanavalina A
CTRL
Controle - Indivíduos Sadios
DC
Dendritic cell
ECD
Electron Coupled Dye (similar ao PE-TR)
ELISA
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay – Ensaio imunoenzimático
FITC
Isotiocianato de fluoresceína
FSC
Forward Scatter
gp-63
Glicoproteína 63
IDRM
Intradermorreação de Montenegro
IFN-γ
Interferon-gama
IgG
Imunoglobulina G
IL
Interleucina
LC
Leishmaniose Cutânea
LCD
Leishmaniose Cutânea Difusa
LDis
Leishmaniose Disseminada
LM
Leishmaniose Mucosa
LPG
Lipofosfoglicano
LT
Leishmaniose Tegumentar
LTA
Leishmaniose Tegumentar Americana
LV
Leishmaniose Visceral
MFI
Mean Fluorescence Intensity (Intensidade Média de Fluorescência)
MHC
Major Histocompatibility complex - Complexo Principal de
Histocompatibilidade
NK
Célula Natural-Killer
NNN
Meio de cultura McNeal, Novy & Nicolle
ix
OMS
Organização Mundial da Saúde
PBS
Phosphate Buffered Saline
PBSAZ
Sódica
Phosphate Buffered Saline – Tampão Fosfato Salino - contendo 0,1% de Azida
PCR
Polimerase Chain Reaction – Reação em Cadeia da Polimerase
PDT
Pacientes Durante o Tratamento
PE
Ficoeritrina
PE-TR
Ficoeritrina-Texas Red
RIFI
Reação de imunofluorescência indireta
SSC
Side Scatter
TCR
T Cell Receptor - Receptor de célula T
Th-1
Linfócitos T helper do tipo 1
Th-2
Linfócitos T helper do tipo 2
TLR
Receptor do tipo Toll
TME
Linfócitos T de Memória Efetora
TMC
Linfócitos T de Memória Efetora
TNF-α
Tumor Necrosis Factor alpha - Fator de necrose tumoral-alfa
Vβ
Cadeia varíavel Beta do TCR
x
RESUMO
A resposta imune envolve a participação de subpopulações de células T naïve, efetoras e de
memória, as quais são funcionalmente distintas, e a atividade destas células depende do
reconhecimento antigênico, que ocorre no contexto MHC-peptídeo-TCR. A manutenção
destas subpopulações e a homeostasia do sistema imune são controlados, entre outros fatores,
pela apoptose. No entanto, este processo de morte também tem sido relacionado à diversas
patologias, sendo responsável pela modulação de eventos imunológicos, interferindo no curso
da infecção. Em pacientes com leishmaniose cutânea (LC), apesar da indução preferencial de
linfócitos T CD4+, os linfócitos T CD8+ estão envolvidos nos processos de progressão e
controle da infecção. Neste contexto, a citometria de fluxo foi utilizada definir
simultaneamente as subpopulações de linfócitos T CD8+ naïve, efetora, de memória central e
de memória efetora; a diversidade do repertório Vβ destes linfócitos; e a ocorrência de
apoptose, na resposta imune da LC. Neste estudo foram analisadas amostras de sangue
periférico, obtidas ex vivo de pacientes durante e após o tratamento, e de indivíduos sadios; e
após cultivo in vitro frente a antígenos de Leishmania braziliensis. Os resultados mostram que
a apoptose exerce um papel modulador, diminuindo a frequência de linfócitos T CD8+, o que
parece contribuir para a persistência da lesão ativa, no décimo dia de tratamento; enquanto a
cura clínica parece ser consequência da diminuição de apoptose nestes linfócitos T CD8+
contribuindo para o restabelecimento da frequência destas células. A análise da distribuição
das subpopulações de linfócitos T CD8+ revelou que a proporção de células naïve e efetoras é
invertida ao longo do tratamento e do processo de resolução da lesão. Paralelamente, apesar
do maior percentual de linfócitos T CD8+ efetores observados em pacientes durante o
tratamento, a ocorrência de apoptose nestas células pode comprometer uma resposta imune
eficaz, estando associada à presença de lesão ativa ulcerada. O caráter modulador que este
processo de morte exerce na resposta imune em ambos os grupos de pacientes sugere que a
ocorrência de apoptose, mais intensa na fase ativa da doença, esteja relacionada à manutenção
da infecção. A reunião das análises de repertório Vβ nas diferentes subpopulações de
linfócitos T CD8+ mostraram uma indução oligoclonal na qual as células que expressam Vβ 9,
Vβ 13.2 ou Vβ 23 podem ser os clones selecionados a se diferenciar em células de memória
central após a cura clínica; enquanto que os clones que expressam a cadeia Vβ 22, parecem
ser preferencialmente selecionados a se diferenciar em células de memória efetora, durante a
fase ativa da doença. Os únicos clones de linfócitos T CD8+ efetores que apresentaram uma
expansão significativa foram aqueles que expressam a cadeia Vβ 12, a qual parece estar
associada à resposta imune efetora desencadeada na fase ativa da LC. Sendo assim, a
heterogeneidade entre o repertório Vβ das diferentes subpopulações de linfócitos T CD8+
ressalta a importância de avaliar separadamente o repertório das células naïve, efetoras, de
memória central e de memória efetora.
xi
ABSTRACT
The immune response involves the participation of subpopulations of naïve effector and
memory T cells, which are functionally distinct, and the activity of these cells depends on
antigen recognition, which occurs in the context of MHC-peptide-TCR. The maintenance of
these subpopulations and the homeostasis of the immune system are controlled, among other
factors, by apoptosis. However, this process of death has also been linked to several diseases,
being responsible for the modulation of immunological events, affecting the course of
infection. In patients with cutaneous leishmaniasis (CL), despite of preferential induction of
CD4+ T lymphocytes, CD8+ T cells are involved in the processes of progression and outcome
of infection. In this context, flow cytometry was used to define the subpopulations of naive,
effector, central memory and effector memory T CD8+ lymphocytes; the diversity of the Vβ
repertoire of these lymphocytes, and the occurrence of apoptosis, during the immune response
of the CL. We analyzed peripheral blood samples, obtained ex vivo from patients during and
after treatment and from healthy individuals, and after in vitro against antigens of Leishmania
braziliensis. The results show that apoptosis plays a modulating role, reducing the frequency
of CD8+ T cells, which appears to contribute to the persistence of active lesions on the tenth
day of treatment; while clinical cure appears to be the result of decreased apoptosis in these
CD8+ T lymphocytes, contributing to the restoration of the frequency of these cells. The
analysis of the distribution of subpopulations of CD8+ T cells showed that the proportion of
naïve and effector cells is reversed during the treatment process and the resolution of the
lesion. In parallel, despite the higher percentage of effector CD8+ T lymphocytes observed in
patients during treatment, the occurrence of apoptosis in these cells may impair an effective
immune response, being associated with the presence of active lesions ulcerated. The
modulator character that this death process has on the immune response in both groups of
patients suggests that the occurrence of apoptosis, more intense in the active phase of the
disease, is related to the maintenance of infection. Taking together the data analysis of Vβ
repertoire in different subsets of CD8+ T cells showed an oligoclonal induction, in which cells
expressing Vβ 9, Vβ 13.2 and Vβ 23 can be the clones selected to differentiate into central
memory cells after clinical cure; while clones expressing Vβ 22, seem to be preferentially
selected to differentiate into effector memory cells during the active phase of the disease. The
only clones of effector CD8+ T lymphocytes that showed a significant expansion were those
that express the Vβ 12, which seems to be associated with an effector immune response
triggered in the active phase of the CL. Thus, the heterogeneity between the Vβ repertoires of
different subsets of CD8+ T cells underscores the importance of separately assessing the
repertoire of naïve, effector, central memory and effector memory T cells.
xii
Lista de Tabelas
Tabela 1.1: Perfis de resposta imune celular associada às diferentes formas clínicas da
leishmaniose tegumentar Americana .......................................................................................37
Tabela 4.1: Anticorpos monoclonais específicos para 24 cadeias Vβ utilizados no protocolo
experimental, conforme distribuição em oito tubos de ensaio (A-H) contendo a mesma
amostra. Kit IOTest® Beta Mark .............................................................................................51
Tabela 4.2: Combinação de 7-AAD e anticorpos monoclonais, utilizados como marcadores
para avaliar diferentes características celulares por citometria de fluxo, em ensaio
experimental ex vivo .................................................................................................................52
Tabela 4.3: Combinação de 7-AAD e anticorpos monoclonais, utilizados como marcadores
para avaliar diferentes características celulares por análise citofluorimétrica, no ensaio in
vitro ..........................................................................................................................................54
Tabela 5.1: Características clínicas e epidemiológicas dos 22 pacientes de leishmaniose
cutânea incluídos no estudo .....................................................................................................63
Tabela 5.2: Contrações (setas vermelhas) e expansões (setas azuis) de cadeias Vβ expressas
por linfócitos T CD8+ e pelas subpopulações naïve; efetora; de memória efetora e de memória
central .......................................................................................................................................95
xiii
Lista de Figuras
Figura 1.1: Distribuição geográfica da leishmaniose tegumentar nas Américas ....................19
Figura 1.2: Ciclo de vida da Leishmania SP ...........................................................................22
Figura 1.3: Fotografias do aspecto macroscópico de lesão de leishmaniose tegumentar
Americana. Lesão de leishmaniose cutânea (A); lesão de leishmaniose mucosa (B);
lesão de leishmaniose difusa (C); lesões de leishmaniose disseminada (D) ............................24
Figura 1.4: Estrutura do complexo receptor de célula T e cadeias que compõem o CD3 (TCRCD3) .........................................................................................................................................29
Figura 1.5: Apresentação e reconhecimento antigênico no contexto MHC-peptídeoTCR ..........................................................................................................................................34
1.6: Resposta
Figura
imune
celular
durante
a
leishmaniose
tegumentar
Americana.................................................................................................................................38
Figura 4.1: Esquema do protocolo citofluorimétrico utilizado no ensaio ex vivo ..................52
Figura 4.2: Esquema do protocolo citofluorimétrico utilizado no ensaio in vitro ..................54
Figura 4.3: Ajuste de quadrantes e compensação de cores .....................................................56
Figura 4.4: Estratégia do “contra-gate” para definição da região de análise (gate) nos
linfócitos ...................................................................................................................................57
Figura 4.5: Dot plot de granularidade (SSC) vs tamanho (FSC); com gate de linfócitos em
azul (A); histograma baseado no gate de linfócitos, e linfócitos T CD8+ separados das células
natural killer pela diferença entre alta e baixa intensidade de fluorescência; Dot plot de antiCD8
vs
FSC
e
gate
de
linfócitos
T
CD8+
com
alta
intensidade
de
fluorescência ............................................................................................................................59
Figura 4.6: Esquema representativo do protocolo citofluorimétrico utilizado na análise de
cada amostra obtida ex vivo......................................................................................................64
Figura 4.7: Representação gráfica do protocolo citofluorimétrico de análise multiparamétrica
das amostras obtidas após cultivo in vitro ...............................................................................60
xiv
Figura 5.1: Avaliação, ex vivo (A) e após cultivo in vitro (B), do percentual de linfócitos T
CD8+ .........................................................................................................................................64
Figura 5.2: Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+ cultivados in vitro, sem estímulo
antigênico
(background
-
BG);
e
sob
estímulo
de
antígenos
de
Leishmania
(Viannia) braziliensis (Lb-Ag) .................................................................................................65
Figura 5.3: Perfil de distribuição de células efetoras (CD8+CD45RA+CD27-), naïve
(CD8+CD45RA+CD27+), de memória efetora (TME) (CD8+CD45RA-CD27-) e de memória
central (TMC) (CD8+CD45RA-CD27+) .....................................................................................67
Figura 5.4: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T CD8+CD45RA+CD27(efetores) ..................................................................................................................................68
Figura 5.5: Avaliação do percentual de linfócitos (Linf.) T CD8+CD45RA+CD27- (efetores),
cultivados in vitro, sem estímulo antigênico (background - BG); e sob estímulo de antígenos
de Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb-Ag).........................................................................69
Figura 5.6: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos (Linf) T CD8+CD45RA+CD27+
(naïve) ......................................................................................................................................70
Figura 5.7: Avaliação do percentual de linfócitos (Linf.) T CD8+CD45RA+CD27+ (naïve),
cultivados in vitro, sem estímulo antigênico (background- BG); e sob estímulo de antígenos
de Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb-Ag) ........................................................................70
Figura 5.8: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T CD8+CD45RA-CD27- (de
memória efetora - TME) ...........................................................................................................71
Figura 5.9: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T CD8+CD45RA-CD27+ (de
memória central – TMC) ............................................................................................................71
Figura 5.10: Avaliação do percentual de linfócitos (Linf.) T CD8+CD45RA- (de memória)
cultivados in vitro, sem estímulo antigênico (background- BG); e sob estímulo de antígenos
de Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb-Ag) ........................................................................72
Figura 5.11: Avaliação, ex vivo (A) e após cultivo in vitro (B), do percentual de
linfócitos T CD8+ em apoptose ................................................................................................73
xv
Figura 5.12: Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+ em apoptose, cultivados in vitro,
sem estímulo antigênico (background - BG); e sob estímulo de antígenos de Leishmania
(Viannia) braziliensis (Lb-Ag) .................................................................................................74
Figura 5.13: Perfil de distribuição das subpopulações de linfócitos T CD8+ efetora
(CD8+CD45RA+CD27-),
+
-
-
(CD8 CD45RA CD27 )
naïve
e
de
(CD8+CD45RA+CD27+),
memória
central
(TMC)
de
memória
+
efetora
-
(TME)
+
(CD8 CD45RA CD27 )
em
apoptose ...................................................................................................................................76
Figura 5.14: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T (Linf.) CD8+CD45RA+CD27(efetores) em apoptose .............................................................................................................77
Figura 5.15: Avaliação do percentual de linfócitos T (Linf.) CD8+CD45RA+CD27- em
apoptose, cultivados in vitro, sem estímulo antigênico (background - BG); e sob estímulo de
antígenos de Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb-Ag) ........................................................78
Figura 5.16: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T CD8+CD45RA+CD27+ (naïve)
em apoptose ..............................................................................................................................79
Figura 5.17: Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+ CD45RA+CD27+ em apoptose,
cultivados in vitro, sem estímulo antigênico (background - BG); e sob estímulo de antígenos
de Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb-Ag) ........................................................................80
Figura 5.18: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T CD8+CD45RA-CD27- (de
memória efetora) em apoptose .................................................................................................81
Figura 5.19: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T CD8+CD45RA-CD27+ (de
memória central) em apoptose .................................................................................................81
Figura 5.20: Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+CD45RA- em apoptose, cultivados
in
vitro,
sem
estímulo
antigênico
(background
-
BG);
e
sob
estímulo
de
antígenos de Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb-Ag) ........................................................82
Figura 5.21: Perfil do repertório de 24 cadeias Vβ em linfócitos T CD8+ ..............................84
Figura 5.22: Percentual de expressão das cadeias Vβ 2; Vβ 13.2; Vβ 18; Vβ 9; Vβ 23; em
linfócitos (linf.) T CD8+............................................................................................................86
xvi
Figura 5.23: Percentual de expressão da cadeia Vβ 12; Vβ 21.3; e Vβ 22; em linfócitos (linf.)
T CD8+CD45RA+CD27- (efetores) ..........................................................................................88
Figura 5.24: Percentual de expressão da cadeia Vβ 2; Vβ 13.2; Vβ 5.3; Vβ 23; Vβ 3 e Vβ 9;
em linfócitos (linf.) T CD8+CD45RA+CD27+ (naïve) .............................................................90
Figura 5.25: Percentual de expressão da cadeia Vβ 2; Vβ 5.2; Vβ 9; Vβ 18 e Vβ 22; em
linfócitos (linf.) T CD8+CD45RA-CD27- (memória efetora) .................................................92
Figura 5.26: Percentual de expressão da cadeia Vβ 2; Vβ 13.2; Vβ 9; Vβ 18 e Vβ 23; em
linfócitos (linf.) T CD8+CD45RA-CD27+ (memória central) .................................................94
xvii
1. INTRODUÇÃO
1.1 EPIDEMIOLOGIA DAS LEISHMANIOSES
As leishmanioses constituem um grupo de doenças causadas por protozoários de
diferentes espécies do gênero Leishmania, e caracterizam-se por apresentar um amplo
espectro de manifestações clínicas que podem ser divididas em dois grupos: a leishmaniose
visceral (LV) e a leishmaniose tegumentar (LT) (Lainson, 1983; Grimaldi & Tesh, 1993;
Desjeux, 1996). As manifestações clínicas das leishmanioses dependem da espécie de
Leishmania; da resposta imune e das características genéticas do hospedeiro vertebrado; e da
espécie do inseto vetor envolvida na transmissão do parasito (Antinori et al, 2005; Reithinger
et al, 2007).
Atualmente a leishmaniose é considerada uma antropozoonose. Entretanto,
historicamente esta doença constitui uma zoonose típica, com reservatórios silvestres e
vetores bem definidos, enquanto os humanos assumem o papel de hospedeiros acidentais. A
forma tegumentar da doença já foi descrita em animais sinantrópicos como cães, gatos e
cavalos (Aguilar et al, 1987; Mancianti, 2004). Como as altas taxas de infecção nestes animais
acompanham o aumento das infecções no ambiente doméstico, acredita-se que os mesmos
atuem como reservatórios desta doença (Reithiger & Davis, 1999). Além disso, com o
crescimento populacional, a urbanização, as mudanças ambientais, a devastação de florestas e
a adaptação do vetor ao ambiente peridomiciliar, o homem passou a fazer parte do ciclo
(SVS/MS, 2010).
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) as leishmanioses estão entre as seis
doenças tropicais de maior importância para a saúde pública, porém ainda estão inseridas no
grupo das doenças negligenciadas. A doença está amplamente distribuída, atingindo oitenta e
oito países, principalmente aqueles situados em regiões tropicais e subtropicais. De acordo
com o Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana (SVS/MS, 2010),
estima-se que, no mundo, 350 milhões de indivíduos estejam expostos ao risco de se infectar,
com registro anual de dois milhões de novos casos de leishmaniose.
Devido às diferenças geográficas, epidemiológicas e clínicas da forma tegumentar, a
doença tem sido classificada como Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) no Novo
Mundo (Américas) e Leishmaniose Tegumentar do Velho Mundo (Europa, Ásia e África)
(Grimaldi, Tesh & McMahon-Pratt, 1989; SVS/MS, 2010).
No Brasil, são observadas as formas clínicas tegumentar e visceral, constituindo um
quadro endêmico com características próprias relacionadas às questões de saúde pública. A
LTA é observada desde o Sul dos Estados Unidos (Texas) até o norte da Argentina (Figura
1.1), alcançando maior importância no Peru e no Brasil, onde apresenta ampla distribuição
18
por todo o território nacional. De acordo com a última edição do Manual de Vigilância da
Leishmaniose Tegumentar Americana (SVS/MS, 2010), no período de 1985 a 2005 foi
verificada uma média anual de aproximadamente 30.000 casos autóctones registrados, embora
não haja dados mais recentes. A maioria dos casos é causada pela espécie L. (Viannia)
braziliensis, incluindo também a L. (Leishmania) amazonensis e L. (V.) guyanensis como as
principais espécies responsáveis pela doença no país (Da-Cruz & Pirmez, 2005).
Figura 1.1: Distribuição geográfica da leishmaniose tegumentar nas Américas. Adaptado de World Healthy Org
anization (WHO), 2010. http://www.who.int/leishmaniasis/leishmaniasis_maps/en/index.html.
Com a expansão geográfica da LTA, durante a década de 1980, a doença foi
assinalada em 19 estados brasileiros e, em 2003, foi confirmada a autoctonia nos 27 estados
do país. Apesar da ampla dispersão no território nacional há intensa concentração de casos em
determinadas áreas, principalmente nas regiões Norte e Nordeste, enquanto que em outras, os
casos apresentam-se isolados. A doença é incidente na Amazônia; na Bahia; em Minas Gerais,
na região do Triângulo Mineiro e nas regiões próximas à bacia do rio Mucuri e do rio Doce;
em São Paulo, na região sul que abrange a área de Mata Atlântica; bem como nos estados do
Espírito Santo; Mato Grosso do Sul e Goiás. Também são encontrados focos da doença no
estado do Rio de Janeiro, como, por exemplo, nos municípios de Mesquita; Paraty; Ilha
Grande; Paracambi e na própria capital (Oliveira-Neto et al, 2000(a); Vieira-Gonçalves et al,
2008; Rangel & Lainson, 2009). Os casos autóctones e epidemias de LTA no estado do Rio
de Janeiro podem ser explicados pela ocupação de áreas florestais e consequente urbanização
das mesmas, expondo a população aos vetores infectados com L. braziliensis (Lutzomyia
intermedia e Lu. migonei) ou L. amazonensis (Lu. flaviscutellata).
19
1.2 AGENTES ETIOLÓGICOS E CICLO DE VIDA
Taxonomicamente, a Leishmania pertence ao reino Protista, filo Protozoa, subfilo
Sarcomastigophora, classe Mastigophora, ordem Kinetoplastida, subordem Trypanosomatina,
família Trypanosomatidae e gênero Leishmania (Maslov, Podlipaev & Lukes, 2001; Rey,
2008). Foram identificas pelo menos dezessete espécies patogênicas ao homem (Grimaldi,
Tesh & McMahon-Pratt, 1989). As espécies de Leishmania podem pertencer ao subgênero
Viannia ou ao subgênero Leishmania dependendo da localização no intestino do hospedeiro
invertebrado em que se desenvolvem (Killick-Kendrick, 1979; Ryan et al, 1987).
Os
protozoários deste gênero são heteroxenos, incluindo em seu ciclo de vida a participação de
um hospedeiro invertebrado e um hospedeiro vertebrado, e apresentam-se sob duas formas
evolutivas: amastigota e promastigota (Rey, 2008).
O homem e outros mamíferos, como os cães e roedores silvestres, representam os
hospedeiros vertebrados da Leishmania, enquanto as fêmeas (hematófagas) de flebotomíneos
são os vetores da doença. Estes insetos (Ordem: Díptera; Família: Psychodidae) pertencem à
subfamília Phlebotominae e podem ser do gênero Lutzomyia no Novo Mundo ou do gênero
Phlebotomus no Velho Mundo (Laison, 1983; Rey, 2008; Rangel & Lainson, 2009). Apesar
das 500 espécies de flebotomíneos já identificadas, somente 40 participam do ciclo da
Leishmania como vetores (Grimaldi & Tesh, 1993; Rocha et al, 2010). Poucas espécies são
responsáveis pela transmissão dos agentes infecciosos da LTA, indicando que as espécies de
Leishmania parecem ter preferência por espécies particulares de flebotomíneos (Rangel &
Lainson, 2009).
No flebotomíneo, os parasitos do gênero Leishmania localizam-se na luz do tubo
digestório e se apresentam sob a forma promastigota. Nesta fase do ciclo, os parasitos têm
forma alongada, medindo de 8 a 15 µm, com flagelo emergindo do pólo anterior do corpo
celular que lhes confere motilidade, podendo chegar a 20 µm. As amastigotas parasitam
células do sistema fagocítico do hospedeiro vertebrado, possuem forma arredondada ou
ovóide, medem de 3 a 5 µm e possuem flagelo interiorizado (Rey, 2008).
O ciclo evolutivo da Leishmania (Figura 1.2) é iniciado no momento que o inseto
vetor (flebotomíneo), ao realizar o repasto sanguíneo em um hospedeiro vertebrado infectado,
ingere monócitos/macrófagos contendo as formas amastigotas do parasito. Ao serem liberadas
no trato digestivo do inseto, as amastigotas se diferenciam em promastigotas procíclicas que
aderem ao epitélio intestinal graças à expressão de lipofosfoglicano (LPG), que facilita a sua
fixação. Além deste glicoconjugado, a metaloprotease gp63 atua na proteção das
promastigotas contra as enzimas hidrolíticas do intestino do inseto. Nesta fase, ocorre intensa
20
multiplicação que se reflete na expansão inicial da população dos parasitos (Descoteaux &
Turco, 1999; Bates & Rogers, 2004). A fase seguinte, denominada metaciclogênese, se
caracteriza pela diferenciação das promastigotas procíclicas em promastigotas metacíclicas,
forma infectante para o hospedeiro vertebrado, na qual o LPG é alterado fazendo com que os
parasitos se desprendam do intestino e migrem para a porção anterior do trato digestivo
(Sacks & Perkins, 1984; Sacks & da Silva, 1987; Bates, 2007).
Ao realizar o repasto
sanguíneo, a fêmea de flebotomíneo regurgita as promastigotas metacicíclicas dando início ao
processo infeccioso no homem. A saliva do inseto também está envolvida neste processo de
transmissão e contribui para o desenvolvimento das lesões características da doença, através
da supressão da produção de óxido nítrico (NO2) nos macrófagos, aumentando a chance de
sobrevivência do parasito (Alexander, Satoskar & Russel, 1999; Menezes et al, 2008).
Após escaparem do meio extracelular, as promastigotas invadem as células do sistema
fagocítico mononuclear, como macrófagos, células dendríticas e neutrófilos (Peters et al,
2008). No caso de infectarem os macrófagos, as leishmânias são interiorizadas no fagossoma,
o qual se funde ao lisossomo formando uma estrutura chamada fagolisossomo ou vacúolo
parasitóforo, onde se diferenciam em amastigotas. Dentro destes vacúolos, as formas
amastigotas se multiplicam sucessivamente por divisão binária, rompem as células e são
fagocitadas por novas células, propagando a infecção. Os neutrófilos infectados parecem
funcionar como uma ponte entre o parasito e a célula hospedeira final, o macrófago, já que
após a morte fisiológica dos neutrófilos (células de vida curta) as formas amastigotas
liberadas são prontamente fagocitadas pelos macrófagos, assim como os neutrófilos
apoptóticos contendo amastigotas (John & Hunter, 2008; Laskay, Van Zandbergem &
Solbach, 2008).
O ciclo se completa quando um flebotomíneo realiza um repasto sanguíneo em um
hospedeiro infectado e ingere as células infectadas com as formas amastigotas. Novamente,
no inseto vetor, as amastigotas se diferenciam em promastigotas, reiniciando o ciclo de vida
da Leishmania (Bates, 2007; Silveira et al, 2009).
21
Figura 1.2: Ciclo de vida da Leishmania sp. Adaptado e traduzido de Sacks & Noben-Trauth, 2002.
1.3 FORMAS CLÍNICAS DA LEISHMANIOSE
As formas clínicas da leishmaniose dependem do tropismo da espécie de Leishmania
infectante. A LV, também denominada calazar, é uma doença sistêmica, causada
principalmente pelas espécies viscerotrópicas L. donovani, L. infantum (no Velho Mundo) e
L. infantum chagasi (nas Américas) (Barral et al, 1986; Herwaldt, 1999). Já a LT apresenta,
por sua vez, uma grande variedade de manifestações clínicas, histopatológicas e imunológicas
que caracterizam as seguintes formas da doença: leishmaniose cutânea, leishmaniose mucosa,
leishmaniose cutânea difusa e leishmaniose cutânea disseminada (Da-Cruz & Pirmez, 2005;
Silveira et al, 2009).
1.3.1 Leishmaniose Subclínica
Alguns indivíduos, mesmo infectados por Leishmania, apresentam manifestação
clínica discreta ou não apresentam nenhuma manifestação, com o controle da infecção, não
havendo evolução e nem a necessidade de tratamento. Já foi relatado em área endêmica que
10% dos indivíduos sadios apresentavam Intradermoreação de Montenegro (IDRM) positiva,
caracterizando uma forma subclínica da leishmaniose (Guerra et al, 1985; Follador et al,
2002; Fagundes et al, 2007).
