centro estadual de educação tecnológica “paula

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CENTRO ESTADUAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA “PAULA
SOUZA”
FACULDADE DE TECNOLOGIA DE PIRACICABA – FATEC
TECNOLOGIA EM BIOCOMBUSTÍVEIS
MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE CANA-DEAÇÚCAR VISANDO RESISTÊNCIA À BROCA (Diatraea saccharalis)
ANA PAULA DE OLIVEIRA ALMEIDA
JOÃO PAULO AUGUSTO RAMOS
MARIANA REAME SANTOS
PIRACICABA
JUNHO/2011
2
ANA PAULA DE OLIVEIRA ALMEIDA
JOÃO PAULO AUGUSTO RAMOS
MARIANA REAME SANTOS
MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE CANA-DE-AÇÚCAR
VISANDO RESISTÊNCIA À BROCA (Diatraea saccharalis)
Trabalho de Graduação apresentado à Banca Examinadora como
requisito parcial à obtenção do título de Tecnólogo em
Biocombustíveis.
Orientador: Profª. Dra. Márcia Nalesso Costa Harder
Co-orientador: Dra. Sabrina Moutinho Chabregas
PIRACICABA
JUNHO/2011
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AUTORIZAMOS A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E
PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Almeida, Ana Paula de Oliveira
Ramos, João Paulo Augusto
Santos, Mariana Reame
MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE CANA-DE-AÇÚCAR VISANDO
RESISTÊNCIA À BROCA (Diatraea saccharalis)/ Ana Paula de Oliveira Almeida, João Paulo
Augusto Ramos, Mariana Reame Santos ; Orientadora Profa. Dra. Márcia Nalesso Costa Harder;.
Co-orientadora Dra. Sabrina Moutinho Chabregas - - Piracicaba, 2011.
54p.
Trabalho de Graduação (Graduação – Tecnologia) – Faculdade de Tecnologia de Piracicaba –
Centro de Educação Tecnológica “Paula Souza”.
1. Cana-de-açúcar 2. Transformação genética 3. Harder, N. C. Marcia – orientadora 4. Chabregas,
M. Sabrina – co-orientadora | Título: MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE
CANA-DE-AÇÚCAR VISANDO RESISTÊNCIA À BROCA (Diatraea saccharalis)
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“Dedico,
Aos meus pais, Sandra e Paulo
pela dedicação, amor incondicional, confiança e pelo exemplo de força de vontade,
As minhas irmãs, Lívia e Maria Clara
amores que completam a minha vida,
A Alexandre,
pelo carinho e compreensão nos momentos difíceis”.
Ana Paula
“Dedico,
Aos meus pais, Vergínia e Rogério,
base de toda a educação recebida, exemplo de humildade, honestidade e
responsabilidade.
À minha família,
minha esposa Rita e meu filho Eduardo, fonte de inspiração para tudo de bom que
desejo realizar.
João Paulo
“Dedico,
Aos meus pais, Nandir e Maria Rosa
pelo amor e exemplo de vida
A minha irmã, Carolina
que faz minha vida mais feliz
A Felipe,
por estar sempre ao meu lado.”
Mariana
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AGRADECIMENTOS
A Deus, pela força e saúde para enfrentar os obstáculos do dia-a-dia.
A nossa família, por nos proporcionarem a possibilidade de realizar um sonho e nos
apoiarem nos momentos mais difíceis.
Aos amigos, por nos apoiarem nos momentos de dificuldade, pela ótima convivência
durante este período.
A Profa. Dra. Márcia Nalesso Costa Harder, pela orientação e aprendizado durante os 3
anos de faculdade.
A Profa. Dra. Daniela Defavari do Nascimento, pelas aulas de Biotecnologia e toda a
atenção na correção deste trabalho.
A Profa. Dra. Filomena Maria Formaggio, pela paciência durante orientação para que este
trabalho pudesse acontecer.
Ao Centro de Tecnologia Canavieira - CTC em especial à Equipe de Biotecnologia, por
todo o aprendizado neste período de estágio.
A Dra. Sabrina Moutinho Chabregas, pela dedicação incondicional como orientadora, um
exemplo.
A Dra. Maria Cristina Falco, pelas sugestões, conselhos, confiança e intensa orientação
durante o estágio.
A Dra. Danila Montewka Melotto Passarin, por todo o apoio e enriquecimento do trabalho
de graduação com seu vasto conhecimento e sua tese de doutorado.
A Dra. Juliana de Maria Félix, pela amizade e grande auxílio no aprendizado.
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A Dra. Karine Miranda Oliveira, pelo convívio e amizade.
A Daniela Truffi Veiga, pela paciência nas explicações, amizade e companheirismo.
A Daiane Aline da Silva, pelo carinho e amizade, durante a vida acadêmica e profissional.
A Márcia Patrícia Moreno, pelo carinho, amizade e conselhos, desde o primeiro ano da
faculdade.
A Priscila Alvernaz Miranda, pelos gráficos.
Ao Dr. Luiz Carlos de Almeida, pela riqueza das imagens e materiais.
Agradecemos a todos aqueles que de maneira direta ou indireta contribuíram para a
realização deste trabalho.
A todos nossos sinceros agradecimentos.
7
“Para cultivar a sabedoria, é preciso força
interior. Sem crescimento interno, é difícil
conquistar a autoconfiança e a coragem
necessária. Sem elas, nossa vida se complica.
O impossível torna-se possível com a força de
vontade”.
Dalai Lama
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MÉTODOS DE TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE CANA-DE-AÇÚCAR
VISANDO RESISTÊNCIA À BROCA (Diatraea saccharalis)
RESUMO
A proposta do presente trabalho é realizar e disponibilizar uma revisão de literatura
que venha a contribuir positivamente para o desenvolvimento do setor canavieiro,
abordando técnicas e processos envolvidos na obtenção de cana-de-açúcar transgênica. O
Brasil é o líder na produção e exportação de derivados de cana-de-açúcar, bem como na
utilização desta cultura como fonte de energia renovável. O melhoramento genético da
planta aparece como base fundamental para o desenvolvimento de novas variedades para a
manutenção e incremento dos agronegócios da agroindústria sucroalcooleira. Técnicas de
engenharia genética, como a transformação genética, estão trazendo excelentes resultados
no melhoramento genético da cultura permitindo diminuir o custo e o tempo de obtenção
de novas variedades. A busca por melhor qualidade de vida faz com que as pessoas
procurem novas tecnologias que auxiliem no combate ao que será prejudicial ao
desenvolvimento humano. A broca Diatraea saccharalis é a principal causa de danos à
cultura da cana-de-açúcar, além de provocar doenças na planta. O desenvolvimento de
tecnologias para a cultura permitirá a expressão de outros genes de interesse como
resistência a herbicidas, a insetos e a doenças, além de possibilitar um aumento do teor da
sacarose e à tolerância ao estresse hídrico. Sendo assim as plantas transgênicas
representam uma nova alternativa aos insetos-praga das lavouras. A bactéria
entomopatogênica Bacillus thuringiensis (Bt) é a fonte dos genes de resistência nas
chamadas plantas-Bt. No presente trabalho de revisão, são abordados os aspectos
relacionados à bactéria Bt como fonte de genes de resistência a insetos-pragas, plantas
geneticamente modificadas, métodos de transformação, dentre os quais se destacam as
transformações via Agrobacterium tumefaciens e Biobalística, comparando-as quanto à
respectiva eficiência, vantagens do uso de plantas-Bt, bem como perspectivas dessas
ferramentas biotecnológicas.
PALAVRAS
CHAVE:
Cana-de-açúcar;
transformação
Agrobaterium tumefaciens; Bacillus thuringiensis.
genética;
biobalística;
9
METHODS FOR GENETIC TRANSFORMATION OF SUGARCANE FOCUSING
SUGARCANE BORER RESISTANCE (Diatraea saccharalis)
ABSTRACT
The purpose of this study is to perform and provide a literature review that will
contribute positively to the development of the sugarcane industry, with techniques and
processes involved in getting genetically modified sugarcane. Brazil is the leader in the
production and export of sugarcane products, as well as the use of the crop as a source of
renewable energy. Plant breeding appears as a fundamental basis for developing new
varieties for the maintenance and expansion of sugarcane agribusiness. Genetic
engineering techniques such as genetic transformation, are bringing excellent results in
plant performance improvement allowing to reduce the cost and time to obtain new
varieties. The search for better quality of life causes people to seek new technologies that
help to combat that will be detrimental to human development. The sugarcane borer
Diatraea saccharalis is the main cause of damage to the crop, because it causes diseases in
plants. The development of technologies for the crop will allow the expression of other
genes of interest such as herbicide tolerance, insect and disease resistance, and providing
increased sucrose content. Thus the transgenic plants represent a new alternative to insect
pests of crops. The entomopathogenic bacterium Bacillus thuringiensis (Bt) is the source
of resistance genes in so-called Bt-plants. In this review, we focus on the aspects related to
Bt as a source of genes for resistance to insect pests, genetically modified plants,
processing methods, among which are the transformation by Agrobacterium tumefaciens
and biolistic, comparing them as to their efficiency advantages of using Bt-plants and
prospects of these biotechnological tools.
KEY-WORLDS: sugarcane; genetic transformation; biolistic; Agrobaterium tumefaciens;
Bacillus thuringiensis.
10
LISTA DE ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES
µm – Micrometro
Bt –Bacillus thuringiensis
CANASAT – Mapeamento da cana via imagens de satélite de observação da Terra
Copersucar – Cooperativa de Produtores de Cana-de-Açúcar, Açúcar e Álcool do Estado
de São Paulo.
CTC – Centro de Tecnologia Canavieira
CTNBio – Comissão Técnica Nacional de Biossegurança
DNA – Ácido desoxirribonucléico
dATP, dGTP, dTTP, dCTP – Desoxirribonucleotídeos Fosfatados (DNTP’s)
ELISA – Enzyme Linked ImmunonoSorbent Assay
FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo
I.I. – Intensidade de Infestação
INPE – Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais
OGM – Organismo Geneticamente Modificado
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction)
pH – Potencial Hidrogeniônico
t-DNA – DNA de transferência
UNICA – União da Indústria de Cana-de-açúcar
UV – radiação ultravioleta
11
LISTA DE FIGURAS
PÁGINA
Figura 1 Formas Biológicas da broca da cana de açúcar (Diatraea
saccharalis).
