Produção secretória da proteína recombinante do Capsídeo de

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA
JACKELINE GOMES DA SILVA ARAÚJO
Produção secretória da proteína recombinante do Capsídeo de Circovírus
Suíno 2 em Pichia pastoris e sua aplicação como antígeno
Recife
2014
JACKELINE GOMES DA SILVA ARAÚJO
Produção secretória da proteína recombinante do Capsídeo de Circovírus
Suíno 2 em Pichia pastoris e sua aplicação como antígeno
Tese de Doutorado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Inovação
Terapêutica da Universidade Federal de
Pernambuco, para a obtenção do Título de
Doutor em Inovação Terapêutica
Orientador: Prof(o). Dr. Antonio Carlos de Freitas
Recife
2014
Catalogação na fonte
Elaine Barroso
CRB 1728
Araújo, Jackeline Gomes da Silva
Produção secretória da proteína recombinante do capsídeo de Circovírus
Suíno 2 em Pichia pastoris e sua aplicação como antígeno/ Recife: O Autor,
2014.
89 folhas : il., fig., tab.
Orientador: Antonio Carlos Dias de Freitas
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco, Centro
de Ciências Biológicas, Inovação Terapêutica, 2014.
Inclui bibliografia
1.
Circovírus 2. Suíno- doenças
(orientador) II. Título
571.99211
CDD (22.ed.)
I. Freitas, Antonio Carlos Dias de
UFPE/CCB- 2014- 195
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
Programa de Pós-Graduação em Inovação Terapêutica
REITOR
Prof. Dr Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
VICE-REITOR
Prof. Dr. Silvio Romero de Barros Marques
PRÓ-REITOR(A) PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
Prof Dr. Francisco de Sousa Ramos
DIRETOR(A) DO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Prof(a). Dr. Ângela Maria Isidro Farias
VICE- DIRETOR(A) DO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Prof(a). Dr. Silvia Regina Arruda de Moraes
COORDENADOR(A) DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA
Prof. Dr. César Augusto Souza de Andrade
VICE- COORDENADORA DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM INOVAÇÃO TERAPÊUTICA
Prof. Dr. Luiz Alberto Lira Soares
FOLHA DE APROVAÇÃO
Nome: SILVA, Jackeline Gomes
Título: Produção secretória da proteína recombinante do capsídeo de Circovírus Suíno 2 em
Pichia pastoris e sua aplicação como antígeno.
Tese apresentada à Universidade Federal de Pernambuco para obtenção do título de Doutor
em Inovação Terapêutica
Aprovada em: 27/02/14
Banca Examinadora
Prof(a). Dr. Eliane Campos Coimbra
Instituição: Universidade Federal Rural de Pernambuco - UFRPE
Assinatura:______________________________________________________
Prof(a). Dr (a) Clara Nilce Barbosa
Instituição: Universidade Federal Rural de Pernambuco - UFRPE
Assinatura:______________________________________________________
Prof(a). Dr. André Luiz Santos de Jesus
Instituição: Universidade Federal de Pernambuco - UFPE
Assinatura:______________________________________________________
Prof(a). Dr (a) Maira Galdino da Rocha Pitta
Instituição: Universidade Federal de Pernambuco - UFPE
Assinatura:______________________________________________________
Prof(a). Dr. Antonio Carlos de Freitas
Instituição: Universidade Federal de Pernambuco
Assinatura:______________________________________________________
DEDICATÓRIA
Dedico,
Unicamente aos meus pais,
Pedro Marinho da Silva e Raimunda Gomes da Silva, pelo
amor, dedicação e incentivo na minha carreira. E pela
transposição dos reais valores do amor familiar recebidos
de Deus.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo seu amor incondicional, cuidadoso, zeloso e abundante. Pela sua graça
ter me alcançado e por isso fazer total diferença em meu viver. Grata pelo seu favor
imerecido, Senhor!
Ao meu marido, pelo incentivo e vontade de me ver crescer, através de sua amorosa
forma de saber dividir os nossos dias, momentos, planos e conquistas. Por todo o seu cuidado,
zelo e dedicação pelo nosso lar e essencialmente pelo nosso amor. Obrigada, amor!
A minha família, irmão e irmãs, por sermos uma família linda e cheia de alegria.
Sendo eles mais velhos, agradeço por compartilharem comigo “o gene do esforço”, pois como
filha caçula ainda consegui “pegar” muita coisa boa. Vocês se assemelham ao Ouro!
Ao Professor Antonio Carlos, meu orientador, pela confiança ao longo desse período.
E porque não citar, a coragem em aceitar um mestre em Toxicologia de Produtos Naturais,
para trabalhar com biologia molecular. Obrigada, Professor Antonio!
A minha família “Sal e Luz”, por auxiliarem em um caminhar que agrade a Deus,
acima de tudo. Pelos momentos de compartilhar à vida juntos e isto torná-la melhor vivida
em tudo que possamos fazer ou ter. Por sermos felizes desde agora em saber que o nosso
criador voltará. Vocês são aqueles bem chegados que geram riso no meu coração. Obrigada
por estarem comigo!
Ao grupo, Clodine, Márcia (e sua trupe), Aline, Jaci, Priscila, Léia, Lailson, Sérgio,
Sabrina, Paula, Sandro, D. Eliane, D. Socorro e Jully por fazerem da minha sexta-noite uma
oportunidade a mais de celebrar o amor de Deus em nossas vidas. Vocês são bênçãos. Bateu
valeu, galera!
Aos meus amigos do LEMTE, Ana Pavla, Conceição, Bárbara, Élyda, Rita, Nayara
(Nanay), Cosme, Karin, Ana Jéssica, por serem pessoas compromissadas com aquilo que
fazem, vivendo isso de forma rotineira no laboratório. E também por tornar o ambiente de
trabalho um local prazeroso de permanecer. Obrigada a cada um (a)!
Aos amigos da linha de expressão heteróloga, Eliane (Eli-te), André (Doctor), Filipe
(Filipe-te), Marcelo (Tchecha) e Luciana (Lu) por funcionarmos em grupo, com diferentes
habilidades que foram compartilhadas e que ao final somaram-se. Pelos inúmeros momentos
de risadas e alegria. Vocês tornaram esses anos bem especiais para mim. Obrigada-TE! (o TE
é interno!!.rsrs).
As meninas Denise, Carol, Angélica e Heidi por dividirem comigo um local de
moradia feliz. O viver tranquilo e alegre fez toda a diferença ao longo desse tempo. Obrigada,
meninas!
Ao professor Roberto Soares de Castro pela colaboração para a realização desse
trabalho, sua orientação e confiança prestada. Isto foi essencial para a finalização da Tese.
Obrigada, Professor!
Ao pessoal da Universidade Federal Rural, Ana Cláudia e Sérgio pelo curto tempo que
trocamos experiência, mas de ótimo convívio. Em particular, à Ana pela sua excelente e
essencial ajuda nos experimentos de ELISA. Muito obrigada, pessoal!
A Professora Inês Portela Lobato da UFMG pela colaboração e fornecimento dos
soros suínos utilizados. Agradecida, Professora!
A professora Clara Nilce Barbosa pelo “ponta pé” inicial dos estudos com Circovírus
no LEMTE-UFPE
A professora Suely Galdino (in memoriam) pelo seu exemplo de entusiasmo pela
pesquisa e por seu notório interesse pelos objetivos comuns aos “PPGITeanos”. Seu exemplo
não pode ser esquecido!
Aos Professores da pós-graduação que com suas experiências ajudaram à minha
formação.
Ao secretário do PPGIT, Paulo, pelo auxílio de forma correta e exemplar para os
PPGITeanos em geral. Obrigada, Paulo!
Tudo tem o seu tempo determinado, e há tempo
para todo o propósito debaixo do céu.
Há tempo de nascer e tempo de morrer; tempo
de plantar e tempo de arrancar o que se
plantou;
Tempo de matar e tempo de curar; tempo de
derrubar e tempo de edificar;
Tempo de chorar e tempo de rir; tempo de
prantear e tempo de dançar;
Tempo de espalhar pedras e tempo de ajuntar
pedras; tempo de abraçar, e tempo de afastar-se
de abraçar;
Tempo de buscar e tempo de perder; tempo de
guardar e tempo de lançar fora;
Tempo de rasgar e tempo de coser; tempo de
estar calado e tempo de falar;
Tempo de guerra e tempo de paz
REI SALOMÃO
RESUMO
.
O Circovírus Suíno (CVS) é um vírus de DNA fita simples, que pertence à família
Circoviridae, com genoma de 1,7kilobases. Apresenta dois tipos principais, o CVS1 e o
CVS2. O CVS1 não é patogênico, enquanto que o CVS2 está associado a um conjunto de
doenças como a Síndrome Multissistêmica do Definhamento de Suínos (SMDS). Estes tipos
virais possuem a proteína Rep, essencial para replicação e a proteína Cap, formadora do
capsídeo. A pCap possui epítopos imunoreativos e imunodominantes e tem sido utilizada
como um antígeno tanto para o diagnóstico, quanto para aplicação vacinal, contra infecções
causadas pelo CVS2. Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica que utiliza metanol como
única fonte de carbono e tem sido utilizada para expressar genes heterólogos por apresentar
vantagens como, a realização de modificações pós-traducionais e sua fácil manipulação.
Objetivou-se nesse estudo expressar o gene Cap códon-otimizado do CVS2 para expressar em
Pichia pastoris, visando a produção secretória da pCap e sua aplicação como antígeno
recombinante em imunoensaios. Para tanto, a construção pPICZαA/CVS2Capo obtida após
clonagem gênica foi inserida no genoma da levedura por eletroporação e o sistema foi
induzido com metanol, sob o controle do promotor AOX1, por 72h. Os clones expressos
positivamente foram identificados em Colony blot e Dot blot, após a reação dos clones com
anticorpo-antiHis. A rCap foi detectada com massa molecular de ~39 kDa em sobrenadante
da P. pastoris por SDS-PAGE e Western blot. Neste último, a detecção foi feita pelo
reconhecimento da rCap por anticorpos anti-CVS2 de soros de animais com histórico de
SMDS. A rCap testada em ELISA indireto contra soros de animais sabidamente negativos e
positivos, previamente determinados pela imunoperoxidase (IP), mostrou alta eficiência
discriminatória com alta razão positivo/negativo de 597. Após análise preliminar de
parâmetros concordantes e discordantes, entre o IP e ELISA, observou-se uma alta
concordância entre eles. Os resultados representam a efetiva produção da rCap pela via
secretória de P. pastoris, com sugestiva preservação dos epítopos imunoreativos na mesma.
Isto demonstra a viabilidade do sistema eucarioto de expressão utilizado e o potencial uso da
rCap para detecção de anticorpos anti-CVS2 como ferramenta auxiliar no diagnóstico de
doenças causadas pelo CVS2 como a SMDS.
PALAVRAS-CHAVE: Circovírus Suíno 2. Pichia pastoris. proteína do capsísdeo. antígeno
recombinante. ELISA indireto.
ABSTRACT
The pig circovirus (CVS) is a single strand, which belongs to the family Circoviridae with 1.7
kilobase genome DNA viruses. It has two main types, the PCV1 and PCV2. The PCV1 is not
pathogenic, whereas PCV2 is associated with a number of diseases such as Postweaning
Multisystemic Wasting Syndrome of Swine (SMDS). These viral types have the Rep protein
essential for replication and Cap protein, forming the capsid. The pCap has immunodominant
and immunoreactive epitopes and has been used as an antigen for both diagnosis and vaccinal
application against infections caused by PCV2. Pichia pastoris is a methylotrophic yeast that
uses methanol as sole carbon source has been used to express heterologous genes by its
advantages as the realization of post-translational modifications and its easy handling. The
objective of this study express the codon-optimized gene for PCV2 Cap the express in P.
pastoris, targeting secretory production of pCap and its application as a recombinant antigen
in immunoassays. For this, the construction (pPICZαA/CVS2Capo) obtained after cloning the
gene was inserted into the genome of yeast by electroporation and the system was induced
with methanol, under the control of AOX1 promoter, for 72h. The expressed clones were
positively identified in Colony blot and Dot blot after reaction with antibody-antiHis clones.
The rCAP was detected with a molecular mass of ~39 kDa in the supernatant of P. pastoris by
SDS-PAGE and Western blot. In the latter, the detection was made by rCap recognition by
anti-PCV2 antibodies in sera from animals with a history of PMWS. The rCap tested in
ELISA against sera from known negative and positive animals, previously determined by
immunoperoxidase (IP), showed high efficiency with high discriminatory reason
positive/negative 597. Upon preliminary analysis of concordant and discordant parameters
between the IP and ELISA, there was a high correlation between them. The results represent
an effective production rCap the secretory pathway of P. pastoris with suggestive
preservation of immunoreactive epitopes in the rCap. This demonstrates the viability of
eukaryotic expression system used and the potential use of rCap for detection of anti-PCV2
antibodies and as an auxiliary tool for diagnosis of diseases caused by PCV2 like PMWS.
.
KEY WORDS: Porcine Circovirus 2. Pichia pastoris. capsid protein. recombinant antigen
ELISA.
LISTAS DE ILUSTRAÇÕES
Página
Figura 1: Organização Genômica do Circovírus Suíno 2
22
Figura 2: Microscopia eletrônica dos vírions do CVS2
33
Figura 3: Estrutura secundária da proteína do Capsídeo
34
Figura 4: Mapa do vetor pPICZα (Invitrogen)
41
Figura 5. Estratégia da construção do gene Cap otimizado de CVS2 para
expressão em Pichia pastoris.
44
Figura 6: Comparação entre a utilização do codon usage de P. pastoris e os
utilizados para a expressão do gene do capsídeo otimizado de CVS2
53
Figura 7: Comparação entre a utilização dos códons utilizados por P. pastoris
e os utilizados para a expressão do gene do capsídeo selvagem de CVS2
54
Figura 8: Alinhamento das sequências nucleotídicas do genes cap selvagem e
códon otimizado de CVS2.
56
Figura 9: Esquematização da obtenção do gene Capo e do vetor de expressão
pPICZαA
56
Figura 10: Obtenção do gene Capo e do vetor de expressão pPICZαA.