22
1.3.2 Leishmaniose Cutânea (LC)
A LC representa a forma mais frequente da doença. Possui como agente etiológico
principalmente as espécies L. braziliensis e L. amazonensis, mas pode ser causada por
qualquer espécie dermotrópica. A LC é caracterizada pelo desenvolvimento de lesões únicas
ou escassas na pele, restritas ao(s) local(ais) de inoculação, geralmente em regiões do corpo
expostas ao inseto vetor. O período de incubação varia de dez dias a três meses até o
aparecimento de um eritema inicial da lesão. A seguir, a lesão avança para uma pápula ou
nódulo com bordas elevadas, podendo formar uma úlcera centralizada (Figura 1.3A) com ou
sem linfadenopatia regional (Barral et al, 1995; Reithinger et al, 2007). A doença evolui de
forma crônica e usualmente a lesão cicatriza quando os pacientes recebem a terapia
recomendada pelo Ministério da Saúde (SVS/MS, 2010), podendo ainda ser curada de forma
espontânea (Marsden et al, 1984; Carvalho et al, 1985).
As lesões cicatrizadas em geral são lisas, brilhantes e finas com dimensões que
correspondem aos limites da úlcera. A ocorrência de traumatismo da cicatriz pode facilitar o
surgimento de lesão leishmaniótica, levando à reativação da infecção, provavelmente
relacionada à manutenção do parasito nestes locais (Oliveira-Neto et al, 1998). Foi
demonstrado ainda que três anos após a cicatrização o padrão de celularidade da reação
inflamatória da lesão leishmaniótica altera lentamente mesmo após a cura clínica, sugerindo
um estabelecimento do equilíbrio parasito-hospedeiro somente após este período (Morgado et
al, 2010). As lesões localizadas causadas por L. braziliensis, em geral, apresentam baixa carga
parasitária, enquanto as lesões causadas por L. amazonensis e L. guyanensis apresentam-se
mais ricas em parasitos (Silveira, Lainson & Corbett, 2005; Silveira et al, 2009; Matta et al,
2009).
1.3.3 Leishmaniose Mucosa (LM)
Cerca de 3% a 5% dos pacientes de LC, causada por L. braziliensis, desenvolvem
leishmaniose mucosa (LM) (Marsden, 1986). A LM é uma forma mais grave, caracterizada
por múltiplas ou extensas lesões destrutivas na cavidade oral e nasofaríngea associada à
intensa resposta inflamatória (Figura 1.3B) (Amato, de Andrade & Duarte, 2003). Nesta
forma clínica, a lesão geralmente não cura espontaneamente e os pacientes apresentam uma
resposta celular exacerbada, intensa perda tecidual e baixa carga parasitária (Carvalho et al,
1985; Marsden, 1986; Oliveira-Neto et al, 1998; Silveira et al, 2009). A lesão causa
deformidade devido ao intenso infiltrado inflamatório, geralmente da mucosa nasal, palato e
faringe. Em alguns casos a infecção inicia-se na semimucosa exposta, como no lábio, e é
denominanda LM primária (Marzochi,1992).
23
1.3.4 Leishmaniose cutânea disseminada (LDiss)
A LDiss é uma forma rara da doença, na qual 1% dos pacientes com LC apresenta
disseminação da lesão inicial. A LDiss é identificada quando há mais de dez lesões espalhadas
pelo corpo (Figura 1.3C), pequenas, papulares ou acneiformes, com pequenas úlceras que
apresentam escassez ou ausência de parasitos (Carvalho et al, 1994). O processo de difusão
pode ocorrer em dois ou três meses, quando diversas lesões com pápulas eritematosas e/ou
ulceradas podem aparecer (Costa et al, 1986; Turetz et al, 2002; Silveira, Lainson & Corbet,
2005; Vieira-Gonçalves et al. 2008).
1.3.5 Leishmaniose cutânea difusa (LCD)
A LCD é uma forma grave e rara da leishmaniose, causada pela espécie
L. amazonensis. O início da doença é lento, com desenvolvimento de uma lesão nodular única
que não responde ao tratamento e evolui progressivamente para a forma difusa, sem ulceração
(Figura 1.3D). Esta lesão tende a se disseminar por toda a pele, com acentuada proliferação
de parasitos e consequente disseminação da infecção. Os pacientes de LCD apresentam
resposta imune anérgica, IDRM negativa e são refratários ao tratamento (Silveira et al, 2009).
Figura 1.3: Fotografias do aspecto macroscópico de lesão de leishmaniose cutanea (A); lesão de leishmaniose
mucosa (B); lesão de leishmaniose difusa (C); lesões de leishmaniose disseminada (D).
Adaptado de Secretaria de Vigilância Sanitária; Ministério da Saúde (SVS/MS), 2007 e 2010.
http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/manual_vigilancia_leishmaniose_tegumentar_americana.pdf
24
A LTA, portanto, se mostra como uma doença de grande impacto na saúde pública não
somente pela sua alta incidência e ampla distribuição geográfica, mas também pela
possibilidade de assumir formas que podem levar a lesões destrutivas, desfigurantes e ainda
incapacitantes. Os casos desta doença devem ser vistos sob uma perspectiva abrangente
incluindo a espécie do parasito e a resposta imune de cada indivíduo, sendo a associação
destes fatores determinante para a evolução da doença (SVS/MS, 2010).
1.4 DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERIACANA
O diagnóstico clínico da LTA é baseado na aparência e localização das lesões e na
epidemiologia, principalmente quando o paciente tem procedência de área endêmica ou
visitou áreas onde há ou houve casos de leishmaniose.
O “padrão ouro” de diagnóstico laboratorial da leishmaniose é realizado através de
métodos diretos de isolamento e identificação do parasito. As formas amastigotas presentes na
lesão podem ser identificadas por análise microscópica do tecido acometido, por
multiplicação do parasito em cultura e/pu pelo inóculo de raspados de lesões ou de fragmento
de tecido retirado por biópsia, em animais susceptíveis, como hamsters. A técnica de PCR
também permite diagnosticar as leishmanioses através da amplificação de segmentos gênicos
específicos do protozoário em questão (Uliana et al,1991; Fagundes et al, 2010).
A IDRM é uma forma indireta de diagnóstico laboratorial baseado na mensuração da
resposta imune celular com a injeção intradérmica de antígenos do parasito. O resultado é
avaliado entre 48 e 72 horas, sendo consideradas positivas as reações com área de enduração
maior ou igual a 5 mm. No entanto, nas primeiras semanas (4 a 6) após o surgimento da
lesão, a reação pode ser negativa. Pacientes de LM usualmente apresentam resposta
exacerbada, com vários centímetros de enduração, enquanto nos pacientes com a forma difusa
a reação costuma ser negativa e nos pacientes de LC a resposta é moderada. Este método
indireto complementa o diagnóstico clínico-epidemiológico, mas a confirmação da doença é
realizada por métodos parasitológicos (Vega-Lopez, 2003; SVS/MS, 2010).
Testes sorológicos para detecção de anticorpos anti-Leishmania circulantes no soro
dos pacientes também podem ser realizados, como a reação de imunofluorescência indireta
(RIFI) e o ensaio imuno-enzimático (ELISA) (Barroso-Freitas et al, 2009; SVS/MS, 2010).
25
1.5 TRATAMENTO DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA
Há seis décadas os antimoniais pentavalentes têm sido recomendados como a droga de
primeira escolha no tratamento das leishmanioses (Herwaldt, 1999; Ashutosh, Sundar &
Goyal, 2007), sendo que no Brasil o mais utilizado é o antimonial pentavalente N-metil
glucamina (Glucantime ® Rhodia).
Na maioria dos casos o tratamento com antimoniais é efetivo, apresentando taxa de
cura entre 60 e 100%. Entretanto esta medicação possui algumas desvantagens, como alto
custo, difícil administração e alta toxicidade, podendo desencadear efeitos adversos como
artralgia, mialgia, anorexia, náusea, dor abdominal, pancreatite, distúrbios intestinais, cefaléia,
alterações cardíacas e hepáticas, e insuficiência renal aguda (Nogueira & Sampaio, 2001;
Mayrink et al, 2006). Por este motivo alguns pesquisadores têm buscado esquemas
terapêuticos alternativos e doses menores para o uso de antimoniais com o objetivo de obter
resultados satisfatórios, em casos de resistência à dosagem recomendada, e de minimizar os
efeitos colaterais (Oliveira-Neto et al, 2000(b); Oliveira-Neto & Mattos, 2006 (a)(b);
SVS/MS, 2010).
A resposta ao tratamento é avaliada a partir de critérios clínicos. Os pacientes de LC
são considerados curados quando apresentam epitelização completa da lesão (ou lesões) e
regressão total da infiltração e eritema, até três meses após a conclusão do esquema
terapêutico. Nos casos em que os pacientes não respondem ao tratamento, a segunda linha de
escolha para tratar as leishmanioses são as drogas pentamidina e a anfotericina B (SVS/MS,
2010).
1.6 IMUNOPATOGENIA DA LEISHMANIOSE TEGUMENTAR AMERICANA
A infecção produzida por espécies do gênero Leishmania gera respostas imunes muito
complexas e a evolução da infecção pode tomar vários rumos dependendo das populações
celulares envolvidas; tipo e quantidade de citocinas produzidas e secretadas; e da espécie de
Leishmania envolvida no processo patogênico, a qual está diretamente relacionada com a
forma clínica que a doença se apresenta (Silveira et al, 2009).
O processo imunológico que ocorre durante a leishmaniose é mediado pela imunidade
inata e adaptativa, e é iniciado assim que a fêmea de flebotomíneo regurgita as promastigotas
metacíclicas de Leishmania no hospedeiro vertebrado durante o repasto sanguíneo.
26
1.6.1 Resposta Imune Inata
A resposta imune inata é de baixa especificidade e é capaz de acionar rapidamente
mecanismos celulares e bioquímicos durante a infecção por microorganismos. Esta resposta é
realizada através de barreiras físicas e químicas; de células fagocíticas, que detectam os
antígenos por suas regiões microbianas conservadas; de células Natural Killer (NK); de
proteínas sanguíneas, como os membros do sistema complemento e mediadores inflamatórios;
e das citocinas que regulam e coordenam diversas atividades desta resposta (Abbas &
Litchman, 2007).
A alteração da integridade da pele causada pelo inseto vetor gera uma resposta
inflamatória inicial, a qual envolve o recrutamento e a migração de uma variedade de células,
em especial células NK e células fagocíticas como as células dendríticas (denditric cell - DC)/
células de Langerhans, neutrófilos e macrófagos (Silveira et al, 2009).
Nos três primeiros dias de infecção, após as leishmânias escaparem da lise mediada
pelo sistema complemento (Sacks & da Silva, 1984), os neutrófilos são as células
preponderantes e representam a primeira população celular a chegar ao sítio inflamatório e,
portanto, as primeiras células a serem infectadas pelas formas promastigotas metacíclicas de
Leishmania (John & Hunter, 2008; Laskay, Van Zandbergem & Solbach, 2008; Peters et al,
2008). A seguir, as DC (células de Langerhans epidérmicas e DC cutâneas) e os macrófagos,
derivados de monócitos e residentes no tecido epitelial, também fagocitam estes parasitos e
participam do processo inicial de resposta à infecção (Von Stebut et al, 1998; Baldwin et al,
2004; Van Zandbergen et al, 2004; Garg, Trudel & Trembley, 2007; Ritter & Osterloh, 2007;
Von Stebut, 2007; Silveira et al, 2008).
Os neutrófilos são células de vida curta que entram em processo de apoptose em torno
de 6 a 10 horas. As promastigotas de Leishmania podem inicialmente ser fagocitadas por
neutrófilos, que por sua vez adiam o processo de apoptose por aproximadamente três dias.
Neste período há recrutamento de monócitos/macrófagos, através da secreção de quimiocinas,
para o sítio inflamatório onde fagocitam os neutrófilos infectados em apoptose. Esta
transferência de parasitos dos neutrófilos aos macrófagos, denominada “Cavalo de Tróia”,
inclui um mistura de parasitos viáveis e mortos (Van Zandbergen et al, 2004; John & Hunter,
2008; Laskay, Van Zandbergen & Solbach, 2008; Ritter, Frieschknecht & Van Zandbergen,
2009).
Em particular, os macrófagos desempenham um papel triplo durante a infecção por
Leishmania, já que representam as células hospedeiras do parasito; atuam como células
27
apresentadoras de antígenos (APCs); além de exercer sua função de célula efetora de
eliminação do patógeno (Bogdan & Rollinghoff, 1999; Cunningham, 2002; Ruiz & Becker,
2007). As promastigotas interiorizadas são abrigadas nos vacúolos parasitóforos dos
macrófagos, permitindo que os microorganismos intracelulares sejam expostos à atividade
leishmanicida desta célula, a qual inclui ação de enzimas lisossômicas, radicais de oxigênio e
NO2 (Weinberg, 1998; Liew, Xu & Chan, 1999; Bogdan et al, 2000). Paralelamente, o
microambiente deste vacúolo induz a diferenciação das promastigotas em amastigotas, forma
evolutiva mais resistente à resposta oxidativa desencadeada pela célula hospedeira
(Cunnihghan, 2002).
As APCs são capazes de reconhecer moléculas presentes na superfície do parasito,
como o lipofosfoglicano (LPG), através de receptores tipo Toll-2 (Toll-like receptor 2 - TLR2) e TLR-4 (de Veer et al, 2003; Tuon et al, 2008). A partir deste reconhecimento, estas
células são capazes de induzir a produção de citocinas proinflamatórias, como fator de
necrose tumoral-α (Tumoral Necrosis Factor, TNF-α), Interferon-γ (IFN-γ), interleucina-12
(IL-12), IL-1, IL-6. Estas citocinas são decisivas tanto para o controle da disseminação do
parasito como para a evolução das lesões já que estes mediadores inflamatórios, quando em
níveis elevados, podem levar a destruição do tecido (Aebischer et al, 1994; Da-Cruz et al,
1996). Entretanto, não só a LPG, como também a gp63, presentes na superfície da
Leishmania, são capazes de inibir a ativação de macrófagos, impedindo, alterando ou adiando
a produção destas citocinas (Reiner & Malemud, 1985).
O processo de infecção é dinâmico, ao ponto que, enquanto o sistema imune
desencadeia mecanismos para neutralizar e/ou lisar os parasitos e recuperar a homeostasia, a
própria Leishmania possui mecanismos de escape que alteram o processo imunológico que
está sendo desencadeado. Sendo assim, os parasitos podem sofrer repetidas divisões binárias
até que os macrófagos sejam lisados e, então, invadir células vizinhas promovendo a
manutenção da infecção (Kima, 2007; Ritter & Osterloh, 2007).
1.6.2 Resposta Imune Adaptativa
A resposta imune adaptativa se caracteriza pela especificidade e memória e envolve a
participação dos linfócitos T e B. Esta resposta é dividida nas seguintes fases: reconhecimento
antigênico; ativação de linfócitos antígeno-específicos; fase efetora de eliminação e controle
de patógenos; apoptose de clones de linfócitos efetores e manutenção de células de memória
imunológica; e finalmente retorno à homeostase (Abbas & Litchman, 2007). Sendo assim, a
diferenciação dos linfócitos naïve em subpopulações efetoras e de memória são processos
fundamentais da imunidade celular adaptativa (Appay et al, 2008).
28
A resposta imune a patógenos intracelulares é mediada principalmente por linfócitos T
(Abbas & Litchman, 2007). Nos pacientes de LTA, o desencadeamento de uma resposta
imune eficaz é caracterizado por uma reação de hipersensibildiade tardia dependente da
indução de linfócitos T circulantes específicos aos antígenos de Leishmania (Castés et al,
1983; Silveira et al, 1991; Convit et al. 1993, Carvalho et al, 1995; Castés & Tapia, 1998).
1.6.2.1 O Repertório de Linfócitos T
Os linfócitos T constituem um grupo de células caracterizado pela expressão do
receptor de célula T (T cell receptor – TCR) ligado de forma não covalente à molécula CD3
(Figura 1.4). Neste complexo molecular (TCR-CD3) o TCR é a unidade de reconhecimento
antigênico, enquanto o CD3 é a unidade de transdução de sinais do linfócito T. Além deste
complexo, os linfócitos T também se caracterizam pela expressão das moléculas adaptadoras
CD4 ou CD8, as quais distinguem duas populações linfocitárias com funções efetoras
distintas, mas que atuam de forma conjunta na resposta imune (Peakman & Vergani, 2011;
Abbas & Litchman, 2007).
Figura 1.4: Estrutura do complexo receptor de célula T e cadeias que compõem o CD3 (TCR-CD3). Os
heterodímeros α:β do TCR estão associados com um complexo de quatro cadeias (duas ε, uma δ, uma γ), além de
dois domínios intracelulares. Adaptado de Janeway, 2008(a).
O TCR é especializado em reconhecer complexos moleculares compostos por
peptídeos de origem intracelular apresentados pela molécula do complexo principal de
histocompatibilidade (major histocompatibility complex – MHC), ou CD1, e é incapaz de
reconhecer antígenos solúveis (Loureiro & Ploegh, 2006). O MHC de classe I está presente
em todas as células nucleadas do organismo, enquanto o MHC de classe II está presente
somente nas APCs (Abbas & Litchman, 2007).
29
Para a indução de clones de linfócitos T específicos aos antígenos de Leishmania, as
APCs infectadas migram para os órgãos linfóides secundários, principalmente linfonodos,
onde os linfócitos T estão concentrados, e então apresentam os antígenos do parasito a estas
células. Nestes órgãos ocorre uma interação célula-célula, conhecida como sinapse
imunológica, e consequente apresentação antigênica no contexto MHC-peptídeo-TCR.
Diferentes TCRs compõem o repertório de linfócitos T, garantindo que uma variedade de
peptídeos não próprios seja reconhecida, o que permite que clones específicos sejam
selecionados para proliferar e participar da resposta imune adaptativa (Abbas & Litchman,
2007; Nolte et al, 2009; Viola, Contento & Molon, 2010).
O TCR é um heterodímero formado por duas cadeias de glicoproteínas ligadas de
forma covalente. A maioria dos linfócitos T possui TCR do tipo αβ (90-99%), enquanto uma
minoria expressa TCR do tipo γδ. Cada cadeia (α, β, γ, δ) é formada por uma região
transmembrana hidrofóbica; uma região citoplasmática curta; um domínio constante (C); e um
domínio variável (V), o qual possui o sítio de ligação ao antígeno. A porção extracelular deste
heterodímero, similar ao fragmento de ligação ao antígeno das imunoglobulinas, é composta
por regiões V e C da cadeia leve e da cadeia pesada (Meuer et al, 1983; Brenner, Trowbridge
& Strominger, 1985). A diversidade necessária para o reconhecimento de uma variedade de
antígenos pelo TCR é gerada no timo, durante a ontogenia dos linfócitos T (Kimura et al,
1987). A ampla variedade das cadeias α, β, γ, δ é dada pelo conjunto de segmentos gênicos
descontínuos denominados V (variável); J (juncional); e D (diversidade), presente somente na
cadeia β e na cadeia γ; além de um ou dois segmentos C (constante) (Abbas & Litchman,
2007). Os genes que codificam a cadeia α estão localizados no cromossomo 14 enquanto os
genes que codificam a cadeia β localizam-se no cromossomo 7 (Collins et al, 1985; Kimura et
al, 1987; Robinson et al, 1993; Rowen, Koop & Hood, 1996). A codificação da região
variável é realizada através de um processo denominado recombinação somática, na qual os
segmentos de um gene V, de um gene J e, no caso da cadeia β, de um gene D se combinam
aleatoriamente. Em cada clone de linfócito T ocorre uma combinação diferente dos segmentos
gênicos V, (D) e J, os quais se aproximam para formar um único gene V(D)J, que então se
torna contíguo ao gene C para produzir uma das cadeias do receptor. Este processo inclui a
excisão dos segmentos e junção de um segmento D a um segmento J. A seguir, ocorre a
junção de DJ a um segmento V na recombinação da cadeia β (Hozumi & Tonegawa, 1976;
Mak et al, 1987; Fugmann et al, 2000; Abbas & Litchman, 2007). Neste contexto, a
diversidade destes segmentos e a imprecisão aleatória do processo de junção dos mesmos é
que garantem a diversidade dos TCRs. A consequência deste processo promove uma
30
característica de combinação única e original ao TCR, expresso nos diferentes clones de
linfócito T (Rowen, Koop & Hood, 1996).
A variabilidade entre os diferentes TCRs se concentra no domínio V das cadeias α e β,
que é composto por três regiões de variabilidade, denominadas regiões hipervariáveis ou
determinantes da complementariedade (CDR1, 2 e 3). Estas regiões fornecem uma superfície
complementar à superfície tridimensional do antígeno, sendo que o CDR3 é a região que
confere maior diversidade ao TCR (van der Merwe & Davis, 2003; Abbas & Litchman, 2007;
Murre, 2007; Peakman & Vergani, 2011).
As propriedades de reconhecimento antigênico são testadas quanto à especificidade e
avidez da interação do TCR ao complexo peptídeo-MHC, a fim de garantir que somente as
células com tolerância a antígenos próprios sobrevivam e amadureçam. Quando esta interação
é de baixa avidez, o linfócito é selecionado positivamente e, em contrapartida, as células cujo
TCR tem alta avidez pelo MHC próprio são selecionadas negativamente (Hogquist, Baldwin
& Jameson, 2005). Sendo assim, os diferentes linfócitos T podem ser selecionados para
morrer por apoptose antes de atingir a maturidade, ou podem ser selecionados para sobreviver
e desenvolver a população de linfócitos maduros. Após deixar o timo, os linfócitos T
maduros, CD4+ ou CD8+, concentram-se nos órgãos linfóides secundários, como baço e
linfonodos, e recirculam continuamente pelos tecidos periféricos a fim de propiciar o encontro
com possíveis antígenos (Peakman & Vergani, 2011; Murre, 2007).
O repertório do TCR αβ que pode ser gerado pela recombinação gênica é da ordem de
cem mil especificidades, entretanto, somente uma parte desta variedade de clones é
selecionada para deixar o timo e migrar para os órgãos linfóides secundários. Após a seleção
tímica de restrição do MHC, de auto-tolerância e de competência imunológica,
aproximadamente 95% dos timócitos que sofreram o rearranjo V(D)J não amadurecem e
sofrem apoptose, e somente os linfócitos maduros é que representam o repertório αβ do TCR
de cada indivíduo (Davis & Bjorkman, 1988; Arstila et al, 2000). Apesar do baixo percentual
de timócitos selecionados positivamente, estes linfócitos expressam um repertório de
receptores de tal diversidade que os capacita a responder a uma quantidade ilimitada de
antígenos não próprios, através da seleção clonal que atua na resposta imune adaptativa.
Existe ainda, uma população de linfócitos T CD8+ cujo TCR é formado por um
homodímero αα, os quais apresentam uma menor capacidade de interação com o MHC classe
I e menor habilidade na transdução de sinais, quando comparados com o heterodímero αβ.
Sendo assim, a cadeia β seria mais eficiente no processo de reconhecimento antigênico
exercendo um importante papel na resposta imune (Das & Janeway, 1999; Bosselut et al,
31
2000). Neste cenário, diversas pesquisas baseadas na resposta imune adaptativa e na
especificidade dos linfócitos T têm sido conduzidas através da análise da cadeia variável β do
TCR, isto é, do repertório Vβ.
Inicialmente os estudos do repertório Vβ estavam associados ao papel dos
superantígenos na ativação do sistema imune e à proliferação e deleção de linfócitos T
específicos em resposta à estimulação por antígenos dominantes (Gollob & Palmer, 1992;
Fleischer et al, 1996). Posteriormente, o repertório Vβ passou a ser estudado principalmente
no câncer (Stefanski & Mathur, 1996), nas doenças auto-imune (Martinez-Taboada, Goronzy
& Weyand, 1996), na infecção pelo HIV (Gorochov et al, 1998), e nas doenças causadas por
protozoários (Pirmez et al, 1993; Uyemura et al, 1993; Costa et al, 2000; Lumsden, Cranmer
& Krzych, 2010). Na leishmaniose foi demonstrado que o repertório Vβ apresenta algumas
expansões em mais de 50% dos pacientes infectados por L. braziliensis, embora tal avaliação
não tenha sido realizada separadamente em linfócitos T CD4+ e T CD8+ (Uyemura et al,
1993). Neste cenário, o estudo do repertório Vβ, inicialmente realizado por biologia
molecular, passou a ser realizado por citometria de fluxo devido a possibilidade de se definir
os perfil de repertório Vβ em diferentes populações celulares em uma mesma amostra (van
den Beemd et al, 2000; Lima et al, 2003; Menezes et al, 2004; Giacoia-Gripp et al, 2005;
Clarêncio et al, 2006, Keesen et al, 2011; Tembhare et al, 2011).
Ao longo dos últimos 25 anos, foi produzida uma variedade de anticorpos específicos
para a cadeia variável do TCR, sendo que a maioria destes é reativa à cadeia β. Diferentes
perfis de distribuição deste repertório já foram associados a algumas doenças, como leucemia
(Plasilova, Risitano & Maciejewski, 2003); esclerose múltipla (Hong et al, 1999); artrite
reumatóide (Goodall, Bledsoe & Gaston, 1999); psoríase (Bour et al, 1999); Doença de
Chagas (Costa et al, 2000; Menezes et al, 2004); artrite reumatóide (Moss et al, 1992), e
leishmaniose (Uyemura et al, 1993; Clarêncio et al, 2006; Kariminia et al, 2007; Xin et al,
2011). Além disso, alguns estudos vêm demonstrando uma expansão oligoclonal de linfócitos
T antígeno-específicos e uma distribuição heterogênea dos clones durante diferentes
processos infecciosos (Menezes et al, 2004; Giacoia-Gripp et al, 2005, Clarêncio et al, 2006;
Keesen, 2010). Outra abordagem de caracterização do repertório Vβ de linfócitos T baseia-se
na avaliação de indivíduos sadios com o intuito de definir a distribuição clonal normal e
proporcionar uma melhor interpretação da frequência de clones de linfócitos em diferentes
patologias (van den Beemd et al, 2000).
Os segmentos gênicos Vβ são agrupados em 26 diferentes famílias, baseadas na
homologia das sequências gênicas (75% de homologia), sendo que algumas destas consistem
32
de vários membros, como as famílias Vβ 5, Vβ 6, Vβ 8 e Vβ 13 (Arden et al, 1995). Uma
avaliação do repertório Vβ em indivíduos sadios mostrou que a distribuição das famílias
parece ser heterogênea, já que a expressão de determinados membros Vβ tendem a ser mais
dominantes como Vβ 2, Vβ 6, Vβ 8, Vβ 17, enquanto as famílias Vβ 12 e Vβ 24 são menos
expressas (Malhorta et al, 1992). Além disso, algumas cadeias são preferencialmente mais
expressas em subpopulações de linfócitos T CD4+ como Vβ 5.1, Vβ 6.7, Vβ 8, Vβ 9 e Vβ 12,
assim como as famílias Vβ 1, Vβ 5.2, Vβ 9, Vβ 14, e Vβ 23 são mais frequentes em linfócitos
T CD8+ (Grunewald, Janson & Wigzell, 1991; Clarke et al, 1994; Muraro et al, 2000; van der
Beemd et al, 2000; Melenhorst et al, 2002).
A habilidade dos linfócitos T em detectar, eliminar e memorizar uma variedade de
antígenos encontrados em vários patógenos é garantida por esta extraordinária diversidade do
repertório de seus receptores, e pela capacidade de distinguir uma infinidade de sequências
peptídicas (antígenos) diferentes, desencadeando uma cascata de eventos imunológicos
(Murre, 2007).
1.6.2.2 Reconhecimento Antigênico e Ativação de Clones Específicos
Na LTA, o curso da doença é determinado pela natureza e magnitude das respostas
orquestradas por linfócitos T, os quais precisam ser ativados, através da apresentação
antigênica e da ação de citocinas, para exercer suas funções em total plenitude.
A apresentação dos antígenos de Leishmania ocorre preferencialmente via MHC
classe II para os linfócitos T CD4+ (Scott et al, 1989). Alguns autores já demonstraram que os
linfócitos T CD8+ também são capazes de reconhecer estes antígenos através da apresentação
via MHC classe I (Conceição-Silva et al, 1994; Rodriguez et al, 1999; Bertholet et al, 2006;
Janeway, 2008b). Para isto, os antígenos de Leishmania são transportados do vacúolo
parasitóforo para o citosol, onde são processados por proteossomos, para então serem
apresentados no contexto do MHC classe I (Ruiz & Becker, 2007). A habilidade de um
antígeno endocitado de escapar do compartimento endossomal para o citoplasma e ser
apresentado via MHC classe I é chamada de “apresentação cruzada” (cross presentation)
(Kovacsovics-Bankowski & Rock, 1995; Janeway, 2008b).