Figura 2 Ciclo
Biológico
23
da
broca
da
cana-de-açúcar
(Diatraea
saccharalis).
23
Figura 3 Controle biológico da broca da cana de açúcar (Diatraea
saccharalis).
24
Figura 4 Cristal de cepas de Bacillus thuringiensis. (A) Forma bipiramidal
da cepa 344; (B) forma cubóide da cepa 1644.
25
Figura 5 Clonagem do Gene de Interesse.
29
Figura 6 Desenho esquemático do equipamento de biobalística.
32
Figura 7 Equipamento de biobalística utilizado no processo de introdução
de genes.
32
Figura 8 Sequência para obtenção de calos embriogênicos in vitro. A:
Ponteiros de cana vindos do campo. B: Segmento da parte apical
(10cm) que contém o meristema apical caulinar protegido por
folhas jovens enroladas (Palmito). C: Esterilização superficial
com etanol absoluto, e posteriormente com solução de hipoclorito
de sódio 30% sob agitação. D: Cortes transversais de
aproximadamente 2mm de espessura. E: Disco foliar em meio
MS3AC para indução de calos no escuro. F: Calos embriogênicos
em meio MS3AC que são selecionados e transferidos para meio
fresco em cada subcultivo. G e H: Regeneração de plântulas em
meio MSAC (fotoperíodo 16 horas).
Figura 9 Doença causada por A. tumefaciens, galha da coroa
33
36
12
Figura 10 Esquema representativo do método de transformação genética da
cana-de-açúcar por A. tumefaciens. A: Cultura de A. tumefaciens
linhagem EHA105, com o vetor binário pNW166, para incubação
dos calos embriogênicos. B: Seleção de células transformadas em
meio seletivo com antibiótico. C: Observação de brotos em lupa.
D: Enraizamento de plântulas em meio seletivo. E: Plantas
regeneradas sob aclimatação em substrato.
36
Figura 11 Exemplo de reação de PCR mostrando a amplificação do
fragmento correspondente ao gene Bt (indicado pela seta)
introduzido em plantas de cana de açúcar.
39
Figura 12 Análise ELISA de plantas transgênicas da variedade SP80-1842
expressando a proteína Bt CryIA(b) em folhas e colmos.
41
Figura 13 Análise de Southern blot em plantas de cana de açúcar
transgênicas
das
variedades
SP80-1842
e
SP80-3280
transformadas com o gene Cry1A(b)
43
Figura 14 Exemplo de Bioensaio realizado com folhas de plantas de canade-açúcar transgênicas expressando o gene Bt CryI(A)b (à direita)
e plantas da mesma variedade (SP80-1842) não transformadas (à
esquerda)
44
Figura 15 Exemplo de inoculação da broca da cana (Diatraea saccharalis)
em plantas adultas de cana-de-açúcar transgênicas expressando o
gene Bt CryI(A)b (B) e plantas da mesma variedade (SP80-1842)
não transformadas (A).
45
Figura 16 Pedidos de liberação planejada de cana-de-açúcar transgênica em
todo o mundo – Finalidade dos OGM
47
Figura 17 Pedidos de Liberação Planejada de cana-de-açúcar transgênica em
todo o mundo – Solicitante X Ano
48
Figura 18 Área plantada, em milhões de hectares, com lavouras transgênicas
no Brasil
49
13
SUMÁRIO
PÁGINA
RESUMO
ABSTRACT
viii
x
LISTA DE ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES
xii
LISTA DE FIGURAS
xiii
INTRODUÇÃO
15
2. REVISÃO DE LITERATURA
18
2.1 A cana-de-açúcar atualmente
19
2.2 Novas unidades produtoras
20
2.3 Produção de açúcar e etanol
21
2.4 Broca da cana-de-açúcar
21
2.5 Bacillus thuringiensis
24
2.6 Preservação de inimigos naturais
26
2.7 Vantagens da cana-de-açúcar resistente à Diatraea saccharalis
26
3. OBTENÇÃO DE CANA-DE-AÇÚCAR GENETICAMENTE
MODIFICADA
27
3.1 Clonagem do gene interesse
28
3.2 Transformação genética
29
3.2.1 Biobalística
30
3.2.2 Agrobacterium tumefaciens
34
3.3 Caracterização Molecular
37
3.3.1 PCR – Reação da Polimerase em Cadeia
37
3.3.2 Eletroforese
38
3.3.3 Elisa – Expressão da Proteína
39
3.3.4 SOUTHERN BLOT-Análise de número de cópias
41
3.4 Bioensaio
43
3.5 Análises de Campo
44
3.6 Análises de Biossegurança
46
4. A PRODUÇÃO DE TRANSGÊNICOS
47
4.1 No Mundo
47
4.2 No Brasil
48
14
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
50
6. REFERÊNCIAS
51
15
INTRODUÇÃO
A área ocupada pela cana-de-açúcar no país e destinada ao setor sucroalcooleiro
alcança 8,1 milhões de hectares na safra 2010/11, o que representa 9,2% a mais do que na
safra anterior. O Estado de São Paulo tem a maior parte, com 4,4 milhões de hectares;
seguido por Minas Gerais, 648 mil de hectares; Paraná, 608 mil hectares; Goiás, 601 mil
hectares; e Alagoas, 464 mil hectares. O total representa apenas 0,95% do território
nacional (CANAL RURAL, 2011).
Segundo Carrer et al., (2010) o estabelecimento de uma agricultura sustentável, que
preserve o meio ambiente e proporcione segurança alimentar futura, é um fator primordial
para o desenvolvimento da humanidade ante as mudanças climáticas e o declínio das
reservas energéticas não renováveis. Diante das previsões de crescimento populacional
mundial, atingindo nove bilhões de habitantes em 2050, existe o desafio de criar métodos
avançados e eficientes para aumentar a produção de alimentos e energia renovável sem,
contudo, esgotar os recursos naturais. Em 2050, o mundo provavelmente estará vivendo
sob a influência de três grandes crises anunciadas: a diminuição das reservas de petróleo, a
escassez de água potável e a falta de alimentos para grande parte da população. Nesse
cenário, a biotecnologia de plantas ocupa papel central na busca de soluções para atenuar
os problemas, atuais e futuros, causados pelo estilo de vida adotado pelo homem.
Os insetos têm sido uma das maiores causas de danos na produção de alimentos
sendo estas perdas da ordem de 20 a 30% da produção mundial. Estima-se que cerca de
67.000 espécies de insetos causem danos às plantações sendo as regiões tropicais,
normalmente as mais pobres do mundo, as que mais sofrem com a alta incidência de
insetos-praga. Os métodos convencionais de proteção das culturas estão baseados no uso
de agroquímicos. Entretanto, mesmo com uma movimentação comercial de inseticidas em
torno de U$ 8,11 bilhões em 1997 as perdas de produção continuam altas. A busca por
métodos alternativos de controle de insetos-praga tem sido realizada com afinco por vários
laboratórios ao redor do mundo, devido à necessidade de uma agricultura mais sustentável
e desenvolvida com uma maior preocupação com a preservação do meio ambiente
(MELOTTO-PASSARIN, 2009).
Num primeiro momento, a biotecnologia esteve centrada na questão da saúde
humana e animal, em que se utilizou de microorganismos para a fabricação de antibióticos.
Relatos de culturas de células in vitro são datados da segunda Guerra Mundial, quando
cultura de Penicillum notarum era usada para a produção do antibiótico penicilina cuja
16
ação como antibiótico foi descoberta por Alexander Fleming em 1929. Mas foi na década
de 1970 que ocorreu o início das metodologias de uso do DNA recombinante e do
sequenciamento do DNA que proporcionaram grandes avanços na ciência de plantas. A
biotecnologia se insere como propulsora para o aumento da produtividade, da qualidade da
produção e para o desenvolvimento de plantas adaptadas a diversas condições ambientais
de espécies com potencial energético. Em adição, a biotecnologia atua no desenvolvimento
de outras fontes de bioenergia como a produção de biocombustíveis a partir de algas
transformadas geneticamente (CARRER et al., 2010).
Para melhorar a eficiência do uso da água na agricultura, a biotecnologia atua em
duas frentes: no desenvolvimento de espécies tolerantes a seca, diminuindo a irrigação
intensiva e conservando a água no solo, e no melhoramento genético de variedades para a
resistência a pragas e doenças, reduzindo a necessidade da utilização de produtos químicos
nas lavouras (CARRER et al., 2010).
Nesta mesma perspectiva percebe-se o quanto é importante que ocorram mudanças
no que está relacionado à cultura, principalmente no que diz respeito ao controle de pragas.
Dentre as pragas da cultura, a Diatraea saccharalis popularmente conhecida como broca
da cana-de-açúcar, vem assumindo grande importância por ser uma praga de ciclo longo,
que pode causar prejuízos diretos e indiretos e até mesmo a morte da planta.
Atualmente existem inúmeras pesquisas relacionadas às pragas da cana-de-açúcar.
O interesse crescente em utilizar tecnologias com menor impacto ambiental e devido as
suas propriedades entomopatogênicas, fez da bactéria Bacillus thuringiensis um agente
promissor para controle de populações de insetos que causam danos em lavouras, e tem
impulsionado várias pesquisas com o objetivo de selecionar isolados com atividade tóxica
para diferentes espécies de insetos (CÍCERO, 2007).
A produção de transgênicos está difundida em praticamente todas as regiões
agrícolas do planeta, e a adoção da biotecnologia pelos produtores atinge níveis nunca
alcançados por outras tecnologias avançadas, em toda história da agricultura. Em 2009,
culturas modificadas geneticamente foram plantadas por mais de 14 milhões de
agricultores, em 134 milhões de hectares, distribuídos em 25 países. O Brasil ocupa o
segundo lugar entre os países com maior área cultivada com transgênicos no mundo, cerca
de 21,4 milhões de hectares, atrás apenas dos Estados Unidos com 62,5 milhões de
hectares. A razão desse indiscutível sucesso são os benefícios obtidos com a produção de
17
plantas transgênicas resistentes a doenças e insetos, a redução no uso de defensivos e o
aumento da produção (JAMES, 2010).