57
Figura 11: Ilustração da clonagem do gene Capo no vetor pPICZαA
58
Figura 12: Confirmação da clonagem do gene Cap no vetor pPICZαA
58
Figura 13: Alinhamento da construção pPICZα/CVS2Cap com o gene Cap
códon otimizado de CVS2
59
Figura 14: Linearização da construção pPICZαA/CVS2Capo
60
Figura 15: Triagem dos recombinantes de Pichia pastoris em Colony blot
61
Figura 16: Screening dos recombinantes de Pichia pastoris em Dot blot
62
Figura 17: Proteína Recombinante (rCap) analisada por SDS-PAGE
63
Figura 18: Imunodetecção da Proteína recombinante do capsídeo de CVS2
(rCap) em Western Blot
64
Figura 19: Padronização do ELISAr
65
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Principais componentes do vetor pPICZα (Invitrogen) e suas
funções
41
Tabela 2. Volumes e concentrações dos reagentes utilizados na reação de
46
digestão
Tabela 3: Diluições testadas do antígeno recombinante, do soro e da
proteína-G na padronização do ELISA indireto
64
Tabela 4: Comparação dos resultados de soros de suínos testados
pelo IP, teste de referência, com os resultados da DO450nm do ELISA
65
LISTA DE ABREVIATURAS
A
ABIPECS: Associação da indústria produtora e exportadora de carne suína
AOX1: Álcool oxidase 1
AOXp: Promotor AOX1
B
BMGY: Meio complexo tamponado com glicerol
C
CpG: citosina-guanina dinucleotídeos
CaCL2: Cloreto de Cálcio
CVS: Circovírus Suíno
CpG: Cotosina-Granina - Olinonucelotídeo
D
D.O: densidade ótica
DNA: ácido desoxirribonucleico
DACVS: Doenças Associadas ao Circovírus Suíno
E
ELISA: Ensaio Imunoadsorvente ligado à enzima
ELISA-r:
H
HS: hibridização “in situ”
I
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IF: Imunofluorescência
IPMC: Imunoperoxidase em camada de Células
L
LB: Meio Luria Bertani
LPD:Leite em pó desnatado
M
MSC: Múltiplo sítio de Clonagem
N
ng: nanogramas
nt: nucleotídeo
O
ORF: Fase aberta de leitura
P
PEG: Polietilenoglicol
pBSK: Vetor de clonagem pBluescriptSK
pCap: proteína do capsídeo
PCRq: Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa
PVDF: Fluoreto de polivinildileno
S
SEAB: Secretaria de Estado da Agricultura e do Abastecimento
T
TBS: Tris Buffered Saline
TCA: Ácido tricloacético
V
VLPs: Partículas semelhantes a vírus
Y
YPD: Meio extrato de levedura peptona glicose
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO
17
2. REVISÃO DE LITERATURA
19
2.1 Suinocultura
19
2.2. Circovírus
19
2.2.1 Organização Genômica e Replicação
21
2.3. Doenças associadas ao circovírus suíno 2 (DACVS2)
23
2.3.1 Síndrome Multissistêmica do Definhamento em Suínos (SMDS)
25
2.4. Diagnóstico para Doenças associadas ao circovírus suíno 2
26
2.4.1 Diagnóstico laboratorial
28
2.4.2 Diagnóstico sorológico
29
2.5. Transmissão e controle das DACVS2
31
2.6 Proteína do casídeo (pCap) de CVS2
33
2.6.1 Estrutura e Função
33
2.6.2 Produção da Proteína do Capsídeo (pCap) do CVS2 em sistemas
36
recombinantes de expressão
2.7 Sistema heterólogo de expressão em levedura
37
2.7.1 Pichia pastoris como sistema de expressão heteróloga
38
43
3. OBJETIVOS
3.1 Geral
43
3.2 Específico
43
44
4. METODOLOGIA
4.1. Obtenção do gene Cap de CVS2 códon-otimizado
44
4.2. Clonagem do gene Cap em vetor de expressão pPICzαA
44
4.2.1. Preparação de células competentes de E. coli via CaCl2
45
4.2.2. Transformação plasmidial em Escherichia coli
45
4.2.3 Extração plasmidial, digestão e ligação
46
4.2.4
Análise
dos
clones
pPICZαA/CVS2Capo
sequenciamento
4.3. Protocolos de manipulação de Pichia pastoris
por
digestão
e
46
47
4.3.1 Eletrocompetência das células de Pichia pastoris
4.3.2 Eletroporação da construção pPICZαA/CVS2Cap em Pichia
pastoris
4.4. Imunoensaios para triagem dos clones recombinantes em Pichia pastoris
47
47
48
4.4.1 Colony Blotting
48
4.4.2 Dot Blotting
48
4.5 Indução dos recombinantes de Pichia pastoris com cultivos em frascos
4.6. Tratamento com os sobrenadantes com Polietilenoglicol (PEG) e Ácido
tricloroacético ( TCA)
49
49
4.7 Análise por SDS (dodecil-sulfato de sódio de poliacrilamida) e Western Blot
50
4.8. ELISA indireto
51
4.8.1 Padronização do ELISA indireto (Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay)
5. RESULTADOS
51
52
5.1. Análise in silico do gene Cap de CVS2 códon otimizado Cap de CVS2
52
5.2. Clonagem do gene Cap otimizado (Capo) em vetor de expressão pPICZαA
56
5.3. Análise dos recombinantes de Pichia pastoris através do screening em
Colony blotting e Dot blotting
5.4. Detecção da proteína recombinante do capsídeo (rCap) de CVS2 por SDSPAGE e Western Blot
5.5. Padronização do ELISA indireto
60
61
63
6. DISCUSSÃO
65
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÃO
75
8. PERSPECTIVAS
76
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
77
17
1. INTRODUÇÃO
A suinocultura progrediu em muitos países como China, Estados Unidos e os países da
União Européia, os quais representam 80% da produção mundial de carne suína. A
representatividade do Brasil neste mercado mundial é de 3,1% (SEAB, 2013). O crescimento
no comércio mundial de carne suína estimulou entre os produtores, um aprimoramento de
técnicas de manejo, nutrição e reprodução dos suínos, assim como uma maior preocupação
com a saúde dos animais nos plantéis. A intensificação do comércio de animais pode propiciar
a multiplicação e disseminação de vários patógenos, principalmente vírus e bactérias,
resultando na ocorrência de surtos de enfermidades que acarretam elevados prejuízos
econômicos (BARCELLOS et al., 2008).
Circovírus Suíno (CVS) é um agente patogênico viral que é amplamente distribuído
em suínos por todo o mundo e de grande importância para suinocultura mundial. São vírus
pertencentes à família Circoviridae que inclui dois tipos: o CVS1, que não é patogênico e o
CVS2. Ambos o tipos virais possuem duas principais ORFS (quadro aberto de leitura). A
ORF1 codifica a proteína replicativa rep, e a ORF2, codifica a única proteína estrutural do
capsídeo, cap. A proteína Cap possui sítios de reconhecimento para o receptor viral e forma o
capsídeo viral e representa o antígeno imunodominante do vírus, responsável pela produção
de anticorpos neutralizantes. Nela estão contidos epítopos imunoreativos e imunoconservados,
reconhecedores de anticorpos anti-CVS2. Isto a torna eleita para ser utilizada como marcador
sorológico da infecção com circovírus, ou para uma estratégia protetora, como as vacinas
contra este patógeno (FENAUX et al., 2003; BUCAREY et al., 2009).
O CVS2 está associado a um conjunto de doenças como: doença reprodutiva de Suíno,
doença respiratória de Suíno, doença entérica, dermatite e nefropatia Suína e a síndrome
multissistêmica do definhamento de suínos (SMDS), que é a mais importante (BAEKBO,
KRISTENSEN, LARSEN, 2012). As infecções com CVS2 promovem variados níveis de
depleção linfocitária, e agressão à primeira linha de defesa da resposta imune celular,
infectando macrófagos e células dendríticas (KIXMOLLER et al., 2008). Um quadro
inflamatório também é comum nos órgãos afetados. A evolução das doenças causadas pelo
CVS2 é influenciada pela presença de multifatores, como: predisposição do hospedeiro e o
seu quadro imunológico, co-infecções virais ou bacterianas. Particularmente, a SMDS causa
distúrbios em vários sistemas, o que dificulta o diagnóstico dessa doença (SEGALÉS, 2012).
18
Nas doenças causadas pelo CVS2, os animais podem ser diagnosticados, se
apresentarem: sinais clínicos e lesões macroscópicas em órgãos específicos, lesões
histopatológicas, em tecidos alvos e a presença do antígeno de CVS2.
O diagnóstico laboratorial das infecções pelo CVS2 pode ser feito através de
isolamento viral, imunofluorescência (IF), imunoperoxidase (IP) (ALLAN E ELLIS, 2000),
hibridização in situ (HS) (NAWAGITGUL et al., 2000) e PCR (Reação em cadeia da
Polimerase) (CALSAMIGLIA et al., 2002). A HS e IHQ são mais comumente aplicadas para
identificação
do
Circovírus
Suíno
2,
entretanto
a literatura aponta que testes
imunoenzimáticos, como o IP e ELISA, também tem sido bem escolhido. O ELISA por
apresentar maior acurácia e praticidade é um teste bem sugerido e atualmente, um ELISA
realizado com antígenos recombinantes tem sido muito atrativo (NAWAGAITGUL et al.,
2000).
Antígenos recombinantes produzidos em diferentes sistemas de expressão heteróloga,
têm sido aplicados no campo da pesquisa de doenças veterinárias (COUTINHO et al., 2012;
GONÇALVEZ et al., 2010). Sistemas de expressão como Pichia pastoris, Escherichia coli,
Saccharomyces cerevisae e Baculovírus já têm sido testados para expressão do gene Cap de
CVS2 visando à produção de proteínas recombinantes de interesse para diagnósticos e ou
vacinação (WU et al., 2008; KAMSTRUP et al., 2004; FENAUX et al., 2003).
Dentre estes sistemas, a levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido usada com
grande sucesso (CREGG, CEREGHINO, HIGGINS, 2000), devido a apresentar
características
peculiares
que
exercem
muitas
vantagens
sobre
outros
sistemas
(MACAULEY-PATRICK et al., 2005), tais como: simplicidade das técnicas para a
manipulação genética, capacidade de produzir proteínas heterólogas em altos níveis,
habilidade de realizar modificações pós-traducionais, tipicamente associadas a eucariotos
superiores, e de secretar proteínas solúveis para o meio (GELLISSEN, 2000). Além disso,
esta levedura tem um padrão de glicosilação similar ao das células animais e não promove
hiperglicosilação como Saccharomyces cerevisiae que pode afetar a função biológica da
proteína produzida (CREGG, CEREGHINO, HIGGINS, 2000).
Neste trabalho o gene Cap do Circovírus Suíno 2 com o códon otmizado foi expresso em
sistema eucarioto utilizando a levedura Pichia pastoris como hospedeira. A proteína
recombinante do capsídeo (rCap) do CVS2 produzida por via secretória apresentou
bioatividade contra soros de suínos positivos para CVS2 em imunoensaios. A rCap foi
utilizada como antígeno em teste de ELISA indireto a fim de averiguar sua potencial
imunoreatividade. Parâmetros intrínsecos ao teste, como sensibilidade e especificidade, foram
19
determinadas para fins comparativos entre o ensaio teste ELISA, e o teste de referência,
Imunoperoxidase em Monocamada de Células (IPMC).
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Suinocultura
A produção mundial de carne suína possui grande representatividade. A China ocupa o
primeiro lugar, seguida da união Européia e Estados Unidos. O Brasil atualmente ocupa a
quarta posição, com representatividade de 3,1% da produção mundial (ABIPECS, 2013). A
carne suína é a fonte de proteína animal mais consumida mundialmente, sendo praticamente o
dobro da carne bovina. A Europa, América do Norte e Oceania, representam a ordem
decrescente do consumo mundial. O consumo no Brasil ainda é superado pela carne Bovina
(ABIPECS, 2013; SEAB, 2013).
O acentuado crescimento de consumo e vendas veio acompanhado da modernização
mundial da indústria suinícola, nas últimas duas décadas, com melhorias dos sistemas
produtivos, das tecnologias envolvidas na produção, bem como do manejo e padrões de abate
(SEAB, 2013). O aumento no tamanho dos sistemas de produção (granjas ou complexos de
granjas e núcleos) trouxe paralelamente um aumento na densidade animal incrementando a
pressão de infecção. A intensificação do comércio de animais de uma região para outra, criou
uma situação propícia para a multiplicação e disseminação de vários patógenos,
principalmente vírus e bactérias (BARCELLOS et al., 2008). Em vista disso, a Suinocultura
está sendo exposta a problemas técnicos e econômicos, com exigência de implantação de
programas sanitários e de biossegurança mais refinados (BARCELLOS et al., 2008). Este
contexto tornou evidente a necessidade de uma maior atenção à saúde dos plantéis.
2.2 Circovírus
A família Circoviridae compreende dois gêneros bem descritos: Circovírus e
Gyrovírus. O primeiro, infecta suíno e aves (gansos, papagaios, patos, cisne, corvo, canários);
o segundo infecta somente galinhas. Foi sugerido pertencer ao gênero Gyrovirus um tipo de
vírus que pode infectar humano (SAUVAGE et al., 2011) e um Circovírus que infecta peixes
(LORINCZ et al., 2011). Phan et al. (2012) sugeriram um novo gênero para a família,
chamado de Cyclovírus, que consiste no tipo viral que infecta chimpanzés e humanos.
20
Circovírus são vírus não-envelopados, de simetria icosaédrica, com tamanho do
genoma variando entre 1,7 a 2,3 kilobases, com DNA circular de fita simples (ss-DNA). São
os menores vírus de mamíferos conhecidos e impressiona não somente por induzir uma
patogênese complexa, mas também por possuir um reduzido material genético que responde
todas as necessidades funcionais da maquinaria do vírus (FINSTERBUSCH e MANKERTZ,
2009).
O Circovírus Suíno foi descoberto através de análises de microscopia eletrônica, na
forma de um contaminante persistente que infectava células de rim de suíno da linhagem PK15, mas que não promovia efeito citopático (TISCHER et al., 1982). Nestas análises foi
observada a presença de um DNA circular de fita simples, daí o nome dado à amostra viral
recém-achada de Circovírus (vírus circular) (TISCHER et al., 1974). O vírus foi inicialmente
chamado de CVSnp (Circovírus não patogênico) (HAMEL et al., 1998), e hoje é denominado
de Circovirus Suíno tipo 1 (CVS1). Uma nova variante patogênica foi nomeada de Circovírus
da síndrome do definhamento de suínos (CVSsmds) (ALLAN et al., 1998; ELLIS et al.,
1998), e atualmente é denominado de Circovírus Suíno tipo 2 (CVS2). Assim, foram
definidos dois tipos virais: um que não induz a doença (CVS1) e outro (CVS2) ao qual estão
associadas todas as patologias causadas pelo circovírus suíno (SEGÁLES, 2012).
Baseado no nível de variação genética da ORF2 (fase aberta de leitura), cinco subtipos tem sido descritos: CVS2 (a, b, c, d, e) (TRIBLE & ROWLAND, 2012; BAEKBO,
KRISTENSEN, LARSEN ET AL., 2012 et al., 2012). O CVS2 tem sido detectado em muitos
lugares do mundo como: Europa, América, Austrália, China, Tailândia e Corea. O genótipo
CVS2c foi detectado somente na Dinamarca e os genótipos CVS2d e CVS2e, somente na
Ásia (DUPONT et al., 2008; JANTAFONG et al., 2011). Entretanto, a proposta dos novos
genótipos CVS2d e CVS2e tem sido controversa (CORTEY et al., 2011).
O Circovírus Suíno tipo 2 é reconhecido por ter a maior taxa de mutação dentre os
vírus de DNA, quando comparada à razão de mutação de um vírus de RNA (PÉREZ et al.,
2011). Vírus quiméricos contendo a ORF1 do subgrupo 2a e ORF2 do subgrupo 2b têm sido
encontrado no mesmo hospedeiro, implicando que eventos de recombinação são frequentes no
gênero Circovírus (KIM et al., 2009). Ademais, a literatura relata que outros vírus podem
infectar células já infectadas pelo CVS2, favorecendo a recombinação gênica e uma maior
diferenciação antigênica dentro do grupo (LEFEBVRE et al., 2009).