Os linfócitos T, para os quais os peptídeos antigênicos são apresentados, são
denominados de “células naïve” (virgens), ou seja, células que não tiveram contato prévio
com nenhum antígeno relacionado, sendo assim também conhecidas como “células em
repouso” (resting cells). A manutenção da viabilidade e da diversidade destes linfócitos T
naïve é garantida pela seleção positiva, mencionada anteriormente, que também acontece nos
33
ambientes extratímicos através da constante interação TCR-MHC. Além da interação com
MHC, os linfócitos naïve também dependem do contato com a IL-7 para se manterem vivos e
neste estado funcional (Pinti et al, 2010; Kim, Hong & Park, 2011).
O estado inativo das células naïve é mantido até que uma APC apresente algum
peptídeo antigênico a estes linfócitos (Mescher et al, 2006; Sarkar et al, 2008). Após a
interação do complexo MHC-peptídeo com o TCR, o CD3 se encarrega de transduzir os sinais
para o interior do linfócito T, enquanto a molécula adaptadora CD4 ou CD8 (ligada ao MHC
classe II ou MHC classe I, respectivamente) exercem a função de sustentar esta interação
(Figura 1.5).
Figura 1.5: Apresentação e reconhecimento antigênico no contexto MHC-peptídeo-TCR. APC (célula
apresentadora de antígeno); MHC (complexo principal de histocompatibilidade classe I); TCR (receptor de
célula T; CD8+ T (linfócito T CD8+); CD8 (molécula adaptadora); α e β (cadeias alfa e beta que compõem os
heterodímeros MHC e TCR).
Além destas interações, a ativação das células naïve requer outros dois sinais
adicionais. Um deles é dado pela interação das moléculas co-estimulatórias, B7-1 (CD80) e
B7-2 (CD86) presentes na superfície das APCs, à molécula CD28, expressa em 95% dos
linfócitos T CD4+ e em 50% dos linfócitos T CD8+ (Bromley et al, 2010; van der Merwe &
Cordoba, 2011). Esta interação regula positivamente os genes de sobrevivência, facilitando
assim a progressão do ciclo celular e a produção de IL-2 (Sharpe & Freeman, 2002).
Outra importante molécula co-estimulatória é o CD27, membro da superfamília de
receptores do fator de necrose tumoral (TNF). Esta glicoproteína transmembrana de linfócitos
T e B têm como único ligante o CD70, presente principalmente em células dendríticas. Após a
interação com o CD70, a trimerização do CD27 contribui para a sinalização intracelular que
34
resulta na ativação do linfócito. Em consequência da ativação celular há um aumento da
expressão de CD27 nos linfócitos naïve, entretanto, conforme estas células se diferenciam em
efetoras, este receptor é liberado da superfície dos linfócitos, muito provavelmente por
proteases ligadas à membrana (Loenen et al, 1992; Hamann et al, 1999; Schildknecht et al,
2007). Tanto em humanos como em modelos de infecção murinos, foi revelado que os
linfócitos T CD8+ efetores apresentam baixa ou nenhuma expressão deste receptor (Kuijpers
et al, 2003; Wherry et al, 2003; Baars et al, 2005). Neste contexto, a interação CD27-CD70
parece ser crucial para a regulação da resposta imune celular (Nolte et al, 2009).
O outro sinal necessário para a ativação das células naïve é dado pela secreção de
citocinas, pelas APCs, como por exemplo: IL-12, IFN tipo I (IFN-α e β) e IL-4. Após a
ativação, os sinais co-estimulatórios precisam ser sustentados ou modificados para promover
a expansão clonal e a diferenciação celular. Nos linfócitos T, o CD40L (ligante de CD40,
presente na superfície das APCs) desempenha o papel de induzir a expressão de B7, que por
sua vez contribui com a ativação celular. A IL-2, ao interagir com seu ligante (CD25),
também participa deste processo, orientando a expansão do número de linfócitos T antígenoespecíficos e a diferenciação destas células. Assim como o CD25, a molécula CD69 também
faz parte do fenótipo dos linfócitos ativados, sendo a quantificação destes receptores uma das
ferramentas utilizadas para se determinar tal ativação.
A caracterização fenotípica, não só das células naïve, mas também de outras
subpopulações de linfócitos T, como células efetoras e de memória, são frequentemente
realizadas através da determinação da expressão de isoformas de CD45 (CD45RA e
CD45RO); de moléculas co-estimulatórias (CD27 e CD28); e/ou de moléculas associadas à
migração celular, como CCR7 e CD62L, na membrana destas células. Desta forma, a
expressão destas moléculas e a interação com seus ligantes são fortemente reguladas e
dependentes do estado de ativação celular.
Após o reconhecimento antigênico, as células ditas efetoras são linfócitos que foram
ativados e executam suas funções de forma a eliminar o parasito (Hamann et al, 1997; Young
et al, 1997; Sallusto et al, 1999; Baars et al, 2000; Hendriks et al, 2000; Boyman et al, 2009).
Neste contexto, na infecção por Leishmania, a atividade efetora mútua e a cooperação entre os
linfócitos T CD4+ e CD8+ parecem definir o curso da resposta imune responsável pela
imunopatogenia na LTA. Os linfócitos T CD4+ (T helper – Th) ativados, reativos aos
antígenos de Leishmania, são responsáveis por orquestrar e direcionar a resposta imune
celular. Em modelos murinos de infecção por Leishmania, foi estabelecida uma dicotomia de
perfis de diferenciação de linfócitos T CD4+ baseado na produção de determinadas citocinas:
35
perfil de resposta do tipo Th1, caracterizada por um elevado nível das citocinas IL-2, IFN-γ e
TNF-α; e perfil de reposta do tipo Th2, que é caracterizada pela secreção principalmente de
IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13 (Locksley & Scott, 1991; Reiner & Locksley, 1993). A secreção
destas últimas resulta em ativação de linfócitos B, com consequente produção de anticorpos e
em ausência de estímulo de ativação de macrófagos para destruição do parasito, sendo o perfil
Th2 associado a uma anergia na resposta imune em relação ao parasito, observada na
progressão da doença (Scott et al, 1989; Cáceres-Dittmar et al, 1993; Reiner & Locksley ,
1993; Sacks & Noben-Trauth, 2002).
Na resposta do tipo Th1, a produção de citocinas pró-inflamatórias tem sido associada
à cura da doença, não só pela ativação de macrófagos através do IFN-γ, que aumenta sua
habilidade em fagocitar e destruir os parasitos, mas também pela indução e manutenção de
linfócitos T CD8+ citotóxicos, através da IL-2 (Ruiz & Becker, 2007). Estes linfócitos T CD8+
citotóxicos têm a propriedade de destruir as células infectadas por mecanismos de
citotoxicidade, através da liberação de grânulos líticos, após o reconhecimento do antígeno na
superfície da célula-alvo, ou por secreção de citocinas do tipo Th1. Tais grânulos
compreendem a perforina, que é capaz de formar poros na membrana das células–alvo,
comprometendo assim a integridade das mesmas e induzindo morte celular por apoptose; e
também a granzima, outra proteína citotóxica, que tem a capacidade de ativar caspases na
célula-alvo, levando-a a morte por apoptose (Sacks & Noben-Trauth, 2002; Ruiz & Becker,
2007). Atualmente tem sido descrita uma terceira classe de grânulos líticos, chamada
granulisina, cuja atividade antimicrobicida a torna capaz de induzir apoptose de células-alvo
(Janeway, 2008(a)). Neste contexto, a secreção destes grânulos é fundamental para os
mecanismos efetores destes linfócitos, induzindo apoptose nas células infectadas. Além da
citotoxicidade, os linfócitos T CD8+ efetores participam do processo de resolução da infecção
por Leishmania, através da secreção de IFN-γ que ativa os macrófagos, induzindo-os a
destruir estes parasitos (Pompeu et al, 2001; Da-Cruz et al, 2002; Nateghi Rostamani et al,
2010).
Os pacientes de LTA com menor capacidade de montar uma resposta imune celular do
tipo Th1 tendem a um pior prognóstico da doença e a uma resposta terapêutica menos
favorável (Scott et al, 1989; Coutinho et al, 1996). Já foi reportado que as células T de
pacientes de LC que apresentaram cura espontânea apresentam uma intensa proliferação
quando reestimuladas com antígenos de Leishmania (in vitro) e uma alta capacidade de
produção de IFN-γ (Carvalho et al, 1995). Contudo, indivíduos naturalmente capazes de
controlar a infecção apresentam mecanismos imunológicos que levam a um adequado
36
equilíbrio da produção de IFNγ e IL-10, associado a um controle da replicação parasitária sem
causar danos teciduais (Gomes-Silva et al, 2007). Paralelamente, pacientes de LM apresentam
produção exarcebada de IFN-γ e TNF-α, as quais parecem ser responsáveis pelos danos
teciduais que caracterizam as manifestações clínicas desta forma da doença (Bacellar et al,
2002; Da-Cruz et al, 2002). Atualmente, se aceita, de maneira geral, que a diferença entre
resistência e susceptibilidade à infecção por Leishmania está relacionada ao balanço entre as
citocinas produzidas pelos linfócitos T CD4+ Th1 e Th2 (Pirmez et al, 1993; Bacellar et al
2002; Gomes-Silva, 2007). Além deste perfil de citocinas, a distribuição de linfócitos T CD4+
e CD8+ também está associada às diferentes manifestações clínicas da LTA, resultando em
uma resposta celular de hipersensibilidade que pode ser avaliada pela intensidade do teste de
IDRM (Barral et al, 1987; Coutinho et al, 1987; Hernández-Ruiz et al, 2010) (Tabela 1.1).
Tabela 1.1: Perfis de resposta imune celular associada às diferentes formas clínicas da leishmaniose
tegumentar Americana.
LM (leishmaniose mucosa); LC (leishmaniose cutânea); LDiss (leishmaniose disseminada); LD (leishmaniose
difusa); Th1 e Th2 (perfil de produção de citocinas, por linfócitos T CD4+, do tipo 1 e do tipo 2); CD4 e CD8
(linfócitos T CD4+ e CD8+); IDRM (Teste de Intradermorreação de Montenegro).
Em pacientes de LC, a evolução para a cura está associada a uma regulação aumentada
de linfócitos T CD8+, principalmente pela produção de IFN-γ (Uzonna, Joyce & Scott, 2004).
Além disso, foi demonstrado, em modelo experimental, que os linfócitos T CD8+ contribuem
para uma produção ótima de IFN-γ pelos linfócitos T CD4+(Herath, Kropf & Muller, 2003).
Segundo Uzonna, Joyce e Scott (2004) na ausência de linfócitos T CD8+ há uma sustentação
do perfil Th2, e o perfil Th1 depende da produção de IFN-γ por linfócitos T CD8+, os quais
teriam então um papel regulador dos linfócitos T CD4+. Entretanto, a produção exacerbada de
IFN-γ pode estar envolvida com o dano tecidual e com as formas mais graves da doença
(Brodskyn et al, 1997; Bacellar et al, 2002). Estes dados parecem confirmar o importante
papel dos linfócitos T CD8+ em uma resposta equilibrada durante a LC, provavelmente
relacionada à destruição de células infectadas, levando à resolução da infecção (Chan, 1993;
Conceição-Silva et al, 1994; Da-Cruz et al, 1994; Coutinho et al, 1998; Agnelo et al 2003;
Da-Cruz et al, 2005; Ruiz & Becker, 2007; Hernández-Ruiz et al, 2010) (Figura 1.6).
37
Figura 1.6: Resposta imune celular durante a leishmaniose tegumentar Americana. APC (célula
apresentadora de antígeno); MHC (complexo principal de histocompatibilidade); TCR (receptor de célula T); IL
(interleucina); IFN-γ (Interferon gama); TNF-α (Fator de necrose tumoral alfa) Linf T (linfócito T); Th1 e Th2
(linfócitos T helper - CD4+ - que produz citocinas do tipo 1 ou 2). Adaptado de Ruiz & Becker, 2007.
Durante a fase efetora, os linfócitos T atuam de forma a promover a destruição das
células-alvo através da secreção de citocinas e grânulos líticos, no caso dos linfócitos T CD8+.
Estas células possuem um fenótipo que se caracteriza pela modulação de determinadas
moléculas de superfície. Para exercer suas funções efetoras, os linfócitos T deixam de
expressar tanto o CD62L como o CCR7, porém passam a expressar VLA-4, que permite a
ligação ao endotélio vascular em locais de inflamação. Da mesma forma, tanto o CD28 como
o CD27 são liberados nesta fase, enquanto o CD45RA permanece na superfície celular destes
linfócitos (Wowk & Trapani, 2004; Abbas & Litchman, 2007).
1.6.2.3 Os Linfócitos T de Memória
Após a atividade efetora, a maioria dos clones de linfócitos efetores que participaram
do controle do patógeno sofre apoptose. Uma minoria destas células antígeno-específicas (1 a
3 %) se diferencia em linfócitos de memória como uma forma de armazenar as células com
especificidade àqueles antígenos, promovendo um grau de proteção ao mesmo. Para tal
função, característica da imunidade adaptativa, as células de memória possuem vida
prolongada e apresentam altas taxas de divisão celular que contribuem para a sua renovação e
manutenção (Tough & Sprent, 1994; Zielinski et al, 2011).
38
Além dos linfócitos efetores, os linfócitos naïve também podem se diferenciar em
células de memória durante uma resposta imune antígeno-específica. O processo de
diferenciação das células naïve em células de memória já foi demonstrado em linfócitos T
CD4+ e sugerido para linfócitos T CD8+ (Sprent & Tough, 1994; Sallusto et al, 1999; Scott et
al, 2004; Stemberger et al, 2007). Em ambos os casos, o antígeno previamente reconhecidos,
caracteriza a especificidade das células de memória, as quais são capazes de montar uma
resposta qualitativa e quantitativamente aumentada, em relação à resposta primária. O
reconhecimento deste antígeno leva a uma ativação e intensa proliferação dos linfócitos de
memória específicos aos mesmos, de forma que as atividades efetoras destas células resultam
em rápida secreção de citocinas e/ou de grânulos líticos (Abbas & Litchman, 2007).
A resposta imune celular de memória está diretamente relacionada com a proteção
contra determinados patógenos, quando responde de forma eficaz a um antígeno previamente
reconhecido pelo sistema imune (Gourley et al, 2004). Devido a estas propriedades, as células
de memória são alvo de estudos para a elaboração de vacinas e estratégias para controle de
doenças causadas não só por patógenos, como também por antígenos próprios como nas
doenças auto-imune e no câncer (Zanetti, Castiglioni & Ingulli, 2010).
Os mecanismos de geração e manutenção destes linfócitos T de memória ainda não
estão completamente esclarecidos. Sabe-se que estas células fazem parte de uma população
heterogênea que apresenta diferenças quanto à capacidade de responder a uma infecção e
promover proteção, podendo ser diferenciadas por seus receptores de superfície, pela secreção
de citocinas e pela atividade citotóxica (Hamann et al, 1997). Sendo assim, os linfócitos T de
memória podem ser divididos em células de memória central (TMC) e células de memória
efetora (TME). Neste contexto, alguns estudos têm demonstrado a importância destas duas
subpopulações celulares não só no controle de infecções, mas também na eficácia de vacinas
(Lauvau et al, 2001; Seaman et al, 2004; Zaph et al, 2004).
Fenotipicamente ambas as subpopulações de linfócitos de memória são CD45RACD45RO+ e podem ser diferenciadas pelas moléculas co-estimulatórias CD27 ou CD28 e/ou
pelas moléculas associadas à migração celular, como CD62L e CCR7, devido às diferentes
características funcionais entre as células de memória efetora e central (Hamann et al, 1997;
Young et al, 1997; Sallusto et al, 1999; Baars et al, 2000; Hendriks et al, 2000).
Os linfócitos TMC estão concentrados nos órgãos linfóides secundários. A viabilidade
destas células é mantida por longo período mesmo na ausência de estímulo antigênico,
apresentando uma baixa atividade efetora. Entretanto, sob novo estímulo antígeno-específico,
estas células podem ser prontamente ativadas. Algumas moléculas como CD27, CD62L,
39
CCR7 são expressas constitutivamente por estas células, além do CD45RO, mencionado
anteriormente. Já os linfócitos TME dependem de um estímulo antigênico contínuo para que a
manutenção da sua viabilidade seja garantida. Estas células povoam preferencialmente tecidos
periféricos e têm a capacidade de se diferenciar rapidamente em células efetoras sendo
direcionadas para o sítio de infecção. Sendo assim, estas células expressam moléculas, como
o CD25 e CD69, indicando seu estado ativado e são capazes de secretar IFN-γ, IL-4 e IL-5.
Além
disso,
+
as
células
-
-
de
memória
podem
ser
caracterizadas
pelo
fenótipo
-
CD45RO CD45RA CD27 CCR7 (Hamann et al, 1997; Sallusto et al, 1999; Sallusto et al,
2004).
Apesar dos padrões característiscos de distribuição, no sangue as proporções relativas
de linfócitos TMC de TME variam entre os linfócitos T CD4+ e T CD8+, sendo que as células
TMC são predominatemente linfócitos T CD4+ e as células TME, linfócitos T CD8+ (Sallusto et
al, 2004). Uma terceira população de células de memória tem sido caracterizada pela sua
produção de perforina, sendo chamadas de células de memória efetoras altamente
diferenciadas (TEMRA) (Geginat, Sallusto & Lanzavecchia, 2003; Harari et al, 2004).
O sistema imune reúne uma variedade de fatores que são imporantes para a
manutenção das subpopulações de células de memória, assim como de células efetoras e
naïve. O controle deste processo envolve fatores de sobrevivência como IL-2, IL-7, e
estimulação antigênica. Inversamente, a renovação celular e redução do número de células são
controladas pela apoptose, a qual também exerce a função de manter ou recuperar a
homeostase do sistema imune. A sobrevivência das células naïve, em repouso, durante alguns
anos; a expansão de linfócitos T em resposta à estimulação antigênica, seguida da remoção e
contração destas células; e a seleção de clones antígenos-específicos que são mantidos a
longo prazo (células de memória) são exemplos do balanço destes processos de manutenção,
renovação e redução das subpopulações (Sprent & Tough, 1994; Abbas & Lichtman, 2007).
1.6.2.4 A apoptose de linfócitos T na Leishmaniose Cutânea
A apoptose é um processo de morte comprometido com a manutenção da homeostase,
responsável pela renovação; maturação e seleção do repertório de linfócitos; e diferenciação
celular, mencionados anteriormente, assim como com a remoção de células infectadas,
danificadas ou auto-reativas (Kerr, Willie & Currie, 1972; Cohen et al, 1992; Krammer et al,
1994; 2000; Parolin & Reason, 2001). A apoptose de linfócitos está envolvida nos processos
fundamentais que regulam o sistema imune, atuando como um mecanismo capaz de controlar
o curso da resposta imune celular (Krammer et al, 1994). Este processo de morte celular
40
programada, geneticamente controlado, depende da interação célula-meio externo e envolve a
participação de uma família de proteínas, chamada Bcl-2, constituída por membros pró (Bax,
Bak e Bid) e anti-apoptóticos (Bcl-2, Bcl-w e Bcl-xL) (Cohen et al, 1992; Tsujimoto, 2003;
Tichý, 2006).
O processo apoptótico pode ocorrer através de duas vias principais: a via extrínseca ou
dos receptores de morte; e a via intrínseca ou mitocondrial. Estas duas vias diferem no modo
pelo qual são iniciadas, mas ambas convergem para a ativação de caspases efetoras (caspases
3, 6, 7), responsáveis pela proteólise observada no processo apoptótico. Após a ativação das
caspases efetoras ocorrem alterações funcionais, expressas morfologicamente, por
desorganização do citoesqueleto de maneira que a célula perde o contato com as células
vizinhas; encolhimento celular; fragmentação do DNA; alteração da membrana plasmática de
forma que o fosfolipídeo fosfatidilserina (PS) se desloca da porção interna para a porção
externa da membrana plasmática; e formação de corpos apoptóticos contendo os fragmentos
nucleares e as organelas condensadas em seu interior (Taylor, Cullen & Martin, 2008). De
uma maneira geral, várias horas são necessárias do início do processo de morte celular até a
fragmentação celular final, sendo que o cronograma correto depende do tipo celular, do
estímulo e da via apoptótica desencadeada (Ziegler & Groscurth, 2004). O evento final do
processo apoptótico consiste na remoção dos corpos apoptóticos por fagócitos, sem que haja a
formação de um processo inflamatório, já que a integridade da membrana celular das células
apoptóticas é mantida e, portanto não há liberação dos constituintes celulares potencialmente
indutores de uma resposta inflamatória (Elmore, 2007).
A indução e a inibição da apoptose de células hospedeiras tem um importante papel
nas infecções parasitárias, podendo estar diretamente relacionadas com o controle e a
eliminação dos parasitos (Guillermo et al, 2009). Diversos estudos vêm demonstrando que a
exarcebação ou inibição da apoptose de determinadas populações celulares estariam
relacionadas ao agravamento ou à cura de doenças como o câncer (Debatin et al,1993; Lane et
al, 1994; Debatin, 2009); a AIDS (Gougeon & Montagnier, 1993; Sloand et al, 1997; Ross,
2001; Roshal, Zhu & Planelles, 2001; Gallo & Montagnier, 2003); a diabetes (Barreto et al,
2006); a Doença de Chagas (Lopes et al, 1995; Barcinski & DosReis, 1999; Lüder, Gross &
Lope, 2001; de Meis et al, 2008); e as leishmanioses (Das et al, 1999; Bertho et al, 2000;
Lüder, Groos & Lopes, 2001; Shaha, 2006; Hernández-Ruiz et al, 2010).
A própria Leishmania pode sofrer apoptose como um mecanismo regulatório do
número de parasitos durante o processo de divisão celular das promastigotas no trato
digestivo do inseto vetor, impedindo que uma multiplicação excessiva comprometa a vida do
41
flebotomíneo. Nos macrófagos do hospedeiro vertebrado a apoptose das formas amastigotas
pode atuar no controle da divisão celular, regulando o número de parasitos na célula
hospedeira e minimizando a resposta imune (Shaha, 2006). Acredita-se que a exposição de
fosfatisilserina pelas formas promastigotas está relacionada à capacidade da Leishmania de
mimetizar uma morte apoptótica, induzindo a fagocitose das mesmas pelos macrófagos, que
contribuiria para o estabelecimento da infecção (Wanderley et al, 2006, 2009).
Tem sido observado níveis aumentados de apoptose em linfócitos T durante as
infecções por Trypanosoma cruzi (Lopes & DosReis, 1994; Lopes et al, 1995; Martins et al,
1998; DosReis & Lopes, 2009), Toxoplasma gondii (Khan, Matsuura & Kasper, 1996; Luder,
Gross, 2005; Lee et al, 1999), Plasmodium sp. (Baldé, Sarthou & Roussilhon, 1995;
Matsumoto et al, 2000), e Leishmania sp. (Das et al,1999; Bertho et al, 2000). A morte destas
células parece comprometer o processo de expansão clonal e diferenciação celular, resultando
em produção insuficiente de citocinas e diminuição de atividade citotóxica que resultariam na
persistência do parasito (Guillermo et al, 2009).
Tanto em pacientes infectados por Leishmania como em infecções experimentais, tem
sido descrita e discutida a influência da apoptose na imunopatogênese da doença. Em
camundongos suscetíveis a L. donovani, foi observado um aumento da apoptose de linfócitos
T CD4+ após a ativação destas células com conseqüente redução da produção de IL-2 e IFN-γ
(Das et al, 1999). A resposta do tipo Th1 realizada pelos linfócitos T CD4+ em camundongos
infectados por L. major ou por L. donovani parece ser modulada pela indução do processo
apoptótico e modulação da produção de IFN-γ por estar células (Huang et al, 1998;
Alexander, Kaye & Engwerda, 2001). Além disso, a anergia celular induzida por antígenos de
L. amazonensis, principal agente etiológico da LCD, está associada à apoptose de linfócitos T,
que prejudicaria a apresentação antigênica pelos macrófagos, resultando em uma ativação
reduzida da resposta imune celular (Pinheiro et al, 2004).Em camundongos suscetíveis à
infecção por L. major (BALB/c) foi observado um aumento progressivo deste processo de
morte celular programada nos órgãos linfóides, enquanto nos camundongos resistentes a esta
infecção (CBA), havia apenas uma apoptose transitória (Desbarats et al, 2000).
Tanto os linfócitos T CD4+ como os linfócitos T CD8+, presentes nos linfonodos de
camundongos infectados por L. major, sofrem apoptose durante a infecção (Desbarats et al,
2000). Em lesões de pacientes infectados por L. braziliensis, estas células também sofrem
apoptose sendo que este fenômeno de morte se mostra mais acentuado nos linfócitos T CD8+,
o que parece comprometer uma resposta imune eficiente (Bertho et al, 2000). Por sua vez, a
morte de linfócitos T CD4+ interfere na produção adequada de citocinas do tipo Th1
42
reduzindo assim, a ativação dos linfócitos T CD8+. Em humanos, a anergia celular e a
apoptose, observadas durante a leishmaniose visceral, foram correlacionadas a uma baixa
produção de IL-2 e níveis reduzidos de proteínas da família Bcl-2 em linfócitos T os quais
poderiam estar entrando em processo de morte por falta do estímulo de ativação (IL-2) e de
sobrevivência (Bcl-2) (Das et al, 1999; Mukherjee, Sen & Ghose, 2006). Sendo assim, a
apoptose parece ter um papel imunomodulador do sistema imune, seja fisiologicamente,
exercendo o papel de controlar a homeostase, seja influenciando a imunopatogenia de uma
série de doenças como, por exemplo, a leishmaniose.
1.7 CITOMETRIA DE FLUXO
Ao longo dos últimos quarenta anos, a citometria de fluxo veio ganhando espaço no
cenário científico, apresentando-se como a principal ferramenta utilizada para a caracterização
fenotípica e funcional de uma diversidade de populações celulares, tendo um importante papel
no avanço dos conhecimentos na área da imunologia. Esta metodologia permite uma análise
celular individual na qual diversas de características, fenotípica e funcional, podem ser
avaliada simultaneamente. Particularmente na leishmaniose, a citometria de fluxo tem
oferecido uma grande contribuição para o estudo da imunopatogenia desta doença,
principalmente, no que diz respeito à frequência e proporção de linfócitos T CD4+ e T CD8+ e
a produção de citocinas por estas células (Scott et al, 1989; Da-Cruz et al, 1994; Barral et al,
1995, Coutinho et al, 1996; Bertho et al, 2000; Bottrel et al, 2001; Toledo et al, 2001; DaCruz et al, 2002; 2005; Gomes-Silva et al, 2007; Mendes-Aguiar et al, 2009; Maretti-Mira et
al, 2011).
Com o avanço tecnológico dos equipamentos e com a evolução da produção dos
anticorpos monoclonais e substâncias fluorescentes, os protocolos multiparamétricos se
mostram cada vez mais elaborados envolvendo uma diversidade de marcadores que
possibilitam uma avaliação fenotípica/funcional mais abrangente, envolvendo uma série de
abordagens.
O estudo da apoptose, inicialmente realizado por microscopia ótica e posteriormente
através da microscopia eletrônica (Fesq et al, 1994; Walker et al, 1998) e eletroforese em gel
(Wyllie, 1998), passou a ser realizado por citometria de fluxo (Schimid et al, 1994;
Darzynkiewicz et al, 1997; Vermes et al, 1995; Douglas et al, 1998; Bertho, Santiago &
Coutinho, 2000) a qual se mostra, como uma ferramenta adequada, no que tange a
determinação e avaliação de células neste processo de morte e que é atualmente a metologia
43
de escolha preferencialmente utilizada (Schimid, Uittenbogaart & Jamienson, 2007; Gille et
al, 2011; Zimmermann & Meyer, 2011). Alterações morfológicas, atividade das caspases,
manutenção da integridade de membrana, e principalmente a detecção da fragmentação do
DNA podem ser utilizados para identificar as células apoptóticas por citometria de fluxo.