Neste contexto, com base nos dados acima apresentados, é ressaltado que a
proposta do presente trabalho foi realizar e disponibilizar uma revisão de literatura que
venha a contribuir positivamente para o desenvolvimento do setor canavieiro, abordando
técnicas e processos envolvidos na obtenção de cana-de-açúcar transgênica.
18
2. REVISÃO DE LITERATURA
A cana-de-açúcar pertence ao gênero Saccharum L. Há pelo menos seis espécies do
gênero, sendo que a cana-de-açúcar cultivada é um híbrido multiespecífico, recebendo a
designação Saccharum spp. As espécies de cana-de-açúcar são provenientes do Sudeste
Asiático. A planta é a principal matéria prima para a fabricação do açúcar e álcool
(WAACK et al., 1998).
A cana-de-açúcar sempre apresentou importância significativa ao longo de toda a
História. Na Europa, a raridade e o preço do açúcar faziam dele privilégio de grandes
senhores, produto da farmacopéia ou instrumento de práticas de magia. O comércio na
Europa do açúcar do Oriente proporcionou a formação de grandes fortunas e poderes
nacionais, como por exemplo, Gênova e Veneza, e foi um dos fatores responsáveis pelas
grandes navegações (COPERSUCAR, 1989).
Quando o Brasil foi descoberto, o açúcar era mercadoria bastante escassa na
Europa. Embora em pequena escala, o cultivo da cana já era conhecido pelos portugueses,
que o praticavam em suas ilhas de Madeira e Cabo Verde. Com a descoberta, a cana foi
trazida para as novas terras, enquanto o mesmo era feito pelos holandeses nas Antilhas.
Admite-se que as primeiras mudas de cana de açúcar tenham chegado ao Brasil com a
expedição de Martim Afonso de Souza, em 1532, onde, em Pernambuco, alcançou especial
êxito como cultura comercial. As condições propiciadas pelo clima quente e solo fértil
favoreceram e marcaram o início de uma atividade altamente rentável para Portugal. O
açúcar, até então artigo de luxo, transformou-se em uma das mais importantes fontes de
energia e em alimento humano. Durante quase dois séculos após o descobrimento, a
economia colonial assentou-se praticamente na agroindústria canavieira. Até essa época, o
Brasil era o maior produtor e exportador de açúcar do mundo. Daí em diante, apesar das
numerosas crises, a cana continuou sendo o principal produto comercial de sua agricultura,
condição que só veio a perder em fins do século passado, quando definitivamente se
firmou o ciclo do café (SZMRECSANYI, 1978).
Segundo Marin (2007), a cultura da cana-de-açúcar se adapta muito bem às regiões
de clima tropical, quente e úmido, cuja temperatura predominante está entre 19 e 32º C e
onde as chuvas estão bem distribuídas, com precipitação acumulada acima de 1000
milímetros por ano, seu desenvolvimento ocorre em duas fases:
- crescimento vegetativo: fase em que a planta é favorecida pelo clima úmido e
quente;
19
- maturação: quando temperaturas mais amenas e a baixa disponibilidade de água
favorecem o acúmulo de sacarose.
Pertence a vasta família das gramíneas a qual inclui mais de 5000 espécies,
representada pelo milho, sorgo, arroz e muitas outras. A planta de cana, da família
Poaceae, está constituída por quatro partes principais, que são: raízes, colmo, aéreo e
fibroso; atinge de 2 a 5 metros de altura, de cor variada, dividido em nós e entrenós mais
ou menos largo, dependendo da variedade, composta também por folhas e flores. As
principais características dessa família são a forma da inflorescência (espiga), o
crescimento do caule em colmos, e as folhas com lâminas de sílica em suas bordas e
bainha aberta (WAACK et al., 1998).
2.1 A cana-de-açúcar atualmente
De acordo com a União da Indústria de Cana-de-Açúcar – ÚNICA (2011), em
conjunto com o CTC - Centro de Tecnologia Canavieira, demais sindicatos e associações
de produtores de etanol e açúcar da região Centro-Sul, a projeção estimada para a safra de
2011/2012 aponta para uma moagem de 568,50 milhões de toneladas, crescimento de
2,11% em relação ao total processado na última safra, que foi de 556,74 milhões de
toneladas.
Os dados levantados pela UNICA (2011), bem como o mapeamento com imagens
de satélite da região Centro-Sul feitas pelo Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais
(CANASAT – INPE), indicam uma pequena expansão na área de cana-de-açúcar
disponível para colheita. Este incremento de área para moagem deve ocorrer
principalmente nas unidades novas e em usinas que iniciaram suas atividades nos últimos
anos, com destaque para aquelas localizadas nos Estados do Mato Grosso, Mato Grosso do
Sul, Goiás e Minas Gerais.
Esse crescimento de área para colheita não deve se traduzir em aumento
significativo da quantidade de cana a ser processada, devido à menor produtividade
agrícola do canavial (mensurada em toneladas de cana por hectare), especialmente nas
unidades tradicionais. Na safra (2010/2011), a quebra agrícola, decorrente do longo
período de estiagem observado em toda a região produtora de cana-de-açúcar, foi
especialmente severa. Para a safra de 2011/2012, esse fenômeno não deverá ocorrer e a
expectativa é de que a produtividade por estágio de corte fique próxima de valores
históricos, superiores aos observados na safra anterior (UNICA, 2011).
20
Apesar dessa recuperação da produtividade agrícola por estágio de corte, espera-se
que a produtividade média da área total de cana-de-açúcar na safra 2011/2012 diminua
relativamente à observada no último ano, devido aos seguintes fatores:
• Envelhecimento do canavial – o canavial disponível para colheita nas áreas
tradicionais está mais velho em função dos baixos índices de renovação observados nos
últimos anos – a idade média do canavial foi de 3,7 anos na safra 2010/2011, contra 4 anos
previstos para a nova safra;
• Redução no volume de cana bisada – a cana bisada (aquela que permanece no
campo por mais de uma safra e, por isso, geralmente apresenta uma produtividade agrícola
maior), representou 14% da área colhida nas unidades tradicionais no último ano. Para este
ano, tal área deverá ser mínima, respondendo por menos de 3% da área total;
• Menor produtividade no início de safra – a produtividade do canavial colhido no
início de cada safra é fortemente dependente do clima observado no ano anterior. Portanto,
a expectativa é de queda na produtividade da cana neste início de safra em razão das
condições climáticas desfavoráveis para o desenvolvimento da planta registradas de abril a
agosto de 2010.
O desequilíbrio do perfil do canavial está mais acentuado nesta safra: “Uma lavoura
estabilizada é composta por 60% de cana nova e mais produtiva e por 40% de cana
envelhecida, acima de quatro cortes. Para a safra 2011/2012, esse cenário está invertido e o
impacto negativo desse envelhecimento do canavial sobre a produtividade da lavoura é
expressivo. O setor precisará investir fortemente na renovação do canavial ao longo deste
ano, para garantir o crescimento da oferta a partir da safra 2012/2013” (UNICA, 2011).
2.2 Novas unidades produtoras
Na avaliação da UNICA (2011), apenas cinco novas unidades iniciarão suas
atividades na safra 2011/2012. É um número significativamente inferior ao observado nos
últimos anos, reflexo da desaceleração no crescimento do setor sucroenergético após a
crise global de crédito em 2008 e 2009. Foram 25 novas usinas na safra 2007/2008, 30 em
2008/2009, 19 em 2009/2010 e 10 unidades produtoras na última safra. As novas unidades
esperadas para 2010/2011 estão localizadas nos Estados do Mato Grosso do Sul (3), Goiás
(1) e São Paulo (1).
21
2.3 Produção de açúcar e de etanol
Do total de cana-de-açúcar projetado para a safra 2011/2012, a UNICA (2011)
estima que 45,34% serão destinados à produção de açúcar, leve acréscimo em relação aos
44,71% observados no último ano. Assim, a exemplo dos anos anteriores, a maior parte da
cana colhida nesta safra (54,66%) continuará sendo utilizada para a produção de etanol.
A produção de açúcar projetada é de 34,58 milhões de toneladas, crescimento de
3,25% em relação as 33,49 milhões de toneladas produzidas na safra 2010/2011. Para
atingir essa produção projetada, as unidades aptas à produção de açúcar deverão operar
próximo da capacidade máxima instalada, na medida em que a moagem de cana por essas
unidades deverá ser praticamente a mesma do último ano. O incremento de moagem
previsto para a nova safra decorre do aumento do volume de cana processada pelas
unidades que só produzem etanol. A produção de etanol, por sua vez, deverá atingir 25,51
bilhões de litros, aumento de 0,52% em relação à produção da última safra, que totalizou
25,37 bilhões de litros (UNICA, 2011).
Dos 25,51 bilhões de litros de etanol que deverão ser produzidos, 17,21 bilhões
serão de etanol hidratado e 8,30 bilhões de etanol anidro. Esse volume de etanol anidro é
suficiente para atender à mistura de 25% do produto na gasolina, mesmo considerando uma
menor parcela da frota flex utilizando etanol hidratado em função da consequente migração
para o consumo de gasolina (UNICA, 2011).
2.4 A Broca da cana-de-açúcar
Uma das principais pragas que atacam a cultura da cana-de-açúcar é a broca da
cana (Diatraea saccharalis), um inseto que penetra no interior da planta e cava galerias
internas, causando grandes prejuízos aos produtores. Seu ciclo no canavial (Figura 1)
começa com as mariposas, que colocam pequenos ovos na parte de baixo das folhas.
