laboratório nat
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ESTA PALESTRA NÃO PODERÁ SER REPRODUZIDA SEM A REFERÊNCIA DO AUTOR TRIAGEM SOROLÓGICA EM SERVIÇOS HEMOTERÁPICOS Dr. José Lúcio Jorge Barbosa Coordenador do Setor de Sorologia do HEMOCE Agentes / Período de Janela / Risco Residual AGENTE PESQUISA Período de Janela/Risco Residual Sífilis Ac Treponêmicos - 30 a 45 d - Relato de Sífilis transfusional antes da 2ª Guerra HBV HBsAg/Anti-HBc - 54 a 56 d (38 d) - 1/220.000 a 1/357.0000 Unidades HCV Ac (3ª geração) -70 d -< 1/100.000 Unidades Ag/Ac -3a4d - 1/1,1 M Unidades HTLV I/II Ac - 36 a 71 d (51 d ) - Desconhecido HIV 1/2 Ac -22 d - 1/493.000 Unidades Ag p24 -16 d - 1/676.000 Unidades BUSCA DE MELHORIA CONTÍNUA Solucionar problema; Intenção de mudar, melhorar; Aumentar a qualidade do produto e aumento da segurança; Atitudes pessoais em querer otimizar os processos; Capacitação profissional; ....... COMO ESTÁ A QUALIDADE/SEGURANÇA DO SANGUE QUE OFERECEMOS ???????? Transfusão Sanguínea É um processo que envolve risco sanitário com a ocorrência potencial de incidentes transfusionais, que podem ser classificados em imediatos ou tardios mesmo quando atendidas as normas técnicas preconizadas. Dentre os incidentes transfusionais tardios, destacamos aqueles relacionados às doenças infecciosas e parasitárias. Triagem Sorológica em Doadores de Sangue Objetivo: Evitar a transmissão de doenças infecto – contagiosas em receptores de sangue e componentes sanguíneos. O número de testes são acrescidos de acordo com a epidemiologia de cada país ou região. Doação de Sangue Cuidados - doador: sinais vitais, peso, altura e ht. Cuidados - receptor : Triagem Clínica e Triagem Sorológica Fases Analíticas A. Pré-Analítica Tipo de amostra; plasma , soro ??? Identificação. Coleta. Escolha adequada do tipo de tubo: - volume de amostra adequado; - diâmetro do tubo adequado ao equipamento; - sem interferentes nos resultados sorológicos; - adaptações adequadas para as bolsas de coleta; - tubo plástico, resistente e uso único; - adequados aos tamanhos dos suportes dos equipamentos. Fases Analíticas A. Pré - Analítica Estabilidade da amostra (validade). Critério de aceitação de amostra (hemólise, lipêmia, diluída, etc). Acondicionamento e transporte. Centrifugação (respeitando o tempo prévio ). Fases Analíticas B. Analítica Água usada para preparo dos reagentes (cuidado com estoque de água – contaminação bacteriana). Limpeza de materiais (frascos ,vidrarias) e equipamentos. Cautela com o uso de hipoclorito no Lab. poderá ter interferência nos ensaios. Fases Analíticas B. Analítica Uso de metodologia adequada. Temperaturas de armazenamentos de reagentes e amostras. Temperaturas de equipamentos e ambientes. Adequações de calibrações e manutenções preventivas. Validações prévias em todo o processo. Descartes adequados dos resíduos. Treinamento de recursos humanos. Fases Analíticas C. Pós – Analítica Resultados. Testes para detecções de infecções transmissíveis pelas transfusões Hepatite B Hepatite C AIDS/SIDA Doença de Chagas Sífilis Infecção por HTLV-I e HTLV-II Portaria MS 2.712 -12.11.13 Segurança Transfusional Janela Sorológica: período de tempo entre a exposição ao agente infeccioso e o aparecimento de positividade em exames laboratoriais. Soroconversão: mudança no estado sorológico de um indivíduo. Portaria MS 2.712 - 12.11.13 (triagem sorológica) Hepatite B (dois testes): detecção do antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg); detecção de anticorpos contra o capsídeo do HBV – anti-HBc (IgG ou IgG + IgM). Hepatite C (dois testes): detecção do anticorpo contra o vírus da hepatite C ou detecção combinada de