Além disso, do ponto de vista morfológico, a retração celular pode ser considerada uma
característica de morte celular por apoptose. A célula dimunui seu tamanho e aumenta sua
granulosidade, sendo facilmente evidenciadas através da citometria de fluxo (Bertho, Santiago
& Coutinho, 2000). Entre outros marcadores do processo apoptótico, estão os anticorpos
monoclonais anti-caspases iniciadoras (caspases 2, 8, 9 e 10) e anti-caspases efetoras
(caspases 3, 6, 7) (Taylor, Cullen & Martin, 2008; Martinez, Reif & Pappas, 2010). Além das
características morfológicas e ds anticorpos monoclonais (anti-caspase, anti-Bcl, anti-Fas); a
Anexina-V; o Iodeto de Propídeo; e a 7-AAD também têm sido utilizados para a identificação
destas
células,
podendo
ainda
ser
utilizados
concomitantemente
a
uma
análise fenotípica (Nicoletti et al, 1991).
O repertório de linfócitos T, o qual era avaliado por biologia molecular (Pantaleo et al,
1994; Hawke, Rast & Litman, 1996; Ria et al, 2001), passou a ser estudado também por
citometria de fluxo, principalmente pela possibilidade de reunir informações fenotípicas aos
perfis do TCR, através da marcação das células com uma combinação de anticorpos
monoclonais (van den Beemd et al, 2000; Lima et al, 2003; Menezes et al, 2004; GiacoiaGripp et al, 2005; Clarêncio et al, 2006, Keesen et al, 2011; Tembhare et al, 2011). Além
disso, a fabricação de kits (kit IOTest Beta Mark TCR Vβ Repertoire – Beckman Coulter,
EUA) permitiu que o repertório Vβ fosse analisado a partir de um número reduzido de
amostras, facilitando e otimizando tal estudo.
As alterações fenotípicas que caracterizam o processo de diferenciação celular também
têm sido exploradas para a identificação das subpopulações de linfócitos por citometria de
fluxo, através de combinações de anticorpos monoclonais como anti-CD45RA, anti-CD45RO,
anti-CD27, anti-CD28, anti-CCR7 e anti0CD62L (Hamann et al, 1997; 1999; Sallusto et al,
1999; Baars et al, 2000; Monsurrò et al, 2002; Mackus et al, 2003; Campbell et al, 2009;
Nikolova et al, 2009; Libri et al, 2011).
Neste cenário, a citometria de fluxo se apresenta como uma ferramenta adequada,
moderna, e indispensável para o estudo fenotípico/funcional de diversas populações celulares,
permitindo, a partir de protocolos multiparamétricos, determinar características e fenômenos
imunológicos, em amostras obtidas de modelos experimentais e de humanos.
44
2. JUSTIFICATIVA
A extensa distribuição geográfica da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), sua
alta incidência e o grande número de indivíduos expostos fazem desta morbidade uma questão
de grande importância para a saúde pública mundial. No Brasil, são registrados anualmente
cerca de 30.000 novos casos de LTA (SVS/MS, 2010), tornando-se necessária uma atenção
especial, por parte dos órgãos competentes, aos esforços direcionados para o controle desta
doença. A LC é a forma clínica mais frequente da doença e é endêmica no Estado do Rio de
Janeiro, onde a maioria dos casos é causada pela espécie Leishmania (Viannia) braziliensis.
A estratégia mais expressiva para a profilaxia da LC seria o desenvolvimento de uma
vacina capaz de proteger os indivíduos que se encontram nas áreas de risco de transmissão do
parasito. Paralelamente, uma terapia menos agressiva, em termos de efeitos colaterais, se faz
necessária, com o intuito de amenizar as consequências da terapia atualmente utilizada.
A perspectiva de controle desta doença depende de um aprofundamento e detalhamento
do conhecimento no que diz respeito aos fenômenos que ocorrem durante a resposta imune
específica a Leishmania. Este conhecimento é fundamental para estabelecer parâmetros
imunológicos associados com a patogênese, a cura e a resposta protetora da LC, para que
possa então, ser aplicado em manipulações terapêuticas e no desenvolvimento de vacinas.
Sabendo que a LC está em expansão e ainda sem controle efetivo, estudos mais detalhados em
relação à resposta imune são extremamente relevantes para uma melhor compreensão e
aprofundamento dos conhecimentos no que diz respeito à imunopatogenia desta doença.
Ao longo dos anos, vários estudos vêm demonstrando a importância da resposta imune
celular, mediada por linfócitos T, na LC. Os avanços no entendimento desta doença têm sido
obtidos através de estudos baseados na avaliação da frequência de linfócitos T CD4+ e T
CD8+. No entanto, estes linfócitos T se diferenciam em células funcionalmente distintas,
tornando-se importante uma avaliação das subpopulações naive, efetora, de memória central e
de memória efetora (Hamann et al, 1997; Sallusto et al, 2004; Appay et al, 2008).
Apesar dos linfócitos T CD4+ orquestrarem a resposta imune celular na LC, os
linfócitos T CD8+ parecem estar diretamente relacionados à destruição de células infectadas,
atuando não só através da sua atividade citotóxica, com secreção de grânulos citolíticos como,
também, através de IFN-γ (Pirmez, 1992; Da-Cruz et al, 1994; Barral-Neto et al, 1995;
Mendonça et al, 1995; Brodskyn et al 1997; Coutinho et al, 1998; Pompeu et al, 2001; DaCruz et al, 2002; Bertholet et al, 2005; Maretti-Mira et al, 2011). Além disso, já foi
demonstrado que a progressão da doença está associada a uma maior ocorrência de apoptose
dos linfócitos T CD8+. Bertho e colaboradores (2000) demonstraram que, em lesões de
45
pacientes que evoluíram para a cura espontânea havia um menor percentual de apoptose dos
linfócitos T CD8+ enquanto a maior ocorrência deste processo de morte, em lesões de
pacientes, estava associada á progressão da doença. Sendo assim, a apoptose teria um papel
modulador na resposta imune de pacientes de LC, podendo contribuir para a progressão da
doença.
Neste contexto, a ativação de linfócitos T; a diferenciação de células efetoras e de
memória; e a apoptose são mecanismos envolvidos na resposta imune, os quais estão
envolvidos na respoata imune durante a LC e que podem influenciar os processos de proteção,
cura e progressão desta doença.
Quanto à especificidade dos linfócitos T, diversas pesquisas baseadas na resposta
imune adaptativa têm sido conduzidas através da análise da cadeia variável β do TCR, isto é, do
repertório Vβ. Diferentes perfis de distribuição deste repertório já foram associados à doenças
como leucemia (Plasilova, Risitano & Maciejewski, 2003); esclerose múltipla (Hong
et al, 1999); artrite reumatóide (Goodall, Bledsoe & Gaston, 1999); e Doença de Chagas (Costa
et al, 2000; Menezes et al, 2004). Na LC, poucos estudos têm sido realizados com o objetivo de
avaliar possíveis alterações no perfil do repertório de linfócitos T em pacientes (Uyemura et al,
1993; Clarêncio et al, 2006). Além disso, ainda não há descritona literatura uma análise do
repertório Vβ de subpopulações de linfócitos T em pacientes de leishmaniose, o que permitiria
uma avaliação dos clones preferencialmente induzidos e que poderiam participar de uma
resposta imune no sítio da infecção..
Sendo assim, a avaliação da diversidade dos clones de linfócitos T CD8+ entre
subpopulações funcionalmente distintas (naïve, efetora e de memória) e a indução de apoptose
nestas células, tornaram-se um importante foco de investigação que possibilita uma melhor
compreensão e aprofundamento dos conhecimentos dos fenômenos envolvidos na resposta
imune na LC, associados à progressão e à cura da doença. Neste contexto, as informações
obtidas através de uma análise fenotípica/funcional multiparamétrica de linfócitos T CD8+ de
pacientes, com doença ativa e em tratamento, e curados após o fim daterapia, trazem novas
perspectivas para os estudos em vacina; terapias mais eficientes e menos agressivas; e
melhores condições de avaliar a resposta terapêutica após o tratamento.
Seguindo esta linha de pesquisa, o desenho experimental deste trabalho é fruto do
interesse em aprofundar os conhecimentos acerca das características da resposta imune celular
por linfócitos T CD8+, durante a LC causada por L. braziliensis. Para isto, a citometria de
fluxo mostra-se como a ferramenta ideal, que permite a realização de uma análise
multiparamétrica para determinar características fenotípicas e funcionais dos linfócitos T
CD8+.
46
3. OBJETIVO GERAL
Avaliar o papel da apoptose e a diversidade do repertório de linfócitos T CD8+ e de suas
subpopulações naïve, efetora, de memória central e de memória efetora, na resposta imune de
pacientes durante e após o tratamento da leishmaniose cutânea.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
3.1.1 Avaliar a frequência de linfócitos T CD8+ e a ocorrência de apoptose nestas
células, obtidas ex vivo e após estimulação in vitro com antígenos de L. braziliensis, nos dois
grupos de pacientes e em indivíduos sadios;
3.1.2 Determinar a razão da frequência de linfócitos T CD8+ naïve, efetores, de
memóriacentral e de memória efetora, a fim de identificar se a distribuição/proporção destas
subpopulações sofre alguma alteração, nos diferentes estados imunológicos que se encontram
os indivíduos dos três grupos estudados;
3.1.3 Avaliar a influência dos antígenos de L. brazliensis na indução de apoptose dos
linfócitos T CD8+ naïve, efetores, de memória central e de memória efetora; e na frequência
destas subpopulações;
3.1.4 Caracterizar o perfil do repertório Vβ do TCR de linfócitos T CD8+, obtidos ex
vivo, através da avaliação do percentual de expressão de 24 cadeias Vβ e comparar a
distribuição dos clones entre os indivíduos sadios; os pacientes em tratamento, com doença
ativa; e os pacientes pós-tratados, clinicamente curados, a fim de identificar possíveis
expansões ou contrações clonais nos diferentes estágios da doença;
3.1.5 Caracterizar o perfil do repertório Vβ das células naïve, efetoras, de memória
central e de memória efetora, e avaliar se a distribuição dos clones é heterogênea entre estas
subpopulações dos linfócitos T CD8+.
47
4. METODOLOGIA
4.1 CASUÍSTICA
Participaram deste estudo, indivíduos adultos, maiores de 18 anos com média de idade
de 38,1±17,6 anos entre os homens e de 38±13,4 anos entre as mulheres, os quais foram
divididos em três grupos:
Grupo I: Indivíduos sadios (Controles – CTRL; n=18); sem histórico prévio de
leishmaniose e que não residem em áreas endêmicas desta doença.
Grupo II: Pacientes de leishmaniose cutânea (LC) em tratamento (décimo dia após o
início do tratamento com Glucantime®) (pacientes durante tratamento - PDT; n=14),
apresentando lesões cutâneas ulceradas, cujo diagnóstico de (LC) foi confirmado por critérios
clínicos, epidemiológicos, e exames parasitológicos (cultivo, PCR e/ou imprint).
Grupo III: Pacientes de LC após a conclusão da terapia, de acordo com critérios
definidos pela equipe médica do IPEC (octagésimo dia após o início do tratamento),
clinicamente curados (pacientes póstratamento - PPT; n=11).
Todos os pacientes foram atendidos no ambulatório do Serviço de Referência em
Leishmaniose do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC), FIOCRUZ, e foram
submetidos a um ensaio clínico de tratamento, randomizado e duplo cego, com Glucantime®.
Foram investigadas informações epidemiológicas e clínicas, como idade e sexo;
número e área das lesões durante a fase ativa; tempo de evolução; local de moradia dos
indivíduos; resposta ao teste de Intradermorreação de Montenegro (IDRM); resposta ao
tratamento; cura clínica; reativação e re-infecção, através de levantamento dos prontuários dos
pacientes.
O critério de cura clínica foi definido pela epitelização total das lesões ulceradas,
regressão da infiltração e do eritema, após conclusão do esquema terapêutico (Ministério da
Saúde, 2010). Com base nestas definições, as lesões cicatrizadas, em até três meses após a
conclusão do esquema terapêutico, foi considerada como cura clínica recente. Em caso de
ausência de cicatrização completa, após uso do Glucantime®, o tratamento seria considerado
insatisfatório, sendo necessário um esquema terapêutico alternativo ou a repetição de um ciclo
da mesma terapia antimonial, o que não ocorreu neste estudo, já que todos os pacientes
avaliados apresentaram cura clínica após a terapia, e ausência de reativação até o octagésimo
dia após o início do tratamento.
48
Foram excluídos do estudo os pacientes com doenças sistêmicas concomitantes, que
sabidamente interferem na capacidade imunológica do indivíduo; pacientes sob o uso de
medicação tópica sobre a lesão cutânea; gravidez; tratamento prévio com leishmanicidas; e
pacientes com contra-indicação para o uso do Glucantime®, na dose e esquema terapêutico
recomendados pelo Ministério da Saúde. Foram excluídos, ainda, os indivíduos que
apresentaram resposta negativa à IDRM, a fim de incluir somente aqueles que apresentaram
uma resposta imune celular preservada.
O estudo segue a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde que trata das
diretrizes e normas de pesquisas envolvendo seres humanos. O desenho experimental e o
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (anexo 1) foram aprovados pelos Comitês de
Ética em Pesquisa da FIOCRUZ (CEP-FIOCRUZ) sob o número 502/09 e do Instituto de
Pesquisa Clínica Evandro Chagas (CEP-IPEC/FIOCRUZ) sob o número 057/2009.
4.2 COLETA DO MATERIAL BIOLÓGICO
Foram obtidas amostras de sangue periférico, através de punção venosa em tubos
heparinizados (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA), num volume máximo de 20 mL
de sangue de cada indivíduo, as quais foram enviadas ao laboratório onde foram processadas.
O tempo entre a coleta do material biológico e o processamento do mesmo foi no máximo 24
horas. Havendo necessidade os tubos com sangue foram deixados de um dia para o outro
(overnight), à temperatura ambiente de 20ºC±2º C, sempre sob homogeneização (Arsec, São
Paulo, SP, Brasil).
4.3 OBTENÇÃO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGUE PERIFÉRICO
A obtenção de células mononucleares de sangue periférico (CMSP), utilizadas nos
ensaios experimentais ex vivo e in vitro, foi feita através de centrifugação em gradiente de
Ficoll-Hypaque (Histopaque® 1077, Sigma, St. Louis, MO, EUA), descrita a seguir: o sangue
heparinizado foi diluído na proporção 1:1 em meio de cultura RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad,
CA, EUA), suplementado com HEPES (10mM; Sigma, EUA), 2-mercaptoetanol (1mM;
Gibco, EUA), L glutamina (1,5mM; Sigma, EUA), penicilina (200UI; Sigma, EUA) e
estreptomicina (200µg/mL; Sigma, EUA). O sangue diluído foi então depositado
cuidadosamente sobre o Ficoll-Hypaque, numa proporção 2:1, em tubo de 50 mL (Corning
Inc., México). Posteriormente, esta amostra foi submetida a uma centrifugação por 30
minutos, a 400 g na temperatura de 20ºC, sem freio (Thermo Fisher Scientific Inc., EUA.). As
células mononucleares foram coletadas, com auxílio de uma pipeta Pasteur (Corning Inc.,
Corning, NY, EUA), a partir do anel de células formado na interface entre o soro e o Ficoll,
49
sendo a seguir submetidas a três lavagens, com meio RPMI suplementado, por centrifugação
(10 minutos/250 g/20°C, com freio). O número de células viáveis foi determinado através da
diluição em Azul de Tripan (Sigma, EUA) seguida da contagem em câmara de Neubauer com
auxílio de microscópio óptico (Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY, EUA). A concentração de
células viáveis foi ajustada para 3x106/mL de meio RPMI suplementado, acrescido de 10% de
soro humano AB Rh+ inativado (Sigma, EUA). Estas células foram, então, utilizadas nos
ensaios ex vivo e in vitro de caracterização fenotípica e e funciona dos linfócitos T CD8+.
4.4 ENSAIO EX VIVO PARA AVALIAÇÃO FENOTÍPICA DAS SUBPOPULAÇÕES
DE LINFÓCITOS T CD8+, REPERTÓRIO Vβ E APOPTOSE
As CMSP obtidas dos indivíduos dos três grupos estudados foram sedimentadas por
centrifugação (679 g, 5 minutos) e ressuspendidas numa solução de Tampão Fosfato contendo
0,1% de azida sódica (Merck, EUA) e 2% de Soro Fetal Bovino (SFB; Sigma, EUA) (PBSaz).
Posteriormente, estas células foram distribuídas em tubos de microcentrifugação de 1,5 mL
(Eppendorf, Hauppauge, NY, EUA) na concentração 5x105 células/50 µL de PBSaz e
submetidas a um protocolo citofluorimétrico de marcação, que inclui a 7-AAD (7aminoactinomicina D) e um painel de anticorpos monoclonais, descrito a seguir (Figura 4.1):
para a determinação do repertório Vβ de linfócitos T foi utilizado o kit IOTest Beta Mark
TCR Vβ Repertoire (gentilmente cedido pela Beckman Coulter, EUA), o qual é composto por
anticorpos monoclonais específicos para um total de vinte e quatro (1, 2, 3, 4, 5.1, 5.2, 5.3,
7.1, 7.2, 8, 9, 11, 12, 13.1, 13.2, 13.6, 14, 16, 17, 18, 20, 21.3, 22, 23) (Tabela 4.1),
pertencentes a 19 das 26 famílias Vβ conhecidas. Estas 24 cadeias abrangem 70% do
repertório Vβ do TCR de linfócitos T CD3+ de um indivíduo normal, e são divididas em oito
frascos de forma que os três anticorpos monoclonais contidos em cada frasco são conjugados
ao FITC, ao PE ou ao FITC e PE. Além dos anticorpos anti-Vβ, utilizou-se os anticorpos
monoclonais anti-CD8/APC; e anti CD45RA/ECD (PE-TR) e anti-CD27/PE-Cy7 para
identificar as subpopulações naïve, efetora, e de memória (efetora e central), os quais foram
adicionados às oito amostras.
50
Tabela 4.1: Designação dos anticorpos monoclonais específicos para 24 cadeias Vβ utilizadas no protocolo
experimental, conforme distribuição em oito tubos d ensaio contendo a mesma amostra. (A-H). Kit IOTest®
Beta Mark.
Cadeia Vβ*
Fluorocromo conjugado
Tubo
Vβ 5.3
PE
A
Vβ7.1
FITC/PE
A
Vβ 3
FITC
A
Vβ9
PE
B
Vβ 16
FITC/PE
B
Vβ17
FITC
B
Vβ18
PE
C
Vβ5.1
FITC/PE
C
Vβ20
FITC
C
Vβ13.1
PE
D
Vβ13.6
FITC/PE
D
Vβ8
FITC
D
Vβ5.2
PE
E
Vβ 2
FITC/PE
E
Vβ 12
FITC
E
Vβ23
PE
F
Vβ 1
FITC/PE
F
Vβ21.1
FITC
F
Vβ 11
PE
G
Vβ 22
FITC/PE
G
Vβ 14
FITC
G
Vβ 13.2
PE
H
Vβ 4
FITC/PE
H
Vβ 7.2
FITC
H
*Nomenclatura segundo Wei et al (1994). FITC - Isotiocianato de fluoresceína; PE - Ficoeritrina .
Após a marcação com os anticorpos monoclonais, as amostras foram incubadas por 30
minutos a 4°C (no gelo), protegidas da luz, e em seguida lavadas com PBSaz por
centrifugação (670 g, 5 min.). Posteriormente as amostras foram submetidas à marcação com
20 µg/mL de 7-AAD, para identificação das células em apoptose, incubadas por 30 min a 4ºC,
e adquiridas através do citômetro de fluxo em até 12 horas. Havendo a necessidade de realizar
a aquisição das amostras posteriormente a este período, as amostras foram submetidas a um
protocolo de fixação com actinomicina D (AD; Sigma, EUA) e paraformaldeído (PFA;
Sigma, EUA) em PBS. Para isto, as células foram centrifugadas (670 g, 5 min) e o sedimento
celular foi ressuspendido em 500 µL de PBS contendo 1% de parafolmaldeído e 20 µg/mL de
AD (AD/PFA). As amostras fixadas foram armazenadas em geladeira (2 a 8o C), protegidas da
51
luz, e adquiridas por citometria de fluxo em até cinco dias (Schimid et al, 1994). A
combinação de marcadores utilizada na análise citofluorimétrica para avaliar as características
celulares está descrita na Tabela 4.2.
Figura 4.1: Esquema do protocolo citofluorimétrico utilizado no ensaio experimental ex vivo. São
adicionados, em cada uma das oito amostras, anticorpos monoclonais específicos para 3 diferentes cadeias Vβ,
anticorpos monoclonais anti-CD8, antiCD27 e anti-CD45RA e a 7AAD. Fluorocromos: FITC - Isotiocianato de
Fluoresceína; PE - Ficoeritrina; ECD Ficoeritrina-Texas red; PE-Cy7 - Ficoeritrina-Cianina 7; APC Aloficocianina; 7-AAD - 7-Actinomicina D.
Tabela 4.2: Combinação de anticorpos monoclonais e 7-AAD, utilizados como marcadores para avaliar
diferentes características celulares por citometria de fluxo, em ensaio experimental ex vivo.
Amostra
CMSP
Análise citofluorimétrica
Característica celular avaliada
Vβ-FITC+ Vβ-PE- Vβ-FITC-PE-
Cadeia Vβ do TCR
Vβ-FITC- Vβ-PE+ Vβ-FITC-PE-
(em 8 tubos contendo anticorpos
Vβ-FITC- Vβ-PE- Vβ-FITC-PE+
monoclonais para 3 famílias Vβ)
CD8high*
Linfócito T CD8+
CD45RA+ CD27+
Linfócito T naïve
+
-
Linfócito T efetor
-
-
Linfócito T de memória efetora
-
+
Linfócito T de memória central
CD45RA CD27
CD45RA CD27
CD45RA CD27
7-AAD
low**
Células em apoptose
CMSP - Células mononucleares de sangue periférico; Cadeia Variável Beta do TCR (Vβ); Isotiocianato de
Fluoresceína (FITC); Ficoeritrina (PE); * high - células que apresentam alta intensidade de fluorescência; ** low
- células que apresentam baixa intensidade de fluorescência.
52
4.5 PREPARO DE ANTÍGENOS PARTICULADOS DE LEISHMANIA (VIANNIA)
BRAZILIENSIS
As
formas
promastigotas
da
cepa
de
referência
de
L.
braziliensis
(MHOM/BR/75/M2903) foram utilizadas para a obtenção de antígenos particulados, os quais
foram utilizados no ensaio experimental in vitro. Os parasitos foram expandidos em garrafas
de poliestireno de 25cm2 contendo meio de cultura Schneider (pH 7,2; Sigma, EUA)
suplementado com 1,5 mM de L-glutamina (Sigma, EUA); penicilina (200 UI; Sigma, EUA)
e estreptomicina (200 µg/mL; Sigma, EUA); e 20% de soro fetal bovino (Sigma, EUA); 2%
de urina. Após o 50º dia de cultivo, quando as leishmânias estão em fase estacionária, os
parasitos foram submetidos a duas lavagens por centrifugação (15 minutos, 1900 g, 40º C)
com PBS. A seguir foi realizada a contagem de leishmânias e ajuste para 108
promastigotas/mL, também em PBS. A suspensão foi submetida a 10 ciclos de congelamento
em nitrogênio líquido e descongelamento em banho-maria a 70ºC, a fim de lisar os parasitos e
obter o antígeno particulado. Após a confirmação da lise completa, através da ausência de
parasitos íntegros, realizada através de microscopia óptica, o antígeno foi aliquotado e
conservado a -20o C.
4.6 ENSAIO IN VITRO PARA AVALIAÇÃO FENOTÍPICA DAS SUBPOPULAÇÕES
DE LINFÓCITOS T CD8+ E APOPTOSE
As CMSP obtidas dos indivíduos dos três grupos estudados, foram ajustadas em meio
RPMI suplementado, acrescido com 10% de soro humano AB Rh+ inativado (Sigma, EUA).
Estas células foram distribuídas (3x105/poço) em placa de poliestireno de 96 poços de fundo
chato (Beckton & Dickinson, EUA) e cultivadas em estufa com atmosfera úmida de 5% de
CO2 na temperatura de 37ºC (Napco, EUA). A cultura foi realizada em triplicatas sob três
diferentes condições de cultivo, baseado no protocolo de resposta proliferativa de linfócitos
(Mendonça et al, 1986): células sem estímulo antigênico, utilizadas como controle negativo
(background- BG); células estimuladas com o mitógeno Concanavalina-A (Con-A)
(1µg/poço) (Sigma, EUA), como controle positivo de proliferação; e células estimuladas com
antígenos particulados de L. braziliensis (Ag-Lb) equivalente a 106 promastigotas
metacíclicas/poço, para um volume final de 200 µL/poço.
O tempo de cultura das células estimuladas com Con-A foi de três dias, enquanto as
células estimuladas com antígeno de L. braziliensis e as células sem estímulo foram
cultivadas por cinco dias. O acompanhamento da cultura foi realizado por microscopia óptica
e após o cultivo as células foram submetidas ao protocolo citofluorimétrico de marcação,
53
descrito a seguir: no 3o dia de cultivo, as CMSP, estimuladas com Con-A, foram
homogeneizadas e transferidas para tubos de 1,5 mL (Eppendorf, EUA) e lavadas por
centrifugação (670 g, 5 min). As células sedimentadas foram ressuspendidas em PBSaz e
submetidas ao protocolo de marcação com 7-AAD (Sigma, EUA) (Schimid et al, 1994), como
controle positivo de apoptose. Posteriormente, no 5o dia de cultivo, as CMSP estimuladas com
Ag-Lb assim como as células do BG foram homogeneizadas e transferidas com pipeta Pasteur
para tubos microcentrifugação de 1,5 mL (Eppendorf, EUA). Estas células foram
sedimentadas por centrifugação (670 g, 5 minutos), ressuspendidas em 50µL de PBSaz e
submetidas marcação com anti-CD8/PE, anti-CD45RA/ECD e anti-CD27/PE-Cy7 (todos da
Beckman Coulter, EUA). A seguir, as amostras foram incubadas por 30 minutos, a 4oC e
protegidas da luz. Após uma lavagem em PBSaz (670 g, 5 min.) foi realizada a marcação
intracelular com 7-AAD (Sigma, EUA), para determinar as células em apoptose (Figura 4.2).
Quando necessário, foi feita a fixação das células com AD/PFA (Sigma, EUA). A
combinação da 7-AAD com os anticorpos monoclonais, utilizados como marcadores para a
avaliação das características celulares por citometria de fluxo, após cultivo in vitro, está
descrita na Tabela 4.3.
Figura 4.2: Esquema do protocolo citofluorimétrico utilizado após o ensaio experimental in vitro. No 30 dia
do cultivo in vitro, a 7-AAD é adicionada as amostras que contem as células estimuladas com concanavalina-A
(Con-A). No 50 dia foram adicionados anticorpos monoclonais anti-CD8, antiCD27 e anti-CD45RA, e 7-AAD
as amostras que contem as celulas não estimuladas – background (BG) e aquelas que contém as células
estimuladas com antígenos de L. braziliensis (Ag-Lb).
Tabela 4.3: Combinação de anticorpos monoclonais e de 7-AAD utilizados como marcadores para avaliar
diferentes características celulares por citometria de fluxo, em ensaio experimental in vitro.
Amostra
CMSP
Análise citofluorimétrica
Característica celular avaliada
CD8high*
Linfócito T CD8+
+
+
CD45RA CD27
Linfócito T naïve
CD45RA+ CD27-
Linfócito T efetor
CD45RA- CD27-
Linfócito T de memória efetora
CD45RA- CD27+
Linfócito T de memória central
7-AADlow**
Células em apoptose
CMSP - Células mononucleares de sangue periférico * high - células que apresentam alta intensidade de
fluorescência; ** low - células que apresentam baixa intensidade de fluorescência.