Quando os ovos eclodem saem minúsculas larvas, de cerca de 1 a 2 milímetros, que
caminham em direção à região próxima ao colmo (caule) da planta, onde penetram e se
alimentam da polpa carnuda e doce. Dentro da cana, as larvas vão mudando de fase (Figura
2), até atingir cerca de 3 a 4 centímetros, quando saem da planta, transformam-se
novamente em mariposas e dão início a um novo ciclo de vida do inseto. As galerias feitas
por esses insetos mastigadores ocupam praticamente todo o interior da planta, provocando
diminuição da massa vegetal e falhas na germinação, entre outros danos (FAPESP, 2006).
22
Os furos abertos pelas brocas também são porta de entrada para fungos que causam
a podridão vermelha, doença responsável pela diminuição na produção de sacarose.
Quando a matéria-prima se destina à produção de álcool, o problema é ainda mais grave,
pois os microorganismos invasores contaminam o caldo e concorrem com as leveduras na
fermentação. (FAPESP, 2006).
A broca pertence à ordem dos Lepidópteros. Os Lepidópteros são insetos
holometabólicos, ovíparos. Dos ovos saem larvas chamadas lagartas, as quais, depois de
uma série de transformações, cada uma se evidenciando após uma ecdise, atingem o
completo desenvolvimento, realizando-se, então, a primeira metamorfose, da qual resulta a
pupa, bem conhecida pela designação especial crisálida. Desta surge, tempos depois, após
uma segunda metamorfose, o inseto adulto ou imago, borboleta ou mariposa (LIMA,
1945).
Com relação aos prejuízos econômicos, os levantamentos de danos são realizados
por ocasião da colheita da cana, coletando-se 20 canas/ha, no mínimo, rachando-se
longitudinalmente os colmos e efetuando-se a contagem dos entrenós totais e dos entrenós
danificados pela broca. A Intensidade de Infestação (I.I.) é a porcentagem dos entrenós
brocados em relação ao total examinado. A Infestação é a porcentagem de canas brocadas
em relação ao número de canas examinadas. Experimentos conduzidos em telados e
campo indicam que para cada 1% de I.I. ocorrem perdas médias de 0,77% na produção de
cana, acrescidas de 0,25% na produção de açúcar e 0,20% na produção de álcool.
(ALMEIDA, STINGEL e ARRIGONI, 2005).
Para combater a broca da cana as grandes usinas sucroalcooleiras produzem em
seus laboratórios pequenas vespas (Cotesia flavipes), liberadas no campo para parasitar as
lagartas (Figura 3). Os pequenos produtores não têm como fazer o controle biológico
porque não há produção suficiente de vespas em escala comercial, sem contar que elas têm
de ser liberadas na plantação nas condições ideais de temperatura e quantidade para surtir
efeito. E a partir do momento em que a broca penetra na cana as perdas são inevitáveis,
porque nessa fase não dá mais para recorrer ao controle biológico nem ao químico, devido
ao alto custo dos inseticidas e à baixa eficiência dos produtos, incapazes de atingir as
lagartas no interior da planta (LIMA, 1945).
23
Figura 1. Formas Biológicas da Broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis). Fonte:
ALMEIDA et al., 1974
Figura 2. Ciclo Biológico da Broca da cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis). Fonte:
ALMEIDA et al., 1974
24
Figura 3. Vespa Cotesia flavipes parasitando larva da Broca-da-Cana (Diatraea
saccharalis). Fonte: CORRÊA, 2008
2.5 Bacillus thuringiensis
O Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram positiva, que pode ser
caracterizada pela sua habilidade de formar cristais protéicos durante a fase estacionária
e/ou de esporulação. O Bt ocorre naturalmente em diversos habitats incluindo solo,
filoplano, resíduos de grãos, poeira, água, matéria vegetal e insetos. O cristal protéico
também chamado de delta-endotoxinas, possui propriedades inseticidas específicas. Este
cristal protéico é responsável por 20-30% da proteína total da célula e pode ter várias
formas, tais como: bipiramidal, esféricos, retangulares, cubóides e irregulares (Figura 4).
Os cristais bipiramidais apresentam uma maior freqüência de toxicidade do que os outros
tipos e a maioria dos isolados que possuem alguma atividade contra os lepidópteros
possuem este tipo de cristal (CARNEIRO et al., 2009).
Segundo Pinto et al. (2010), B. thuringiensis apresenta um genoma com 2,4 a 5,7
milhões de pares de bases, e a maioria dos isolados apresentam elementos extra
cromossômicos lineares ou circulares. Os genes cry, responsáveis pela síntese de diferentes
proteínas inseticidas, estão localizados em plasmídios e muitos isolados de B. thuringiensis
possuem diversos genes cry (LERECLUS et al., 1993). Durante seu desenvolvimento, B.
25
thuringiensis passa por duas fases, a fase vegetativa e a estacionária, semelhantes ao
desenvolvimento de Bacillus subtilis.
O mecanismo de ação das proteínas Cry de Bt envolvem a solubilização do cristal
no intestino médio do inseto, a ação de proteases sobre a protoxina, a aderência da toxina
Cry aos receptores do intestino médio e a sua inserção dentro da membrana apical criando
canais de íons ou poros. A degradação dos cristais protéicos por enzimas proteolíticas
libera proteínas tóxicas menores, chamadas de delta-endotoxinas. As atividades das deltaendotoxinas estão restritas ao trato digestivo dos insetos. Após a solubilização, muitas
protoxinas devem ser processadas por proteases presentes no intestino médio do inseto para
se tornarem toxinas ativas. As proteínas Cry ativadas funcionam junto a receptores e canais
iônicos do intestino (CARNEIRO et al., 2009).
Figura 4. Cristal de cepas de Bacillus thuringiensis. (A) Forma bipiramidal da cepa 344;
(B) forma cubóide da cepa 1644. Fonte: CARNEIRO et al. (2009).
Mesmo sendo estudados e utilizados como biopesticidas há mais de meio século e
com claras indicações de serem menos impactantes ao meio ambiente do que os
agroquímicos e não prejudiciais ao ser humano, os produtos a base de Bacillus
thuringiensis (Bt) nunca ocuparam um lugar de destaque no mercado de vendas de
inseticidas, principalmente por problemas relacionados à perda de estabilidade, à ausência
de translocação nas plantas, ao espectro limitado de ação e à degradação rápida pela ação
da luz ultravioleta (BOBROWSKI, 2003).
Com a clonagem e a caracterização de um gene de Bt codificador de uma proteína
responsável pela atividade tóxica em insetos, novas perspectivas do uso desta bactéria e de
26
suas proteínas inseticidas foram vislumbradas. Entre elas, está a possibilidade de se
introduzir os genes de Bt codificadores das toxinas nos genomas dos vegetais, permitindo a
expressão contínua das proteínas em todos os tecidos da planta e atingindo, assim, apenas
os insetos-praga que se alimentam dos tecidos. A primeira geração de plantas transgênicas
resistentes a insetos foi desenvolvida exatamente com o uso de genes codificadores de
proteínas inseticidas do entomopatógeno Bt (BOBROWSKI, 2003).
2.6 Preservação de inimigos naturais
O efeito das toxinas de Bt sobre inimigos naturais dos insetos-praga como
parasitóides ou predadores foi estudado em laboratório e a campo, indicando pouco ou
nenhum efeito sobre estes organismos. Os inimigos naturais são extremamente
importantes, pois pragas secundárias podem tornar-se um problema, caso a população de
insetos benéficos for reduzida pelo uso de inseticidas químicos de amplo espectro. Na
China, o uso de algodão-Bt determinou a redução do uso de inseticidas químicos,
resultando em um aumento de 24% na população de inimigos naturais dos insetos-praga,
quando comparado com campos de plantas de algodão não modificadas geneticamente e
submetidas ao controle químico convencional (MELOTTO-PASSARIN, 2009).
2.7 Vantagens da cana-de-açúcar resistente à Diatraea saccharalis
Os inseticidas biológicos, utilizados há mais de 50 anos no Brasil, são uma
alternativa para o controle mais seletivo de insetos nocivos. Esta prática inclui,
principalmente, o emprego de microrganismos. Mais recentemente, plantas transgênicas
resistentes a insetos, desenvolvidas pela integração, nos seus genomas, dos genes de
resistência provenientes desses microrganismos, como, os genes Bt codificadores da
proteína Cry, responsável pela atividade tóxica no intestino dos insetos, constituem-se em
mais uma alternativa com grande potencial de proteção contra as perdas causadas por
insetos-praga (MELOTTO-PASSARIN, 2009).
Como descrito, as culturas transgênicas podem ser munidas de genes que lhes
confiram resistência as suas pragas naturais, produzindo toxinas que matam essas pragas.
Com isto, é desnecessário o uso de químicos como os pesticidas na agricultura, uma vez
que a própria planta se “protege sozinha”, contribuindo assim para reduzir a poluição
ambiental.
Além disso, devido à diminuição da necessidade de aplicação de inseticidas, é
observada grande economia de água e combustíveis fósseis.
27
No caso da cana-de-açúcar resistente à broca, descrita no presente trabalho, como
prática de manejo integrado de pragas, é interessante que ainda seja usado conjuntamente o
controle biológico pela Cotesia flavipes, a fim de evitar ou retardar o aparecimento de
organismos resistentes ao gene utilizado e prolongar a vida útil da tecnologia desenvolvida.
A planta modificada com gene Bt apresenta diversas vantagens. Podemos citar os
riscos ambientais e eficiência de controle de pragas avaliados durante os 50 anos de
utilização no Brasil da bactéria entomopatogênica Bt como bioinseticida, pode-se
considerar que as plantas Bt oferecem segurança e controle efetivo de insetos. Em nível
mundial, os produtores agrícolas perdem bilhões de dólares com a redução da
produtividade ocasionada pelo ataque de insetos e pelo custo em defensivos agrícolas
necessários para minimizar os danos. Alguns inseticidas químicos, como os piretróides
sintéticos, têm sido amplamente utilizados no controle de insetos-pragas, porém estes têm
perdido a eficácia devido ao surgimento de insetos resistentes. Por outro lado, a
necessidade de diminuir os custos e minimizar os efeitos ambientais e os riscos à saúde dos
produtores têm tornado as plantas-Bt uma alternativa promissora para o controle de insetos
(BOBROWSKI, 2003).