2.2.1 Organização Genômica e Replicação
21
Ambos os tipos virais, CVS1 e CVS2, possuem um total de onze ORFs (fase aberta de
leitura), das quais três (ORF1, ORF2 e ORF3) são as mais conhecidas. Em ambos os tipos
virais a ORF1 codifica a proteína Rep e a ORF2 codifica a proteína Cap. A primeira (Rep) é
uma proteína essencial para replicação do vírus e a segunda (Cap) é a única proteína estrutural
formadora do capsídeo (cap) (FENAUX et al., 2003). A ORF3 codifica uma proteína que
induz a apoptose (LIU et al., 2006). Acerca das demais, ainda não se conhece as funções das
proteínas que codificam (HAMEL et al., 1998). O estudo de Hamel et al. (1998) somente
descreveram os produtos protéicos das ORFs 4, 5, 6, 7 e 8 em relação às sequências
numéricas dos aminoácidos e sobre a identificação de sítios de glicosilação. Sobre os
aminoácidos, estas ORFs codificam pequenas proteínas com até 115 aminoácidos, e quanto
aos sítios de glicosilação partilhados foram descritos nas ORFs 1, 2, 4, 5 e 6. Tais sítios na
ORF4 foram descritos em ambos os tipos virais, enquanto que nas ORFs 5 e 6 foi apenas
revelado no CVS1 (HAMEL et al., 1998).
O tamanho do genoma para CVS1, CVS2a e CVS2b é 1759, 1768 e 1767 pb,
respectivamente. Os dois subtipos CVS1 e CVS2 apresentam uma organização genômica com
aproximadamente 80% de similaridade. Entre os sub-tipos de CVS2 a identidade na sequência
de nucleotídeos é de 95%. Os genes rep de CVS1 e CVS2 possuem 83% de identidade na
sequência nucleotídica e 86% na sequência de aminoácidos, enquanto que o gene cap de
ambos apresenta alta divergência antigênica, com identidade de 67% na sequência
nucleotídica e 65% na sequência de aminoácidos (GILLESPIE et al., 2009). Acredita-se que
isto contribua para a diferença da patogenia do vírus entre CVS1 e CVS2 (MANKERTZ et
al., 2004).
A duas maiores ORFs, ORF1 e ORF2, do Circovírus têm uma orientação contrária no
genoma (orientação ambisense). O gene cap apresenta uma orientação anti-horária (3’-5’),
diferente do gene rep. Tal conformação cria duas regiões intergênicas: uma curta e uma maior
que compreende a origem de replicação (ORI), localizada entre os terminais 5’
(FISNTERBURG e MANKERTZ, 2009). A origem de replicação apresenta uma estrutura
haste-volta; adjacente a esta estrutura existem motivos conservados (Hexâmeros 1-4) que são
sítios de ligação da replicase. A haste (stem) é formada por uma sequência de onze pares de
bases repetidas e invertidas formando um palíndromo, enquanto que a volta (loop) contém
entre 10 e 12 nucleotídeos (12 no CVS1 e 10 no CVS2), onde está um motivo de octâmeros
conservados (AXTAXT * ACC), onde * indica o sítio de clivagem (CHEUNG, 2012), como
mostra a figura 1. A ORF3 está localizada na fita viral negativa e tem tamanhos diferentes nas
variantes de CVS (CVS1 = 621 nd e CVS2= 315 nd) (LIU et al., 2006).
22
Figura 1: Organização Genômica do Circovírus Suíno 2.
Genoma circular mostrando as principais ORFs (Fase aberta
de leitura). Em preto a ORF1, codificadora da protéina de
replicação (Rep); Em cinza, a ORF2, codificadora da proteína
do capsídeo (Cap); Região intergênica com a formação da
estrutura stem-loop (haste-alça); Origem da replicação (Ori);
H: hexâmero. Fonte: Finsterbusch e Mankertz (2009), com
algumas modificações.
O gene rep sofre splicing e forma duas proteínas rep e rep’ que são essenciais para a
replicação, a qual somente ocorre se ambas forem expressas simultaneamente (MANKERTZ
e HILLENBRAND, 2001). A proteína Rep’ regula negativamente o promotor que controla a
transcrição do gene rep (MARKERTZ e HILLENBRAND, 2003). A replicação do Circovírus
é via círculo rolante, um mecanismo que é largamente usado em plasmídeos de bactérias,
fagos e plantas (CHEUNG, 2012). O processo de replicação, que converte o DNA fita
simples, em um DNA fita dupla é realizado por enzimas expressas na fase S do ciclo celular
do hospedeiro (FINSTERBUSCH e MANKERTZ, 2009).
A preferência do tipo de células para replicação do vírus ainda não é consensual. O
CVS2 já foi encontrado em linhagens de monócitos, macrófagos e células dendríticas (ALAN
et al., 1994), mas estes tipos de células não são alvos eficientes para replicação do vírus
(GILPIN et al., 2003). Outras evidências indicam que o vírus pode ser encontrado em
linfócitos (DARWICH e MATEU, 2012), e que o CVS2 se replica em linfoblastóides
provocando lise celular (RODRÍGUES-CARIÑO et al., 2011). Recentemente, grandes
23
quantidades de vírus foram encontradas em células mononucleares e endoteliais de vasos
sanguíneos em pulmões de suínos jovens (CINO-OZUNA et al., 2011).
Quando alcança o sucesso da replicação, o CVS2 de modo geral causa variados níveis
de depleção linfocitária e imunosupressão (OPRIESSNING, MENG, HALBUR, 2007),
caracterizando à ação viral na modulação da resposta imune do hospedeiro. Estudos tem
demonstrado que esta capacidade está associada à multifatores, como: predisposição do
hospedeiro, pois dependendo da linhagem do suíno os sinais clínicos da doença são mais
severos, e à presença de co-infecções virais e bacterianas (BEACH e MENG, 2012).
2.3 Doenças Associadas ao Circovírus Suíno 2 (DACVS2)
Atualmente, o Circovírus Suíno 2 é um dos mais importantes patógenos virais sob o
ponto de vista econômico para suinocultura (MENG, 2012). Desde a sua primeira descrição, a
abrangência clínica e patológica tem diversificado bastante, ao ponto que hoje se reconhece
um conjunto de doenças oriundas da infecção por este patógeno. Este conjunto de doença é
denominado de Doenças Associadas ao Circovírus Suíno, conhecido mundialmente como
PCVAD-Porcine circovirus-associated disease. Nesse conjunto de doenças se inclui:
Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS), Síndrome da Nefropatia e
Dermatite Suína, Doença respiratória de Suíno, Síndrome reprodutiva de Suíno (BAEKBO,
KRISTENSEN, LARSEN et al., 2012), tremor congênito (STEVENSON et al., 2001;
FRANÇA et al., 2005) e Doença entérica (SEGÁLES, 2012). Vale ressaltar que após o estudo
de Kennedy et al. (2003) o tremor congênito A2 não tem sido mais associado ao CVS2.
Além de infecções clínicas associadas a este vírus, ocorrem hoje as infecções
subclínicas. Estudos baseados em sorologia demonstraram que o CVS2 é ubíquo, enquanto
que a prevalência das doenças clínicas é baixa. Estudos sugerem a hipótese que estas
infecções subclínicas podem ser provenientes da ineficiente resposta protetora de algumas
vacinas atuais utilizadas contra as circoviroses (SEGALÉS, 2012).
Uma marca das infecções causadas por este tipo viral é o quadro de inflamação e
depleção linfocitária. Nas infecções subclínicas e na síndrome Nefropatia e Dermatite Suína,
o nível de depleção varia de baixa a moderada, com inflamação granulomatosa dos tecidos
linfóides. Na doença reprodutiva do suíno não ocorre lesão em tecidos linfóides, e na entérica
a depleção e a inflamação ocorrem nas placas de Peyer (SEGÁLES, 2012). Na SMDS ocorre
a forma mais severa de depleção linfocitária, afetando as células B, T e células NK (TRIBLE
et al., 2012), provocando grave queda dos anticorpos anti-CVS2 (CHAE , 2004).
24
Muito embora a causa da depleção ainda não seja completamente compreendida, ela
parece ser originada pela infecção do CVS2 nos precursores dos linfócitos na medula óssea ou
no timo. O CVS2 já foi encontrado infectando o timo, e as lesões tímicas têm ocorrido
simultaneamente com a depleção de linfócitos de outros tecidos (MAGAR et al., 2000,
DARWICH e MATEU, 2012). Na medula óssea não é encontrada esta relação, embora este
órgão também possa ser infectado (OPRIESSING et al., 2009). Shibahara et al. (2000) têm
proposto que a apoptose de linfócitos B pode contribuir para esta depleção. Chang et al.
(2007) têm reforçado a idéia de ativação de apoptose via infecção do CVS2, pela consequente
ativação de NF-kB e o ligante Fas/Fas. Muito embora, Krakowka et al. (2004) afirmem que a
apoptose não está diretamente relacionada com a severa depleção linfóide de SMDS.
Ocorre um quadro inflamatório crônico nos animais infectados com CVS2
(SEGÁLES, 2012) coerente com a ineficiente resposta imune inata devido às alterações no
padrão de citocinas dos tecidos linfóides. Esta modificação é refletida pelo aumento da IL-12,
IL-10, IL-1 e IL-8 e pela indução de vírions completos e VLP (virus like-particles).
(DORTER et al., 2010). As citocinas secretadas pelas células T são diminuídas, por
consequência da depleção linfocitária nestas células (DARWICH e MATEU, 2012).
O DNA de CVS2 induz supressão de IFN-α e reduz a capacidade de destruição dos
macrófagos, além de interferir na apresentação de antígeno das células dendríticas mielóides.
Respostas a padrões moleculares associados a patógenos, como os motivos CpG, interferem
na capacidade de resposta endocítica das células dendríticas plasmocitóides e mielóides,
devido à presença da dupla fita (ds) de DNA do vírus (CHANG et al., 2006). Esta mudança
no padrão da resposta imune inata, pela infecção por CVS2, oferece aos microrganismos
oportunistas a chance de induzirem infecções, fazendo com que o suíno infectado adquira
deficiência nas respostas imunes. Sendo assim, a Síndrome multissistêmica pode ser
considerada uma doença semelhante à imunodeficiência secundária (DARWICH et al., 2004;
DARWICH e MATEU, 2012).
Contudo, Darwich e Mateu (2012) relataram que em casos naturais de infecção com
CVS2 a remoção do vírus parece ser mediada por anticorpos neutralizantes e resposta
mediada por células.
2.3.1 Síndrome Multissistêmica do Definhamento de Suínos - SMDS
Dentre estas manifestações clínicas associadas ao CVS2, a primeira descrita foi a
SMDS (OPRIESSING, MENG, HALBUR, 2007; BAEKBO, KRISTENSEN, LARSEN et al.,
25
2012). Atualmente é uma das doenças emergentes em suínos causadas pelo CVS2, que tem
recebido mais atenção dos pesquisadores e dos suinocultores (MENG, 2012), sendo a mais
importante sob o ponto de vista econômico e patogênico.
Sobre sua descrição, esta síndrome foi inicialmente observada em Suínos como uma
doença esporádica e caracterizada por definhamento e palidez, em 1991, no Canadá
(HARDING, 1997; SEGÁLES, 2012). No Brasil, a SDMS foi diagnosticada em 2000, na
Região Sul (CIACCI-ZANELLA e MORÉS, 2003). Logo depois a presença de antígenos
virais de CVS2 associada a esta síndrome, foi observada no Rio de Janeiro (FRANÇA, 2004),
São Paulo (CASTRO et al., 2003) e Minas Gerais (BARBOSA et al., 2011).
A SMDS tem sido diagnosticada em todos os continentes, incluindo Oceania (GRAUROMA et al., 2011). Muitos países Europeus enfrentaram uma epidemia com alta perda de
suínos pós-desmamados (BAEKBO, KRISTENSEN, LARSEN et al., 2012). No decorrer
desse período foram observados que os sinais clássicos da síndrome acometendo suínos em
fase de crescimento, com alta mortalidade, mudou para uma forma mais severa, acometendo
animais de mais idade. A alta mortalidade pós-desmame tem provocado trágico efeito nos
rebanhos afetados, devido à acentuada perda de peso frequente dos animais (BAEKBO,
KRISTENSEN, LARSEN et al., 2012). Na América do Norte, o que predomina é o
acometimento da síndrome em suínos em crescimento, de até seis semanas de idade
(BAEKBO, KRISTENSEN, LARSEN et al., 2012). A diferença na idade em que os suínos
são acometidos parece estar associada a diferentes técnicas de manejo e esquema de
vacinação (SHULZE et al., 2003).
A alta mortalidade em conjunto com o uso de antibióticos repercute os custos
provocados pela doença, estimados em 600 milhões de Euros por ano na União Européia
(SEGALÉS, GORDON, DOMINGO, 2005).
2.4 Transmissão e Controle das Doenças Associadas ao CVS2
A transmissão da doença é decorrente de duas hipóteses: a da transmissão vertical ou
da horizontal. A detecção da carga viral de CVS2 já foi descrita em amostras de sêmen
(MADSON et al., 2009), colostro, soro, fluidos oral e nasal e excreção fecal (PATTERSON et
al., 2011). O contato com suínos infectados, instalações, equipamentos e fômites são fatores
prováveis na transmissão horizontal do vírus; fatores de risco causadores de estresse, como
densidade elevada, baixa qualidade do ar, água e ração, mistura de lotes com procedência e
26
idades diferentes, e a presença de enfermidades concomitantes podem intensificar as
manifestações clínicas e favorecer o desenvolvimento da doença (FRANÇA et al., 2005).
Uma das formas de controle da doença é através de técnicas de manejo e alojamento
dos animais, como agrupar um número menor que 400 animais por rebanho, técnicas de
higiene, uso de antibióticos para controle e eliminação de infecções secundárias, diminuição
de fatores que provocam estresse, boa nutrição, e também, a forma atual mais eficiente que é a
vacinação (PEJSAK et al., 2010). As co-infecções possuem um importante papel para as
doenças associadas ao vírus, e o controle dessas infecções, com auxílio do diagnóstico dos
agentes causadores, diminuem a severidade da doença. A maioria das co-infecções é devido à
presença de bactérias e vírus, principalmente Mycoplasma hypneumoniae e o vírus da
síndrome respiratória e reprodutiva do suíno (OPRIESSNING, MENG, HALBUR, 2007).