54
4.7 CITOMETRIA DE FLUXO
As amostras foram adquiridas em um total de 50 mil eventos, nos citômetros de fluxo
Cyan (Beckman Coulter, EUA), da Plataforma de Citometria de Fluxo do IOC, FIOCRUZ e
no citômetro de fluxo FACS Aria (Becton and Dickinson, EUA), da Plataforma do PDTIS,
FIOCRUZ. As análises citofluorimétricas foram realizadas utilizando os programas
computacionais específicos Summit 4.3 e FACSDiva.
4.7.1 Definição de Regiões e Compensação de Cores
Anticorpos monoclonais isotípicos anti-IgG conjugados aos mesmos fluorocromos dos
ensaios fenotípicos ex vivo e in vitro foram utilizados para controles negativos de marcação e
para o ajuste da voltagem ideal, de forma que as células negativas ficaram representadas até
grandeza de 101 no gráfico biparamétrico de intensidade de fluorescência. Feito isto, os
cursores foram posicionados de modo a formar quatro quadrantes de análise (Figura 4.2B),
sendo que as células duplo-negativas foram delimitadas pelo quadrante 3.
Para ajustar a compensação de cores foram realizadas seis diferentes marcações
simples, isto é, somente um tipo de anticorpo monoclonal e, portanto um fluorocromo,
descritos a seguir: anti-CD4/FITC, anti-CD8/PE (Figuras 4.3E e 4.3F), anti-CD45/ECD
(Figuras 4.2C e 4.2D), anti-CD3/PE-Cy7 e anti-CD45/APC (todos da Beckman Coulter,
EUA), além da marcação simples com 7-AAD (Sigma, EUA).
A compensação dos sinais interferentes de fluorescência foi baseada nos critérios de
aproximação dos valores da intensidade média de fluorescência (mean fluorescence intensity MFI) entre os quadrantes 1 e 3 (Q1 e Q3), no eixo do x; e entre os quadrantes 3 e 4 (Q3 e Q4),
no eixo do y (Figuras 4.3C e 4.3F). As amostras foram adquiridas individualmente e
analisadas em gráficos biparamétricos de marcação (dot plot) para avaliar o fluorocromo
utilizado na marcação simples versus todos os outros fluorocromos utilizados nas amostras
submetidas ao protocolo multiparamétrico. As compensações foram ajustadas de modo que a
MFI, no eixo do x, observada no quadrante um (Q1 – Figuras 4.3E e 4.3F), represetando as
células positivas para o anticorpo utilizado, deveriam ter um valor igual ou mais próximo
possível da MIF do quadrante três (Q3 – Figuras 4.3E e 4.3F), que representa as células
negativas para o mesmo anticorpo. O mesmo procedimento foi feito em relação à MFI no eixo
do y, observando-se os quadrantes três e quatro (Q3 e Q4 - Figuras 4.3C e 4.3D). A Figura
4.3G representa uma amostra devidamente compensada para dois fluorocromos.
55
Figura 4.3: Ajuste de quadrantes e compensação de cores. Dot plot dividido pelos quadrantes Q1, Q2, Q3 e
Q4 (A); limite dos quadrantes posicionado de acordo com a amostra de CMSP não marcada (B); marcação
simples com anti-CD45/ECD não compensada, com valores de MFI (intensidade média de fluorescência)
diferentes entre o Q1 (quadrante 1) e o Q3 (C); amostra com marcação simples com anti-CD45/ECD
compensada, com MFI entre o Q1 e o Q3 ajustada para valores próximos (D); marcação simples com antiCD8/PE não compensada, com MFI diferentes entre o Q4 e o Q3 (E); a mesma amostra com marcação simples
com anti-CD45/ECD compensada, com MFI entre o Q4 e o Q3 ajustada para valores próximos (F); amostra
compensada contendo os dois anticorpos monoclonais, analisada em protocolo com compensação previamente
ajustada (G).
56
4.7.2 Análise Citofluorimétrica das Amostras Obtidas Ex vivo
Inicialmente, foi realizada uma marcação simples das CMSP com anticorpos
monoclonais anti-CD3, a fim de definir a região de análise (gate) nos linfócitos T, através da
estratégia do contra-gate. Para realizar esta estratégia foram criados simultaneamente, um
gráfico biparamétrico (dot plot) de granularidade (side scatter – SSC; eixo x) vs tamanho
(forward scatter – FSC; eixo y) (Figura 4.4A) e um histograma de intensidade de
fluorescência para se definir a região positiva para CD3 (Figura 4.4B). A partir desta região
CD3 positiva, foi possível identificar os linfócitos T no dot plot de SSC vs FSC
(exemplificado na Figura 4.4C pela cor azul, correspondente às células CD3+). Esta região
foi utilizada em todas as análises citofluorimétricas ex vivo realizadas no estudo (Figura
4.4D).
Figura 4.4: Estratégia do “contra-gate” para definição da região de análise (gate) nos linfócitos. Gráfico (dot
plot) de granularidade (SSC) vs tamanho (FSC) (A); histograma de marcação para o anticorpo monoclonal antiCD3 (células negativas - 10 pico; e positivas - 20 pico, em azul) (B); população de linfócitos T CD3+
representados em azul no dot plot SSC vs FSC (C); dot plot com gate de linfócitos utilizado na análise de novas
amostras (D).
A partir disto, foi criado um protocolo citofluorimétrico multiparamétrico, no qual,
primeiramente, foi feito um gate na região dos linfócitos (Figura 4.5A), baseado na marcação
com anti-CD3 (como descrito anteriormente na Figura 4.4), a partir do qual foi identificada a
população de linfócitos T CD8+, com alta intensidade de fluorescência (high) (Figura 4.5B e
4.5C).
57
Figura 4.5: Dot plot de granularidade (SSC) vs tamanho (FSC), com gate de linfócitos em azul (A);
histograma baseado no gate de linfócitos e linfócitos T CD8+ separados das células natural killer pela diferença
entre alta e baixa intensidade de fluorescência delimitada por gate, respectivamente, (B); Dot plot de anti-CD8 vs
FSC, baseado no gate de linfócitos, e gate de linfócitos T CD8+ com alta intensidade de fluorescência, em
vermelho (C).
A partir do gate de linfócitos T CD8+ (Figura 4.6B), outros dot plots foram criados
com o intuito de avaliar: o percentual de expressão de três diferentes cadeias Vβ (PE+;
FITC+PE+; e FITC+) nos linfócitos T CD8+ (Figura 4.6C); o percentual de linfócitos T CD8+
efetores (CD8+CD45RA+CD27-), naïve (CD8+CD45RA+CD27+), de memória efetora (T
CD8+ME) (CD8+CD45RA-CD27-), e de memória central (T CD8+MC) (CD8+CD45RACD27+) (Figura 4.6D); e o percentual de linfócitos T CD8+ em apoptose, com base na
positividade para a marcação com 7-AAD, apresentando baixa intensidade de fluorescência
(CD8+7-AADlow) (Figura 4.6E). Adicionalmente, a partir de um gate em cada uma das
quatro subpopulações de linfócitos T CD8+, o percentual de apoptose e de expressão das três
cadeias Vβ, representados graficmente pelos dot plots das Figuras 4.6F e 4.6G,
respectivamente. Vale ressaltar que, apesar das células em apoptose também poderem ser
identificadas na região do gráfico que representa um menor tamanho (baixo FCS), tais células
não foram incluídas no gate de análise, devido ao fato destas células estarem em processo
final de apoptose. Nesta etapa da morte celular as células apresentam alterações na membrana
plasmática, e consequentemente, de moléculas e receptores de superfície, influenciando a
avaliação fenotípica.
58
Figura 4.6: Esquema representativo do protocolo citofluorimétrico utilizado na análise de cada amostra obtida
ex vivo: (A) dot plot de SSC vs FSC e gate nos linfócitos (azul); (B) gate nos linfócitos T CD8+, (vermelho); (C)
linfócitos T CD8+ que expressam a cadeia Vβ 5.3 (PE+), ou Vβ 3 (FITC+PE+), ou Vβ 7.1 (FITC+); (D) linfócitos
T CD8+7-AADlow, em apoptose; (E) linfócitos T CD8+ efetores (CD45RA+CD27+), naïve (CD45RA+CD27+), de
memória efetora (CD45RA-CD27-) e de memória central (CD45RA- CD27+); (F) expressão de cadeia Vβ pelas
quatro diferentes subpopulações; (G) subpopulações de linfócitos T CD8+ em apoptose.
* Os anticorpos anti-Vβ utilizados na amostra exemplificada, pertencem ao tubo A do kit IOTest Beta Mark:
anti-Vβ 5.3 (PE); anti-Vβ 3 (FITC-PE); e anti-Vβ 7.1(FITC).
59
4.7.3 Análise Citofluorimétrica das Amostras Obtidas Após Estimulação In vitro com
Antígenos de Leishmania
A identificação dos linfócitos T CD8+ das amostras cultivadas in vitro (Figura 4.7B)
foi realizada a partir do gate nos linfócitos, delimitado pela mesma estratégia do contra-gate,
descrita no item 4.7.2. Nestas amostras, o gate de linfócitos foi criado de forma a incluir as
células blásticas, observadas nestes experimentos, de acordo com seus perfis morfológicos
(tamanho e granularidade) (Figura 4.7A). A partir do gate de linfócitos T CD8+ (Figura
4.7B) foram identificados as células em apoptose (Figura 4.7C); e as células naïve, efetoras,
e de memória (Figura 4.7D). A seguir, foram identificadas as células em apoptose, a partir do
gate em cada subpopulação (Figura 4.7E).
Figura 4.7: Representação gráfica do protocolo citofluorimétrico de análise multiparamétrica das amostras
obtidas após cultivo in vitro: (A) dot plot de SSC vs FSC e gate nos linfócitos (azul); (B) gate linfócitos T CD8+,
(vermelho); (C) linfócitos T CD8+7-AADlow, em apoptose; (D) linfócitos T CD8+ efetores (CD45RA+CD27+),
naïve (CD45RA+CD27+), de memória (CD45RA-); (E) subpopulações de linfócitos T CD8+ em apoptose.
60
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como média±desvio padrão e mediana. As análises de
variância entre os três grupos estudados foram realizadas através do teste ANOVA, não
paramétrico (teste Kruskal-Wallis) e do pósteste de Dunns. Os resultados do ensaio
experimental in vitro foram avaliados pelo teste pareado, não paramétrico de Wilcoxon.
Todos os cálculos estatísticos e representações gráficas destes resultados foram obtidos
através do programa GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA). Foram
consideradas estatisticamente significantes as diferenças que apresentaram valores de p<0,05.
61
5. RESULTADOS
5.1 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E EPIDEMIOLÓGICAS DOS INDIVÍDUOS
AVALIADOS
Foi avaliado um total de 22 pacientes com leishmaniose cutânea (LC) provenientes do
Estado do Rio de Janeiro. Deste total, 15 são do sexo feminino e 7 são do sexo masculino,
com idade média ± desvio padrão de 38,1±16,2 anos. A maioria dos pacientes (54,4%) reside
em Bangu e Campo Grande, na cidade do Rio de Janeiro; e em Friburgo e São Fidélis, no
norte do estado. Nenhum dos pacientes apresentou a forma disseminada da doença, ou
evolução para a forma mucosa. As principais características clínico-epidemiológicas dos
pacientes estão representadas na Tabela 5.1.
Os pacientes foram divididos em 2 grupos: um grupo de pacientes durante o
tratamento (PDT), composto por 14 indivíduos; e outro grupo de pacientes póstratamento
(PPT), composto por 11 indivíduos.
A maioria dos pacientes apresentou apenas uma lesão (19 em 22 pacientes; 86,3%) e o
tempo de evolução mais frequente foi de 2 meses (9 em 22 pacientes; 40,9%). Todos os
pacientes avaliados durante o tratamento (PDT), ainda apresentavam lesão ulcerada, com
infiltrado inflamatório, podendo ser observado que, mesmo após dez dias sob terapia
antimonial, estes pacientes ainda apresentavam doença ativa. Ao fim da terapia antimonial (80
dias após o início do tratamento), todos os pacientes avaliados apresentaram resposta
satisfatória ao tratamento e nenhum deles apresentou reativação da doença. Desta forma, o
grupo de PPT foi composto por indivíduos com cura clínica recente.
O grupo controle (CTRL) foi composto por 18 indivíduos sadios, sem diagnóstico
prévio de leishmaniose, residentes no Estado do Rio de Janeiro, fora de áreas endêmicas. A
idade média±desvio padrão deste grupo foi igual a 33,7 ± 10,7 anos.
62
Tabela 5.1: Características clínicas e epidemiológicas dos 22 pacientes de leishmaniose cutânea incluídos no
estudo.
Característica
Freqüência (n)
Percentual (%)
Masculino
15 (22)
68,1
Feminino
7 (22)
31,8
Bangu
3 (22)
13,6
Campo Grande
3 (22)
13,6
Friburgo
3 (22)
13,6
Itaguaí
1 (22)
4,54
Japeri
1 (22)
4,54
Nova Iguaçu
1 (22)
4,54
Padre Miguel
1 (22)
4,54
São Fidélis
3 (22)
13,6
Saquarema
1 (22)
4,54
Senador Vasconcelos
1 (22)
4,54
Seropédica
1 (22)
4,54
Teresópolis
2 (22)
9,09
1 mês
6 (22)
27,2
2 meses
9 (22)
40,9
3 meses
4 (22)
18,1
5 meses
3 (22)
13,6
1 lesão
19 (22)
86,3
3 lesões
2 (22)
9,09
8 lesões
1 (22)
4,54
Antebraço
4 (22)
18,1
Braço
8 (22)
36,3
Face
4 (22)
18,1
Mão
3 (22)
13,6
Perna
4 (22)
18,1
Sexo
Local de Residência
Tempo de Evolução
Número de lesões
Local da Lesão
(n) – Número de pacientes avaliados
63
5.2 AVALIAÇÃO DO PERCENTUAL DE LINFÓCITOS T CD8+ OBTIDOS EX VIVO
E IN VITRO
A partir da determinação dos percentuais médios dos linfócitos T CD8+, obtidos ex
vivo, foi realizada uma análise comparativa entre os CTRL (n=18), os PDT (n=14) e os PPT
(n=11). Foi observado um menor percentual médio de linfócitos T CD8+ nos PDT
(15,2%±6,6%; mediana=18,1%), quando comparado ao percentual médio destas células nos
CTRL (23,6%±5,4%; mediana=22,1%) (p<0,01). Já os PPT apresentaram um maior
percentual médio destes linfócitos (21,1%±7,7%; mediana=19,8%) quando comparado aos
PDT, e ligeiramente inferior, quando comparado aos CTRL. Estes dados sugerem que haja
uma tendência ao restabelecimento da frequência destas células e que a maior frequência das
mesmas pode estar associada à cura da lesão e controle da infecção (Figura 5.1A).
Com o objetivo de avaliar a frequência de linfócitos T CD8+ sob estimulação
antigênica, esta análise comparativa também foi realizada a partir das células obtidas após
estímulo in vitro com antígenos de Leishmania braziliensis (Ag-Lb). Nestes experimentos
foram analisadas amostras de oito CTRL, doze PDT e seis PPT. O padrão de resultados
observados in vitro foi semelhante àqueles obtidos ex vivo. O percentual médio dos linfócitos
T CD8+ nos PDT, após estímulo antigênico, foi inferior (13,9%±3,5%; mediana=14,2%) e
estatisticamente significante quando comparado ao percentual destas células tanto nos CTRL
(21,3%±2,7%; mediana=22%) (p<0,01), como nos PPT (25,7%±10,5%; mediana=28,0%)
(Figura 5.1B). Os resultados in vitro sugerem que os Ag-Lb modulam de maneira oposta a
frequência de linfócitos T CD8+ durante a doença e após a cura clínica, sendo que a
diminuição destas células foi relacionada à fase ativa da doença e o aumento das mesmas após
o fim da terapiare parece estar associado à resolução da lesão.
Figura 5.1: Avaliação, ex vivo (A) e in vitro (B), do percentual de linfócitos T CD8+. Foram avaliados CTRL
(controles - indivíduos sadios) (A: n=18; B: n=8), PDT (pacientes durante o tratamento, com doença ativa) (A:
n=14; B: n=12), e PPT (pacientes póstratamento) (A: n=11; B: n=6). * (p<0,05) e ** (p< 0,01). Valor de p obtido
pelo teste ANOVA não-paramétrico de Kruskal-Wallis e pósteste de Dunns. A mediana foi representada por
barras horizontais. Cada ponto representa um indivíduo.
64
A fim de avaliar a influência do estímulo antigênico sob a frequência de linfócitos T
CD8+, foi realizada uma análise pareada entre o percentual dos linfócitos T CD8+ não
estimulados (background - BG) e aqueles estimulados com antígenos de Leishmania (Ag-Lb).
Nos CTRL, não foi observada diferença entre os percentuais das células cultivadas sem
estímulo (BG) (18,2%±4.6%; mediana=18,1%) e aquelas estimuladas com Ag-Lb
(20,3%±4,7%; mediana=22%) (Figura 5.2A), demonstrando assim que estes antígenos não
alteraram a frequência destas células. Já nos PDT, o percentual de linfócitos T CD8+ sob este
estímulo antigênico (13,1%±3%; mediana=13,1%) apresentou uma diminuição significante
em relação ao BG (16,7%±3,6%; mediana=16,7%) (p<0,001) (Figura 5.2B). Inversamente,
nos PPT, o percentual de linfócitos T CD8+ estimulados com Ag-Lb (22,8%±11,9%;
mediana=21,6%) foi superior ao percentual de células cultivadas sem estímulo antigênico
(17,8%±9,1%; mediana=16,1%) (p<0,05) (Figura 5.2C). Estes resultados demonstram uma
especificidade da resposta por linfócitos T CD8+ frente aos Ag-Lb, tanto nos PDT como nos
PPT, levando a uma diminuição e a um aumento destas células, respectivamente.
Figura 5.2: Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+ cultivados in vitro, sem estímulo antigênico
(background - BG); e sob estímulo de antígenos de Leishmania (viannia) braziliensis (Ag-Lb). Foram avaliados
CTRL (controles - indivíduos sadios) (A) (n=8), PDT (pacientes durante o tratamento, com doença ativa) (B)
(n=12), e pacientes póstratados (PPT) (C) (n=6). * (p<0,05) e ***(p<0,001). Valor de p obtido pelo teste
pareado, não-paramétrico de Wilcoxon. As linhas contínuas ligam os resultados referentes ao mesmo indivíduo.
65
5.3 PERFIL DE DISTRIBUIÇÃO DAS SUBPOPULAÇÕES DE LINFÓCITOS T CD8+
A partir do gate de linfócitos T CD8+ totais (Figura 5.3B), foram identificadas as
subpopulações naïve; efetora; de memória efetora; e de memória central com base na
expressão das moléculas de superfície CD45RA e CD27 (Figura 5.3E). O perfil de
distribuição destas quatro subpopulações foi avaliado individualmente nos 18 CTRL; nos 14
PDT, com doença ativa; e nos 11 PPT, curados clinicamente.
Em relação aos linfócitos T CD8+ totais (percentual médio 23,6%±5,4%), foi
observado que, nos CTRL, as células naïve representam a maioria destes linfócitos
(35,6%±10%). Um percentual semelhante foi encontrado nas células de memória central
(32,5%±11%), enquanto os linfócitos T CD8+ efetores (16,5%±14,5%) e de memória efetora
(14,9%±7,5%), representaram as subpopulações minoritárias dos linfócitos T CD8+ totais
(Figura 5.3A).
Inversamente, nos PDT, as células efetoras (30,79%±14,68%) representaram a maioria
dos linfócitos T CD8+ totais (15,2%±6,6%). O percentual médio de células de memória
central (31,1%±12,4%) foi semelhante àquele observado das células efetoras e a minoria
destes linfócitos foi representada pelas células de memória efetora (15,1%±6,1%). Os
linfócitos T CD8+ naïve apresentaram um percentual médio (22,4%±9,5%) com valor
intermediário às outras três subpopulações (Figura 5.3B).
Já nos PPT, a distribuição dos linfócitos T CD8+ totais (19,9%±8,2%) apresentou uma
maioria de células de memória central (38,55%±10,94%) e uma minoria composta por células
efetoras (17,49%±16,63%) e células de memória efetora (19,6%±8,1%). Assim como nos
PDT, os linfócitos T CD8+ naïve dos PPT apresentaram um percentual médio
(29,42%±17,5%) com valor intermediário quando comparado às outras três subpopulações
(Figura 5.3C).
Ao realizar uma avaliação intragrupo, através da comparação dos percentuais médios
das subpopulações de linfócitos T CD8+, foram observadas algumas diferenças
estatisticamente significantes que refletem uma distribuição heterogênea destas células.
Paralelamente,
através
de
uma
avaliação
intergrupo,
pôde-se
observar
que
as
subpopulaçõesmajoritárias dos três grupos eram diferentes (naïve, nos CTRL; efetora nos
PDT; e de memória central nos PPT) e, portanto, a distribuição das subpopulações também
mostrou ser heterogênea entre os grupos estudados (Figura 5.3).
66
Figura 5.3: Perfil de distribuição de células efetoras (CD8+CD45RA+CD27-), naïve (CD8+CD45RA+CD27+),
de memória efetora (TME) (CD8+CD45RA-CD27-) e de memória central (TMC) (CD8+CD45RA-CD27+). Foram
avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (A) (n=18), PDT (pacientes durante o tratamento, com doença
ativa) (B) (n=14), e PPT (pacientes póstratamento) (C) (n=11). *** (p<0,05), ** (p<0,01) e * (p<0,001). Valor
de p obtido pelo teste ANOVA não-paramétrico de Kruskal-Wallis e pósteste de Dunns. Os resultados foram
mostrados como média±desvio padrão.
67
5.4 ANÁLISE COMPARATIVA DAS SUBPOPULAÇÕES DE LINFÓCITOS T CD8+
ENTRE OS GRUPOS ESTUDADOS.
Ao analisar a diferenciação dos linfócitos T CD8+ em diferentes subpopulações, em
relação às células CD8+CD45RA+CD27- (efetoras), foi observado que os PDT apresentaram
um maior percentual médio (30,8%±14,7%; mediana =31,7%) quando comparado tanto aos
CTRL
(16,5±14,4%;
mediana=13,1%;
p<0,01)
como
aos
PPT
(17,5%±16,7%;
mediana=14,6%; p<0,05) (Figura 5.4). Foi importante notar a semelhança entre o percentual
médio destas células efetoras nos CTRL e nos PPT. Além disso, o maior percentual médio
observado nos PDT reforça a idéia de que há uma expansão clonal de células efetoras
preferencialmente na fase ativa da doença.
Figura 5.4: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T (Linf.) CD8+CD45RA+CD27- (efetores). Foram
avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (n=18), PDT (pacientes durante o tratamento, com doença ativa)
(n=14), e PPT (pacientes póstratamento) (n=11). ** (p<0,01) e * (p<0,05). Valor de p obtido pelo teste ANOVA
não-paramétrico de Kruskal-Wallis e pósteste de Dunns. A mediana foi representada por barras horizontais.
Cada ponto representa um indivíduo.
Após o quinto dia do ensaio experimental in vitro, enquanto os linfócitos T CD8+
efetores dos CTRL (Figura 5.5A) parecem não ser ativados pelos Ag-Lb, (BG:11,5%±2,1%;
Ag-Lb:11,9%±2%), em ambos os grupos de pacientes pôde-se observar um aumento da
frequência destas células na presença dos Ag-Lb (PDT - BG: 33,1%±9,5%; mediana=37%;
Ag-Lb: 41,1%±9,9%; mediana=40,2%; PPT - BG: 26,7%±5,8%; mediana=28,3% AgLb: 37,2±6,1%; mediana=38,4%) (Figura 5.5B e C).
68
Figura 5.5: Avaliação do percentual de linfócitos (Linf.) T CD8+CD45RA+CD27- (efetores), cultivados in
vitro sem estímulo antigênico (background - BG); e sob estímulo de antígenos de Leishmania (viannia)
braziliensis (Ag-Lb). Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (A) (n=8), PDT (pacientes durante o
tratamento, com doença ativa) (B) (n=12), e pacientes póstratados (PPT) (C) (n=6). * (p<0,05) e ***(p<0,001).
Valor de p obtido pelo teste pareado, não-paramétrico de Wilcoxon. As linhas contínuas ligam os resultados
referentes ao mesmo indivíduo.
Inversamente, em relação aos linfócitos T CD8+CD45RA+CD27+ (naïve), os PDT
apresentaram um menor percentual médio (22,4%±9,6%; mediana=22,2%) quando
comparados aos CTRL (35,6%±9,9%; mediana=33,2%) e aos PPT (29,4%±17,5%;
mediana=26,7%). Entretanto somente a comparação entre os percentuais de linfócitos T CD8+
naïve dos CTRL e dos PDT foi estatisticamente significante (p<0,01) (Figura 5.6). Mais uma
vez, vale ressaltar a heterogeneidade dos percentuais destas células nos PPT.
69
Figura 5.6: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T (Linf.) CD8+CD45RA+CD27+ (naïve). Foram
avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (n=18), PDT (pacientes durante o tratamento, com doença ativa)
(n=14), e PPT (pacientes póstratamento) (n=11). * (p<0,05). Valor de p obtido pelo teste ANOVA nãoparamétrico de Kruskal-Wallis e pósteste de Dunns. A mediana foi representada por barras horizontais. Cada
ponto representa um indivíduo.
Apesar da diminuição desta subpopulação de linfócitos T CD8+ nos PDT, avaliada ex
vivo, após o quinto dia de cultura sob o estímulo de Ag-Lb não foi observada alteração do
percentual de células naïve nestes pacientes (BG: 35,7%±8,9%; mediana=37,5% Ag-Lb:
34,8%±7,8%; mediana= 37,8%) (Figura 5.7B), assim como nos PPT (BG: 44,9%±9,5%;
mediana=41,2%; Ag-Lb: 43,2%±13,3%; mediana=42,8%) (Figura 5.7C) e nos CTRL (BG:
59,5%±3%; mediana=57,8% Ag-Lb: 58,2%±3,3%; mediana=56,6%) (Figura 5.7A).
Figura 5.7: Avaliação do percentual de linfócitos (Linf.) T CD8+CD45RA+CD27+ (naïve), cultivados in vitro
sem estímulo antigênico (background- BG); e sob estímulo de antígenos de Leishmania (viannia) braziliensis
(Ag-Lb). Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (A) (n=8), PDT (pacientes durante o tratamento,
com doença ativa) (B) (n=12); e pacientes póstratados (PPT) (C) (n=6). Teste pareado, não-paramétrico de
Wilcoxon. As linhas contínuas ligam os resultados referentes ao mesmo indivíduo.
70
Em relação aos percentuais de células de memória, os linfócitos T CD8+ CD45RACD27- (TME) apresentaram um percentual médio semelhante entre os CTRL (14,9%±7,5%;
mediana=12,1%) e os PDT (15,2%±6,1%; mediana=13,2%). Já nos PPT, apesar do percentual
mínimo e máximo de frequência de linfócitos T CD8+ME ter sido semelhante aos outros dois
grupos e da ausência de significância estatística, pôde-se observar um percentual médio
ligeiramente mais elevado nestes pacientes (19,6%±8,1%; mediana=19,7%) (Figura 5.8).
Figura 5.8: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T (Linf.) CD8+CD45RA-CD27- (de memória
efetora - TME). Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (n=18), PDT (pacientes durante o
tratamento, com doença ativa) (n=14), e PPT (pacientes póstratamento) (n=11). Teste ANOVA não-paramétrico
de Kruskal-Wallis. A mediana foi representada por barras horizontais. Cada ponto representa um indivíduo.
A diferença da frequência média de linfócitos T CD8+CD45RA-CD27+ (TMC), entre os
três grupos estudados também não foi estatisticamente significante (CTRL: 32,5%±10,93%;
mediana=35,9%;
PDT:
31,4%±12,4%;
mediana=30,4%;
PPT: 38,6%±10,9%;
mediana=35,9%). No entanto, é importante ressaltar a heterogeneidade dos percentuais, a qual
pode ser consequência da diversidade de especificidade destas células de memória, em cada
indivíduo (Figura 5.9).