3. OBTENÇÃO DE CANA-DE-AÇÚCAR GENETICAMENTE MODIFICADA
Para descrever como seriam as etapas para obtenção de cana-de-açúcar transgênica,
expressando gene Bt para controle da broca da cana, foi realizada pesquisa criteriosa
durante 18 meses o que havia sido publicado em revistas, tais como, Revista Biotecnologia
Ciência e Desenvolvimento, em teses, livros, papers, incluindo também o grande auxílio
recebido do Centro de Tecnologia Canavieira, onde um dos integrantes do grupo é
estagiário desde Março de 2010, o que possibilitou grande troca de informações.
Os procedimentos descritos abaixo são comumente realizados em ensaios para
produção e validação de plantas transgênicas e se tratam de uma revisão de literatura, os
quais são: clonagem do gene de interesse, transformação genética de cana-de-açúcar
através das técnicas de biobalística e Agrobacterium tumefaciens e transferência das
plantas para estufa, análises para detectar a presença do transgene (PCR), análises para
detectar a expressão da proteína transgênica (ELISA), Southern blot, análise do número de
cópias do transgene, bioensaio com inoculação da broca da cana-de-açúcar (Diatraea
saccharalis) em folhas das plantas transgênicas, análises de campo e análises de
biossegurança.
28
3.1 Clonagem do gene de interesse
O genoma de uma bactéria contém aproximadamente 5.000 genes, o de plantas tem
em torno de 40.000 a 60.000, enquanto que o genoma dos seres humanos consiste na faixa
de 100.000 genes. Independente do organismo e de sua complexidade, os genes são
segmentos de um mesmo tipo de molécula: o ácido desoxirribonucléico (DNA). Esta
propriedade é que permite que características de um organismo sejam potencialmente
funcionais em outro (GANDER et al., 1997).
Uma das possibilidades de isolamento dos genes é a construção de uma “biblioteca
genômica”. Para tal, o DNA do organismo contendo o gene de interesse é extraído. Em
seguida, este DNA é cortado em fragmentos menores utilizando as enzimas de restrição –
que são utilizadas como “tesouras” moleculares. Estes fragmentos são, então, ligados a
outros fragmentos de DNA (Figura 5). Este material é inserido na bactéria e replicado
várias vezes, tal procedimento é denominado clonagem gênica. A partir daí é só selecionar
a colônia de bactéria que contém o fragmento de DNA correspondente ao gene de
interesse. Desta maneira, uma quantidade impressionante de genes bacterianos de plantas,
animais e humanas já foi isolada e está á disposição da comunidade científica (GANDER
et al., 1997).
Em organismos cujo genoma foi sequenciado, a amplificação por PCR é
frequentemente a forma mais simples de obter uma região de DNA específica e de
interesse para clonagem. Nesta aplicação da PCR, os dois primers são desenhados para
hibridizar com sequências adjacentes à região genômica de interesse e incluir sequências
reconhecidas pelas enzimas de restrição. Após amplificação da sequência-alvo, o produto
de PCR é purificado com kits específicos, então, podem ser clonados, através de choque
térmico, em células de E. coli, por exemplo.
29
Figura 5. Clonagem do Gene de Interesse. Fonte: CTC - Centro de Tecnologia Canavieira,
2010
3.2 Transformação Genética
A transformação genética, transgenia, converge com as técnicas de engenharia
genética como solução biotecnológica para problemas que afetam a agricultura brasileira e
mundial, como pragas, doenças e estresses ambientais. Além disso, pode beneficiar os
setores de saúde, indústria e alimentação, contribuindo para agregar valor aos produtos
agropecuários, unindo o agronegócio aos setores farmacêutico e industrial. Essa tecnologia
é uma potente ferramenta de auxílio ao melhoramento genético tradicional, que transpõe as
barreiras do cruzamento entre diferentes espécies e acelera o processo de seleção de
plantas (CARRER et al., 2010).
A cana-de-açúcar apresenta características que a tornam uma excelente planta para
o melhoramento através da transformação genética, como a sua facilidade para regeneração
de plantas a partir de calos in vitro e, ao seu modo de multiplicação em escala comercial
por propagação vegetativa que possibilitaria a distribuição de transformantes estáveis aos
produtores através de mudas (MELOTTO-PASSARIN, 2009).
Existem várias técnicas de transformação genética, mas estas devem seguir alguns
critérios para que o sucesso dos experimentos seja alcançado (BRAGA, 2001). Pesquisas
relacionadas ao melhoramento genético têm levado a aumentos consideráveis na
produtividade de diversas espécies cultivadas através de várias abordagens metodológicas
para obtenção de maior ganho genético após a seleção (MELOTTO-PASSARIN, 2009).
30
A tecnologia do DNA recombinante possibilitou o isolamento de genes e a inserção
estável em um genoma hospedeiro. Está técnica, também chamada de transformação
genética, pode ser definida como a introdução controlada de ácidos nucléicos (DNA),
contendo as características de interesse, em um genoma receptor, excluindo-se a
introdução por fecundação. A inserção estável destas moléculas em um genoma hospedeiro
dá origem a um indivíduo igual ao receptor da molécula recombinante, porém acrescido de
uma característica nova e particular (MELOTTO-PASSARIN, 2009).
Foram abordados neste trabalho os dois métodos de transformação genética de
plantas, sendo classificados em duas categorias: transferência indireta e direta de genes. A
indireta é aquela que o DNA exógeno é inserido no genoma pela ação de um vetor
biológico, como exemplo a transformação via Agrobacterium tumefaciens, enquanto que a
direta é baseada em processos físico-bioquímicos, demonstrada através de Biobalística.
Para os itens a seguir, tivemos como referência a tese de doutorado de Danila
Montewka Melotto-Passarin, atualmente pesquisadora de biotecnologia no CTC, cujo
título é “Transformação genética de cana-de-açúcar por biolística e Agrobacterium
tumefaciens visando estudar o mecanismo de morte celular programada”, focando na
diferença entre os respectivos métodos de transformação.
3.2.1. Biobalística
Inicialmente proposto por Sanford, o processo de biobalística tem como objetivo
introduzir material genético no genoma nuclear de plantas superiores. A biobalística utiliza
microprojéteis em alta velocidade para introduzir ácidos nucléicos e outras moléculas em
células e tecidos in vitro. Esse processo também tem sido denominado de método de
bombardeamento com microprojéteis, gene gun (arma de genes), aceleração de partículas,
entre outros (BRASILEIRO et al., 1998).
Foram relatadas as primeiras canas transformadas através da técnica de
bombardeamento na Austrália. No Brasil, o CTC foi o pioneiro em transformação genética
de cana de açúcar, produzindo em 1994 uma variedade transformada tolerante ao herbicida
glufosinato de amônio (BRAGA, 2001).
O método consiste na aceleração de micropartículas que atravessam a parede
celular e a membrana plasmática, de forma não letal, carreando substâncias adsorvidas,
como DNA, RNA ou proteínas, para o interior da célula. São utilizados microprojéteis de
ouro ou tungstênio, com diâmetro em torno de 1 μm, nos quais são precipitadas as
31
moléculas de DNA. O tipo de aparelho (Figuras 6 e 7) usado para acelerar as
micropartículas envolvidas pelo DNA pode ter propulsão a ar, pólvora, gás hélio ou
eletricidade (FERREIRA et al., 2004).
Os sistemas que utilizam gás hélio são, atualmente, os mais utilizados. A onda de
choque é gerada pela rápida liberação de uma descarga de alta pressão de gás hélio (10001200 psi). A onda de choque gerada impulsiona o macrocarregador, no qual as
micropartículas cobertas com DNA (microprojéteis) foram previamente depositadas. Ao
atingir a tela de retenção, a membrana é retida e as micropartículas contendo o DNA
continuam em direção às células alvo, penetrando na parede celular e membrana
plasmática (LACORTE et al., 1999).
Diversos parâmetros físicos e biológicos devem ser levados em consideração para
se estabelecer um protocolo de transformação utilizando-se esse método (FERREIRA et
al., 2004) deve-se ter em mente uma série de processos pré-determinados para a adequação
da técnica. Tendo em vista isto, o primeiro passo consiste na escolha do tecido alvo que
receberá os transgenes; em seguida, deve-se escolher o gene-repórter o qual indicará que
tipo de inserção será obtido. Junto a este, temos um gene marcador seletivo e um meio
seletivo, para que sejam colocadas em evidência somente as células transformadas
(SACILOTO, 2003).
Segundo Saciloto (2003) a escolha do alvo é um dos fatores fundamentais neste
processo. Dentre todos os testes em cana, observaram que os calos embriogênicos (Figura
8) foram os melhores, apesar de possuírem uma alta probabilidade de variação somaclonal
quando comparados com os tecidos meristemáticos. Além disso, o uso dos calos
embriogênicos possui uma certa vantagem pois regeneram plantas com alta facilidade. O
uso de calo ainda confere a vantagem de alto manuseio no processo de seleção em meio de
cultura, além de se obter alta produção de material para o uso em bombardeamento num
pequeno espaço de tempo, resultando também na diminuição do aparecimento de
quimerismo, muito comum quando se utilizam alvos mais organizados.
As perspectivas de inúmeros trabalhos em transformação genética de cana-deaçúcar foram incrementadas com o Projeto Genoma da Cana, financiado pela FAPESP e
CTC. Este projeto identificou milhares de sequências expressas em cana-de-açúcar, que
serão utilizadas através de transformação para que possa estudar de maneira mais completa
a biologia da planta. Assim novas variedades poderão ser produzidas num espaço de tempo
inferior àquele necessário no melhoramento tradicional para seleção dos melhores clones, o
32
que representará milhões de dólares de economia por parte dos programas de
melhoramento de cana-de-açúcar (BRAGA, 2001).