anticorpo + antígeno do vírus da hepatite C; detecção de ácido nucleico (NAT) do HCV. Portaria MS 2.712 - 12.11.13 (triagem sorológica) AIDS/SIDA (dois testes): detecção de anticorpo contra o HIV (HIV 1, 2 e subtipo O) ou detecção combinada do anticorpo contra o HIV (HIV 1, 2 e subtipo O) + antígeno p24 do HIV; detecção de ácido nucleico (NAT) do HIV. No caso da realização dos testes NAT em pool, o grupo de amostras que apresentar resultado positivo deve ser desmembrado e suas amostras testadas individualmente para identificação do agente infeccioso. Portaria MS - 2.712 - 12.11.13 Doença de Chagas: detecção de anticorpo anti -T Cruzi por método de ensaio imunoenzimático (EIE) ou quimioluminescência (QLM)/Eletroquimioluminescência (ECLIA) Sífilis: teste de detecção de anticorpo anti-treponêmico ou não-treponêmico. Infecção por HTLV I/II: detecção de anticorpo contra o HTLV I/II. Risco Residual Infeccioso Risco residual infeccioso: é a possibilidade de transmitir uma doença pela transfusão, apesar de terem sido adotadas as medidas possíveis para evitá-la. Risco Residual Infeccioso Processo de triagem de doador. Incidência da infecção na população de doadores. Período de Janela ( teste de triagem)- período de tempo entre a exposição ao agente infeccioso e o aparecimento de positividade em exames laboratoriais. Erros operacionais ( laboratoriais e de liberações de hemocomponentes). Cepas indetectáveis nos ensaios. Teste NAT – Uma realidade no HEMOCE FINALIDADE DO TESTE NAT Teste para detecção de ácido nucleico do vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), do vírus da Hepatite C (HCV) e do vírus da Hepatite B (HBV) em amostras provenientes de serviços de hemoterapia. IMPORTÂNCIA DO TESTE NAT - Diminuição da janela imunológica : HIV (de 22 dias para 10 dias) HCV (de 60 dias para 12 dias) HBV (de 54-56 dias para 10 dias) - Aumento da segurança transfusional; - Teste complementar a triagem sorológica. METODOLOGIA Técnica de Biologia Molecular; PCR em tempo real - quantificação de moléculas a cada ciclo; PCR multiplex HIV/HCV/HBV - amplificação ao mesmo tempo. Histórico ANO ATIVIDADES 2004 Projeto para o desenvolvimento do teste NAT para centros hemoterápicos (Portaria nº 112, 29.01.14, MS) 2008 Estudo piloto de avaliação do teste NAT (HEMOSC – 5.000 amostras) 2010 - Obtenção do registro KIT NAT (HIV/HCV) pela ANVISA - Estudo Multicêntrico do teste NAT (HEMOSC, HEMOPE, HEMORIO e Fundação Pró-Sangue de São Paulo (FPS) como sítios testadores do NAT (SIT-NAT), além do HEMORGS, HEMONORTE, HEMOIBA, HEMOES e HEMOSantos, como unidades referenciadoras e coletoras de amostras) 2011 Término do estudo Multicêntrico do teste NAT (219.791 amostras) Histórico ANO ATIVIDADES 2012 - 2013 Obrigatoriedade da realização do teste NAT (HIV/HCV) nos hemocentros (portaria nº2.712, 12.11.13, MS) 2014 - 2015 Chegada dos Equipamentos da Plataforma NAT no HEMOCE (Abril) Instalação , Validação e Liberação dos Equipamentos (Maio) Treinamento da Equipe (Junho) Inicio das Rotinas NAT HIV/HCV no HEMOCE (Junho) Inicio da análise das amostras do Piauí e Maranhã (Setembro/Outubro) Chegada de equipamentos (ABI) para realização do teste NAT HBV (Novembro) Instalação, Validação e Liberação dos equipamentos (ABI) para NAT HBV (Dezembro) Inicio da realização do teste NAT HBV nas amostras do CE, PI e MA (Março) Sítios testadores NAT no Brasil Hemocentro Referência HEMORIO RJ, ES FPS, HEMOCAMP, FHRP SP HEMOMINAS MG HEMOCE CE, MA, PI HEMOPE PE, RN, (PB)* HEMOBA BA, AL, SE HEMOSC SC, RS HEMEPAR PR FHB DF, GO, TO HEMOSUL MS, MT HEMOAM AM, RO, RR, AC HEMOPA PA, AP RECEBIMENTO E ORGANIZAÇÃO DAS AMOSTRAS NAT PIPETAGEM DAS AMOSTRAS 100µL de cada amostra X Y Z