Figura 5.9: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T (Linf.) CD8+CD45RA-CD27+ (de memória
central – TMC). Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (n=18); pacientes durante o tratamento
(PDT) (n=14); e pacientes póstratamento (PPT) (n=11). Teste ANOVA não-paramétrico de Kruskal-Wallis. A
mediana foi representada por barras horizontais. Cada ponto representa um indivíduo.
71
Após os cinco dias do cultivo in vitro, foram observados percentuais muito baixos
destas duas subpopulações de linfócitos T CD8+ de memória, tanto nos CTRL como nos
pacientes. Sendo assim, para melhor interpretar os resultados, na análise citofluorimétrica, o
gate foi feito de forma que as duas subpopulações fossem somadas, facilitando a interpretação
da posterior análise das células em apoptose. Sendo assim, enquanto os linfócitos T CD8+ de
memória dos CTRL não proliferaram em resposta a estimulação antigênica (BG: 3,7%±1,7%;
mediana= 3,7%; Ag-Lb: 4,2%±1,5%; mediana= 4,1%) (Figura 5.10A), tanto as células de
memória dos PDT (BG: 3,1%±1,5%; mediana=3,4%; Ag-Lb: 4,7%± 1,9%; mediana=)
(Figura 5.10B), e mais expressivamente as células dos PPT (BG: 5,1%±1,2%; mediana=
4,9% Ag-Lb: 8,1%±1,1%; mediana= 8,2%) (Figura 5.10C), foram reativas aos Ag-Lb.
Figura 5.10: Avaliação do percentual de linfócitos (Linf.) T CD8+CD45RA- (de memória) cultivados in vitro
sem estímulo antigênico (background- BG); e sob estímulo de antígenos de Leishmania (viannia) braziliensis
(Ag-Lb). Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (A) (n=8); PDT (pacientes durante o tratamento,
com doença ativa) (B) (n=12); e pacientes póstratados (PPT) (C) (n=6). * (p<0,05) e **(p<0,01). Valor de p
obtido pelo teste pareado, não-paramétrico de Wilcoxon. As linhas contínuas ligam os resultados referentes ao
mesmo indivíduo.
72
5.5 AVALIAÇÃO DO PERCENTUAL DOS LINFÓCITOS T CD8+ EM APOPTOSE.
Os percentuais médios de linfócitos T CD8+ em apoptose foram comparados entre os
três grupos, a fim de avaliar um possível papel da ocorrência deste fenômeno na modulação
do perfil de distribuição destas células.
Nos PDT, verificou-se um maior percentual médio de linfócitos T CD8+ em apoptose
(14,07%±10,59%; mediana=8,9%) em relação aos CTRL (1,9%±1,6%; mediana=1,7%)
(p<0,001), enquanto nos PPT, o percentual destas células em apoptose não teve diferença
significante em relação aos outros dois grupos (6,1%±6,9%; mediana=4,2%), sugerindo que a
apoptose de linfócitos T CD8+ esteja associada à fase ativa da doença (Figura 5.11A).
A mesma comparação foi realizada entre os percentuais médios dos linfócitos T CD8+
após estímulo com Ag-Lb, a fim de determinar se a estimulação antigênica é capaz de induzir
a apoptose nestas células. Assim como no ensaio ex vivo, foi observado um maior percentual
de linfócitos T CD8+ em apoptose nos PDT (12%±6,4%; mediana=10,5%) em relação aos
CTRL (5,3%±3,5%; mediana=3,7%). Neste ensaio, os PPT apresentaram um menor
percentual de linfócitos T CD8+ (2%±2,1%; mediana=2,9%) quando comparados aos PDT
(p<0,05), e mediana semelhante aos CTRL (Figura 5.11B). Estes dados indicam que a
apoptose de linfócitos T CD8+, na presença de Ag-Lb, ocorre principalmente nos PDT.
Figura 5.11: Avaliação, ex vivo (A) e in vitro (B), do percentual de linfócitos T CD8+ em apoptose. Foram
avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (A: n=18; B: n=8); PDT (pacientes durante o tratamento, com
doença ativa) (A: n=12; B: n=12); e PPT (pacientes póstratamento) (n=10; n=6). ** (p<0,01) e *** (p<0,001).
Teste ANOVA não-paramétrico de Kruskal-Wallis e pósteste de Dunns. A mediana foi representada por barras
horizontais. Cada ponto representa um indivíduo.
.
Paralelamente foi realizada uma análise pareada entre o percentual dos linfócitos T
+
CD8 em apoptose, não estimulados (BG) e estimulados com Ag-Lb, a fim de avaliar se o
percentual destes linfócitos T em apoptose é alterado frente a este estímulo.
73
Nos CTRL, esses antígenos parecem não induzir apoptose nos linfócitos T CD8+ já
que o percentual médio das células cultivadas sem estímulo (BG) (3,7%±2,1%;
mediana=2,9%) não foi estatisticamente diferente daquelas estimuladas com Ag-Lb
(5,3%±3,5%; mediana=3,7%) (Figura 5.12A), assim como nos PPT (BG: 2,7%±1,6%;
mediana=2,4%; Ag-Lb: 2,9%±2,1%; mediana=2,9%) (Figura 5.12C). Já nos PDT, pôde ser
observado um maior percentual de linfócitos T CD8+ em apoptose na presença de Ag-Lb
(BG: 5,6%±5,3%; mediana=3,4%; Ag-Lb: 12%±6,4%; mediana=10,5%) sugerindo que a
apoptose destes linfócitos seja induzida especificamente pelos Ag-Lb (Figura 5.12B).
Figura 5.12: Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+ em apoptose, cultivados in vitro sem estímulo
antigênico (background - BG); e sob estímulo de antígenos de Leishmania (viannia) braziliensis (Ag-Lb). Foram
avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (A) (n=8); PDT (pacientes durante o tratamento, com doença
ativa) (B) (n=12); e pacientes póstratados (PPT) (C) (n=6). ** (p<0,01). Valor de p obtido pelo teste pareado,
não-paramétrico de Wilcoxon. As linhas contínuas ligam os resultados referentes ao mesmo indivíduo.
Em conjunto, estes resultados sugerem que a apoptose seja um fenômeno associado à
fase ativa da doença o qual se apresenta diminuído após o fim da terapia e a cura clínica dos
pacientes. Além disto, o menor percentual de linfócitos T CD8+ observado nos PDT e a
tendência de restabelecimento do número destas células nos PPT parecem ser influenciados
por este fenômeno de morte.
74
5.6 DISTRIBUIÇÃO DAS SUBPOPULAÇÕES DE LINFÓCITOS T CD8+ EM
APOPTOSE
Nos experimentos ex vivo, a distribuição de linfócitos T CD8+ efetores
(CD8+CD45RA+CD27-),
naïve
(CD8+CD45RA+CD27+),
de
memória
efetora
(CD8+CD45RA-CD27-), e de memória central (CD8+CD45RA-CD27+) em apoptose foi
avaliada através da incorporação de 7-AAD (7-AADlow), a partir do gate em cada uma destas
subpopulações de linfócitos TCD8+.
Nos CTRL foi observado um maior percentual médio de apoptose nas células naïve
(2,7%±1,4%) em relação às outras subpopulações (TME: 0,1%±0,3%; efetora: 0,5%±0,7%;
TMC: 0,5%±1,1%) (Figura 5.13A).
Nos PDT, os linfócitos T CD8+ naïve também representaram a subpopulação com
maior percentual de apoptose (22%±12%) enquanto as células TME (8,6%±19%) e TMC
(10%±19,6%) apresentaram os menores percentuais. Já o percentual médio de células efetoras
em apoptose foi de 17,9%±16,8% (Figura 5.13B).
Ao avaliar os PPT, novamente, os linfócitos T CD8+ naïve representaram a maioria
das células em apoptose (14,8%±15,3%). As células TME (6,4%±9,6%) e as TMC
(6,8%±9,4%) apresentaram percentuais semelhantes e representaram, novamente, as
subpopulações com menor ocorrência de apoptose. Ainda, os linfócitos T CD8+ efetores
apresentaram um percentual médio (9%±10,2%) com valor intermediário às outras três
subpopulações (Figura 5.13C).
Foi realizada uma avaliação intragrupo, através da comparação dos percentuais médios
das subpopulações de linfócitos T CD8+. Foi observada uma distribuição heterogênea destas
células, tanto nos CTRL como nos PDT, constatada pela diferença estatisticamente
significante entre os percentuais de diferentes subpopulações. Paralelamente, foi realizada
também uma avaliação intergrupo da distribuição das subpopulações em apoptose, na qual foi
observado um perfil homogêneo entre os três grupos estudados, sendo que os linfócitos T
CD8+ naïve representaram a maioria das células em apoptose; as células de memória
representraam a minoria, e as células efetoras apresentaram um percentual intermediário a
estas três subpopulações (Figura 5.13).
75
Figura 5.13: Perfil de distribuição das subpopulações de linfócitos T CD8+ em apoptose: efetora
(CD8+CD45RA+CD27-), naïve (CD8+CD45RA+CD27+), de memória efetora (TME) (CD8+CD45RA-CD27-) e de
memória central (TMC) (CD8+CD45RA-CD27+). Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (A)
(n=15); PDT (pacientes durante o tratamento, com doença ativa) (B) (n=11); e PPT (pacientes póstratamento)
(C) (n=10). *** (p<0,05) e * (p<0,001). Valor de p obtido pelo teste ANOVA não-paramétrico de KruskalWallis e pósteste de Dunns. Os resultados foram mostrados como média±desvio padrão.
76
5.7 ANÁLISE COMPARATIVA DAS SUBPOPULAÇÕES DE LINFÓCITOS T CD8+
EM APOPTOSE ENTRE OS GRUPOS ESTUDADOS
Em relação à subpopulação de linfócitos T CD8+CD45RA+CD27- (efetores) em
apoptose, os CTRL apresentaram percentuais inferiores (0,5%±0,7%; mediana=0,3%) em
relação aos PDT (17,9%±16,8%; mediana=6,5%) e aos PPT (8,9%±10,2%; mediana=4,9%)
(p<0,001). É importante salientar que apesar dos dois grupos de pacientes terem apresentado
percentuais significativamente maiores que os CTRL, o percentual de linfócitos T CD8+
efetores em apoptose nos PPT foi menor do que o percentual observado nos PDT (Figura
5.14). Apesar dos PDT apresentarem uma maior frequência linfócitos T CD8+ efetores em
relação aos outros dois grupos (como descrito no item 5.6, Figura 5.14), muitas destas células
estão programadas para morrer, o que poderia influenciar os efeitos da atividade citotóxica na
resposta imune. Paralelamente, apesar dos PPT apresentarem um menor percentual de células
efetoras, em relação aos PDT, verificou-se um menor número de linfócitos T CD8+ efetores
em apoptose, sugerindo que o menor comprometimento da viabilidade destas células pode
estar associado a uma maior eficácia das mesmas, levando a cura clínica.
Figura 5.14: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T(Linf.) CD8+CD45RA+CD27- (efetores) em
apoptose. Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (n=15); PDT (pacientes durante o tratamento,
com doença ativa) (n=11); e PPT (pacientes póstratamento) (n=10). ** (p<0,01) e *** (p<0,001). Valor de p
obtido pelo teste ANOVA não-paramétrico de Kruskal-Wallis e pósteste de Dunns. A mediana foi representada
por barras horizontais. Cada ponto representa um indivíduo.
Similarmente, após a estimulação in vitro com Ag-Lb, enquanto os linfócitos T CD8+
efetores dos CTRL não apresentaram alteração do percentual de apoptose (BG: 1,7%±1,2%;
mediana=1,7%; Ag-Lb: 1,7%±1,3%; mediana=1,6%) (Figura 15A), nos PPT pôde-se
observar um aumento da frequência destas células em processo de morte (BG: 9,4%±2,5%;
mediana=9% Ag-Lb: 11,4%±2,9%; mediana= 10,6%) (Figura 15B), o que foi ainda mais
77
evidente nos PDT (BG: 20,8%±3,3%; mediana= 21,5%; Ag-Lb: 29,2%±5,8%; mediana=
30,1%) (Figura 15C).
Figura 5.15: Avaliação do percentual de linfócitos T (Linf.) CD8+CD45RA+CD27- em apoptose, cultivados
in vitro sem estímulo antigênico (background - BG); e sob estímulo de antígenos de Leishmania (viannia)
braziliensis (Ag-Lb). Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (A) (n=8); PDT (pacientes durante
o tratamento, com doença ativa) (B) (n=12); e pacientes póstratados (PPT) (C) (n=6). * (p<0,05) e ***(p<0,001).
Valor de p obtido pelo teste pareado, não-paramétrico de Wilcoxon. As linhas contínuas ligam os resultados
referentes ao mesmo indivíduo.
Os CTRL também apresentaram baixo percentual médio de apoptose nos linfócitos T
CD8+ naïve (2,7%±1,3%; mediana=2,5%) enquanto nos PDT a frequência média destas
células foi de 22%±12% (mediana=18,2%; p<0,001). Os PPT apresentaram um percentual
médio de apoptose em linfócitos T CD8+ naïve, intermediário aos CTRL e aos PDT
(14,8%±15,3%; mediana=8%). Entretanto, alguns destes PPT apresentaram uma frequência
destas células em apoptose semelhante aos CTRL, enquanto outros PPT apresentaram um alto
percentual de linfócitos T CD8+ naïve em apoptose, conforme alguns PDT (Figura 5.16).
Interessantemente, em ambos os grupos de pacientes foi observado que alguns indivíduos
apresentavam alto percentual de linfócitos T CD8+ em apoptose, enquanto os outros
pacientes, do mesmo grupo, apresentavam uma menor frequência destas células.
78
Figura 5.16: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T (Linf.) CD8+CD45RA+CD27+ (naïve) em
apoptose. Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (n=15); PDT (pacientes durante o tratamento,
com doença ativa) (n=11); e PPT (pacientes póstratamento) (n=10). *** (p<0,001). Valor de p obtido pelo teste
ANOVA não-paramétrico de Kruskal-Wallis e pósteste de Dunns. A mediana foi representada por barras
horizontais. Cada ponto representa um indivíduo.
Ao serem cultivados in vitro por cinco dias, somente os linfócitos T CD8+ naïve dos
PDT apresentaram uma maior ocorrência de apoptose ao serem estimulados com Ag-Lb (BG:
16,5%±2,8%; mediana= 15,2%; Ag-Lb: 25,1%±7,1%; mediana= 21,5%) (Figura 5.17B).
Sendo assim, tanto os CTRL (BG: 5,2%±2,3%; mediana= 4,7%; Ag-Lb: 5,9%±2%; mediana=
5,5%) (Figura 5.17A), como os PPT (BG: 11,1%± 3,8%; mediana= 9,5% Ag-Lb: 13%±3,7%;
mediana= 10,7%) (Figura 5.17C).
79
Figura 5.17: Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+ CD45RA+CD27+ em apoptose, cultivados in vitro
sem estímulo antigênico (background - BG); e sob estímulo de antígenos de Leishmania (viannia) braziliensis
(Ag-Lb). Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (A) (n=8); pacientes com doença ativa (PDT)
(B) (n=12); e pacientes póstratados (PPT) (C) (n=6). ** (p<0,01). Valor de p obtido pelo teste pareado, nãoparamétrico de Wilcoxon. As linhas contínuas ligam os resultados referentes ao mesmo indivíduo.
Em geral, foi observado um baixo percentual de apoptose dos linfócitos T CD8+ de
memória, tanto TME como TMC. Em relação a apoptose de linfócitos T CD8+ME, os percentuais
médios observados tanto nos PDT (10%±19,6%; mediana=0,5%) como nos PPT (6,4%±9,6%;
mediana=2%), foram superiores ao percentual médio destas células nos CTRL (0,1%±0,3%;
mediana=0%) (p<0,001; p<0,01, respectivamente). Foi possível observar que nos três grupos
estudados esta subpopulação de linfócitos T CD8+ se mostrou pouco suscetível a apoptose em
alguns indivíduos não foi verificada ocorrência de apoptose nestas células. No entanto, dois
pacientes, avaliados durante e após o fim da terapia antimonial, diferente dos outros
indivíduos do mesmo grupo, apresentaram um alto percentual de linfócitos T CD8+ME em
apoptose (PDT: 29,3% e 36,5%; e PPT: 19,1% e 28,2%) (Figura 5.18).
80
Figura 5.18: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T (Linf.) CD8+CD45RA-CD27- (de memória
efetora) em apoptose. Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (n=15); PDT (pacientes durante o
tratamento, com doença ativa) (n=11); e PPT (pacientes póstratamento) (n=10). ** (p<0,01). Valor de p obtido
pelo teste ANOVA não-paramétrico de Kruskal-Wallis e pósteste de Dunns. A mediana foi representada por
barras horizontais. Cada ponto representa um indivíduo.
Em relação aos linfócitos T CD8+MC, os CTRL apresentaram um percentual médio de
0,51%±1,05% (mediana=0,9%) de células em apoptose.
Os dois grupos de pacientes
apresentaram percentual médio de apoptose em TMC superior aos CTRL (PDT: 8,6%±18,1%;
mediana=0,6%; PPT: 6,8%±9,4%; mediana=2,9%), embora somente a diferença entre os
CTRL e dos PPT tenha sido estatisticamente significante (p<0,05). Entretanto, apesar de dois
pacientes apresentarem um alto percentual de linfócito T CD8+MC em apoptose, durante e após
o tratamento, a maioria dos PDT e dos PPT apresentaram uma baixa frequência de apoptose
destas células, semelhante aos CTRL (Figura 5.19).
Figura 5.19: Avaliação, ex vivo, do percentual de linfócitos T (Linf.) CD8+CD45RA-CD27+ (de memória
central) em apoptose. Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (n=15); PDT (pacientes durante o
tratamento, com doença ativa) (n=11); e PPT (pacientes póstratamento) (n=10). * (p<0,05). Valor de p obtido
pelo teste ANOVA não-paramétrico de Kruskal-Wallis e pósteste de Dunns. A mediana foi representada por
barras horizontais. Cada ponto representa um indivíduo.
81
Como mencionado anteriormente (item 5.6), após o ensaio experimental in vitro, os
linfócitos T CD8+MC e TME foram analisados conjuntamente. Sendo assim, ao avaliar o
percentual médio de células de memória em apoptose, foi verificado que os Ag-Lb, não
parecem influenciar a frequência destas células em processo de apoptose tanto nos pacientes
(PDT - BG: 1,8%±0,8%; mediana= 2,2; Ag-Lb: 2,1%±0,6%; mediana=1,8% (Figura 5.20B);
PPT - BG:1,9%±0,6%; mediana= 1.8% Ag-Lb: 1,7%±0,6%; mediana=2% (Figura 5.20C)),
como nos CTRL (BG:1,4%±0,5%; mediana= 1,2%; Lb- Ag: 1,7%±0,2%; mediana= 1,8%
(Figura 5.20A)).
Figura 5.20: Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+ CD45RA- em apoptose, cultivados in vitro sem
estímulo antigênico (background - BG); e sob estímulo de antígenos de Leishmania (viannia) braziliensis (AgLb). Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (A) (n=8); PDT (pacientes durante o tratamento,
com doença ativa) (B) (n=12); e PPT (pacientes póstratamento) (C) (n=6). Teste pareado, não-paramétrico de
Wilcoxon. As linhas contínuas ligam os resultados referentes ao mesmo indivíduo.
82
5.8 AVALIAÇÃO DO PERFIL DO REPERTÓRIO VBETA DE LINFÓCITOS T CD8+
Devido à diversidade do repertório do TCR de linfócitos T CD8+, à especificidade
antigênica destas células e à importância das mesmas em uma resposta imune associada à LC,
tornou-se de fundamental importância avaliar a expressão preferencial de determinados
clones, nos diferentes grupos de pacientes.
Para isso, a frequência de expressão de 24 cadeias Vβ do TCR em linfócitos T CD8+
foi caracterizada nos CTRL, nos PDT e nos PPT. Nestes três grupos estudados foi observada
uma distribuição policlonal de linfócitos T CD8+ com percentuais médios de expressão que
variaram, nos CTRL, de 0,9% (±0,2%) a 6,2% (±3,2%) para as cadeias Vβ 4 e 3; nos PDT, de
1,0% (±0,7%) a 5% (±10%) para as cadeias Vβ 11 e 22; e nos PPT, variaram de 0,6%
(±0,6%) a 4,1% (±7%) para as cadeias Vβ 4 e 5.1, respectivamente.
É importante destacar que, enquanto nos CTRL e nos PPT a cadeia Vβ 4 foi a que
apresentou a menor frequência, pôde-se notar que os PDT apresentavam um maior percentual
destes clones, embora não haja diferença estatisticamente significante.
Vale ressaltar
também, alguns PDT apresentaram uma alta frequência de linfócitos T CD8+ que expressam a
cadeia Vβ 22, quando comparados aos outros dois grupos, assim como a cadeia Vβ 11
expressa por alguns PPT representou o maior percentual de expressão dentre o três repertórios
Vβ avaliados.
Ao comparar o percentual de linfócitos T CD8+ que expressam estas 24 cadeias Vβ,
entre os três grupos estudados, tornou-se possível observar que houve uma alteração
significativa da expressão das cadeias Vβ 2, Vβ 9, Vβ 13.2, Vβ 18 e Vβ 23 nos PDT ou nos
PPT, em relação aos CTRL. (Figura 5.21).
83
Figura 5.21: Perfil do repertório de 24 cadeias Vβ (VBeta) em linfócitos T CD8+. Foram avaliados CTRL
(controles - indivíduos sadios - Barra Branca) (n=16), PDT (pacientes durante o tratamento - Barra Cinza)
(n=14), e PPT (pacientes póstratamento - Barra Preta) (n=11). (A) cadeias Vβ 1 – 7.1; (B) cadeias Vβ 7.2 – 13.6;
(C) cadeias Vβ 14 – 23. Valor de p obtido pelo teste ANOVA não-paramétrico de Kruskal-Wallis e pósteste de
Dunns. Cada barra representa a média± desvio para cada cadeia Vβ. * (p< 0,05), ** (p<0,01) e ***( p< 0,001).
84
5.9 COMPARAÇÃO DO REPERTÓRIO VBETA DE LINFÓCITOS T CD8+
ENTRE OS GRUPOS ESTUDADOS
As contrações e expansões das cadeias Vβ de linfócitos T CD8+, isto é, as frequências
de expressão nos PDT e nos PPT que foram significativamente inferiores ou superiores aos
CTRL, foram particularmente analisadas, assim como as diferenças significantes entre os dois
grupos de pacientes, (Figura 5.22) como descritas a seguir.
Ao comparar os PDT aos CTRL, pôde-se observar uma alteração da expressão das
cadeias Vβ2, Vβ13.2 e Vβ18. Os PDT apresentaram uma contração das cadeias Vβ 2
(2,1%±2,1%; mediana= 1,4%) e Vβ 13.2 (1,5%±1,6%; mediana=1,2%) em relação a
expressão destas cadeias Vβ pelos linfócitos T CD8+ nos CTRL (Vβ 2‫ ׃‬5,3%±3,1%;
mediana=5%; Vβ13.2‫ ׃‬3,3%±2%; mediana=3,6%). Nos PPT, a cadeia Vβ 2 (4%±4,3%;
mediana=2,8%)
apresentou uma maior frequência em relação aos PDT, porém estas
frequências não alcançaram o percentual médio de expressão observado nos CTRL (Figura
5.22A). Já nos PPT, a cadeia Vβ 13.2 apresentou um percentual médio de expressão e
mediana semelhante aos CTRL (3,8%±2,6%; mediana=3%) (Figura 5.22B).
Inversamente, a cadeia Vβ 18 de linfócitos T CD8+ apresentou uma expansão
(1,6%±1,6%; mediana=1,3%) nos PDT, ao compará-los aos CTRL (0,4%±0,4%;
mediana=0,3%) (p<0,001). Em relação aos PPT, o percentual médio de expressão da cadeia
Vβ 18 (1,2%±1,2%; mediana=0,9%) foi semelhantes aos PDT, porém não apresentou
diferença estatística em relação aos CTRL (Figura 5.22C).
Estes resultados sugerem que a contração destas cadeias Vβ ocorre preferencialmente
nos linfócitos T CD8+ durante o tratamento, podendo ser restabelecidas após a cura clínica
(Figura 5.22A, B e C).
Ao realizar as mesmas comparações, de expressão de cadeia Vβ em linfócitos T CD8+,
entre os CTRL e os PPT, estes últimos apresentaram uma expansão significativa dos
linfócitos T CD8+ que expressam a cadeia Vβ 9 (2,5%±2,2%; mediana=2,2%) (Figura 5.22D)
e Vβ 23 (3,7%±2,8%, mediana=3,2%), enquanto os CTRL apresentaram percentuais
inferiores e estatisticamente significantes (Vβ 9: 0,7%±0,8%; mediana=0,4%; Vβ 23:
1,6%±1,6%; mediana=1%) (Figura 5.22E). Paralelamente, nos PDT, enquanto a frequência
de expressão da cadeia Vβ 23 (1,6%±1,5%; mediana=1,4%) foi semelhante aos CTRL, a
frequência da cadeia Vβ 9 nestes pacientes (2,2%±2,3; mediana=1,4%) apresentou percentual
médio intermediário aos outros dois grupos estudados.
85
Figura 5.22: Percentual de expressão das cadeias Vβ 2 (A); Vβ 13.2 (B); Vβ 18 (C); Vβ 9 (D); Vβ 23 (E); em
linfócitos (linf.) T CD8+. Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (n=16); PDT (pacientes durante
o tratamento, com doença ativa) (n=14); e PPT (pacientes póstratamento) (n=11). * (p<0,05); ** (p<0,01); e ***
(p<0,001). Valor de p obtido pelo teste ANOVA não-paramétrico de Kruskal-Wallis e pósteste de Dunns. A
mediana foi representada por barras horizontais. Cada ponto representa um indivíduo.
5.10 ALTERAÇÕES DO REPERTÓRIO
VBETA DAS SUBPOPULAÇÕES DE
*
+
LINFÓCITOS T CD8 DURANTE E APÓS O TRATAMENTO DA LEISHMANIOSE
CUTÂNEA
Devido às distintas funcionalidades das subpopulações de linfócitos T CD8+ e o papel
que cada uma delas deve exercer na resposta imune à LC, foi de fundamental importância
detalhar as características particulares de cada uma destas subpopulações, como a expressão
preferencial de determinadas cadeias Vβ do TCR destas células. Para isto, o percentual de
86
expressão das 24 cadeias Vβ em linfócitos T CD8+, efetores, naïve, de memória efetora e de
memória central, foi avaliado nos três grupos. O percentual destas cadeias Vβ foi determinado
a partir do gate em cada uma das quatro subpopulações de linfócitos T CD8+, mostrado
anteriormente pelos dot plots da Figura 4.6G (Item 4.7.2).
5.10.1 Alteração da frequência de Vβ 12, Vβ 21.3 e/ou Vβ 22, em linfócitos T CD8+
efetores
As cadeias Vβ 12, Vβ 21.3 e Vβ 22 em linfócitos T CD8+ efetores apresentaram-se
expandidas em pelo menos um dos grupos de pacientes.
A expansão da cadeia Vβ 12, em linfócitos T CD8+ efetores foi observada nos PDT
(3,6 %±2,4%; mediana=3,1%), quando comparados aos CTRL (1,3%±1,4%; mediana=1,3%)
(p<0,01). O aumento da frequência destes clones pode indicar que os linfócitos T CD8+
efetores que expressam a cadeias Vβ 21 possam ser selecionados positivamente a proliferar
durante a fase ativa da doença já que, nos PPT (1,9%±2,2%; mediana=1,5%), o percentual de
expressão destes clones se assemelha aos CTRL (Figura 5.23A). Foi importante notar ainda
que, enquanto alguns CTRL não apresentam expressão destes clones, todos os PDT
expressaram a cadeia Vβ 12 em linfócitos T CD8+.