Existem quatro vacinas comerciais: Porcillis® PCV (Merck), Circumvent PCV
(Intervet, Merck), Ingelvac CircoFLEX (Boehringer), Circovac® (Merial) e a vacina
Fostera™ PCV2 (Pfizer), recentemente introduzida, mas que consiste na reformulação e
substituição da Suvaxin® PCV2 (Fort Dodge Animal Health) (BEACH e MENG, 2012). A
Circovac® (Merial) foi a primeira licenciada na Europa e a primeira que chegou no Brasil. De
forma geral, a literatura tem mostrado uma boa avaliação das vacinas atuais no controle das
circoviroses suínas, devido à indução das respostas imunes, humoral e celular, observadas em
condições experimentais em camundongos e suínos (KIXMOLLER et al., 2008). Dentre as
vacinas atuais, as mais bem sucedidas foram baseadas na indução da resposta imune contra a
proteína do capsídeo de CVS2 (FACHINGER et al., 2008). As avaliações em animais
vacinados mostraram boa eficácia em estudos experimentais e de campo, com o aumento no
número de anticorpos e diminuição da mortalidade (OPRIESSNING, MENG, HALBUR,
2007). Em outras avaliações foi notada redução na carga viral em tecidos linfóides e nas
lesões (BEACH e MENG, 2012). Estes modelos experimentais tem sido estabelecidos com o
CVS2 e outros patógenos (ALLAN et al., 2000).
O largo interesse em vacinar animais infectados com CVS2, com ou sem sinais
clínicos aparentes, parece ter diminuído o interesse em diagnosticar, devido a grande
dificuldade em estabelecer um diagnóstico padrão aceito pelas agências internacionais
(SEGALÉS, 2012) e também, devido à presença de diferentes antígenos virais, provenientes
de novas variantes do vírus, como o CVS2b que tem sido prevalente em muitas populações de
suínos provocando alta severidade da circovorisose (BEACH e MENG, 2012).
Até o momento, as estratégias vacinais foram baseadas no genótipo de CVS2a (FORT
et al., 2009), assim como, todas as reproduções experimentais da SMDS (FORT et al., 2008).
27
Tem sido demonstrado que o uso dessas vacinas e a boas práticas de manejo diminuem a
severidade das circoviroses, mas estas recentes diferenças na virulência podem remeter a
questionamentos na eficácia das vacinas já desenvolvidas. Trible e Rowland (2012)
demonstraram que a presença simultânea dos dois genótipos, CVS2a e CVS2b, ou somente o
CVS2b ou CVS2a, define uma doença clínica ou subclínica, respectivamente. Enquanto que
Cortey et al. (2011) observaram o aparecimento simultâneo da SMDS e a mudança de
genótipo de CVS2a para CVS2b. Diferenças na virulência possuem importante implicação no
entendimento das diferentes manifestações clínicas, podendo influenciar no desenvolvimento
de futuras vacinas (OPRIESSNING, MENG, HALBUR, 2007). Entretanto, vale ressaltar que
mesmo após 20 anos da descrição do CVS2, o mecanismo preciso das infecções ainda deve
ser bem elucidado (SEGALÉS, 2012).
Logo, chama-se à atenção para considerar que as vacinas para CVS2 podem não
responder como se espera ou fracassar, devido a novas variantes do vírus (BEACH e MENG,
2012), e assim, um diagnóstico sorológico, diferenciando animais vacinados, de animais com
infecção natural, tem sido proposto devido à prática em massa da vacinação (BEACH E
MENG, 2012). Neste sentido, novos contextos de interesse no diagnóstico têm surgido, como:
1) confirmação do diagnóstico nos animais, com sinais semelhantes aos das doenças
associadas ao vírus, mesmo tendo sido vacinados; 2) nas fazendas em que os resultados da
vacinação foram ou estão abaixo das expectativas. Cino-Ozuna et al. (2011) investigaram
rebanhos vacinados contra circovirose, e obervaram que nos animais em idade jovem, com
decaimento de anticorpos maternos, apresentavam edema pulmonar, e que a variante presente
foi o CVS2b. O edema pulmonar é observado no estágio final da doença, devido às infecções
secundárias, mas neste trabalho o achado macroscópico, foi estritamente vinculada somente à
presença do CVS2, diferentemente das outras doenças associadas ao vírus (CINO-OZUNA et
al., 2011).
Nenhuma proposta de diagnóstico tem sido procurada tanto quanto para SMDS,
comparada às outras doenças associadas ao vírus (SEGALÉS, 2012). Assim, o interesse pelo
diagnóstico ainda existe e esta demanda pode ser realizada através de monitoramento
sorológico, somado a um completo estudo diagnóstico, incluindo sinais clínicos e lesões em
órgãos e tecidos (SEGALÉS, 2012).
2.5 Diagnóstico para Doenças Associadas ao CVS2
28
Existe uma extensa lista de sinais clínicos para diagnosticar cada doença clínica
associada ao CVS, porém muitos desses sinais se repetem entre as infecções, principalmente
na SMDS, que a infecção viral afeta mais de um órgão (SEGÁLES, 2012). Isto é bem
exemplificado pelo fato de que em todas as doenças associadas ao vírus, com exceção da
entérica e reprodutiva, o DNA e o antígeno viral é encontrado nos tecidos linfóides que são
mais afetados na SMDS (SEGALÉS, 2012).
O CVS2 sendo ubíquo, o diagnóstico deve ser bem rigoroso, não podendo se restringir
à detecção do vírus, ou à presença de anticorpos contra ele (OPRIESSNIG, MENG,
HALBUR, 2007). Barbosa e Freitas (2011), avaliando rebanhos brasileiros concluíram que
achados macroscópicos não são suficientemente conclusivos de que o animal está com SMDS
(BARBOSA e FREITAS, 2011). Desse modo, sinais clínicos, macroscópicos e
microscópicos, lesões histopatológicas e a presença do antígeno, devem ser considerados em
conjunto para o diagnóstico das doenças associadas ao CVS2 (SEGALÉS, 2012). Mas isto
tem sido bem desafiador para os veterinários de campo, de forma mais particular, referente à
SMDS, pois a presença de antígenos virais já foi observada em animais sem a doença e em
diversos tecidos e órgãos (BARBOSA et al., 2011; SEGALÉS, 2012).
Segundo Segáles (2012), aspectos macroscópicos e microscópicos sugerem que tipo
de infecção clínica o animal possui. Entretanto, em todas as doenças é indispensável à
detecção do antígeno de CVS2. Assim, a classificação da manifestação clínica está associada
à abundância do antígeno nas lesões e em determinados órgãos, como descrito a seguir:
Respiratória do Suíno (com lesões nos pulmões) ou Nefropatia e Dermatite Suína, se
houverem lesões na pele e rins, ou Síndrome reprodutiva do Suíno, se presente lesões nos
tecidos cardíacos de fetos, ou Doenças entéricas, com um quadro clínico severo de diarreia
(SEGÁLES, 2012). Se a presença do antígeno estiver associada a lesões em mais de um
tecido linfóide; ou em um tecido linfóide e pelo menos um órgão como: pulmão, fígado, rins,
intestino, baço; ou em dois desses órgãos, a doença sugerida é a SMDS (OPRIESSNING,
MENG, HALBUR, 2007).
Uma proposta tem sido formalizada para se estabelecer um diagnóstico, ao nível de
rebanho, com dois principais elementos para SMDS: 1) aumento significante de mortalidade
pós-desmame, com a presença de sinais compatíveis com a síndrome; 2) um diagnóstico
individual compatível com a doença, de pelo menos um animal, a cada três necropsiados
(SEGALÉS, 2012). Individualmente, o animal deve apresentar três critérios: 1) presença de
sinais clínicos; 2) lesões macroscópicas e microscópicas, moderadas a severa, em tecidos
29
linfóides e 3) alta quantidade de CVS2 nas lesões típicas (FINSTERBUSCH e MANKERTZ,
2009).
Referente aos aspectos macroscópicos, o animal doente apresenta: alta perda de peso,
definhamento grave, palidez (figura 2). Pulmões não colapsados e o aumento de 3 a 4 vezes
no tamanho dos linfonodos (SEGALÉS, GORDON, DOMINGO, 2005; BAEKBO,
KRISTENSEN, LARSEN et al., 2012). Estes sinais devem ser simultâneos a achados
histológicos no tecido linfático, como: depleção linfática, infiltração histiocítica, corpos de
inclusão e células gigantes (SEGALÉS, GORDON, DOMINGO, 2005). Adicionalmente, o
antígeno do CVS2 deve estar presente especificamente nos tecidos linfóides com lesões
típicas (SEGALÉS, 2012).
É válido descrever que para SMDS a inoculação isolada de CVS2 até promove
alterações microscópicas, mas não produz os sinais clínicos correspondentes à SMDS
(ROVIRA et al., 2002; FRANÇA et al., 2005). Isto demonstra que a infecção com CVS2 é
necessária,
mas
não
suficiente
para
o
desenvolvimento
clínico
da
síndrome
(FINSTERBUSCH e MANKERTZ, 2009; SEGALÉS, 2012). A não ser quando reproduzida
experimentalmente com outros agentes infecciosos como bacterianos e virais (Allan et al.,
2004).
2.5.1 Diagnóstico laboratorial
Muitos métodos laboratoriais podem ser utilizados para completar o diagnóstico das
doenças causadas pelo CVS2 (FRANÇA et al., 2005). Tais métodos são: isolamento viral
(TISCHER et al., 1982), imunohistoquímica (IHQ) (ELLIS et al., 1998), hibridização “in
situ” (HS) (NAWAGTIGUL et al., 2000), imunofluorescência (IF) (ALLAN e ELLIS, 2000),
teste de reação em cadeia da polimerase - PCR e suas variantes como: PCR nested de tubo
único (PONTES et al., 2012) e PCR em tempo real (GRAU-ROMA et al., 2008). Outros
métodos como a imunoperoxidase (IP) (BARBOSA et al., 2011) e ELISA (Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay) têm sido utilizados (OPRIESSING, MENG, HALBUR, 2007). Sorden
(2000) descreveu que a IHQ e HS são os métodos de escolha. Entretanto, quando ambas
foram comparadas, a HS foi mais sensível (KIM e CHAE, 2004).
A técnica de isolamento viral pode ser utilizada, muito embora não seja comumente
realizado pelo tempo consumido, pela necessidade de muitas passagens de cultivo, que podem
induzir mutações no vírus (RACINE et al., 2004). Devido ao CVS2 tipicamente não induzir
30
efeito citopático, para o uso dessa técnica é necessário que a observação seja através de
imunofluorescência ou imunoperoxidase (RACINE et al., 2004).
A técnica de imunohistoquímica consiste em um método que detecta antígenos virais
em tecidos. Para uso dessa técnica, as amostras de tecidos devem ser coletadas na fase S
mitótica (ou replicativa) do vírus, pelo fato de haver mais antígenos virais para serem
marcados e melhor visualizados pela IQH (SEGÁLES et al., 2005). O baixo nível replicativo
inerente ao CVS2 pode representar uma limitação para IHQ. Para detecção do DNA viral do
CVS2 na amostra tecidual, o DNA tem que ser quantificado em torno de 500ng e com uma
carga viral mínima de 108, por uma técnica complementar (BRUNBORG, MOLDAL,
JONASSEN et al., 2004). Em animais com SMDS o vírus foi detectado em órgãos não
linfóides (BARBOSA e FREITAS, 2011), este fato pode requerer uma análise de diversos e
variados tecidos, caso esta técnica seja escolhida para o uso.
A existência da forte relação entre a presença de antígeno, ou DNA, e a severidade de
lesões histológicas, tem sido sugerida para detecção do DNA viral (SEGALÉS, 2012) pela
técnica de PCR em tempo real. A sensibilidade dessa técnica apesar de conhecida, não a torna
o método substituto da histopatologia das doenças associadas ao vírus (GRAU-ROMA et al.,
2008). Entretanto, quando comparadas às técnicas de IQH e HS, a PCR em tempo real foi
mais precisa que as duas (KIM e CHAE, 2004), mas a HS foi mais específica que a IQH. A
PCRq tem sido utilizada para diagnóstico da SMDS na quantificação em casos subclínicos,
mas para as demais doenças é de pouquíssimo uso (GRAU-ROMA et al., 2008).
2.5.2 Diagnóstico Sorológico
Ensaios sorológicos são ferramentas que podem ser empregadas com a finalidade de
monitorar rebanhos, para fins diagnóstico ou epidemiológico. Uma caracterização sorológica
pode fornecer informações essenciais para programas de vacinação e medidas individuais de
controle para diferentes rebanhos (FAUSTO, 2010). Além de promover um conhecimento
tanto atual, quanto retrospectivo da população infectada (MAGAR et al., 2000). Para as
doenças associadas ao CVS2, a sorologia pode fazer parte do conjunto necessário para
diagnosticá-las.
Através de estudos sorológicos foi constatado que a infecção pelo vírus é de alta
prevalência 95% a 100%, contrariamente à ocorrência da doença clínica com 5 a 15%
(RODRÍGUEZ-ARRIOJA et al., 2000). Rodriguez-Arrioja et al. (2000) detectaram a presença
de anticorpos anti-CVS2 antes de serem associados aos sinais clínicos da SMDS,
31
corroborando aos achados de estudos retrospectivos de Mesu et al. (2000) e Magar et al.
(2000) que detectaram o antígeno viral em animais sem sinais clínicos. O desenvolvimento da
síndrome em rebanhos infectados com CVS2, com e sem sinais clínicos da SMDS já foi
registrado por Blanchard et al. (2003).
O método de IF e IP são empregados para localização de antígenos em células ou
tecidos. Para IF utiliza-se um anticorpo conjugado a fluorocromo. O complexo formado é
visualizado através de microscópio de fluorescência, e o anticorpo + flurocromo a cada
experimento tem que ser mudado (FERREIRA e ÁVILA, 1996). Este método tem sido
descrito para CVS2, na detecção do CVS2 inteiro e também de antígenos codificados pela
ORF2 do vírus. Para IP emprega-se uma enzima conjugada ao anticorpo. A enzima possui
maior capacidade de amplificação comparada ao flurocromo, e age convertendo um
cromógeno em um produto solúvel, tal qual pode ser visualizada em microscópio óptico
comum (FERREIRA e ÁVILA, 1996). Este último teste é usado largamente para CVS2
(BARBOSA et al., 2011; BLANCHARD et al., 2003; OPRIESSNING, MENG, HALBUR,
2007).
O ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) tem por princípio básico a
imobilização do imunobiológico em uma fase sólida, enquanto o anticorpo pode ser ligado a
uma enzima. O substrato (cromógeno) origina produtos solúveis coloridos, através da
degradação enzimática. O teste é capaz de detectar quantidades extremamente pequenas de
antígenos e anticorpos, e devido a esta alta sensibilidade pode ser executada em microescala,
o que o torna bastante econômico dada à reduzida quantidade dos reagentes utilizados (GIL,
GIL, KUBOTA, YAMAMOTO, 1999). Logo, caracteriza-se pela elevada sensibilidade,
especificidade, bem como rapidez, baixo custo, simplicidade técnica, versatilidade,
objetividade de leitura e possibilidade de automação (FERREIRA e ÁVILA, 1996).
Os testes de IF, IP e ELISA são tradicionalmente realizados com antígenos obtidos
através de propagação in vitro do vírus (WALKER et al., 2000). Particularmente, para
propagação do CVS2 isso é uma aparente desvantagem devido à dificuldade de reproduzi-lo
experimentalmente, haja vista à natureza replicativa do vírus (ALLAN e ELLIS, 2000).