As principais vantagens do bombardeamento estão relacionadas com a utilização de
vetores simples e de fácil manipulação, além da possibilidade da inserção de mais de um
gene de interesse nas células de maneira eficiente. Embora seja considerado um método de
transformação bastante eficiente para o milho, uma possível desvantagem é a ocorrência de
múltiplas cópias do transgene e de complexos padrões de integração suscetíveis ao
silenciamento da expressão gênica nas gerações futuras (PÔSSA et al., 2010).
Figura 6. Desenho esquemático do equipamento de biobalística. Fonte: ARAGÃO, et al.,
1998
Figura 7. Equipamento de biobalística utilizado no processo de introdução de genes. Fonte:
ARAGÃO, et al., 1998
33
Figura 8. Sequência para obtenção de calos embriogênicos in vitro. A: Ponteiros de cana
vindos do campo. B: Segmento da parte apical (10cm) que contém o meristema apical
caulinar protegido por folhas jovens enroladas (Palmito). C: Esterilização superficial com
etanol absoluto, e posteriormente com solução comercial de hipoclorito de sódio, sob
agitação. D: Cortes transversais de aproximadamente 2mm de espessura. E: Disco foliar
em meio MS3AC para indução de calos no escuro. F: Calos embriogênicos em meio
MS3AC que são selecionados e transferidos para meio fresco em cada subcultivo. G e H:
Regeneração de plântulas em meio MSAC (fotoperíodo 16 horas). Fonte: MelottoPassarin, 2009
34
Segundo Melotto-Passarin (2009) a transformação genética por biobalística se
mostrou um método relativamente simples, mas requer uma atenção especial em suspensão
de partículas utilizada no disparo, evitando a formação de aglomerado de partículas
(grumos) os quais podem levar a morte das células atingidas por eles no bombardeamento.
A biobalística é considerada o principal método para transformação de cana.
3.2.2. Agrobacterium tumefaciens
Conforme citado anteriormente, a produção de plantas transgênicas é realizada por
meio de diferentes métodos que podem ser agrupados em duas categorias: transformação
indireta e transformação direta. No método de transformação indireta, a transferência de
genes é intermediada por bactérias do gênero Agrobacterium, as quais são capazes de
infectar plantas naturalmente (CARRER et al., 2010).
A transformação por A. tumefaciens é uma metodologia utilizada rotineiramente
para
transformar
dicotiledôneas
e
recentemente
foi
adaptada
para
plantas
monocotiledôneas (PÔSSA et al., 2010).
Inicialmente, os pesquisadores associaram o desenvolvimento das galhas da coroa
(Figura 9), induzidas pela Agrobacterium, ao câncer animal, o que estimulou numerosas
pesquisas visando à elucidação das causas da doença (BRASILEIRO et al., 2000).
Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria capaz de infectar células vegetais, causando a
doença conhecida como galha da coroa (crown gall), caracterizada pelo desenvolvimento
de um tumor no local da infecção. A doença está associada à presença, na Agrobacterium,
de um plasmídeo, de alto peso molecular, o plasmídeo Ti (Tumor inducing)
(BRASILEIRO et al., 1998). Esses estudos concluíram que o surgimento da galha é, na
realidade, o resultado de um processo natural de transferência de genes da bactéria para a
célula vegetal, que passam a sintetizar substâncias que estimulam a divisão celular no sítio
de infecção. Os conhecimentos gerados desde então culminaram com o entendimento
bastante aprofundado desse parasitismo, sendo considerado atualmente um sistema modelo
para estudos das interações patógeno-hospedeiro em plantas (BRASILEIRO et al., 2000).
O agente etiológico causal da galha da coroa é Agrobacterium tumefaciens, uma
bactéria tipicamente do solo, do tipo bacilo aeróbico e Gram-negativa. Além de A.
tumefaciens, o gênero Agrobacterium possui outras 4 espécies que diferem entre si pela
patogenicidade e modo de infecção em diferentes plantas, principalmente em
Angiospermas dicotiledôneas. Dessa forma, A. tumefaciens é o agente etiológico da galha
35
da coroa, A. rhizogenes causa a raiz em cabeleira (do inglês hairy root), A. rubi induz
galhas especificamente em Rubus spp., A. vitis induz galhas especificamente em videiras e
A. radiobacter é saprófita (não-patogênica). As agrobactérias pertencem à família
Rhizobiaceae, que agrupa, entre outros, os gêneros Rhizobium, Bradyrhizobium e
Phyllobacterium, que são bactérias fixadoras de nitrogênio (BRASILEIRO et al., 2000).
O plasmídeo Ti dessa bactéria pode ser modificado artificialmente para não formar
o tumor, não provocando doença, e transportar o gene de interesse até o interior da célula
da planta receptora.
A. tumefaciens constitui um excelente sistema de introdução de genes em células
vegetais uma vez que produz transformantes com poucas cópias do transgene e a
integração do T-DNA é um processo relativamente preciso. A região do DNA a ser
transferida está definida pelas sequências flanqueadoras, extremidades direita e esquerda.
Ocasionalmente reordenações são produzidas, mas na maioria das vezes a região é inserida
intacta no genoma da planta. Normalmente, os T-DNA integrados mostram mapas
genéticos consistentes e segregação adequados. Ademais, os caracteres introduzidos por
esta via têm se mostrado estáveis durante muitas gerações de cruzamentos. Esta
estabilidade é critica quando se pretende comercializar as plantas transgênicas geradas
(PÔSSA et al., 2010)
A técnica de transformação (Figura 10) consiste em colocar o tecido da planta em
contato com a Agrobacterium contendo o gene de interesse. As bactérias, assim, infectam o
tecido vegetal, iniciando o processo de transferência e a transformação do genoma da
planta. As Agrobacterium modificadas, que perderam todo ou parte de seu DNA de
transferência (t-DNA), passam a ser incapazes de produzir tumores nas plantas
hospedeiras. A técnica de transformação indireta é limitada pela baixa suscetibilidade da
maioria das monocotiledôneas e gimnospermas, e de algumas dicotiledôneas, à infecção
pela Agrobacterium (CARRER et al., 2010).
De acordo com Melotto-Passarin (2009) os níveis de estabilidade genética e
viabilidade durante o armazenamento da Agrobacterium podem ser mantidos pela redução
da atividade metabólica da célula bacteriana, por meio de diferentes métodos: ausência de
oxigênio, armazenamento em meio mínimo, redução da temperatura, remoção quase total
da água, etc. Em uma coleção de Agrobacterium, algumas linhagens são requisitadas com
mais freqüência que outras; assim, métodos de conservação dessas culturas por diferentes
períodos devem estar disponíveis para as mais diversas finalidades.
36
Figura 9. Doença causada por A. tumefaciens, galha da coroa. Fonte: Wikipedia, 2010
Figura 10. Esquema representativo do método de transformação genética da cana-deaçúcar por A. tumefaciens. A: Cultura de A. tumefaciens linhagem EHA105, com o vetor
binário pNW166, para incubação dos calos embriogênicos. B: Seleção de células
transformadas em meio seletivo com antibiótico. C: Observação de brotos em lupa. D:
Enraizamento de plântulas em meio seletivo. E: Plantas regeneradas sob aclimatação em
substrato. Fonte: Melotto-Passarin, 2009
37
3.3 Caracterização Molecular
Esta é a etapa onde algumas técnicas de biologia molecular são aplicadas, para
detectar a transgenia nas plantas, tais como, PCR – Reação em Cadeia da Polimerase,
eletroforese, ELISA e Southern blot.
3.3.1 PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
A reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction- PCR) é a
amplificação enzimática de uma seqüência específica de DNA, visando à produção de
milhões de cópias desta seqüência em um tubo de ensaio.
Descrita por Kary Mullis no final dos anos 80 e tem revolucionado a genética
molecular, pois possibilita uma nova estratégia na análise dos genes por meio de um
método simples e rápido de amplificação de seqüências, dispensando todas as trabalhosas
etapas de clonagem gênica. Através da técnica de PCR verificamos a presença do
transgene nas amostras de DNA extraídas de plantas transformadas. Como parâmetros de
controle da análise, primeiramente usam-se os reagentes da reação sem a presença de DNA
para se certificar de que não ocorreu contaminação durante o preparo das amostras, em
seguida utiliza-se uma planta não transformada, como controle negativo.
A PCR explora a capacidade de duplicação do DNA. Uma fita simples de DNA é
usada como molde para a síntese de novas cadeias complementares sob a ação da enzima
DNA-polimerase, capaz de adicionar os nucleotídeos presentes na reação, segundo a fita
molde. A DNA-polimerase requer, entretanto, um "ponto de início" ligado à fita molde que
servirá de apoio para que os nucleotídeos subseqüentes sejam adicionados. Esse ponto de
início da síntese é fornecido por um oligonucleotídeo que se hibridiza (se anela) à fita
molde simples, o qual é denominado de primer. Ambas as fitas simples iniciais servem de
fita molde para a síntese, desde que se forneça primers específicos a cada uma delas. Dessa
forma, a região do DNA genômico a ser sintetizada é definida pelos primers, que se
anelam especificamente às suas seqüências complementares na fita molde, delimitando o
fragmento de DNA que se deseja amplificar.
Na prática o que se faz é adicionar em um tubo de ensaio uma quantidade muito
pequena de DNA genômico, mais os quatro nucleotídeos que compõem a cadeia de DNA
(dCTP, dATP, dGTP e dTTP), a enzima DNA-polimerase, os oligonucleotídeos que
servirão de primers e a solução tampão, que fornecerá as condições de pH e salinidade para
que a síntese se processe. O tubo de ensaio é submetido a uma alta temperatura
38
(geralmente 94°C por 5 minutos) para provocar o rompimento das pontes de hidrogênio
entre ambas as cadeias de DNA, causando a desnaturação da molécula. A temperatura é
rebaixada (30 a 60°C por 30 segundos) quando, então, os primers têm a oportunidade de se
anelarem às suas seqüências complementares do DNA genômico. Finalmente, a
temperatura é colocada em torno de 72°C (por 2 a 5 minutos), temperatura ideal para que a
DNA-polimerase utilizada na reação atue, dirigindo a síntese de novas cadeias. Repetindose esses três tipos de passos (desnaturação, anelamento e síntese), por cerca de 30 ciclos,
são produzidas mais de 250 milhões de cópias de uma determinada sequência de DNA em
fita dupla, uma vez que o número de cópias cresce de modo exponencial a cada ciclo. Após
a primeira desnaturação do DNA genômico, o tempo de aquecimento a 94°C pode ser
reduzido para 30 segundos nos ciclos subseqüentes, tendo em vista que a renaturação da
molécula
será
dificultada.