W K Tubos primários 600µL de pool R Tubo secundário PLATAFORMA NAT HIV/HCV JANUS MDX POOLING (2h) EXTRAÇÃO (2h) JANUS PRÉ-PCR (1h) ABI AMPLIFICAÇÃO PCR REAL TIME (3h) TEMPO ESTIMADO DA ROTINA: aproximadamente 8h LABORATÓRIO NAT PREPARAÇÃO DO POOLING LABORATÓRIO NAT EXTRAÇÃO E PURIFICAÇÃO LABORATÓRIO NAT FREEZER A -80° E -30°C LABORATÓRIO NAT DETECÇÃO E AMPLIFICAÇÃO COLETA E ACONDICIONAMENTO DAS AMOSTRAS - Homogeneização após a coleta (6-8 vezes); Centrifugação em até 8h após a coleta (2.700 rpm por 10min); Verificação da separação correta do plasma pelo gel; Acondicionamento entre 2°e 8°C; Centrifugação das amostras de coletas externas, provenientes de qualquer localidade, no ato da chegada ao Hemocentro regional. LABORATÓRIO NAT Quantidade total de amostras analisadas entre os meses de Junho de 2012 a Maio de 2015 (NAT) 25.000 22.328 20.000 22.082 17.987 15.000 10.000 5.000 2.595 2012 Quantidade de Amostras Analisadas 2013 2014 2015 2012 (Jun a Dez) 2013 (Jan a Dez) 2014 (Jan a Dez) 2015 (Jan a Mai) TOTAL 71.587 223.697 232.963 96.298 624.545 MAI ABR MAR FEV JAN DEZ NOV OUT SET AGO JUL JUN MAI ABR MAR FEV JAN DEZ NOV OUT SET AGO JUL JUN MAI ABR MAR FEV JAN DEZ NOV OUT SET AGO JUL JUN 0 LABORATÓRIO NAT Quantidade de Amostras analisadas por Hemocentro Junho/2012 a Maio/2015 2012 (JUN a DEZ) 2013 (JAN a DEZ) 2014 (JAN a DEZ) 2015 (JAN a MAI) TOTAL HEMOCE 52.652 103.225 105.427 43.397 304.701 HEMOPI 12.706 51.873 54.753 21.074 140.406 HEMOMAR 6.229 68.599 72.783 31.827 179.438 LABORATÓRIO NAT Detecções de Janelas Imunológicas Junho/2012 a Maio/2015 2012 (JUN a DEZ) 2013 (JAN a DEZ) 2014 (JAN a DEZ) 2015 (JAN a MAI) TOTAL HEMOCE - - - 02 (HIV) 02 (HIV) HEMOPI - - - - - HEMOMAR - 01 (HCV) 01 (HCV) - 02 (HCV) FLUXOGRAMA DE LIBERAÇÃO DE RESULTADOS Recebimento de Amostras Preparar POOL Realizar o teste NAT NAT HIV/HCV/HBV NEGATIVO NAT HIV/HCV/HBV POSTIVIVO NAT HIV/HCV /HBV Individual NEGATIVO Liberar resultado NAT NÃO DETECTÁVEL HIV/HCV/HBV Realizar NAT HIV/HCV/HBV Individual NAT HIV / HCV/ HBV Individual POSITIVO DETECTÁVEL HIV/HCV/HBV AMOSTRAS PARA REPETIÇÃO (HIV/HCV) AMOSTRAS PARA REPETIÇÃO (HBV) DETECTÁVEL NATNATDETECTÁVEL AntiAnti HBC HBC NEGATIVO NEGATIVO HBsAg NEGATIVO HBsAg NEGATIVO PROVÁVEL JANELA IMUNOLÓGICA DETECTADA PELO NAT HBV AntiAnti HBC HBCPOSITIVO POSITIVO HBsAg POSITIVO HBsAg POSITIVO INFECÇÃO HBV ATIVA AntiAnti HBC HBCPOSITIVO POSITIVO HBsAg NEGATIVO HBsAg NEGATIVO PROVAVEL INFECÇÃO RECENTE PELO HBV COM BAIXA SENSIBILIDADE DO TESTE HBSAG OU HBV MUTANTE COM TESTE HBSAG FALSO NEGATIVO POR INCAPACIDADE DE DETECÇÃO Anti NEGATIVO AntiHBC HBC NEGATIVO HBsAg POSTIVO HBsAg POSTIVO INFECÇÃO RECENTE PELO HBV OU BAIXA RESPOSTA IMUNE DO DOADOR CONVOCAR O DOADOR PARA COLETAR NOVA AMOSTRA AMOSTRAS PARA REPETIÇÃO (HBV) NAT NÃO DETECTÁVEL Anti HBC NEGATIVO HBsAg NEGATIVO Ausência de infecção por HBV LIBERAR BOLSA Anti HBC POSITIVO HBsAg POSTIVO Anti HBC NEGATIVO HBsAg POSITIVO Baixa sensibilidade do teste NAT por carga viral baixa, mutação do HBV impossibilitando a detecção pelo kit ou ausência de DNA circulante. CONVOCAR O DOADOR PARA COLETAR NOVA AMOSTRA Anti HBC POSITIVO HBsAg NEGATIVO Repetir o NAT em single na amostra da doação NAT DETECTÁVEL (baixa sensibilidade do Kit). Descartar bolsa e convocar o doador para coleta de nova amostra. NAT NÃO DETECTÁVEL (cicatriz imunológica) Descartar bolsa e convocar o doador para coleta de nova amostra. EQUIPE NAT Richeyla Custódio (Coordenadora) Maisa Holanda (Farmacêutica Bioquímica) Regina Lúcia (Farmacêutica Bioquímica) Newton Benevides (Farmacêutico Bioquímico) Kamilla Rocha (Farmacêutica Bioquímica) Íris Vasconcelos (Técnica) Rodolfo Gomes (Técnico) Muito obrigado !