Contrapondo as características do ELISA, os métodos de imunofluorescência e IPMC são
imunoensaios que apresentam a limitação de não serem automatizados e com leituras
consideradas subjetivas (OPRIESSING, MENG, HALBUR, 2007).
Os três ensaios podem ter sua sensibilidade e especificidade alteradas dependendo do
antígeno utilizado (WALKER et al., 2000; GE et al., 2012). Se baseados em antígeno
propagado em cultura celular, a sensibilidade pode ser prejudicada porque a taxa replicativa
32
do CVS2 é baixa, e pode ter alteração na especificidade devido à possibilidade de haver
reações cruzadas entre diferentes sequências antigênicas trocadas entre agentes infecciosos,
ou com outras proteínas do vírus (MAGAR et al., 2000). Na tentativa de evitar estes vieses
vem sendo utilizados anticorpos monoclonais (MCNEILLY et al., 2001) e antígenos
recombinantes (TRUONG et al., 2001).
2.6 Potencial diagnóstico e vacinal da proteína do Capsídeo (pCap) do CVS2
É única proteína estrutural de 233 aminoácidos, de massa molecular de 30kDa,
codificada pela ORF2 (gene Cap), cuja função é formar o capsídeo icosaédrico do circovírus.
Nawagitgul et al. (2000) observaram que a proteína recombinante da ORF2 foi capaz de se
auto-encapsidar, fomando partículas semelhantes ao capsídeo, reforçando sua função
estrutural. Esta capacidade que a pCap possui de se formar espontaneamente em Virus like
particles (VLPs) tem direcionado o seu uso para fins vacinais (ZHOU et al., 2005) ( Figura
2). A proteína do capsídeo (pCap) também contribui para o sucesso da replicação viral ao
participar do reconhecimento de receptores glicanos para a fixação e entrada do vírus ao
interior do núcleo (TRIBLE et al., 2012).
Figura 2: Microscopia eletrônica dos vírions do CVS2.
Virus particle (partícula viral); outer capsid (capsídeo
externo). Fonte: “The Control of Porcine Circovirus
Diseases (PCVDs)”, disponível em http://www.pcvd.net.
Dentre os 233 aminoácidos, os 47 primeiros constituem um domínio de sinalização
nuclear da proteína (NLS). Este domínio está localizado na região N-terminal, e é rico em
resíduos de arginina (TRUNDOVA e CELER, 2007) com a presença de importantes epítopos
33
funcionais (figura 3a). A região C-terminal também possui epítopos funcionais importantes
para reconhecimento de anticorpos (figura 3).
Figura 3: Estrutura secundária da proteína do Capsídeo. Em A: Extremidades
arredondadas, azul e vermelha, indicam o N e o C terminal da proteína. As letras (B,C,
D,G, H, I, F) indicam resíduos de reconhecimento para anticorpos. Em B: Estrutura
secundária da VLP completa. Fonte: Khayat et al., (2011).
A pCap é considerada a mais imunogênica do vírus (FENAUX et al., 2003). Uma
proteína é reconhecida por ter propriedade imunogênica quando induz resposta imunológica
com produção de anticorpos ou contém sítios de reconhecimento para ligação de anticorpo
(GIL, KUBOTA, YAMAMOTO, 1999). Epítopos conformacionais neutralizantes tem sido
identificados nesta proteína (BLANCHARD et al., 2003; LEKCHAROENSUK et al., 2004;
SHANG et al., 2009). Mahé et al. (2000) sugerem a relação da imunoreatividade da pCap com
a patogenicidade do vírus. Reação cruzada de soros dos dois subtipos virais com a ORF1 foi
observada, enquanto que o antígeno de CVS2-ORF2 reagiu apenas com o soro de CVS2,
demonstrando um reconhecimento específico da ORF2 somente com o subtipo viral CVS2
(MAHÉ et al., 2000).
Os epítopos específicos incluindo os resíduos 69-83 e 117-131 são importantes para
reconhecimento de anticorpos no soro de animais infectados com CVS2 (MAHÉ et al., 2000).
Devido a anticorpos terem sido gerados contra o epítopo 117-131, em todos os animais
experimentalmente infectados por CVS2, esta região foi considerada como um marcador
sorológico (TRUONG et al., 2001). Outros resíduos diferentes, como: 136-146 e 101-150
(WU et al., 2008) tem sido propostos como marcadores sorológicos, devido a conservação
deste epítopo em diferentes isolados do CVS2, e também, pela especificidade de detecção de
isolados do CVS2, comparada à ausência de detecção do CVS1 e de outros vírus suínos.
34
Lekcharoensuk et al. (2004) observaram regiões imunoreativas nos resíduos 47-85,
165-200 e 200-233, assim como domínios chaves de reconhecimento de anticorpos
conservados entre os genótipos do vírus. Estes pontos chaves foram observados nas seguintes
posições e aminoácidos: 70-Asp, 71-Met, 77-Asn, 78-Asp, 113-Glu, 115-Asp, 127-Asp e 203Glu. Os resíduos 201-Ile e 201-Tyr foram considerados essenciais para o reconhecimento de
anticorpos (KHAYAT et al., 2011).
Trible et al. (2012) relataram que ocorre diferença qualitativa nas respostas
imunológicas, dependendo de quais resíduos são reconhecidos primeiro. Animais vacinados,
animais infectados experimentalmente e clinicamente doentes foram analisados, com
constatação de que no primeiro grupo a primeira ligação anticorpo-epítopo (Ac-Ep) foi
direcionada para o resíduo 43-233, a qual gerou uma forte reação neutralizante contra o vírus.
No último grupo, também ocorreu reconhecimento do pequeno epítopo 169-180, que é
altamente conservado entre os isolados de CVS2. Contudo este não produz resposta protetora
aos animais, o que parece ser um mecanismo de defesa do CVS2 para se replicar. Este grupo
de pesquisadores relatou que os resíduos 173-Tyr, 174-Phe e 175-Glu também são chaves
para ligação de anticorpos, sendo o primeiro resíduo localizado visivelmente na superfície de
uma VLP. A remoção ou ausência de um desses três resíduos é suficiente para inibição do
reconhecimento do anticorpo (TRIBLE et al., 2012).
Mutações de substituição na sequência de aminoácidos (na posição 110, com a troca
de prolina por alanina; e na posição 191, na troca de arginina por serina), resultou em uma
menor viremia, na diminuição de sinais histológicos e no quadro patológico geral dos animais
infectados, implicando na participação da pCap na virulência do CVS2 (FENAUX et al.,
2004; TRIBLE e ROWLAND, 2012).
Estas considerações apontam a importância da pCap não somente na modulação da
resposta imunológica no hospedeiro, favorecendo à patogênese viral, mas sobretudo aponta
que a presença de epítopos imunoconservados e imunoreativos são importantes para
desencadear resposta imunológica protetora. Logo, estudos tem sido realizados com objetivo
de averiguar o potencial uso da proteína do capsídeo em vacinas, bem como, objetivando o
diagnóstico para circovirose suína 2 (WU et al., 2012).
2.7 Produção da Proteína do Capsídeo (pCap) do CVS2 em sistemas recombinantes de
expressão
35
Muitas construções recombinantes baseadas na sequência da proteína do Capsídeo de
CVS2 são descritas na literatura, fazendo uso de sistemas eucariotos e procariotos de
expressão, para diferentes finalidades.
Para finalidade vacinal, a pCap já foi produzida em sistema de expressão de
baculovírus e pelo seu potencial imunogênico observado, hoje são empregadas como vacinas
comerciais (FORT et al., 2008). Este sistema eucarioto também tem sido o escolhido por
outros autores (ZHOU et al., 2005; KIXMOLLER et al., 2008). Diferentemente dos
anteriores, mas ainda tratando-se de um sistema eucarioto, Fan et al. (2007) utilizaram um
“falso” baculovírus, que infecta células de mamíferos. Em todos os trabalhos, nos animais
inoculados com baculovírus recombinante foi observada eficácia na indução da resposta
imune contra a proteína do capsídeo de CVS2. Neste sistema foi possível observar a formação
de VLPs da proteína recombinante produzida (FAN et al., 2007).
O sistema de expressão utilizando células das leveduras Pichia pastoris (TU et al.,
2012) e S. cerevisiae (BUCAREY et al., 2009) também já foram utilizadas. Neste último, a
administração oral da pCap produzida induziu anticorpos anti-CVS2 em camudongos
(BUCAREY et al., 2009).
Vacinas de DNA com o gene Cap também já foram descritas por Kamstrup et al.
(2004) e Fenaux et al. (2003). Após a inserção do plasmídeo recombinante, via “gene gun”
em camundongos, verificaram o produção de altos títulos gerados de anticorpos anti-CVS2.
Blanchard et al. (2003) compararam a eficácia de vacinas de DNA e de subunidade, e
observaram maior eficiência da vacina de subunidade através da neutralização viral nos
animais infectados. Outro plasmídeo recombinante, contendo o gene Cap expresso em células
de mamíferos foi observado indutor de respostas humoral e celular, quando testados em
camundongos BalBc (JÚNIOR et al., 2009), reforçando a eficácia dos sistemas de expressão
para obtenção da pCap.
Em sistema procarioto de expressão a pCap já foi produzida em diferentes estratégias.
Trundova e Celer (2007) ao expressarem o gene Cap inteiro em E. coli, reportaram que o
excesso de arginina na porção N-terminal acarreta um efeito prejudicial que provoca
terminação prematura da cadeia polipeptídica. Quando o gene Cap é expresso parcialmente
truncado neste microrganismo, altas concentrações da proteína recombinante são alcançadas.
Porém, a proteína com este domínio deletado pode reter a sua propriedade antigênica
(TRUNDOVA e CELER, 2007). A pCap foi também produzida no procarioto Lactococcus
lactis, na sua forma inteira e na sua forma truncada (WANG et al., 2008).
36
Em E. coli a formação de VLPS foi observada, mas ao pCap produzir a poteína
truncada, sem os 50 primeiros aminoácidos, ou com deleção do aminoácidos 51-103, houve
formação irregular das VLPs (WU et al., 2012). Ambas as VLPs foram testadas como
imunógenos em suínos, e foi possível conferir resposta protetora nestes testes.
O potencial imunoreativo da pCap na detecção de anticorpos de CVS2, tem
direcionado o interesse de investigar sua aplicação no diagnóstico contra Circoviroses. Wu et
al. (2008) testaram diferentes subunidades do gene Cap para averiguar seu potencial
antigênico, após produzir a subunidades da pCap em E. coli. As diferentes porções estudadas,
porções de A a F, apresentaram diferença na sensibilidade e especificidade no teste de ELISA,
para a detecção de anticorpos. A subunidade C, que compreende os nt 101 a 150, apresentou a
maior sensibilidade. Enquanto que a subunidade F, constituída pelo nt 51 a 233, apresentou
uma menor sensibilidade. Os autores sugerem que esta região tende a formar agregados
insolúveis que podem interferir na ligação com o Ac e no revestimento de placa no ELISA.
Todavia, concluíram que a região F é importante para formação do capsídeo viral, e a região
C-terminal é rica em regiões com alta especificidade a anticorpos anti-CVS2, e pode ser
empregada para métodos de sorodiagnósticos para infecções pelo CVS2.
2.7 Sistema de expressão heterólogo em levedura
Desde os últimos 25 anos, diferentes microrganismos incluindo levedura, fungos
filamentosos e bactérias são utilizados para produção de proteínas recombinantes (proteínas-r)
para fins de pesquisa, para estudos farmacológicos ou para interesse comercial (GASSER et
al., 2008). Espécies diferentes de leveduras são comumente utilizadas como hospedeiras para
produção de proteínas recombinantes, porque elas somam as vantagens de um microrganismo
eucariótico unicelular (como fácil manipulação genética, rápido crescimento) com a
capacidade de realizar modificações pós-traducionais. Diferente de outros organismos
eucarióticos mais complexos, os sistemas de expressão em levedura são considerados
econômicos, em que se alcançam altas densidades celulares sem a presença de pirógenos
(ÇELIK e ÇALIK, 2011).
O sistema utilizando S. cerevisiae é o mais bem caracterizado para expressão em
levedura até os dias atuais (GELLISSEN e HOLLENBERG, 1997). Desde 1980, um vasto
conhecimento acerca dessa levedura foi adquirido, quanto a sua biologia molecular, genética e
fisiologia, com a obtenção de muitos produtos recombinantes reconhecidos pela FDA (Food
and Drug Agency) através dele (GELLISSEN e HOLLENBERG, 1997). A primeira vacina
37
recombinante comercializada contra hepatite B foi um dos primeiros produtos
comercialmente importante produzido neste sistema (ÇELIK e ÇALIK, 2011). Até hoje, os
avanços de produção de proteínas-r permitiram elucidar muitas vantagens e particularidades
desse sistema, assim como algumas desvantagens, como hiperglicosilação das proteínas e uma
razão baixa de secreção (TORRES e MORAES, 2000). Isto tem implicado em certo
enfraquecimento do uso comercial dessa levedura, segundo revisado por Çelik e Çalik (2011).
Ainda assim, S. ceverisiae é o hospedeiro preferido para produção de metabólitos e o
hospedeiro modelo para estudo de doenças em humanos (PETRANOVIC e NIELSON, 2008).
Entretanto, outros sistemas alternativos de expressão têm emergido.
Se elencadas as vantagens de cada levedura, consequentemente as desvantagens
também serão mostradas. Portanto, estando isto devidamente claro, pode-se seguir alguns
parâmetros para otimizar o sistema de escolha objetivando a produção eficaz da proteína de
interesse, tornando o sistema o mais eficiente possível. Çelik e Çalik (2011), consideram que
para o sistema oferecer boa produção de proteínas exógenas, deve-se selecionar os seguintes
aspectos: 1) Selecionar um hospedeiro capaz de realizar modificações pós–traducionais e um
empacotamento adequado das proteínas; 2) escolha de um vetor com um promotor
apropriado; 3) códon otimizar o gene; 4) fusionar o gene a uma etiqueta (tag), para fins de
purificação; 5) escolher uma sequência sinal para induzir a proteína-r para o meio extracelular
ou intracelular e prevenir clivagem proteolítica do produto, com cuidadoso bioprocessamento
da cultura.
As leveduras reconhecidas como hospedeiras para produção de proteínas
recombinantes
compreendem:
Hansenula
polymorpha,
Kluyveromyces
lactis,
Schizosaccharomyces pombe e Pichia pastoris (ÇELIK e ÇALIK, 2011). Muitas delas já
foram sequenciadas e isto tem permitido um conhecimento vasto acerca de cada uma.
Particularmente, P. pastoris teve seu sequenciamento finalizado em 2009 (ÇELIK E ÇALIK,
2011) e esta levedura recebe destaque no presente trabalho.