Nos
próximos
ciclos
estas
sequências
aumentarão
exponencialmente.
3.3.2. ELETROFORESE
Eletroforese é uma técnica laboratorial que permite a separação de moléculas de
DNA, RNA ou proteínas, utilizando como suporte uma matriz de gel (agarose ou
poliacrilamida) (Figura 11). A técnica envolve a migração das moléculas no gel através da
aplicação de uma diferença de potencial.
A carga das moléculas de DNA é negativa, desta forma elas serão repelidas do pólo
negativo e atraídas para o pólo positivo. De acordo com o tamanho da molécula, a
migração se dá em uma velocidade. Moléculas maiores sofrerão maior resistência pelo gel
e migrarão mais lentamente que moléculas menores.
O tamanho das moléculas pode ser calculado através de comparação a outras
moléculas de tamanho já conhecido.
Para visualização das moléculas de DNA e RNA, os géis são geralmente imersos
em uma solução de Brometo de Etídio. O Brometo de Etídio é um agente intercalante que
se liga ao DNA e ao RNA, fluorescendo quando exposto à luz ultravioleta.
A seguir, exemplo de resultado de PCR realizado em plantas de cana de açúcar
transgênicas expressando gene Bt (cryIA(b)).
39
Fragmento
amplificado
gene Bt
Figura 11. Exemplo de reação de PCR mostrando a amplificação do fragmento
correspondente ao gene Bt (indicado pela seta) introduzido em plantas de cana de açúcar.
Fonte: BRAGA, 2001.
3.3.3. ELISA – Expressão da Proteína
No final dos anos 50, começou a surgir uma nova perspectiva para detecção de
proteínas por meio de imunoensaios. Um trabalho pioneiro foi conduzido por YALOW &
BERSON (1959) que descreveram a detecção da insulina por radioimunoensaio.
Posteriormente, surgiram várias inovações que melhoraram sobremaneira a detecção de
proteínas por imunoesnaios. Uma dessas inovações foi a possibilidade de se produzirem
anticorpos monoclonais, o que permitiu a produção de quantidades ilimitadas de moléculas
idênticas de anticorpo. Desde o início dos anos 70, os imunoensaios passaram a utilizar
reagentes não radioativos. Estes ensaios, denominados ELISA (Enzyme Linked
ImmunonoSorbent Assay), além de usarem reagentes enzimáticos, apresentam alta
sensibilidade, facilidade na preparação dos reagentes, rapidez e reprodutibilidade dos
resultados. Tais características, aliadas à variedade dos tipos de ensaio, fizeram com que as
técnicas ELISA fossem amplamente adotadas em análises de anticorpos e antígenos
solúveis. Os sistemas ELISA facilitaram bastante a detecção de várias proteínas e vírus,
sendo amplamente utilizadas no diagnóstico clínico. Posteriormente, as técnicas ELISA
40
passaram a ser utilizadas em todas as áreas de análises biológicas (BRASILEIRO et al.,
1998).
A técnica permite identificar uma proteína presente em uma população de outras
proteínas, utilizando-se preparações cruas ou semi-purificadas. Assim, pela técnica ELISA,
é possível a detecção de uma proteína codificada por um gene exógeno em uma planta
transgênica. Essa técnica, que tem a vantagem de ser rápida e permitir a análise de um
grande número de amostras, possibilita a análise de um grande número de plantas
transgênicas simultaneamente (BRASILEIRO et al., 1998).
Atualmente existem kits específicos para cada proteína já liberada comercialmente.
Estes kits são muito utilizados na inspeção de carregamentos em portos e são
desenvolvidos em formatos que permitem a detecção da proteína de forma simples e
rápida, por exemplo, na forma de sticks capazes de detectar a presença da proteína. É
importante ressaltar que o método de ELISA além de detectar, também quantifica a
expressão da proteína no tecido analisado.
O exemplo a seguir (Figura 12), mostra resultados obtidos a partir de plantas de
cana-de-açúcar transgênica expressando gene Bt produzidas no CTC, observa-se que foram
analisados dois tecidos da planta, colmo e folhas, e houve diferentes resultados
relacionados à expressão da proteína, isto pode ser justificado pelo tipo de promotor
utilizado, na construção do evento transgênico.
41
Tecido
PLANTA
Ng proteína Bt /
mg proteína total
7
folha
879,9
7
colmo
0
41
folha
211,11
41
colmo
193,3
53
folha
1146,5
53
colmo
0
68
folha
1079,4
68
colmo
0
157
folha
707,03
157
colmo
26,17
99
folha
560,14
99
colmo
0
1842 ctrl
L, S, R, LS
0
Figura 12. Análise ELISA de plantas transgênicas da variedade SP80-1842 expressando a
proteína Bt CryIA(b) em folhas e colmos. Fonte: BRAGA, 2001.
3.3.4. SOUTHERN BLOT - Análise de número de cópias
A técnica Southern blot permite detectar fragmentos de DNA específicos em
amostras de composição complexa, como DNAs genômicos. O método foi primeiramente
descrito por Edwin M. Southern e até hoje é usado sem alterações essenciais em relação a
sua primeira descrição (BRASILEIRO et al., 1998)
Segundo Brasileiro et al. (1998), entre diversas aplicações, a Southern blot permite
analisar sequências de DNAs exógenos integrados no genoma vegetal pela Agrobacterium
ou qualquer sistema de transformação genética. O método consiste basicamente nas
seguintes etapas:
i. O DNA vegetal é extraído das células e digerido com uma ou mais enzimas de
restrição;
ii. Os produtos obtidos pela digestão do DNA são separados de acordo com o
tamanho, por eletroforese em gel de agarose;
42
iii. O DNA ainda no gel é desnaturado e transferido para uma membrana de náilon ou
nitrocelulose. É importante ressaltar que as posições relativas dos fragmentos do DNA no
gel se mantêm quando o DNA é transferido para a membrana;
iv. O DNA é fixado à membrana por luz ultravioleta (UV) ou por alta temperatura
(80°C);
v. O DNA fixado à membrana é hibridizado contra uma sonda de DNA ou RNA que
possui homologia com a sequência de interesse. A posição dos fragmentos com homologia
à sonda é visualizada por auto-radiografia ou colorimetria, dependendo do tipo de sonda ou
da forma de detecção utilizados.
A importância da técnica de Southern blot em experimentos de transformação de
plantas reside no fato de ela ser considerada uma prova molecular de integração de genes
exógenos no genoma vegetal. A técnica de PCR também pode ser utilizada para tal fim, no
entanto, sua confiabilidade é menor, em virtude, principalmente, da sua alta sensibilidade,
que pode levar a falsos positivos, por amplificação de quantidades mínimas de DNAs
contendo o gene analisado. Outra vantagem do Southern blot em relação ao PCR é que os
iniciadores (primers) utilizados no PCR normalmente amplificam regiões internas do
transgene. Isso dificulta ainda mais a diferenciação entre o DNA exógeno integrado e
potenciais contaminantes, pois ambos resultam na amplificação de fragmentos de
tamanhos idênticos. Pelo mesmo motivo, a técnica de PCR, quando utiliza iniciadores que
amplificam uma região interna do DNA exógeno, não pode ser utilizada para estimar o
número de cópias do transgene que foi introduzido no genoma vegetal. Por seu turno a
técnica Southern blot, dependendo das enzimas e da sonda utilizadas na análise, pode
fornecer aquele tipo de informação (BRASILEIRO et al., 1998).
A seguir (Figura 13) é mostrado um exemplo de uma análise utilizando a técnica de
Southern blot para analisar o número de cópias do gene cryIA(b) inseridas em plantas
transgênicas de cana de açúcar.
43
Figura 13. Análise de Southern blot em plantas de cana de açúcar transgênicas das
variedades SP80-1842 e SP80-3280 transformadas com o gene Cry1A(b). Fonte: BRAGA,
2001.
Pode-se observar na figura 13, as plantas transgênicas analisadas apresentam várias
cópias do transgene inserido, representado pelo número de bandas no gel, este “arraste”
visualizado permite concluir que o gene de interesse está inserido no genoma da planta.
3.4. Bioensaio
O bioensaio é um método de resultados diretamente quantificáveis fundamentados
na caracterização fenotípica das plantas, pois as expõe ao inseto durante determinado
período (Figura 14), permitindo a avaliação comparativa da reação dos insetos alimentados
com folhas das plantas transgênicas, transformadas com gene de resistência a insetos (Bt),
com insetos alimentados com folhas de plantas convencionais, não transformadas.
Bioensaios também são utilizados para determinar a Concentração Letal Média, ou
seja, a quantidade de entomopatógeno que deve ser utilizada para controlar a metade da
população do inseto (BERLITZ et al., 2009).
As brocas serão inoculadas junto às folhas das plantas geneticamente modificadas,
após esta etapa será avaliado o índice de mortalidade das lagartas. A partir do índice de
mortalidade observado, as plantas transgênicas são selecionadas para prosseguir com as
demais análises e testes necessários.
44
Figura 14. Exemplo de Bioensaio realizado no CTC - Centro de Tecnologia Canavieira
com folhas de plantas de cana-de-açúcar transgênicas expressando o gene Bt CryI(A)b (à
direita) e plantas da mesma variedade (SP80-1842) não transformadas (à esquerda). Fonte:
Centro de Tecnologia Canavieira.
3.5 Análises de Campo
As plantas positivadas anteriormente são levadas a campo para testes de
produtividade e análises de biossegurança.
Qualquer experimento em campo que envolva organismo geneticamente
modificado no Brasil deve ser aprovado pela CTNBio, Comissão Técnica Nacional de
Biossegurança. Esta comissão é responsável no Brasil pela avaliação da proposta de
experimento e dos procedimentos que se pretende realizar. Uma vez obtido parecer
favorável, pode-se proceder ao plantio do experimento.