Em relação à cadeia Vβ 22, os dois grupos de pacientes apresentaram um maior
percentual médio de expressão (PDT‫ ׃‬2,8%±3,2%; mediana=1,5%; PPT‫׃‬2,9%±4,4%;
mediana=1%) (p<0,05), quando comparados aos CTRL (0,5%±0,6%; mediana=0,2%). No
entanto, pode-se notar que alguns pacientes apresentam uma frequência destes clones
semelhante aos CTRL, enquanto que outros 6 pacientes (cinco PDT e três PPT, sendo, que
dois destes foram avaliados durante e após o tratamento) apresentaram percentuais elevados
de expressão da cadeia Vβ 22 por linfócitos T CD8+ efetores. (Figura 5.23B).
Já os linfócitos T CD8+ efetores que expressam a cadeia Vβ 21.3 foram mais
frequentes nos PDT (3%±1,9%; mediana=3%) quando comparados aos CTRL (2,2%±3,7%;
mediana=1,1%), embora não esta diferença não seja significante.
Paralelamente, foi observada uma contração destes clones nos PPT (1,1%±0,9%;
mediana=0,8%) em relação aos PDT. Além disso, nos PPT, a mediana do percentual de
expressão da cadeia Vβ 21.3 nestas células efetoras foi inferior, inclusive, aos CTRL. Este
resultado pode indicar uma tendência de expansão dos linfócitos T CD8+ efetores que
expressam a cadeia Vβ 21.3 na fase ativa da doença seguida de uma contração, observada
após o fim da terapia e resolução da infecção (Figura 5.23C).
87
Figura 5.23: Percentual de expressão da cadeia Vβ 12 (A); Vβ 21.3 (B); e Vβ 22 (C); em linfócitos (linf.) T
CD8+CD45RA+CD27- (efetores). Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos sadios) (n=16), PDT (pacientes
durante o tratamento, com doença ativa) (n=14), e PPT (pacientes póstratamento) (n=11). * (p<0,05) e **
(p<0,01). Valor de p obtido pelo teste ANOVA não-paramétrico de Kruskal-Wallis e pósteste de Dunns. A
mediana foi representada por barras horizontais. Cada ponto representa um indivíduo.
5.10.2 Alteração da frequência de Vβ2, Vβ 3, Vβ 5.3, Vβ 9, Vβ 13.2 e/ou Vβ 23, em
linfócitos T CD8+ naïve
Os linfócitos T CD8+ naïve dos dois grupos de pacientes apresentaram restrição das
cadeias Vβ 2, Vβ 3, Vβ 5.3, Vβ 9, Vβ 13.2 e/ou Vβ 23. Os clones desta subpopulação de
linfócitos T CD8+, que expressam a cadeia Vβ2, Vβ 13.2, Vβ 5.3 e Vβ23, apresentaram um
perfil semelhante, quando a freqüência dos mesmos foi comparada entre os três grupos
estudados. Foi observada uma contração destes clones nos PDT em relação, tanto aos CTRL,
como aos PPT.
A contração dos linfócitos T CD8+ totais que expressam as cadeias Vβ 2
(Figura 5.24A) e 13.2 (Figura 5.24B), nos PDT, também pôde ser observada na
subpopulação
de
células
naïve
que
expressam
estas
cadeias
(Vβ
2;
2,7%±2,5%; mediana=1,5%; Vβ 13.2; 2%±2%; mediana=1,4%). Sendo assim, os CTRL
apresentaram um percentual significativamente maior destes clones (Vβ 2; 5%±2,5%;
mediana=6,1%; Vβ 13.2; 5,3%±3,8%; mediana=4,5%) em relação aos PDT (p<0,05). Da
mesma forma, nos PPT, os clones que expressam a cadeia Vβ 2 (4,8%±4,6%; mediana=4,4%)
apresentam um percentual médio aumentado em relação aos PDT, porém sem diferença
88
significante. Já os clones que expressam a cadeia Vβ 13.2, apresentaram uma expansão nos
PPT (7,2%±5,2%; mediana=5%), quando comparados aos PDT (p<0,01).
Os PDT também apresentaram contração das cadeias Vβ 5.3 (0,8%±1,1%;
mediana=0,3%) (Figura 5.24C) e Vβ 23 (1,6%±1,7%; mediana=0,9%) (Figura 5.28D),
porém quando comparados aos PPT (Vβ 5.3: 3,6%±3,3%; mediana=2,6%; Vβ 23: 7%±5,9%;
mediana=5,2%) (p<0,05 e p<0,01). Nos CTRL, o percentual médio de expressão destes
clones não apresentou diferença significante em relação aos dois grupos de pacientes (Vβ 5.3;
1,4%±1,2%; mediana=1,2%; Vβ 23: 3,2%±3,4%; mediana=1,9%), porém as medianas foram
superiores aos PDT.
Os linfócitos T CD8+ naïve dos PPT também apresentaram contração dos clones que
expressam a cadeia Vβ 3 (3,9%±4%; mediana=2,6%), porém esta restrição foi observada em
relação aos CTRL (7,4%±4,1%; mediana=7,4%) (Figura 5.24E), e não em relação aos PDT,
como ocorre nos clones que expressam as cadeias Vβ 5.3 e Vβ 23. Estes PDT apresentaram
mediana do percentual de linfócitos T CD8+ naïve que expressam a cadeia Vβ 3 (5,5%±5,2%;
mediana=4,1%) intermediária aos outros dois grupos. Inversamente, uma expansão da cadeia
Vβ 9 de linfócitos T CD8+ naïve, pôde ser observada nos PPT (5,5%±5,3%; mediana= 3,8%)
ao compará-los aos CTRL (1,67%±2,41%; mediana=0,61%) (p<0,01) (Figura 5.24F). Apesar
de a diferença significante ter sido observada somente entre estes dois grupos, os PDT
(1,9%±1,9%; mediana=1,4%) apresentaram a mediana do percentual destes clones,
semelhante aos CTRL.
Nestes dois grupos, a maioria dos indivíduos não apresentou
expressão de Vβ 9 em linfócitos T CD8+ naïve, enquanto todos os PPT apresentaram alguma
expressão destes clones.
89
Figura 5.24: Percentual de expressão da cadeia Vβ 2 (A); Vβ 13.2 (B); Vβ 5.3 (C); Vβ 23 (D); Vβ 3 (E) e Vβ
9 (F); em linfócitos (linf.) T CD8+CD45RA+CD27+ (naïve). Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos
sadios) (n=16); pacientes durante o tratamento (PDT) (n=14); e PPT (pacientes póstratamento) (n=11). *
(p<0,05) e ** (p<0,01). Valor de p obtido pelo teste ANOVA não-paramétrico de Kruskal-Wallis e pósteste de
Dunns. A mediana foi representada por barras horizontais. Cada ponto representa um indivíduo.
5.10.3 Alteração da frequência de Vβ 2, Vβ 5.2, Vβ 9, Vβ 18 e/ou Vβ 22, em linfócitos T
CD8+ de memória efetora
Ao analisar a frequência de expressão das 24 cadeias Vβ do TCR de linfócitos T
CD8
+
ME ,
nos três grupos estudados, pôde-se observar uma restrição das cadeias Vβ 2, Vβ 5,2,
Vβ 9, Vβ 18 e Vβ 22. Dentre estas, somente a cadeia Vβ 2 sofreu contração, enquanto as
demais foram expandidas nos PDT. Foi interessante observar que, independente destas
90
alterações, o percentual de expressão destes clones TME foram baixos, se comparados às
subpopulações efetora e naïve.
A contração da cadeia Vβ 2, observada nos linfócitos T CD8+ totais e nos linfócitos T
CD8+ naïve de PDT, também foi identificada nos linfócitos T CD8+ME de PPT (1,2%±1,3%;
0,5%), ao comparar a frequência destes clones aos CTRL (3,4%±2,3%; mediana=3,2%).
Entretanto, apesar da ausência de diferença estatística, os PDT também apresentaram um
menor percentual de expressão desta cadeia (2,6%±3,1%; mediana=1,1%) em relação aos
CTRL. É importante notar que, enquanto todos os CTRL apresentaram algum percentual de
expressão da cadeia Vβ 2 em linfócitos T CD8+ de memória efetora, alguns PDT e PPT não
expressaram estes clones (Figura 5.25A).
A Figura 5.25 também representa a expansão das cadeias Vβ 5.2 (Figura 5.25B),
Vβ 9 (Figura 5.25C), Vβ 18 (Figura 5.25D) e Vβ 22 (Figura 5.25E) em linfócitos T
CD8+ME, em PDT, e as diferenças em relação aos CTRL foram estatisticamente significantes.
Os CTRL apresentaram um percentual médio de expressão destes quatro clones, próximo a
zero (Vβ 5.2‫ ׃‬0,2%±0,3%; mediana=0%; Vβ 9‫ ׃‬0,1%±0,2%; mediana=0,5%; Vβ 18‫׃‬
0,1%±0,2%;
mediana=0%;
e
Vβ
22‫׃‬
0,6%±0,8%;
mediana=0,1%).
A
diferença
estatisticamente significante foi identificada pela maior frequência dos clones destes linfócitos
TME, em PDT, que expressam as cadeias Vβ 5.2, Vβ 9, e Vβ 18 (Vβ 5.2‫ ׃‬1%±0,9%;
mediana=0,7%; Vβ 9‫ ׃‬1%±1,5%; mediana=0,4%; Vβ 18‫ ׃‬0,5%±0,9%; mediana=0,2%), sendo
a expansão da cadeia Vβ 22 (2,6%±1%; mediana= 2,6%) a de maior freqüência de expressão,
dentre estas quatro cadeias expandidas.
Nenhuma diferença significante foi observada em relação à frequência de expressão
destes clones nos PPT, quando comparada à frequência nos PDT e nos CTRL. Os percentuais
médios de expressão das cadeias Vβ 5.2, Vβ 9, Vβ 18, e Vβ 22 pelos PPT (Vβ 5.2‫׃‬
0,8%±1,2%; mediana= 0%; Vβ 9‫ ׃‬0,6%±1,1%; mediana=0,3%; Vβ 18‫ ׃‬0,2%±0,3%;
mediana=0%; e Vβ 22‫ ׃‬1,2%±2%; mediana= 0,2%) se mostraram intermediários quando
comparados aos outros dois grupos, sendo inferiores aos PDT e superiores aos CTRL.
Entretanto, foi importante observar que a freqüência de expressão da cadeia Vβ 22 em
linfócitos T CD8+ME é semelhante entre os CTRL e os PPT, enquanto os PDT apresentaram
altos percentuais de expressão destes clones. Vale notar que os PDT e os PPT que
apresentaram os dois maiores percentuais de expressão da cadeia Vβ 9, também apresentaram
os maiores percentuais de expressão das cadeias Vβ 18 e Vβ 22.
91
Figura 5.25: Percentual de expressão da cadeia Vβ 2 (A); Vβ 5.2 (B); Vβ 9 (C); Vβ 18 (D) e Vβ 22 (E); em
linfócitos (linf.) T CD8+CD45RA-CD27- (memória efetora). Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos
sadios) (n=16), PDT (pacientes durante o tratamento, com doença ativa) (n=14), e PPT (pacientes póstratamento)
(n=11). * (p<0,05), ** (p<0,01) e *** (p<0,001). Valor de p obtido pelo teste ANOVA não-paramétrico de
Kruskal-Wallis e pósteste de Dunns. A mediana foi representada por barras horizontais. Cada ponto representa
um indivíduo.
5.10.4 Alteração da frequência de Vβ 2, Vβ 9, Vβ 13.2, Vβ 18 e/ou Vβ 23, em linfócitos T
CD8+ de memória central
Quando os clones de linfócitos T CD8+MC foram avaliados, tornou-se possível
observar que os dois grupos de pacientes apresentaram uma diferença significativa da
frequência das cadeias Vβ 2, Vβ 9, Vβ 13.2, Vβ 18 e/ou Vβ 23 quando o percentual médio de
expressão destes clones foi comparado aos CTRL. A maioria destas alterações foi observada
92
nos PPT, sugerindo que estes clones possam ser preferencialmente selecionados, positiva ou
negativamente, após o controle da infecção.
Assim como a população total de linfócitos T CD8+ e as subpopulacoes naïve e TME de
PDT, pôde-se observar uma contração das células TMC que expressam a cadeia Vβ 2 nestes
pacientes (3%±3,5%; mediana=0,9%), quando comparados aos CTRL (5,4%±3,3%;
mediana=6%). Nos PPT, o percentual médio de expressão de Vβ 2 em linfócitos T CD8+ME
(4,2%±4,7%; mediana=2,1%) foi intermediário aos outros dois grupos, superior em relação
aos PDT e inferior em relação aos CTRL (Figura 5.26A). No entanto, foi importante notar
que alguns pacientes apresentaram uma maior frequência de expressão de Vβ 2 em relação a
outros pacientes do mesmo grupo, isto é, durante ou póstratamento.
Os PPT também apresentaram expansão dos linfócitos T CD8+MC que expressam Vβ
13.2 (2,6%±1,5%; mediana=2,4%). No entanto, esta maior frequência foi observada em
relação aos PDT (1,5%±2,1%; mediana=0,8%) (p<0,05), já que os CTRL apresentaram um
percentual médio de expressão destes clones dev2%±1,5 % (mediana=1,6%) (Figura 5.26B).
Nos PPT, os linfócitos T CD8+MC que expressam as cadeias Vβ 9, Vβ 18 e Vβ 23
apresentaram-se expandidos, quando comparados aos CTRL.
Os PPT apresentaram expansão dos linfócitos T CD8+MC que expressam a cadeia Vβ 9
(2%±1,6%; mediana=1,8%) (p<0,05), quando comparados aos CTRL (Figura 5.26C),
enquanto nos PDT (1,2%±1,6%; mediana=0,4%), a frequência destes clones foi semelhante
aos CTRL (0,9%±1,5%; mediana=0,4%).
Os dois grupos de pacientes apresentaram um maior percentual de linfócitos T
CD8
+
MC
que expressam a cadeia Vβ 18 (PDT‫ ׃‬1,5%±2,7%; mediana=0,6%; PPT‫ ׃‬0,9%±1,1%;
mediana=0,5%), quando comparados aos CTRL (0,3%±0,6%; mediana=0,1%) (Figura
5.26D), assim como foi observado na população total de linfócitos T CD8+.
Os CTRL e os PDT apresentaram uma frequência semelhante de expressão da cadeia
Vβ 23 em linfócitos T CD8+MC (CTRL‫ ׃‬0,8%±1,1%; mediana=0,6%; PDT‫ ׃‬1%±1,3%;
mediana=0,2%), observada não somente entre as medianas, mas também, entre os indivíduos
que apresentaram os maiores percentuais de expressão destes clones (Figura 5.26E).
Comparados aos CTRL, os PPT, por sua vez, apresentaram uma expansão dos linfócitos T
CD8+MC que expressam a cadeia Vβ 23 (2,8%±2,9%; mediana=1,5%) (p<0,05).
93
Figura 5.26: Percentual de expressão da cadeia Vβ 2 (A); Vβ 13.2 (B); Vβ 9 (C); Vβ 18 (D) e Vβ 23; em
linfócitos (linf.) T CD8+CD45RA-CD27+ (memória central). Foram avaliados CTRL (controles - indivíduos
sadios) (n=16); PDT (pacientes durante o tratamento, com doença ativa) (n=14); e PPT (pacientes
póstratamento) (n=11). * (p<0,05). Valor de p obtido pelo teste ANOVA não-paramétrico de Kruskal-Wallis e
pósteste de Dunns. A mediana foi representada por barras horizontais. Cada ponto representa um indivíduo.
Em conjunto, estes resultados mostraram que, tanto durante a fase ativa da LC como
após a resolução das lesões, o repertório das subpopulações de linfócitos T CD8+ (naïve,
efetora, TME e TMC), sofre uma modulação da frequência de clones Vβ específicos, podendo
ou não ser identificada ao avaliar a população total de linfócitos T CD8+. Na Tabela 5.2 estão
resumidas as contrações e expansões identificadas ao comparar a frequência de 24 cadeias
Vβ, expressas por linfócitos T CD8+, entre os CTRL, os PDT e os PPT.
94
Tabela 5.2: Contrações (setas vermelhas) e expansões (setas azuis) de cadeias Vβ expressas por linfócitos T
CD8+ e pelas subpopulações naïve; efetora; de memória efetora e de memória central.
Linf. T CD8+
totais
Linf. T CD8+
efetores
Linf. T CD8+
naïve
CTRL vs PDT
PDT vs PPT
CTRL vs PPT
Vβ 2; Vβ 13.2
------------
------------
Vβ 18
Vβ 23
Vβ 9; Vβ 23
------------
------------
------------
Vβ12 Vβ 21.3 Vβ 22
Vβ 21.3
Vβ 22
Vβ 2 Vβ 13.2
------------
Vβ 3
-----------Linf. T CD8+ de
memória
efetora
Linf. T CD8+ de
memória central
Vβ 5.3; Vβ 13.2; Vβ 23
Vβ 9
------------
Vβ 2
Vβ 5.2; Vβ 9; Vβ 18;
Vβ 22
------------
------------
------------
------------
------------
Vβ 2
Vβ 13.2
Vβ 9; Vβ 18; Vβ 23
CTRL (controles – indivíduos sadios); PDT (pacientes durante o tratamento, com doença ativa); PPT (pacientes
póstratamento). As linhas tracejadas indicam ausência de diferença significante da freqüência de expressão das
24 cadeias Vβ analisadas entre os dois grupos comparados.
95
6. DISCUSSÃO
As leishmanioses são consideradas pela Organização Mundial de Saúde uma das
doenças tropicais de maior importância para a saúde pública. A estratégia mais expressiva
para o controle desta doença seria o desenvolvimento de uma vacina capaz de promover uma
resposta imunológica que controle a replicação do parasito e previna o dano tecidual
progressivo. Para atingir estas perspectivas de controle é necessário um maior detalhamento
dos eventos imunológicos associados com a progressão e a cura da doença, assim como com a
proteção à mesma.
Os avanços no entendimento das leishmanioses, nas quais a relação parasitohospedeiro está associada às diretrizes da resposta imune e às manifestações clínicas da
doença, têm sido obtidos através de estudos baseados tanto em modelos animais como a partir
de amostras de pacientes.
Ensaios experimentais, ex vivo e in vitro, têm sido utilizados para avaliar as
características fenotípicas e funcionais das células envolvidas nestas respostas, principalmente
macrófagos, células dendríticas, neutrófilos e linfócitos T, contribuindo para uma melhor
compreensão
dos
mecanismos
imunorreguladores
associados
à
resolução
ou
à
manutenção/progressão da infecção.
Sabendo que, na leishmaniose cutânea (LC), a resposta imune é mediada
principalmente por linfócitos T, a avaliação das características imunológicas tem sido baseada
na determinação da frequência dos linfócitos T CD4+ e CD8+ e da produção de citocinas pelos
mesmos (Da-Cruz et al, 1994; 2002; Coutinho et al, 1996; Bomfim et al, 2007). Estas
abordagens têm sido realizadas, predominantemente, a partir de amostras de pacientes antes e
após o tratamento, no entanto, pouco se sabe a respeito das características da resposta imune
desencadeada pelos pacientes durante o tratamento (Mendonça et al, 1986; Toledo et al,
2001). Já foi demonstrado que durante a terapia antimonial os pacientes de LC apresentam
uma resposta proliferativa de linfócitos (RPL), frente a antígenos de L. braziliensis (Ag-Lb),
superior àquela observada nos pacientes antes do tratamento (Mendonça et al, 1986). Neste
estudo, o alto índice de proliferação de linfócitos de pacientes em tratamento foi relacionado à
destruição de parasitos, assim como os efeitos benéficos da terapia foram associados a uma
indução de células T específicas aos Ag-Lb. Em 2001, Toledo e cols. sugeriram que a
persistência de uma resposta proliferativa de linfócitos, após o início do tratamento
convencional com Glucantime®, estava associada à presença in vivo do antígeno e que, no
decorrer da evolução para a cura, este estímulo in vivo teria uma tendência a diminuir .
96
Uma importante característica da LC é que a maioria dos pacientes apresenta uma
resposta satisfatória à terapia antimonial (Oliveira-Neto et al, 2000). Sendo assim, o
tratamento estaria associado ao desenvolvimento de uma resposta imune eficaz o suficiente
para controlar a infecção. Por este motivo, no presente estudo, os pacientes foram avaliados
em dois diferentes momentos do tratamento: durante a terapia antimonial; e após o término da
mesma, na tentativa de identificar características da reposta imune associada à doença ativa e
ao processo de cura clínica.
No décimo dia após o início da terapia, os pacientes ainda apresentavam lesões
ulceradas e, portanto, a forma ativa da doença, a qual é caracterizada por uma intensa
atividade linfocitária em resposta aos antígenos do parasito (Mendonça et al, 1986). Já os
pacientes póstratados apresentavam lesões cicatrizadas, caracterizando um quadro clínico de
cura recente, o qual parece ter sido uma consequência da terapia administrada e da resposta
imune desencadeada nestes indivíduos.
Apesar da indução preferencial de linfócitos T CD4+ durante a fase ativa da LC,
alguns autores sugerem que os linfócitos T CD8+ estão envolvidos no processo de cura desta
doença (Da-Cruz et al, 1994; Barral et al, 1995; Coutinho et al, 1996; Bertho et al, 2000).
Além disso, utilizando modelo murino, Chan (1993) demonstrou que os linfócitos T CD8+
estariam associados à resistência de camundongos à infecção por Leishmania; e Müller e cols.
(1994) demonstraram que estes linfócitos desempenham um importante papel na proteção
contra a Leishmania em caso de reinfecção. Conceição-Silva e cols. (1998) reportaram que,
após a resolução da infecção primária, os linfócitos T CD8+ citotóxicos restritos ao MHC-I e
específicos aos antígenos de L. major, podem ser expandidos quando reestimulados in vitro
com estes antígenos. Em um estudo baseado em amostras de indivíduos vacinados contra a
leishmânia, foi demonstrada uma maior frequência de linfócitos T CD8+ reativos aos Ag-Lb
quando comparados a um grupo de pacientes com lesão ativa de LC, antes do tratamento
(Mendonça et al, 1995). Dados mais recentes sugerem que o aumento da frequência de
linfócitos T CD8+ intralesionais reforça a hipótese de que estas células estariam envolvidas no
processo de resolução das lesões (Da-Cruz et al, 2005). Ainda, em outros trabalhos, a
participação dos linfócitos T CD8+ na resolução da infecção foi correlacionada à produção de
IFN- γ por estas células (Pompeu et al, 2001; Da-Cruz et al, 2002; Nateghi Rostamani et al,
2010).
Atualmente, apesar dos conhecimentos obtidos acerca do papel-chave dos linfócitos T
+
CD8 e T CD4+ na resposta imune da LC, apenas a distinção entre estas duas populações não
é suficiente, já que sabemos que estas células são subdividas, segundo sua fase de
diferenciação, em naïve, efetora e de memória (Peakman & Vergani, 2011; Abbas &
97
Litchman, 2007). Além disto, estas categorias celulares funcionalmente distintas podem estar
sujeitas a morte por apoptose de forma diferenciada, em razão de um estímulo antigênico
(Brunner et al, 1995; Grayson et al, 2004).
Para a identificação destas células, a citometria de fluxo se mostrou uma ferramenta
adequada para avaliar não só a variedade de características que definem estas subpopulações
de linfócitos, como também a ocorrência de apoptose nestas células. Esta metodologia
permitiu uma análise celular individual destas características mencionadas, simultaneamente,
através de um protocolo multiparamétrico. O desenho experimental proposto envolveu duas
abordagens: um ensaio ex vivo, com intuito de identificar características da resposta imune
que estaria ocorrendo in vivo; e um ensaio in vitro no qual foi avaliada a influência da
exposição aos Ag-Lb.
A partir destes ensaios experimentais, os primeiros dados avaliados se referem à
frequência de linfócitos T CD8+ e aos níveis destas células em apoptose, nos três diferentes
grupos estudados. Considerando que nos indivíduos sadios (controles - CTRL) os níveis de
linfócitos T CD8+ circulantes correspondem a padrões de normalidade, a diminuição do
percentual médio destas células, nos pacientes com lesão ativa, em tratamento, foi associada
ao processo infeccioso. A maior frequência de linfócitos T CD8+ em apoptose, observada
nestes pacientes, sugere que este fenômeno de morte pode modular os níveis de linfócitos T
CD8+ e comprometer os efeitos da função que estas células desempenham na resposta imune,
contribuindo assim para a manutenção da infecção. Por outro lado, a semelhança do
percentual destas células entre os indivíduos sadios e os pacientes póstratados indica que,
após a cura clínica, haja uma tendência ao restabelecimento dos níveis de linfócitos T CD8+.
A menor ocorrência de apoptose nestas células poderia contribuir para este restabelecimento
e, consequentemente, para o controle da infecção. Estes resultados estão de acordo com
Bertho e cols. (2000), os quais mostraram que, em lesões de pacientes com LC causada por L.
braziliensis, a doença ativa estaria relacionada ao aumento de apoptose de linfócitos T CD8+,
enquanto uma menor frequência destas células apoptóticas estaria relacionada a indivíduos
que evoluíram para a cura espontânea. Neste contexto, estes autores sugeriram que a apoptose
de linfócitos T CD8+ estaria associada à progressão da doença, exercendo um papel
modulador da resposta imune na LC. Similarmente, Clarêncio (2005) sugeriu que pacientes de
leishmaniose visceral, apresentavam um maior percentual de apoptose dos linfócitos T CD8+
circulantes, quando comparados a indivíduos sadios e a pacientes póstratados.
Os resultados obtidos in vitro mostraram uma maior ocorrência de apoptose nos
linfócitos T CD8+, de pacientes em tratamento, com a doença ativa, na presença de Ag-Lb,
98
sugerindo que, com a provável liberação de grande quantidade de antígenos nesta fase da
doença, os mesmos poderiam ser responsáveis pela indução de apoptose nos linfócitos T
CD8+. Este resultado não foi observado em relação aos pacientes póstratados, indicando que o
controle da infecção estaria associado a uma redução do estímulo antigênico e a uma maior
resistência dos linfócitos T CD8+ destes pacientes em sofrer apoptose.
No presente estudo, a diferença entre a frequência de linfócitos T CD8+ reativos aos
Ag-Lb de pacientes com doença ativa e de pacientes póstratados, corrobora os dados
encontrados por Da-Cruz e cols. (1994, 2002), os quais sugeriram que o aumento dos níveis
de linfócitos T CD8+ de pacientes póstratados estaria associado à resolução da infecção. No
entanto, vale notar que, nestes trabalhos, os pacientes com doença ativa ainda não tinham
iniciado o tratamento, indicando que, após o fim da terapia, a proporção de linfócitos T CD8+
respondedores para antígenos de Leishmania seria superior àquela observada antes e durante o
tratamento. Adicionalmente, os dados obtidos em relação aos dois grupos de pacientes
também foram comparados aos indivíduos sadios, permitindo assim, considerar que a
frequência de linfócitos T CD8+ reativos aos Ag-Lb diminui nos pacientes com doença ativa.
Nestes pacientes a modulação negativa destes linfócitos parece contribuir para a permanência
das lesões, reforçando a hipótese de que o aumento da frequência de linfócitos T CD8+ estaria
associado à resolução da infecção.
Sabendo que a resposta imune desencadeada após o reconhecimento antigênico
envolve a participação de subpopulações celulares funcionalmente distintas, os linfócitos T
CD8+ podem ser caracterizados como células naïve, efetoras ou de memória. Ainda não foi
descrito na literatura uma avaliação conjunta da participação de clones específicos destas
subpopulações de linfócitos T CD8+ na resposta imune da LC, o que se tornou objetivo do
presente estudo. Este processo de diferenciação funcional envolve uma série de alterações
fenotípicas, as quais têm sido exploradas por diversos autores para a identificação das
diferentes subpopulações de linfócitos. Neste cenário, a combinação dos anticorpos
monoclonais anti-CD45RA e anti-CD27 tem sido utilizada para identificar, em humanos, as
subpopulações de linfócitos T CD8+ (Hamann et al, 1997; 1999; Sallusto et al, 1999; Baars et
al, 2000; Monsurrò et al, 2002; Mackus et al, 2003; Nikolova et al, 2009; Libri et al, 2011).