2.7.1 Pichia pastoris como sistema de expressão heteróloga
A levedura Pichia pastoris é uma levedura metilotrófica, ou seja, utiliza metanol
como única fonte de carbono. No curso da metabolização dessa levedura, o metanol sofre
oxidação com a utilização do oxigênio molecular, sob a ação da enzima álcool oxidase,
gerando formaldeído. Outro produto formado nesta reação é o peróxido de hidrogênio. O
38
processo metabólico ocorre na organela peroxissomo, a qual funcionalmente sequestra estes
sub-produtos tóxicos, afastando-os do resto da célula. A enzima álcool oxidase tem uma
afinidade baixa para O2, e a levedura compensa isto pela geração de grandes quantidades da
enzima. O promotor que regula a produção da álcool oxidase é utilizado para dirigir a
expressão de proteínas heterólogas em Pichia, denominado de promotor AOX1 (DALY e
HEARN, 2005). Esta levedura cresce preferencialmente, por via respiratória, ao invés da
fermentativa, possibilitando seu cultivo para uma produção de maior densidade celular (LINCEREGHINO et al., 2002).
Dois genes de P. pastoris, AOX1 e AOX2, codificam a álcool oxidase, todavia a maior
atividade enzimática é atribuída ao produto do gene AOX1. Na organela peroxissomo a álcool
oxidase, juntamente com a catalase, promovem a degradação do peróxido de hidrogênio em
oxigênio e água. Parte do formaldeído sai do peroxissomo e é oxidado para formato e dióxido
de carbono, por ação de duas desidrogenases citoplasmáticas, resultando na fonte de energia
para o crescimento celular da levedura em metanol (CEREGHINO e CREGG, 2000). O
formaldeído restante é requerido para formar constituintes celulares, através da condensação
do formaldeído com xilulose 5-monofosfato, uma reação catalisada pela enzima peroxissomal
diidroxiacetona sintase. Os produtos da presente reação, gliceraldeído-3-fosfato e
dihidroxiacetona, deixam o peroxissoma e ocorre a restituição da xilulose 5-monofosfato, e a
cada três ciclos, uma molécula de gliceraldeído 3-fosfato (CEREGHINO e CREGG, 2000).
A expressão do gene AOX1 é controlada a nível transcricional. Este promotor requer a
presença do metanol para atingir altos níveis de transcrição, mesmo na presença de outra fonte
de carbono repressora, como a glicose (CEREGHINO e CREGG, 2000). Isto identifica uma
vantagem do promotor, pois restringe ao longo do crescimento da biomassa, a seleção e ou
expressão de contaminantes/mutantes (IAN e MEAGHER, 2001). A forma como o metanol é
utilizado categoriza os fenótipos das linhagens de P. pastoris. A perda do gene AOX1, e
consequentemente a redução de atividade da álcool oxidase, define um fenótipo dentre as
linhagens dessa levedura, denominado de Mut s (Mut-) (Methanol utilization Slow), a qual é
definida como uma cepa com habilidade reduzida de metabolizar o metanol. Ao contrário do
fenótipo Mut + (Methanol utilization Plus) que se refere à cepa com crescimento padrão na
presença de metanol (CEREGHINO e CREGG, 2000).
O sistema de expressão utilizando a levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido
largamente escolhido ao longo de várias décadas (LIN-CEREGHINO et al., 2013). Tal
39
sistema de expressão apresenta características peculiares que exercem muitas vantagens sobre
outros sistemas (MACAULEY-PATRICK et al., 2005), tais como a simplicidade das técnicas
para a manipulação genética, a capacidade de P. pastoris de produzir proteínas heterólogas
em altos níveis e a habilidade de realizar modificações pós-traducionais tipicamente
associadas a eucariotos superiores (GELLISSEN, 2000). O padrão de glicosilação dessa
levedura é muito similar ao das células animais e não promove hiperglicosilação como
Saccharomyces cerevisiae (CEREGHINO e CREGG, 2000).
A produção de proteínas heterólogas em Pichia pode ser intracelular ou secretada.
Naturalmente, P. pastoris secreta pouca proteína endógena, portanto, em uma expressão
secretória de P. pastoris encontram-se mais proteínas recombinantes no sobrenadante. Diante
disto se ressalta a vantagem da facilidade de recuperação das proteínas heterólogas para suas
definidas aplicações, através deste sistema (LIN-CEREGHINO, 2006). Existem variados
vetores de expressão que podem ser utilizados neste sistema, seja para expressão do produto
do gene por via intracelular ou via extracelular. Alguns desses vetores são: o vetor pHIL-D2,
pPIC9K, pPIC9, pFLDα, pPICz (A,B,C), pPICzα (A, B, C) (DALY E HERAN, 2005). Os
três primeiros foram os vetores de primeira geração, que diferem dos demais principalmente
pelo tamanho, pois possuem em torno de 9,5 kb, e também, pela marca de seleção dos
plasmídeos recombinantes. O vetores mais utilizados atualmente são menores, possuindo em
torno de 3,6 kb, e utilizam a zeocina para seleção dos recombinantes (DALY e HEARN,
2005).
De forma geral, tratando-se de um vetor de expressão secretória, o processo irá
requerer a presença de uma sequência sinal que direcionará a proteína para ser exportada da
célula (LIN-CEREGHINO et al., 2013). A sequência sinal de secreção nativa de S. cerevisiae,
o fator α-pre-pro peptídeo, tem sido usado largamente, muito embora mais de oito peptídeos
sinais de secreção sejam conhecidos (LIN-CEREGHINO et al., 2013). O sinal de secreção
nestes vetores está upstream (à montante) do sítio múltiplo de clonagem (MSC), local onde o
gene exógeno é inserido, a fim de que o mesmo seja clonado na mesma fase de leitura. O
vetor pPICZα trata-se de um vetor utilizado para secreção da proteína recombinante. Na
figura 5 está o mapa do vetor com seus componentes. Na tabela 1 estão listados os
componentes e sua funções.
40
Figura 4: Mapa do vetor pPICZαA (Invitrogen). Fonte: Invitrogen, 2009.
Tabela 1: Principais componentes do vetor pPICZα (Invitrogen) e suas funções
Componentes
Função
5´AOX1
Promotor que permite a indução por metanol
Fator α
Sequência do peptídeo sinal que direciona a secreção da
proteína
MSC
Múltiplos sítios de Clonagem
Tags c-myc e 6xhis
Permitem a detecção da proteína com anticorpos contra
cada Tag. A tag 6xhis também permite a purificação da
proteína recombinante
Região Terminadora da Transcrição
AOX1 TT
TEF1 e EM7
CYC TT
pUC ori
Ambos são promotores que dirigem a expressão do gene Sh
ble conferindo resistência à Zeocina. PTEF1 no gene de P.
pastoris e EM7 no gene de E.coli
Região 3` do gene CYC1 S. cerevisiae que controla o
processamento eficiente do RNAm do gene Sh ble
Permite a replicação e manutenção do plasmídeo em E.coli
Os aspectos que popularizaram o uso e aplicação dessa levedura para produção de
proteínas recombinantes como: o uso de substratos baratos para crescer, capacidade de
secretar poucas proteínas endógenas para o meio, fácil manipulação de cultivo, habilidade de
empacotamento ideal da proteína recombinante, produção de pequenos resíduos de manose,
41
em comparação aos produzidos em S. cerevisiae, ausência de um resíduo altamente
imunogênico como o α 1-3 ligado à manose, que é produzido em Saccharomyces,
repercutiram a aplicabilidade deste sistema a mais de três décadas, para produzir diversas
proteínas (DALY e HEARN, 2005). Assim, muitos genes de diferentes procedências já foram
expressos sob o controle do promotor AOX1, como genes de vírus (COIMBRA et al., 2011;
JESUS et al., 2011, COUTINHO et al., 2013), de bactérias, de fungos (ZHANG et al., 2003),
de invertebrados (OUTCHKOUROV et al., 2002). Aproximadamente, mais de 500 proteínas
já foram produzidas neste sistema (MACAULEY-PATRICK et al., 2005).
Muitos esforços visando maior aplicabilidade dessa levedura são descritos. Tais
esforços incluem: melhoria no bioprocessamento da levedura, com foco em maiores
concentrações das proteínas obtidas (COS et al., 2006a), avaliação da influência de diferentes
promotores na produção final, estudos das respostas ao estresse celular, visando o estudo do
ambiente de crescimento celular e sua importância na expressão (COS et al., 2006b),
associação entre a formação correta ou não de pontes dissulfeto, que
influenciam na
expressão das proteínas recombinantes (WU et al., 2012). Somado a estes interesses, o recente
sequenciamento do genoma de P. pastoris (SHUTTER et al., 2009) tem permitido estudos
mais abrangentes acerca, por exemplo, das chaperoninas que auxiliam o empacotamento das
proteínas envolvidas na via secretória assim como, estudos de glico-engenharia que consistem
na deleção dos genes envolvidos na hiper-manosilação (LIN-CEREGHINO et al., 2013), a
fim de que o produto terapêutico final não tenha sua eficácia reduzida, visto que, glicosilação
não-humana reduz a meia-vida da proteína e estimula a resposta imunogênica à carboidratos
estranhos (HAMILTON e GERNGROSS, 2007).
42
3
OBJETIVOS
3.1 Geral
•
Produzir a proteína recombinante do capsídeo do Circovírus Suíno 2, utilizando a
levedura metilotrófica Pichia pastoris, e analisar sua imunoreatividade in vitro, a fim
de padronizar um ensaio sorológico para Circovirose Suína 2.
3.2 Específicos
•
Expressar o gene do capsídeo de CVS2 códon otimizado (Capo) para Pichia pastoris
no vetor extracelular pPICZα
•
Produzir a proteína recombinante do capsídeo (rCap) via secretória em P. pastoris
•
Averiguar a imunoreatividade da rCap na detecção de anticorpos anti-CVS2 em soros
de animais positivos para CVS2
•
Padronizar um ensaio sorológico utilizando a rCap como antígeno
43
4. METODOLOGIA
4.1 Construção do gene Cap de CVS2 códon-otimizado
A construção do gene do capsídeo (Cap) foi baseada na seqüência do isolado de CVS2
BRA1 com depósito no genebank (DQ 364650.1). A sequência do gene Cap foi sintetizada
com códons otimizados para expressão em Pichia pastoris. Foram adicionados à sequência o
epítopo AU1 e uma cauda contendo 6xhistidinas, para a imunodetecção da proteína em
ensaios imunoquímicos. A sequência Kex2 foi adicionada, para fins de processamento do
sinal de secreção (figura 6). O programa “Graphical Codon Usage Analyzer” (GCUA),
disponível em http://gcua.schoedl.de foi usado para analisar o codon-usage do organismo
hospedeiro (P. pastoris). O gene foi sintetizado pela Epoch Life Science (TX, USA). O
programa Bioedit foi utilizado para alinhar as sequências, selvagem e otimizada para observar
a modificação dos nucleotídeos entre elas.
Figura 5. Estratégia da construção do gene Cap otimizado de CVS2 para
expressão em Pichia pastoris. Em vermelho (sítios de restrição enzimática); Azul
(sequência Kex2); em preto (ATG – codon incial da tradução); em cinza (Epítopo
AU1); em preto (ORF2); em verde (cauda de polihistidina); em roxo (TAA – códon
de término de tradução); PCV2 (Porcine circovirus 2). Fonte: elaborado pelo autor.
4.2 Clonagem do gene otimizado Cap (Capo) em vetor de expressão pPICzαA
44
O gene Cap codon otimizado veio inserido no vetor pBSK/CVS2Capo, e então, foi
procedida a tranformação bacateriana em E.coli, com posterior reação de digestão com as
enzimas XhoI e NotI (New Englands Biolabs, MA, USA). O produto digerido foi clonado no
vetor de expressão extracelular pPICZαA (Life Technologies, Brasil) para expressão na
levedura P. pastoris. O fator α de secreção, sequência sinal nativa de Saccharomyces
cerevisiae, estava presente no vetor. As etapas seguintes descrevem a metodologia para
obtenção do cassete de expressão (pPICZαA/CVS2Capo).
4.2.1 Preparação de células competentes de E. coli via CaCl2
Antecedendo os protocolos de transformação plasmidial, as células de Escherichia coli
pertencente à linhagem DH5 foram submetidas à quimiocompetência pelo sistema de cloreto
de cálcio (SAMBROOK et al., 1989). Sumariamente, a linhagem a ser transformada foi
inoculada em 50mL de meio LB (extrato de levedura 0,5%; peptona de caseína 1%; NaCl 1%;
Água destilada), crescida 16 horas a 37°C, sob agitação. Após este período, realizou-se o préinóculo com 1mL da cultura em novo erlenmeyer contendo 500ml de LB para crescimento a
37°C, sob agitação, até atingir uma DO600 igual a 0,5. Um volume de 250mL da cultura foi
centrifugada a 5000rpm, por 5 min, a 0°C. O pellet obtido foi ressuspendido em 30mL de
solução gelada de CaCl2 (100mM) e incubado no gelo por 30min. Nova centrifugação a
5500rpm, por 7min, foi realizada para ressuspensão das células em 5ml de solução CaCl2
100mM, 15% de glicerol bem gelados. Alíquotas de 250µL de células competentes foram
armazenadas em freezer -80°C.
4.2.2 Transformação plasmidial em Escherichia coli
Após preparo das células competentes, seguiu-se para transformação das mesmas com
o plasmídeo pBSK/CVS2Capo. Assim, 0,5µg de DNA, 25µl de tampão de transformação e
50µl das células competentes foram incubados no gelo por 30min com posterior choque
térmico a 42°C por 5min. Após isto, as células foram posta 1min no gelo, e a elas foi
acrescentado 800 µl de LB, para recuperação das células, por 1 hora a 37°C. As células assim
transformadas foram posteriormente semeadas em placas de meio de cultura Luria-Bertani
(LB) (Extrato de levedura 0,5%; Peptona de caseína 1%; NaCl 1%; Água destilada) e
ampicilina (100ug/mL), a 37°C, por 16 horas.
45
4.2.3 Extração plasmidial, Digestão e Ligação
As colônias que se mostraram resistentes ao antibiótico, crescidas na placa da
transformação, caracterizaram os possíveis clones. Estas colônias foram inoculadas em meio
líquido LB/Ampicilina para extração posterior extração do plasmídeo pBSK/CVS2Capo. O
kit (Qiagen Plasmid Midi Kit) foi utilizado para extrarir o DNA plasmidial, seguindo o
protocolo segundo as instruções do fabricante. O material proveniente dessa extração foi
empregado para obtenção do gene inserido mediante digestão enzimática com as enzimas
XhoI e NotI. Paralelamente, o vetor pPICZαA de expressão para P. pastoris foi submetido as
mesmas reações.
Após digestão do inserto e do vetor, com suas respectivas concentrações e volumes
observadas na tabela 2 e a corrida eletroforética, ocorreu subsequente excisão do gel de
agarose, para que os fragmentos fossem purificados. O protocolo de purificação foi realizado
segundo as instruções do fabricante do kit utilizado (QIAquick - Gel Extraction Kit).