As análises de campo consistem em demonstrar que a cana geneticamente
modificada é idêntica a não transformada, isto é realizado através de análises agronômicas
e de produtividade, tais como:
 Fibra – Matéria seca insolúvel em água contida na cana-de-açúcar, o valor refere-se a
análise da matéria prima e portanto, inclui as impurezas ou matérias estranhas que
provocam o aumento dos sólidos insolúveis (palhas, ervas - daninhas, etc.)
 Brix – Teor de sólidos em solução. Por consenso, admite-se o Brix como a porcentagem
aparente de sólidos solúveis contida em uma solução açucarada impura. O Brix pode ser
45
obtido por aerômetros utilizando solução de sacarose à 20ºC, sendo denominado “Brix
aerométrico”, ou por refratômetro, que são aparelhos eletrônicos que medem o índice de
refração de soluções de açúcar sendo denominado “Brix refratométrico”.
 POL – Representa a porcentagem aparente de sacarose contida numa solução impura de
açúcar, sendo determinada por métodos polarimétricos (polarímetros ou sacarímetros).
 Tonelada de cana por hectare – Medida de peso das parcelas do experimento, a fim de
calcular a produtividade da cana de açúcar geneticamente modificada, comparativamente a
plantas da mesma variedade não transgênicas.
 Inoculação da Broca da cana de açúcar – Para analisar o potencial da tecnologia
desenvolvida e se a expressão da proteína continua estável na planta adulta.
Pode-se observar na figura 15 a exposição, já em campo, o ataque da broca em cana
transformada (A) e não-transformada (B), onde os danos são visíveis.
A.
B.
Figura 15. Exemplo de inoculação da broca da cana (Diatraea saccharalis) em plantas
adultas de cana-de-açúcar transgênicas expressando o gene Bt CryI(A)b (B) e plantas da
mesma variedade (SP80-1842) não transformadas (A), realizado no CTC – Centro de
Tecnologia Canavieira. Fonte: Centro de Tecnologia Canavieira.
46
As análises de campo têm o objetivo de verificar se a planta transgênica que se
pretende liberar no mercado será capaz de garantir a produtividade desejada pelos
produtores e ainda evitar as perdas que podem ocorrer decorrentes do ataque de insetos.
3.6 Análises de Biossegurança
Como parte do processo de liberação de uma planta geneticamente modificada, são
realizadas análises de composição de amostras coletadas das plantas transformadas,
comparando com os resultados de amostras de plantas da mesma variedade, não
transgênicas. Estas análises têm o objetivo de provar que, exceto pela característica
alterada intencionalmente (neste caso, resistência a inseto), nenhuma outra característica da
planta foi modificada.
A avaliação de segurança de alimentos derivados de matérias-primas geneticamente
modificadas é baseada na análise de risco, metodologia científica que compreende as
etapas de: avaliação, gerenciamento e comunicação de risco. Na etapa de avaliação de
risco procede-se à caracterização qualitativa e quantitativa dos potenciais efeitos adversos,
tendo como balizador o conceito da equivalência substancial, para identificação de
eventuais diferenças entre o novo alimento e o seu correspondente convencional (CTNBio,
2007).
Para avaliar a segurança de uma matéria-prima alimentar geneticamente modificada
ou sua equivalência ao alimento convencional, é recomendável que quatro elementos
principais sejam analisados mais detidamente: (1) a variedade parental, ou seja, a planta
que deu origem à nova matéria-prima geneticamente modificada; (2) o processo de
transformação, incluindo a caracterização da construção utilizada e do evento resultante;
(3) o produto do gene inserido e potencial toxicidade e alergenicidade e; (4) a composição
da nova variedade resultante da transformação genética. O conjunto de dados dessas
análises deve permitir a identificação e caracterização dos potenciais efeitos adversos
associados com o consumo da nova matéria-prima, subsidiando as etapas de gerenciamento
e comunicação de risco. Os resultados de todas as análises realizadas, bem como a
descrição da planta e do processo de obtenção, devem ser compilados e submetidos à
CTNBio para nova avaliação. Somente com parecer favorável desta comissão, é possível
liberar comercialmente uma planta transgênica no Brasil. A avaliação da CTNBio leva em
consideração todos os resultados obtidos durante todas as etapas do desenvolvimento da
47
planta e garante que o produto a ser liberado é seguro para a saúde humana, animal e para
o meio-ambiente (CTNBio, 2007).
4. A PRODUÇÃO DE TRANSGÊNICOS
4.1 No mundo
Em 2009, 14 milhões de agricultores em 25 países cultivaram comercialmente
lavouras geneticamente modificadas, e mais de 90% eram de pequenos produtores rurais
de países em desenvolvimento. Do total plantado, as variedades transgênicas resistentes a
insetos (Bt) e tolerantes a herbicida (Glifosato) representam mais de 99% da área cultivada.
As diferenças significativas para aumentos de produção entre países desenvolvidos e em
desenvolvimento decorrem, provavelmente, da falta de um manejo adequado de pragas e
plantas daninhas nas lavouras convencionais nos países em desenvolvimento. Dessa
maneira, para os agricultores desses países, a adoção da cultura transgênica foi muito mais
vantajosa do que para os agricultores de países desenvolvidos. O Brasil não foi
considerado nessa pesquisa, e os dados de adoção e produção de culturas transgênicas por
pequenos produtores ainda são escassos no país (CARRER et al., 2010).
Podemos observar na figura 16 dados atualizados, mostrando através de número de
liberações planejadas, para qual finalidade a cana-de-açúcar foi modificada.
Figura 16. Pedidos de liberação planejada de cana-de-açúcar transgênica em todo o mundo
– Finalidade dos OGM. Fonte: CTC - Centro de Tecnologia Canavieira, 2011
48
Já na figura 17, há uma comparação de pedidos de liberações feitas por empresas e
centros de pesquisas, lembrando que muitos pedidos não serão levados adiante, já que o
processo de desregulamentação é economicamente inviável.
Figura 17. Pedidos de Liberação Planejada de cana-de-açúcar transgênica em todo o
mundo – Solicitante X Ano. Fonte: CTC - Centro de Tecnologia Canavieira, 2011
4.2 No Brasil
Em 2009, o Brasil se tornou o segundo maior produtor de plantas geneticamente
modificadas (GM) do mundo, atrás apenas dos Estados Unidos. O plantio de soja, milho e
algodão transgênicos alcançou a marca de 21,4 milhões de hectares semeados, superando
em 100 mil hectares a área plantada na Argentina. Desse total, 16,2 milhões de hectares
são plantados com soja Roundup Ready (tolerante ao herbicida glifosato), 5 milhões com
milho Bt (resistente a pragas) e 145 mil hectares com algodão transgênico, destes 116 mil
correspondem ao algodão Bt e 29 mil são tolerantes a herbicida (Figura 18) (JAMES,
2010).
49
Figura 18. Área plantada, em milhões de hectares, com lavouras transgênicas no Brasil.
Fonte: JAMES, 2010
Apesar do domínio da soja na produção de transgênicos no Brasil, o crescimento de
lavouras geneticamente modificadas em 2009 foi liderado pelo milho. A produção do
milho transgênico foi aprovada pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança
(CTNBio) em agosto de 2007, e a partir de então, o plantio vem crescendo
vertiginosamente. O aumento na produção de milho transgênico na safra de 2009 foi de
400%, em comparação ao ano de 2008. Na safra 2010/2011, estão disponíveis para o
produtor 136 cultivares de milho transgênico, e as perspectivas são de produção superior à
safra passada (CARRER et al., 2010).
50
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
As duas técnicas de transformação genética, biobalística e A. tumefaciens, são
importantes para a produção de plantas transgênicas de cana-de-açúcar, sendo que ambas
possuem capacidade de gerar eventos com baixo número de cópias no genoma.
A biobalística é uma técnica rotineira em instituições de pesquisa, como no caso do
CTC, e tem apresentado resultados promissores, com diversas vantagens, principalmente
por ser de metodologia simples e com capacidade de produzir grande número de eventos
transgênicos. Porém, esta metodologia geralmente produz eventos transgênicos com
inserção de alto número de cópias do transgene no genoma, se comparado com a
transformação genética via A. tumefaciens, sendo assim, estas inserções podem ser
aleatórias e causar o silenciamento de genes importantes para a planta, já que não é
possível direcionar este processo. Outro problema pode ocorrer quanto à quebra do
transgene por choque mecânico no momento do bombardeamento, havendo integração de
pedaços incompletos do transgene no genoma, o que geram eventos transgênicos que não
expressam o gene de interesse.
Já a tecnologia de transformação por Agrobacterium tumefaciens, mostra-se mais
complexa e menos eficiente, pois produz baixo número de eventos transgênicos. A técnica
apresenta vantagens por ser simples quanto à execução de protocolo, e geralmente há
inserção de baixo número de cópias de transgene no genoma. Esta característica é
desejável para a seleção dos eventos transgênicos a serem avaliados para liberação
comercial. A A. tumefaciens seleciona naturalmente a inserção do transgene em regiões
não codificadoras do genoma da planta, pode-se dizer então, que a probabilidade de
silenciar algum gene essencial para a planta é menor. Diferentemente da biobalística, não
ocorre quebra do transgene, ou seja, se ocorrer a transformação genética, o gene irá
expressar corretamente.
A transformação via Agrobacterium tumefaciens ocorre na natureza há muitos anos,
porém em plantas dicotiledôneas, justificando a dificuldade de aplicá-la à cultura da canade-açúcar, visto que esta pertence a classe das monocotiledôneas.
Concluí-se que através da transformação genética é possível obter cana-de-açúcar
geneticamente modificada, o que seria de grande importância para o desenvolvimento
biotecnológico dos canaviais, evitando perda de produtividade, reduzindo o uso de
defensivos agrícolas e tantos outros prejuízos que citamos ao longo desta revisão de
literatura.
51
5. REFERÊNCIAS
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