A heterogeneidade da distribuição dos linfócitos T CD8+ naïve (CD45RA+CD27-),
efetores (CD45RA+CD27-), de memória central (TMC, CD45RA+CD27-) e de memória efetora
(TME) (CD45RA-CD27-), nos três grupos estudados, parece ser influenciada pelo estado
imunológico que caracteriza cada um deles. Foi importante notar que, nos indivíduos sadios,
os linfócitos T CD8+ naïve representaram a maioria das células, enquanto nos pacientes em
99
tratamento a maior parte dos linfócitos T CD8+ foi composta por células efetoras. A
predominância destas diferentes subpopulações parece estar associada à ausência e à presença
de infecção, nestes indivíduos. A proporção invertida destas subpopulações nos dois grupos
mencionados sugere que, como consequência da infecção, as células naïve dos pacientes
possam estar sendo ativadas e diferenciadas em células efetoras, as quais por sua vez
sofreriam expansão clonal, explicando assim o maior percentual das mesmas. Após o fim da
terapia, a proporção entre linfócitos T CD8+ naïve e efetores parece ser novamente invertida,
indicando uma tendência de restabelecimento da distribuição destas subpopulações, a qual
pode ser uma conseqüência do controle da infecção. Já a proporção de linfócitos T CD8+ME e
TMC parece ser mantida, independente dos diferentes estados imunológicos que os indivíduos
avaliados se encontravam, embora um maior percentual de TMC tenha sido observado nos
PPT.
Paralelamente, os dois grupos de pacientes apresentaram uma maior ocorrência de
apoptose nas quatro subpopulações de linfócitos T CD8+ em relação aos indivíduos sadios.
Apesar disto, foi interessante notar que, a distribuição das subpopulações em apoptose foi
semelhante entre os três grupos estudados sendo que os linfócitos T CD8+ naïve parecem ser
mais suscetíveis a este processo de morte. Estes dados estão de acordo com Grayson e cols.
(2004), os quais demonstraram que os linfócitos T CD8+ naïve são mais susceptíveis à
apoptose do que as células de memória. Gupta e Gollapudi (2006) atribuíram tal
suscetibilidade à capacidade replicativa e consequente manutenção do repertório de células
naïve. Estes autores também sugeriram que as células TMC são mais suscetíveis a apoptose
enquanto as células TME são mais resistentes. No entanto, no presente estudo, a baixa
frequência de apoptose tanto nos linfócitos T CD8+ME como nos TMC, nos três grupos
estudados, sugere que ambas as subpopulações tenham sido resistentes a este processo de
morte.
Segundo Boyman e cols. (2009) as diferentes subpopulações de linfócitos T são
mantidas em números razoavelmente constantes através de mecanismos de homeostase que
garantem a sobrevivência e a manutenção dos linfócitos T. Sendo assim, a infecção por
L. braziliensis parece modular este mecanismos de homeostase, já que os pacientes de LC,
avaliados no presente estudo, apresentaram uma alteração da proporção de subpopulações de
linfócitos T CD8+ e diminuição do número total destas células. Adicionalmente, apesar da
apoptose exercer um papel no controle da homeostase, este processo de morte parece estar
envolvido na modulação não só da frequência de linfócitos T CD8+ de pacientes em
tratamento e clinicamente curados, como também o efeito da atividade destas células na
resposta imune que ocorre nestes dois grupos de pacientes.
100
Numa análise comparativa entre os três grupos estudados, o maior percentual de
linfócitos T CD8+ efetores durante a fase ativa da doença foi associado à maior indução destas
células durante o processo infeccioso, já que após a cura clínica, os pacientes póstratados,
apresentam uma frequência reduzida destas subpopulação. No entanto, a persistência de um
percentual de linfócitos T CD8+ efetores superior em relação à frequência destas células nos
indivíduos sadios, mesmo após a cura clínica, sugere que apesar do controle da infecção, o
sistema imune ainda não restabeleceu a homeostasia. Segundo alguns trabalhos descritos na
literatura, a manutenção da resposta imune após a cura clínica também pode ser uma
consequência da persistência dos parasitos, demonstrada através da presença dos mesmos em
cicatrizes de pacientes curados (Schubach et al, 1998; Mendonça et al, 2004).
Nossos resultados mostram que na presença de Ag-Lb, as células efetoras de ambos os
grupos de pacientes foram capazes de responder a tal estimulação. Sendo assim, a maior
frequência desta subpopulação de linfócitos T CD8+ nos pacientes em tratamento, em relação
aos indivíduos sadios, seria uma conseqüência da presença in vivo de parasitos nestes
pacientes. Considerando que atividade efetora dos linfócitos T CD8+ inclua a secreção de
grânulos líticos e a produção de IFN-γ, e que ambas devem desempenhar um papel na
resolução da infecção de pacientes de LC (Da-Cruz et al, 2005), esta maior frequência de
células efetoras pode corresponder ao desenvolvimento da resposta imune eficaz que levou
estes pacientes à cura. No entanto, nos pacientes em tratamento a ocorrência de apoptose de
células efetoras quando estimuladas pelos Ag-Lb, sugere que um processo de morte induzida
por ativação (activated induced cell death – AICD) possa estar associado ao estímulo
antigênico (Brunner et al, 1995; Kabelitz et al, 1995), já que estes pacientes apresentam lesão
ativa.
Embora os pacientes póstratados apresentem um menor percentual de linfócitos T
+
CD8 efetores, a ocorrência de apoptose nestas células foi inferior quando comparada aos
pacientes em tratamento. O comprometimento da viabilidade da subpopulação de células T
CD8+ efetoras pode refletir uma modulação negativa do papel da sua atividade funcional,
podendo contribuir para a persistência da lesão. Sendo assim, apesar de um menor percentual
de linfócitos T CD8+ efetores nos pacientes póstratados, o maior percentual de células viáveis
parece estar associado ao controle da infecção e cicatrização das lesões nestes indivíduos.
A ausência de alteração do percentual de linfócitos T naïve, quando estimulados com
Ag-Lb, pode indicar que, o percentual destas células nos dois grupos de pacientes possa ser
um reflexo do aumento da frequência de outra subpopulação de linfócitos T CD8+. No
entanto, pode-se considerar também que a modulação negativa dessas células naïve dos
pacientes em tratamento seja conseqüência da suscetibilidade das mesmas em sofrer apoptose
101
na presença de Ag-Lb, o que poderia comprometer o número de células diferenciadas em
efetoras.
Ao avaliar a frequência de células de memória, foi importante levar em consideração
que apenas uma pequena proporção das células efetoras e/ou naïve se diferencia em células de
memória (Appay et al, 2008). Sendo assim, o percentual de linfócitos T CD8+ME ligeiramente
superior nos pacientes póstratados, pode indicar que alguns linfócitos T CD8+ tenham sido
selecionados para se diferenciar em células de memória, específicas aos Ag-Lb, o que poderia
ser confirmado através do estímulo in vitro, com tais antígenos. De acordo com Sallusto e
cols. (2004), os linfócitos T CD8+ME são células produtoras de perforina e IFN-γ. Sabendo da
importância destas moléculas na resolução da LC, a presença de linfócitos T CD8+ME,
específicas aos Ag-Lb poderia contribuir para a resolução da infecção. No entanto, segundo
Wherry e cols. (2003) as células TMC são mais eficientes em mediar uma resposta imune
devido a uma maior capacidade proliferativa em relação às células TME. Entretanto, estes
autores, descreveram ainda que, as células de memória efetora e central não representam,
necessariamente, duas subpopulações, as quais fariam parte de uma contínua linha de
diferenciação.
Após o ensaio de estimulação antigênica, in vitro, avaliamos se os pacientes teriam
desenvolvido células de memória específicas aos Ag-Lb, capazes de responder a estes. Foi
realizada uma análise conjunta das células TMC e TME, com o intuito de melhor interpretar os
resultados, já que ambas as subpopulações apresentaram semelhança nas suas baixas
frequências. Durante o tratamento e, mais expressivamente, após a cura clínica os pacientes
apresentaram linfócitos T CD8+ de memória específicos aos Ag-Lb, os quais se mostraram
resistentes à apoptose independente da presença destes antígenos, embora um alto percentual
deste processo de morte tenha sido observado nas células de memória de dois pacientes. No
entanto, deve-se considerar que linfócitos T CD8+ de memória, principalmente nos pacientes
em tratamento podem estar em processo inicial de diferenciação sugerindo que ao longo do
tempo uma maior frequência destas células possa ser observada nos pacientes. No entanto, a
suscetibilidade à reinfecção pode indicar que a memória imunológica desenvolvida por
pacientes não represente uma resposta imune anti-Leishmania eficaz (Scott, 2005).
Em conjunto estes dados mostram que na LC, a apoptose parece modular não só a
frequência dos linfócitos T CD8+ como também o perfil de distribuição de suas
subpopulações. A alteração da proporção dos linfócitos T CD8+ naïve e efetores, parece
acompanhar o processo de resolução da infecção. No entanto a maior frequência de células
efetoras durante a fase ativa da doença pode não corresponder a um maior efeito da atividade
desta subpopulação, já que parte destas células efetoras pode estar funcionalmente
102
comprometida pelo processo de apoptose. Neste contexto, a diferença do perfil de distribuição
e a indução de apoptose nas subpopulações de linfócitos T CD8+ que entre o décimo e
octogésimo dia do início do tratamento da LC, parecem caracterizar o processo de resolução
da infecção.
Para investigar um possível envolvimento de clones específicos de linfócitos T CD8+
(naïve, efetores, TME e TMC) na resposta imune desencadeada durante a fase ativa da LC e
após o controle da infecção, foi realizada uma caracterização do repertório Vβ destas células e
uma análise da frequência de expressão de diferentes clones nos indivíduos sadios e nos dois
grupos de pacientes estudados.
Segundo alguns dados descritos na literatura, algumas cadeias Vβ já foram associadas
à infecção por Leishmania. Uyemura e cols. (1993) verificaram a expansão de Vβ 6 em
lesões de pacientes infectados por L. braziliensis, e Clarêncio e cols. (2006) sugeriram que os
linfócitos T que expressam Vβ 12 desempenham um importante papel na LC. Ainda,
Kariminia e cols. (2007) demonstraram que a exposição a L. guyanensis induz
preferencialmente os linfócitos T CD8+ que expressam Vβ 14. Paralelamente, em pacientes
com Doença de Chagas, parece haver uma expressão preferencial de Vβ 3.1 (Menezes et al,
2004) e Vβ 5 (Costa et al, 2000) que estaria envolvida na patologia desta doença.
No presente estudo, a partir do repertório de linfócitos T CD8+, foi avaliada a
frequência e a distribuição dos clones Vβ específicos nas subpopulações naïve, efetora, TME e
TMC. A caracterização do repertório Vβ dos linfócitos T CD8+ do sangue periférico de
indivíduos sadios; de pacientes com LC ativa, sob tratamento; e de pacientes póstratados,
clinicamente curados; revelou uma distribuição policlonal que incluiu a expressão de 24
diferentes cadeias Vβ. A ausência de superexpressão ou deleção clonal Vβ-específica excluiu
a possibilidade de uma atividade superantigênica associada à LC.
Embora todas as cadeias avaliadas tenham sido expressas, foi observada uma
heterogeneidade da frequência de expressão dos diferentes clones que compõem o repertório,
já que algumas cadeias apresentaram uma tendência em serem mais freqüentes, nos três
grupos estudados, como Vβ 3 e Vβ 8, enquanto outras foram menos frequentes, como o Vβ
16 e Vβ 18. Estes dados corroboram aqueles encontrados por Giacoia-Gripp e cols. (2005),
os quais mostraram que os linfócitos T CD4+ e CD8+ de indivíduos sadios apresentavam um
perfil não aleatório de utilização das cadeias Vβ, as quais apresentaram diferentes frequências.
Ao considerar que o repertório dos indivíduos sadios serviria como parâmetro de
comparação da frequência de expressão dos clones Vβ-específicos nos pacientes de LC, pôdese identificar uma modulação do repertório dos linfócitos T CD8+ tanto nos pacientes com
103
lesão ativa em tratamento como naqueles clinicamente curados, sugerindo que haja uma
indução oligoclonal destes linfócitos. Estes dados corroboram àqueles descritos por Uyemura
e cols. (1993), e Clarêncio e cols. (2006) em leishmaniose, e por Menezes e cols. (2004) em
doença de Chagas.
Sob estímulo antigênico, os linfócitos T envolvidos em uma resposta antígenoespecífica podem ser induzidos a proliferar, ou a sofrer uma supressão como conseqüência de
uma estimulação excessiva ou ainda AICD (Abbas & Lichtman, 2007). Neste contexto,
quando o repertório Vβ de linfócitos T CD8+ de indivíduos sadios foi comparado, aos
pacientes em tratamento, com doença ativa ou aos pacientes clinicamente curados, as
diferenças estatisticamente significantes foram identificadas como expansões e contrações,
em caso de aumento ou diminuição do percentual das cadeias Vβ, respectivamente. Também
foram identificadas diferenças estatisticamente significantes ao comparar a frequência de
expressão das cadeias Vβ entre os dois grupos de pacientes, sugerindo que a diferença do
estado clínico seja acompanhada de uma alteração imunológica no que se refere à distribuição
e indução de determinados clones de linfócitos T CD8+.
A cadeia Vβ 4 foi menos expressa tanto nos indivíduos sadios como nos pacientes
póstratados, enquanto nos pacientes em tratamento a cadeia Vβ 11 foi a menos expressa pelos
linfócitos T CD8+. Já a cadeia que apresentou a maior frequência de expressão nestes
pacientes foi a Vβ 22 enquanto nos pacientes póstratados foi a cadeia Vβ 5.1, embora a
frequência de nenhuma destas apresente diferença estatisticamente significante quando
comparadas aos outros grupos de indivíduos avaliados.
As contrações e expansões de diferentes cadeias Vβ de linfócitos T CD8+,
identificadas nos pacientes em tratamento ou nos pacientes clinicamente curados, também
foram identificadas em pelo menos uma das quatro subpopulações analisadas, embora o
inverso não seja verdadeiro. Esta característica foi bastante evidente ao analisar a frequência
das cadeias Vβ das células naïve.
Os diferentes clones de linfócitos T CD8+ Vβ-específicos apresentaram uma
frequência heterogênea entre os pacientes durante a após o tratamento da LC. Ainda neste
contexto, foi interessante notar a ausência de uma contração ou expansão, da mesma cadeia
Vβ, em ambos os grupos de pacientes, tanto na população total de linfócitos T CD8+, como
nas subpopulações estudadas. Este dado sugere que ao longo do tratamento e do processo de
resolução da infecção ocorra uma modulação da frequência dos clones que estão contraídos
ou expandidos durante a doença ativa, de modo que, após a cura clínica os clones expandidos
e contraídos expressam outras cadeias Vβ. Neste contexto, os linfócitos T CD8+ efetores que
expressam cadeia Vβ 22 poderiam ser uma exceção, já que a diferença da média de frequência
104
entre os indivíduos sadios e os dois grupos de pacientes foi estatisticamente significante. No
entanto, sendo importante notar que a maioria dos pacientes apresentou uma frequência de
expressão de Vβ semelhante aos indivíduos sadios.
Os dois momentos da infecção, avaliados neste estudo, parecem se caracterizar não só
pela distribuição das subpopulações de linfócitos T CD8+ e da ocorrência de apoptose nas
mesmas, mas também por uma modulação da expressão de determinadas cadeias Vβ.
Em relação à população total de linfócitos T CD8+, foi verificada uma contração de Vβ
13.2 e de Vβ 2 em pacientes com a doença ativa, em tratamento. Clarêncio e cols., ao avaliar
a população de linfócitos T CD8+ de pacientes de LC, cultivados na presença de antígenos de
L. amazonensis, também verificaram uma diminuição da frequência de Vβ 2 em relação às
células cultivadas sem estímulo antigênico. Estes autores atribuíram que tal diminuição
poderia ser resultado da apoptose destes clones após esta estimulação antigênica.
Os linfócitos T CD8+ MC e naïve dos pacientes em tratamento também apresentaram
contração de Vβ 2, sendo que a frequência destes clones parece ser restabelecida após a cura
clínica. Paralelamente, esta cadeia Vβ 2 também se apresentou contraída nas subpopulação
TME dos pacientes clinicamente curados. Estes dados podem indicar que em pacientes de LC
ocorra uma modulação negativa das diferentes subpopulações de linfócitos T CD8+ que
expressam Vβ 2. Interessantemente, Menezes e cols. (2004) identificaram uma diminuição da
frequência de linfócitos T CD8+ CD28- (ativados) que expressam Vβ 2 em pacientes com
doença de Chagas.
No presente estudo, ao avaliar a população total de linfócitos T CD8+, os pacientes sob
tratamento apresentaram contração de Vβ 2, o que parece ser uma consequência dos baixos
percentuais de Vβ 2 nas células naïve e TMC, que caracterizaram a contração destas células, o
que também é válido para a cadeia Vβ 13.2.
Os linfócitos T CD8+ que expressam a cadeia Vβ 9 parecem ser progressivamente
induzidos no decorrer do tratamento e apresentam-se expandidos mesmo após a cura clínica.
Já a cadeia Vβ 23 apresentou-se expandida somente nos pacientes clinicamente curados.
Nos três grupos estudados, os linfócitos T CD8+ naïve apresentaram uma distribuição
mais homogênea das 24 cadeias Vβ avaliadas, em relação às outras subpopulações. Isto se
explica pelo fato destas células representarem o repertório Vβ original e precursor do
repertório das células efetoras e de memória.
As alterações significativas de frequência das cadeias Vβ de linfócitos T CD8+ naïve,
ocorreram predominantemente nos pacientes clinicamente curados. Enquanto os clones que
expressam Vβ 13.2 ou Vβ 23, em pelo menos parte dos pacientes avaliados, parecem ser
105
recuperados após o controle da infecção, os clones que expressam a cadeia Vβ 9
apresentaram-se expandidos nestes pacientes.
Em relação aos linfócitos T CD8+ME, diversas cadeias Vβ não foram expressas por
alguns indivíduos, principalmente pelos sadios. No entanto a expansão de Vβ 22, a qual nas
células efetoras só ocorreu em alguns pacientes, nas células TME os pacientes em tratamento
apresentaram uma frequência bastante expressiva em relação aos outros dois grupos.
Ao caracterizar o repertório de linfócitos T CD8+MC pôde-se observar uma maior
heterogeneidade da frequência de expressão dos diferentes clones de Vβ pelos indivíduos do
mesmo grupo e, além disso, muitos destes não apresentaram expressão de algumas cadeias.
Apesar disso, as células dos pacientes clinicamente curados que expressam Vβ 9
apresentaram uma maior frequência nesta subpopulação. Estes clones poderiam estar sendo
diferenciados a partir de TME, ao longo do processo de resolução da infecção, de forma que
estejam expandidos nos pacientes clinicamente curados.
O baixo percentual de linfócitos T CD8+ efetores nos indivíduos sadios, parece
implicar em um repertório Vβ heterogêneo entre os membros deste grupo e em uma baixa
frequência de expressão das cadeias Vβ. Por conta disso, as células efetoras dos pacientes
não apresentaram nenhum clone contraído. Apesar disso, nos pacientes clinicamente curados
foi observada uma menor frequência dos linfócitos T CD8+ efetores que expressam a cadeia
Vβ 21.3, quando comparados aos pacientes com doença ativa, em tratamento.
Após a resolução da infecção e modulação negativa da frequência de linfócitos T
+
CD8 efetores, não foi observada expansão ou contração de nenhuma das cadeias Vβ
analisadas.
Nos linfócitos T CD8+ efetores dos pacientes em tratamento, a única expansão
observada foi de Vβ 12. No entanto não foi possível associar uma participação dos linfócitos
T CD8+ efetores que expressam Vβ 12 ao processo de resolução da infecção, já que após a
cura clínica dos pacientes estes clones não se apresentaram expandidos. Apesar desta possível
participação dos linfócitos T CD8+ Vβ 12 na resposta imune anti-Leishmania, estes clones
não parecem ser selecionados para se diferenciar em células de memória. Clarêncio e cols.
(2006), ao avaliarem o repertório Vβ de linfócitos T CD4+ e CD8+ de sangue periférico de
pacientes de LC, após estimulação in vivo e in vitro com antígenos de L. amazonensis
demonstraram uma expressão aumentada de Vβ 12. Além disso, estes autores também
verificaram que a expressão de Vβ 12 era maior nos linfócitos T CD8+ de linfonodo em
relação àqueles obtidos do sangue periférico de pacientes. Adicionalmente, as células que
expressam Vβ 12 se mostraram produtoras de alta quantidade de IFN-γ. A reunião destes
dados pode indicar que, dos linfócitos T CD8+ que são ativados e induzidos a se diferenciar
106
em células efetoras, aqueles que expressam a cadeia Vβ 12 seriam preferencialmente
expandidos durante a fase ativa da LC, podendo exercer um papel importante para o controle
da infecção através da produção de IFN-γ. Vale registrar ainda que Keesen (2010) verificou,
em pacientes de LC, um aumento da frequência de linfócitos T CD4+ expressando Vβ 12,
após serem estimulados com antígeno solúvel de L. braziliensis. Comparando estes dados
com àqueles obtidos por Clarêncio e cols (2006) esta autora sugeriu a existência de antígenos
dominantes comuns nas diferentes especies de Leishmania, que induziriam a expansão de
linfócitos T.
A partir destes resultados pôde-se verificar que os linfócitos T CD8+ que expressam a
cadeia Vβ 2, Vβ 9, Vβ 13.2, ou Vβ 23 podem ser preferencialmente modulados, nas diferentes
subpopulações, durante a resposta imune desencadeada nos pacientes de LC. Além disso, os
linfócitos T CD8+ que expressam Vβ 12 parecem ser os clones efetores preferencialmente
expandidos na fase ativa da LC, no entanto não se pode definir se estas células participam do
processo de controle da infecção. Para isto, seria necessário avaliar a produção de citocinas,
principalmente de IFN-γ, além de um ensaio de citotoxicidade para verificar a secreção de
grânulos líticos por estes clones.
A indução preferencial de clones Vβ-específicos e a alteração da frequência dos mesmos,
parecem estar associadas à modulação da distribuição das subpopulações, as quais, por sua
vez, podem ser comprometidas em número e funcionalidade pela ocorrência de apoptose. O
caráter modulador que este processo de morte exerce na resposta imune de ambos os grupos
de pacientes sugere que a ocorrência de apoptose, mais intensa na fase ativa da doença, esteja
relacionada à manutenção da infecção.
107
7. CONCLUSÕES
• A apoptose parece ser responsável pela menor frequência de linfócitos T CD8+, na fase
ativa da leishmaniose cutânea, e está relacionada à presença de antígenos de Leishmania
braziliensis; enquanto a tendência ao restabelecimento desta frequência, após o tratamento
pode ser uma consequência da menor ocorrência da apoptose de linfócitos T CD8+, que
estaria associada à resolução da lesão;
• Apesar de um maior percentual de linfócitos T CD8+ efetores em pacientes durante o
tratamento, a ocorrência de apoptose nestas células pode estar associada à presença de lesão
ativa, e comprometer uma resposta imune eficaz;
• A inversão da proporção de linfócitos T CD8+ naïve e efetores parece acompanhar o
processo de resolução da lesão, e controle da infecção, ao longo do tratamento;
• Os linfócitos T CD8+ que expressam as cadeias Vβ 9, Vβ 13.2 ou Vβ 23 podem ser
preferencialmente selecionados a expandir durante a resposta imune que é desencadeada em
pacientes de LC, podendo ainda ser os clones selecionados a se diferenciar em células de
memória central;
• A cadeia Vβ 2 expressa nas subpopulações de linfócitos T CD8+ naïve, de memória central
e memória efetora, parece estar envolvida no reconhecimento antigênico na LC e sofrer
contração em consequência de AICD;
• Os linfócitos T CD8+ que expressam a cadeia Vβ 22 podem ser clones com potencial para
serem selecionados a se diferenciar em células de memória efetora durante a fase ativa da
LC;
• Os linfócitos T CD8+ que expressam a cadeia Vβ 12 parecem estar envolvidos na resposta
imune efetora desencadeada na fase ativa da LC;
• A heterogeneidade entre o repertório Vβ das células efetoras, naïve, de memória central e de
memória efetora, mostrou que a análise da população total de linfócitos T CD8+ pode
ocultar uma expansão ou contração de determinados clones nas subpopulações
funcionalmente distintas, ressaltando a importância de analisá-las separadamente.
108
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ANEXO I
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Voluntário
INSTITUIÇÃO: Instituto Oswaldo Cruz - FIOCRUZ, Lab. Imunoparasitologia, Pav. Leônidas Deane, sala 408A, Av. Brasil 4365, Manguinhos. Rio de Janeiro, RJ.
TÍTULO DO PROJETO: Perfil do repertório da cadeia variável β do Receptor de Células T em Linfócitos T
CD8+ efetores ou de memória apoptóticos em pacientes com Leishmaniose
Tegumentar Americana: um estudo citofluorimétrico.
PESQUISADORES RESPONSÁVEIS:
Álvaro Luiz Bertho dos Santos, Doutor, Biomédico, Pesquisador Titular
Raquel Ferraz, Biomédica, Mestranda PGBP
Em caso de dúvida entre em contato pelo tel. 3865.8126
Projeto aprovado pelos Comitês de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do IPEC, sob o nº 057/2009 e da
FIOCRUZ sob. nº 502/2009.
NOME DO VOLUNTÁRIO:____________________________________________________
Declaro que aceito participar como voluntário da investigação científica que está sendo realizada pelo Instituto
Oswaldo Cruz - FIOCRUZ com o objetivo de se estudar os mecanismos que levam o organismo humano a se
curar da leishmaniose. Fui informado de que este estudo não me beneficiará diretamente, mas poderá auxiliar os
estudos para a obtenção de uma vacina contra a doença.
Minha colaboração será submeter-me aos seguintes procedimentos a serem realizados por profissionais de saúde
especializados:
1. Exame clínico;
2. Teste de Montenegro. Este consiste na aplicação de 0,1 ml de uma solução contendo parasitos mortos pelo
mertiolate. A leitura é feita em 48 h.
3. Coleta de 40 mL de sangue através de punção na veia do braço. Esta poderá ser repetida após o tratamento
da doença.
Esclarecimento sobre os procedimentos e inconvenientes:
O teste de Montenegro é utilizado rotineiramente para o diagnóstico da Leishmaniose e sua positividade indica a
exposição ao parasito. No entanto, o teste não deve ser aplicado nos indivíduos alérgicos a mertiolate. A reação
positiva se acompanha de vermelhidão e endurecimento restritos à área de aplicação do teste. Reações mais
intensas como inflamação, ulceração na pele ou mesmo febre são bastante raras.
O volume de sangue retirado não causa danos ou riscos ao organismo. Os possíveis desconfortos, se ocorrerem,
são relacionados a problemas ocorridos durante a punção venosa local, como extravasamento de sangue que leva
a dor e hematoma, mas que regridem em cerca de 3 a 5 dias. Não havendo assim necessidade de indenizações
para qualquer um dos problemas citados.
Os investigadores deverão, a qualquer momento, esclarecer minhas dúvidas sobre a doença, a utilização do
material biológico retirado do meu organismo e os resultados obtidos com o estudo. Estes resultados poderão ser
divulgados na forma de comunicação científica, mas não será permitida a minha identificação. Autorizo, ainda,
eventual armazenamento da amostra biológica para utilização futura. Fui informado, também, que posso me
retirar e meu consentimento em qualquer fase da pesquisa sem penalidade alguma e sem prejuízo ao meu
cuidado.
As amostras serão utilizadas somente neste projeto; se forem usadas em projeto futuro, o mesmo será submetido
novamente ao CEP/Fiocruz e o material não será utilizado sem o devido consentimento e sem o sujeito da
pesquisa ter conhecimento.
Declaro estar ciente do teor deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, decidindo-me a participar da
investigação proposta. Este documento ficará arquivado no Laboratório de Imunoparasitologia do Instituto
Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, ficando Eu de posse de uma cópia.
Voluntário: __________________________________________________
Investigador: _________________________________________________
129