Tabela 2. Volumes e concentrações dos reagentes utilizados na reação de digestão
DNA Inserto
3 μg (1,5μL)
Vetor
0,6 μg (1μL)
XhoI
1uL (unidade)
Not I
1uL (unidade)
Tampão
2 uL
BSA
0,2 uL
H2O
0,2 uL
Total
20 uL
Após purificação foi obtido 100ng de inserto e vetor, o gene Cap foi ligado ao vetor
segundo a razão molar de 5:1 (inserto: vetor). A reação constituída de inserto: 5 μL, vetor: 1
μL, Tampão, enzima T4 1μL, H20 2μL) foi com a T4 DNA ligase e o tampão New England
Biolabs, durante 20 horas, a 16°C, seguida da inativação enzimática por 10’ a 65°C.
Os cálculos para ligação foram baseados na fórmula:
Cálculo Vetor-inserto, relação de 5:1:
Concentração do vetor x Tamanho em Kb do inserto x 5 = ng do inserto necessária
Tamanho em Kb do vetor
46
Alíquotas desta reação de ligação foram transformadas em E.coli, seguindo o mesmo
protocolo do item 4.2.2, exceto pelo uso do antibiótico de seleção a zeocina (25ug/ml), em LB
Low Salt, que serviu para seleção dos clones contendo a construção pPICZαA/CVS2Capo.
4.2.4 Análise dos clones pPICZαA/CVS2Capo por digestão e sequenciamento
Para análise e confirmação das ligações foi feita uma transformação bacteriana pelo
sistema de cloreto de cálcio e posterior mini extração plasmidial, seguida de digestão
enzimática, com as enzimas XhoI e NotI para a liberação do inserto. Após a visualização em
gel de agarose (1%), as amostras foram sequenciadas para observar a correta inserção do
cassete de expressão. As amostras foram sequenciadas no Núcleo Integrado de Tecnologia
(NIT) do CPqAM-FIOCRUZ, utilizando o sequenciador automático de DNA ABI Prism 3100
(Applied Biosystem®).
4.3 Protocolos para manipulação da levedura Pichia pastoris
4.3.1 Preparação de células eletrocompetentes de Pichia pastoris
Para tal protocolo uma colônia da levedura P. pastoris X-33 (linhagem tipo selvagem)
foi pré-inoculada em 10 mL de YPD (extrato de levedura 1%, peptona 2% e glicose 2%), a
250 rpm e 30ºC, durante 6-8 horas, até uma DO600 igual a 3. Um volume de 50µL do préinóculo foi adicionado a 200 mL de meio YPD para crescimento overnight ou até uma DO600
igual a 1.3-1.5. A cultura de levedura depois de alcançada esta D.O., foi centrifugada (3000
rpm, por 5`, a 4ºC) para sedimentação das células. O pellet foi lavado três vezes seguidas,
vagarosamente por pipetagem, através de uma ressuspensão inicial das células em 100 mL de
água gelada (deionizada e autoclavada), seguida de centrifugação e descarte do sobrenadante;
a segunda ressuspensão do pellet foi realizada com 50 mL de água, seguindo-se de nova
centrifugação e descarte do sobrenadante; a última lavagem do pellet foi realizada com 20 mL
de sorbitol gelado 1M. Ao final, as células foram ressuspendidas em 1mL de sorbitol (1M) e
mantidas no gelo.
4.3.2 Eletroporação da construção pPICZαA/CVS2Capo em P. pastoris
47
Tal procedimento foi seguido segundo “A Manual of methods for expression of
recombinant proteins using pPICZ and pPICZα in Pichia pastoris” (catalog no. K1740-01,
Invitrogen). Na eletroporação os DNAs, pPICZαA/CVS2Capo e pPICZαA sem inserto,
foram linearizados (10µL, com 10µg) com a enzima SacI, para possibilitar a recombinação e
inserção da construção no genoma de P. pastoris. O vetor pPICZαA sem inserto também foi
linearizado para se obter o controle negativo da expressão
Após linearização, os DNAs foram homogeneizados com 80µL de células
eletrocompetentes e transferidos para uma cubeta de 0.2cm pré-resfriada no gelo por 5`. A
cubeta foi posta no eletroporador (Multiporator Eppendorf) para transformação, seguindo os
parâmetros sugeridos pelo fabricante: 1500 V por 5 min. Imediatamente, após o pulso
elétrico, 1mL de sorbitol (1M) gelado foi adicionado à cubeta. Em seguida, esse material foi
transferido para um tubo estéril de 15mL e incubado por 2 horas, a 30ºC, sem agitação. Para
aumentar o rendimento da transformação, foi adicionado 1mL de YPD ao tubo, o qual foi
incubado por mais 2-3 horas, a 30ºC, sob agitação. A partir desse material, alíquotas de 10, 25
e 100µL foram semeadas em placas de meio YPDS (extrato de levedura 1%, peptona 2%,
glicose 2%, sorbitol 1M e Agar 2%) contendo 100 µg/mL de Zeocina para incubação a 30ºC,
por 2-5 dias, para crescimento dos clones recombinantes.
4.4 Imunoensaios para triagem dos clones recombinantes em Pichia pastoris
4.4.1 Colony Blotting
Após obtenção dos recombinantes X33/pPICZαA/CVS2Capo, foi realizada uma triagem
inicial para detectar os clones com maior potencial de produção da proteína heteróloga.
Estrias com colônias de levedura recombinantes foram feitas em placa, contendo YPD
sólido com Zeocina a 100µg/ml, e incubadas por 72hr, à 30°C. A cada 24hr, verteu-se
metanol (2%) no volume de aproximadamente 30µL na tampa da placa, para indução do
sistema. Após este tempo, uma membrana de PVDF (0,45µm) foi posta sobre as estrias, por 3
horas. Em seguida, a membrana foi lavada três vezes com o TBS-Tween (0,05%), por 10’. O
bloqueio da membrana foi feito com solução de leite 5%, por 1 hora. O anticorpo penta-His
(Qiagen, Brasil), diluído 1:1000 foi adicionado à solução de incubação, e mantido por 2
horas, a 37°C. Após isto, três lavagens seguidas de 10’, com o TBS-Tween (0,05%) foram
feitas, para posterior adição do anticorpo secundário, conjugado à peroxidase (1:2000) em
48
solução de leite 1%. Após incubação de 1 hora, a membrana foi novamente lavada e
submetida à revelação colorimétrica com TMB (tetra-metil- benzidina) (Sigma-Aldrich,
Brasil).
4.4.2 Dot Blotting
Neste ensaio, foi realizada indução da expressão numa pequena escala com 5mL de
meio líquido de YPD, adicionado de zeocina a 100µg/mL, nos clones positivos no colony
blot. O crescimento foi mantido por 72 horas, sob agitação de 250 rpm, em shaker, à 28°C. O
metanol na concentração final de 1% foi acrescido a cada 24 horas. Após este período de
indução da expressão, os sobrenadantes foram recuperados para sensibilização da membrana.
Para isto, 100µL do sobrenadante foi aplicado em membrana de PVDF 0,45µm (Amersham
Hybond-P; GE), tal qual aderida ao dispositivo dot blotter, acoplado a uma bomba de sucção
a vácuo, sob pressão de 0,8mbar. Passada uma hora de sensibilização, a membrana foi lavada
com 100µl de TBS 1X (Tris-HCl 50mM, pH 7.4 e NaCl 150mM) por 5´. O bloqueio foi feito
com solução de leite 1% por 40´ (100µl). Em seguida, outra lavagem foi procedida com TBS
1X por 5´, seguida de aplicação do anticorpo anti-6xHistidina (Sigma-Aldrich), em solução de
leite 1%, com incubação de 1h, à 28ºC. Após este período, o anticorpo foi retirado e a
membrana foi lavada três vezes com solução TBS-Tween (0,05%) por 10´. À membrana foi
adicionado o anticorpo secundário, conjugado à fosfatase (1:2000), em solução de leite 1%.
Posteriormente, novas lavagens foram feitas, e em seguida foi adicionado o revelador
NTB/BCIP (Sigma-Aldrich) para revelação da reação. Os ensaios acima foram baseados em
Goodnough et al. (1993) e Coimbra et al. (2011), respectivamente.
4.5 Indução dos clones recombinantes de P. pastoris com cultivos em frascos
Após a triagem dos ensaios citados acima, os transformantes ou clones escolhidos de P.
pastoris foram inoculados em 500 mL de meio BMGY (1% extrato de levedura, 2% peptona,
1.34% YNB, 0.002% biotina, 1% glicerol, 100 mM fosfato de sódio, pH 6.0) e incubados por
24horas, a 28°C, sob agitação vigorosa (240 rpm) para obtenção de biomassa. Para indução da
expressão da proteína do capsídeo recombinante (rCap) a biomassa obtida anteriormente foi
centrifugada e ressuspendida em 100 mL de meio BMMY (composição similar ao BMGY,
exceto pela substituição do glicerol por metanol 0,5%). O cultivo e a indução foram
realizados em frascos de um litro, o qual continha fenestras na base para aumentar a
49
oxigenação. A cultura foi mantida a 28°C, sob agitação (240 rpm), por 72 horas. A cada
24horas, metanol 100% na concentração final de 1% era acrescido a cada 24 horas. Os
sobrenadantes do tempo zero (T 0) ao tempo final (T72) foram recuperados para testes
subsequentes.
4.6. Tratamento dos sobrenadantes com Polietilenoglicol (PEG 6000) 40% e Ácido
Tricloroacético (TCA)
A Diálise foi realizada contra o polietilenoglicol (PEG) 6000, a 40%, em Tampão
fosfato (PBS - 0,05M; 0,15M NaCl; pH 7,4), a 4oC, por 24 horas. Sobrenadantes (100 mL)
obtidos da cultura em P. pastoris, como descrito acima, foi vertido em uma membrana com
12000 Daltons para diálise e concentração das proteínas extracelulares (COUTINHO et al.,
2013). Os sobrenadantes foram concentrados 25x (volume inicial de 100 mL para um volume
final de 4mL), e foi adicionado 25µl do inibidor de protease PMSF (phenylmethyl sulfonyl
fluoride) (10mM). O produto dialisado foi utilizado nos imunoensaios Western Blot e ELISA
para fins de detecção e análise da funcionalidade da proteína-r (rCap), respectivamente.
Alguns sobrenadantes também foram analisados após precipitação protéica com TCA e
acetona absoluta. O procedimento discorreu da seguinte forma: em 10mL dos sobrenadantes
foi adicionado 2mL de TCA e precipitados o.n. (overnight), a -20°C. A seguir, as amostras
foram centrifugadas (4000 rpm) por 40min, a 4°C. Os sobrenadantes foram descartados e os
precipitados protéicos foram submetidos a três lavagens seguidas, por 5minuntos, com
acetona gelada. Após as lavagens, os precipitados foram novamente centrifugados e
submetidos à rotação em centrífuga a vácuo por 5-10min para secagem. Ao final, foram
ressuspendidos em 20μL do tampão desnaturante laemmili. Tais precipitados foram utilizados
para análises em Western Blot.
4.7 Análise por SDS-PAGE e Western Blot
Para as análises das proteínas por SDS-PAGE foi preparado o gel separador (resolving
gel) a 12,5% constituído de 6mL de Acrilamida/Bis-acrilamida 30%/0.8%, 3,75mL de TrisHCl 1M/SDS 0,4% pH 8.8, 50μL de APS 10%, 10μL de TEMED (Sigma-Aldrich®) e 15mL
de água e o gel concentrador (stacking gel) de 4%, com os seguintes onstituintes:
Acrilamida/Bis-acrilamida 30%/0,8% (0,65mL), Tris-HCl 1M/SDS 0,4% pH 6.8 (1,25mL),
APS 10% (25μL) (Sigma-Aldrich®), 5μL de TEMED. Um volume de 40ul das amostras,
50
resuspendidas anteriormente com tampão desnaturante (Laemmli 2X - Tris-HCl 1M pH 6.8,
SDS 4%, β-mercaptoetanol 4%, glicerol 20%, azul de bromofenol 0.1%) e incubados por 7
minutos, a 95ºC, foram submetidas a eletroforese. As corridas de eletroforese foram
realizadas com tampão de corrida para SDS-PAGE 1x, com os parêmtros de fonte de tensão
constante e ajustável de: 35mA, por 90 minutos. Após corrida, o gel foi submetido à
coloração com Nitrato de Prata (AgNO3) para a visualização da banda. O marcador de peso
molecular Prestained Protein Pager Ruler (Fermentas) foi utilizado para avaliar o tamanho da
banda detectada.
Para o western- Blot, as proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF
(fluoreto de polivinilildene, poro de 0.45 µm) utilizando um cuba de transferência semi-seca
(Trans-blot Semi-dry (Scie-Plas), a 320mA, por 1hora. A membrana foi bloqueada com
solução contendo leite semi-desnatado (5%) em TBS, em temperatura ambiente, por 1 hora.
Na sequência, foi incubada com soro de suíno positivo para CVS2, na diluição de 1:25, a 4
ºC, por 1 hora e 30 minutos. Após três sucessivas lavagens em TBS-Tween, a membrana foi
incubada com proteína G-conjugada a Peroxidase (Sigma-Aldrich) na diluição de 1:45.000, a
4ºC, por uma hora. A reação foi revelada com ECL (chemiluminescent kit ) (GE/Healthcare).
A proteína foi quantificada pelo método de Bradford (Bio-rad).
4.8 ELISA indireto
O teste procedeu da seguinte forma: placas de poliestireno de 96 poços, com alta
capacidade de adsorção, foram sensibilizadas com o antígeno (rCap) e incubadas em câmara
úmida durante duas horas a 37ºC. Três lavagens com PBS contendo 0,1% tween 20 (v/v)
(PBS-T) foram realizadas, seguido do bloqueio das placas com solução de PBS contendo leite
em pó desnatado a 4% (p/v). Após bloqueio, foi feita a incubação por 1 hora, a 37ºC em
câmara úmida, seguida de duas lavagens com PBS-T. Um volume de 100μL das amostras de
soros diluídas em PBS contendo LPD a 2% (p/v) e 10mM de EDTA (p/v) foram distribuídas
em cada poço, e então, as placas foram incubadas em câmara úmida por 1 hora com o soro a
37ºC. Após nova lavagem com PBS-T, 100μL do conjugado de proteína G-peroxidase diluído
foram distribuídos por poço e as placas incubadas por mais uma hora e posteriormente
lavadas cinco vezes com PBS-T. Em seguida, 100μL de solução tampão citrato-fosfato (0,1M,
pH 5,0) contendo 0,1mg/ml de 3,3’,5,5’- tetramethylbenzidine (TMB) e 0,02% de peróxido de
hidrogênio (v/v) foram adicionados. Após 15 minutos, a reação foi parada com 100μL de
51
ácido sulfúrico (H2SO4) 2N. A leitura da densidade óptica (DO) foi realizada com
espectofotômetro (Multiskan Plus Thermo Fisher Scientific, USA) na faixa de 450nm.
4.8.1 Padronização do ELISA
A padronização consistiu em definir a diluição ótima do antígeno e do soro, de forma
a se obter as melhores condições de diferenciação entre a densidade ótica (DO) dos soros
positivos e negativos (relação DO positivo/DO negativo – P/N) e maior rendimento dos
reagentes.
Antígeno: proteína recombinante do capsídeo viral (rCap) de CVS2 expressa em
P.pastoris foi utilizada para sensibilizar a placa
Soros: Foram utilizados um total de 58 soros, sendo 30 positivos e 28 negativos na IP.
Os soros positivos para infecção com CVS2, foram coletados de animais com histórico de
Circovirose Suína 2. A coleta dos soros foi realizada em diferentes períodos: Gestação,
Lactação e 150 dias de nascidos. A definição dos soros sabidamente negativos e positivos, foi
realizada através da imunoperoxidase em monocamadas de células (IP), como descrito em
Pinto et al. (2011), e para tanto, categorizou-se: títulos de anticorpos <20 foram considerados
negativos; 20 a 80, baixos; 320 a 1280, médios e ≥5120, altos. O título de anticorpos foi
expresso através da média de log 4. Todos os soros foram gentilmente fornecidos/cedidos pela
Professora Dra Zélia Inês Portela Lobato (UFMG).
Para padronização do ELISA foram feitas diluições seriadas (1/25, 1/50, 1/100, 1/200,
1/400 e 1/800) do antígeno e dos soros nas diluições 1/5, 1/10, 1/20 e 1/40. O conjugado de
proteína-G peroxidase (Sigma-Aldrich, USA) foi testado nas diluições de 1/80.000, 1/90.000
e 1/100.000. Todas as diluições foram testadas em duplicata.
Após esta padronização foi feita uma estimativa do ponto de corte através da análise
de variância das médias de 28 soros, classificados como negativos no teste de IPMC,
originários de rebanhos monitorados para circovirose suína, empregando o teste t de Student
(FREY et al., 1998), com intervalo de confiança de 95%. Acima do valor do ponto de corte,
as amostras foram consideradas positivas, e abaixo do ponto de corte as amostras foram
negativas. Em seguida, os parâmetros intrínsecos ao teste ELISA, como a sensibilidade e
especificidade, foram calculados, assim como o indicador de concordância ajustado
(Kappa=k) (FERREIRA E ÁVILA, 1996), considerado, neste caso a IPMC como teste
padrão.
52
5. RESULTADOS
5.1 Obtenção e análise in silico do gene Cap de CVS2 códon otimizado Cap de CVS2
Após o gene Cap ser códon-otimizado foi observada uma redução nos códons raros de
Pichia pastoris de 19% para 10,66%. Esta análise foi feita após a comparação entre as
frequências dos códons do gene do Capsídeo de CVS2 e com os preferenciais da levedura,
pelo programa GCUA, fornecendo a frequência relativa de uso dos códons, para cada
aminoácido na levedura (figuras 6 e 7). A presença de códons raros para o hospedeiro pode
resultar na diminuição da tradução da proteína heteróloga (MARCEKOVA et al., 2009).
53
Figura 6: Comparação dos códons mais utilizados por P. pastoris e os códons
presentes no gene do capsídeo otimizado de CVS2. Colunas em preto: códons mais
utilizados pela levedura; em vermelho: códons presentes no gene Capo. Nos gráficos
a,b,c apresentam-se as diferentes trincas utilizadas para codificar os aminoácidos
específicos.
54
Figura 7: Comparação entre os códons mais utilizados por P. pastoris e os códons
presentes no gene do capsídeo selvagem de CVS2. Colunas em preto: códons utilizados
pela levedura; em vermelho: códons utilizados para o gene otimizado do capsídeo de
CVS2. Nos gráficos a,b,c apresentam-se as diferentes trincas utilizadas para codificar os
aminoácidos específicos.
A sequências nucleotídicas dos genes, selvagem e otimizado, resultaram em 74%
de identidade (figura 8). O conteúdo G+C do gene códon otimizado foi definido na razão
de 41,24% e o conteúdo A+T em 58,76%.
55
Gene selva
Gene otimi
10
20
30
40
50
ACGTATCCAA GGAGGCGTTA CCGGAGAAGA AGACACCGCC CACGCAGCCA
ACTTATCCAA GAAGAAGGTA CAGACGTAGA AGGCATAGAC CAAGATCCCA
60
70
80
90
100
Gene selva
Gene otimi
TCTTGGCCAG ATCCTCCGCC GCCGCCCCTG GCTCGTCCAC CCCCGCCACC
TTTGGGTCAG ATTTTGAGAA GAAGACCCTG GTTAGTTCAC CCTCGTCACA
Gene selva
Gene otimi
110
120
130
140
150
GTTACCGCTG GAGAAGGAAA AATGGCATCT TCAACACCCG CCTCTCCCGC
GATATCGTTG GCGTCGTAAG AACGGAATAT TTAACACTAG GTTGTCTAGA
Gene selva
Gene otimi
160
170
180
190
200
ACCTTCGGAT ATACTATCAA ACGAACCACA GTCAAAACGC CCTCCTGGGC
ACCTTCGGAT ATACTATTAA AAGAACTACT GTGAAAACTC CTTCCTGGGC
Gene selva
Gene otimi
210
220
230
240
250
GGTGGACATG ATGAGATTCA ATATTAATGA CTTTCTTCCC CCAGGAGGGG
TGTCGACATG ATGAGATTTA ACATTAATGA CTTTTTGCCA CCTGGTGGAG
Gene selva
Gene otimi
260
270
280
290
300
GCTCAAACCC CCGCTCTGTG CCCTTTGAAT ACTACAGAAT AAGAAAGGTT
GATCAAATCC TAGGTCCGTC CCATTCGAAT ATTACCGTAT CAGGAAAGTT
Gene selva
Gene otimi
310
320
330
340
350
AAGGTTGAAT TCTGCCCCTG CTCCCCGATC ACCCAGGGTG ACAGGGGAGT
AAAGTAGAGT TCTGTCCCTG TAGTCCTATT ACCCAGGGTG ATAGAGGTGT
Gene selva
Gene otimi
360
370
380
390
400
GGGCTCCAGT GCTGTTATTC TAGATGATAA CTTTGTAACA AAGGCCACAG
CGGTTCCAGT GCTGTCATAT TGGACGATAA CTTCGTTACC AAGGCAACAG
Gene selva
Gene otimi
410
420
430
440
450
CCCTCACCTA TGACCCCTAT GTAGACTACT CCTCCCGCCA TACCATAACC
CTTTGACCTA CGACCCTTAT GTAGACTATA GTTCACGTCA TACTATCACC
Gene selva
Gene otimi
460
470
480
490
500
CAGCCCTTCT CCTACCACTC CCGCTACTTT ACCCCCAAAC CTGTCCTAGA
CAGCCTTTCA GTTACCACTC TCGTTACTTT ACTCCTAAAC CCGTGCTTGA
Gene selva
Gene otimi
510
520
530
540
550
TTCCACTATT GATTACTTCC AACCAAACAA CAAAAGAAAT CAGCTGTGGC
TTCCACCATC GACTATTTCC AACCAAATAA CAAGAGGAAT CAATTGTGGT
Gene selva
Gene otimi
560
570
580
590
600
TGAGACTACA AACTGCTGGA AATGTAGACC ACGTAGGCCT CGGCACTGCG
TGAGATTACA AACAGCAGGA AATGTCGATC ATGTTGGACT TGGAACTGCT
610
620
630
640
650
TTCGAAAACA GTATATACGA CCAGGAATAC AATATCCGTG TAACCATGTA
TTCGAAAATT CTATTTATGA TCAAGAGTAC AATATTAGAG TCACAATGTA
Gene selva
Gene otimi
660
670
680
690
TGTACAATTC AGAGAATTTA ATCTTAAAGA CCCCCCACTT AAACCC
CGTACAATTT AGAGAGTTCA ATCTGAAAGA TCCACCATTA AAGCCA
Gene selva
Gene otimi
Figura 8: Alinhamento das sequências nucleotídicas do genes cap selvagem e códon otimizado de
CVS2. Em vermelho os nucleotídeos modificados no gene otimizado; os números de 10 a 696 indicam o
número total de nucleotídeos das sequências. Gene selva: gene Cap selvagem; gene otimi: gene códon
otimizado.
56
5.2 Clonagem do gene Cap otimizado (Capo) e obtenção do vetor de expressão
pPICZαA/CVS2Capo
O gene Capo inserido no vetor pBSK, foi digerido por XhoI e NotI (figura 10) e sua
liberação foi conferida em gel de agarose, na altura correspondente a 782pb (figura 11a). O
vetor pPICzα também foi submetido à digestão, com as mesmas enzimas, para permitir a
exposição das pontas complementares (coesivas) para o gene exógeno (Figura 10). Após estas
digestões, os fragmentos foram purificados e excisados do gel de agarose. Os fragmentos
purificados apresentaram-se na altura esperada, 3600pb e 782pb, do vetor e inserto,
respectivamente (figura 11b).
Figura 9: Esquematização da obtenção do gene Cap otimizado. XhoI/NotI: enzimas de
restrição; Os quadros em cores representam os elementos contidos compondo o gene códon
otimizado, definidos conforme os quadrantes: Verde: Kex2 (sítio de clivagem da enzima Kex2);
Azul escuro: ATG (códon inicial da tradução); Laranja: AU1 (epítopo AU1); Rosa: Cauda His
(Cauda de 6xhistidinas); Azul claro: TAA (códon de parada da tradução).
Figura 10: Obtenção do gene Capo e do vetor de expressão pPICZαA. Em A, eletroforese em gel
de agarose 1% das digestões da construção (pPBSK + gene Capo) (I) e do vetor pPICZα (II) . Em b,
eletroforese do gene Capo (III) e do vetor pPICZα (IV) purificados. M 1: marcador de 1kb (Ludwig);
M2: marcador de 100pb (Ludwig); ORF2 (gene Cap otimizado).
57
A inserção do gene Capo no vetor de expressão, segundo o esquema na figura 11, permitiu a
obtenção do cassete de expressão pPICZα/CVS2Capo. O cassete de expressão foi confirmado
mediante reação enzimática, com o reconhecimento específico das enzimas XhoI e NotI, nos
respectivos sítios ativos inseridos no gene, mostrando a efetiva liberação do fragmento na altura
esperada de 782pb (figura 12), demonstrando que o gene Capo foi efetivamente inserido. O
cassete de expressão (pPICZαA/CVS2Capo) totalizando ~4400p,b correspondendo ao total de pares
de bases do vetor de 3600pb, somado ao número de bases do inserto com 780pb, foi confirmado
pela visualização em gel de agarose (figura 13b).
Figura 11: Ilustração da clonagem do gene Capo no vetor pPICZαA. Os quadros em cores
representam os elementos contido no gene códon otimizado, definidos em: verde: Kex2 (sítio de
clivagem da enzima Kex2); Azul escuro: ATG (códon inicial da tradução); Laranja: AU1
(epítopo AU1); Rosa: Cauda His (Cauda de 6xhistidinas); Azul claro: TAA (códon de parada da
tradução). O traço abaixo do gene, indica o sítio múltiplo de clonagem (MSC) do vetor de
expressão pPICZαA, onde foi inserido o gene. Fonte: Catálogo da Invitrogen com adaptações feitas
pelo autor.
Figura 12: Confirmação da clonagem do gene Cap no vetor pPICZαA. Em a) Eletroforese
em gel de agarose 1%, da liberação do inserto de 782pb; pPICZαA: vetor de expressão;
pBSK/CVS2Capo: usado como controle; M: marcador de peso molecular (100pb -Ludwig); Em
b) Eletroforese de gel de a garose 1% da construção total (pPICZαA/CVS2Capo). M: marcador
de peso molecular (1kb -Ludwig).
58
A construção também foi confirmada por sequenciamento, e o resultado do anelamento
dos primers complementares ao vetor de expressão e flanqueadores do gene clonado, permitiu
constatar a inserção do gene na matriz de leitura com o vetor de expressão. Para esta
confirmação, as sequências nucleotídicas das construções obtidas foram alinhadas à sequência
do gene cap otimizado (Figura 13).
Figura 13: Alinhamento da construção pPICZα/CVS2Cap com o gene Cap códon
otimizado de CVS2. Primeiros 170 nucleotídeos das sequências dos diferentes clones
alinhados à sequência do gene cap códon otimizado. Seta azul: orf2 (gene códon
otmizado); Seta vermelha: clones recombinantes obtidos.
Após as confirmações das construções pPICZα/CVS2Capo, pôde ser feita a linearização
do cassete de expressão pela ação da enzima SacI que corta uma vez a região 5’AOXI. A
linearização no lócus AOX1 no vetor é requerida antes da eletroporação do DNA em
P.pastoris, a fim de que haja a integração eficiente do cassete de expressão no genoma da
levedura. Assim, em gel de agarose foi observada a linearização completa de diferentes clones
recombinantes obtidos na altura de aproximadamente 4400pb (vetor + inserto) (Figura 14).
Após digestão, o DNA foi excisado do gel de agarose, e aproximadamente 10ug do
cassete de expressão purificado foi eletroporado em P.pastoris.
59
Figura 14: Linearização da construção pPICZαA/CVS2Capo.
Eletroforese em gel de agarose 1% da digestão enzimática com SacI de
vários clones {1-10} obtidas após clonagem do gene otimizado no vetor de
expressão; M: marcador de peso molecular (1kb Ludwig). 4400pb: peso
molecular da construção.
5.3 Seleção de clones recombinantes de Pichia pastoris por Colony blot e Dot blot
O colony blot e o dot blot foram realizados para triagem dos clones que estariam
expressando o gene da proteína do Capsídeo (Cap) de CVS2. Dentre os 35 clones analisados
em meio sólido, sete recombinantes foram revelados com reação mais intensa no Colony blot
(figura 16). A reação observada correspondeu a uma reação de reconhecimento da cauda de
histidina presente no gene Capo, pelo anticorpo anti-5xhis, nas estrias recombinantes obtidas
após cultivo em placa de petri (Figura 15). O controle negativo não foi revelado, constatando
que o gene Capo foi expresso pelos clones induzidos por metanol, sob ação do promotor
AOX1 de Pichia pastoris (Figura 16).
60
Figura 15. Triagem dos recombinantes de Pichia pastoris em Colony blot. Em a:
Representação das colônias estriadas de P pastoris recombinantes em placa de YPDs/Zeocina
{1-36} e C- pPICZαA (controle negativo vetor sem o gene); Em b: membrana de PVDF após
revelação da reação específica anticorpo anti-5xhis nos recombinantes, C- pPICZαA (ausência
de reação imunoquímica).
Os sete clones triados no colony blot tiveram sua expressão confirmada por dot blot,
mas apenas três deles foram observados mais reativos na membrana do dot blot (figura 17).
Não foi possível averiguar esta reação com o mesmo anticorpo anti-pentahix do ensaio
anterior, porém a revelação dos clones reagentes foi observada pela reação imunoquímica do
anticorpo anti-6xhis utilizando o sobrenadante da cultura induzida. Observou-se a ausência de
reação do anticorpo com o sobrenadante da cultura contendo somente o vetor.
Dos resultados presentes foi inferido que houve expressão positiva, certamente devido à
efetiva integração do cassete de expressão no genoma da levedura. Na correspondente
indução, foi verificada uma variação na intensidade da reação específica entre os clones
positivos, alguns mais intensos (quadro pretos) e outros menos intensos (seta) (Figura 16).
Isto pode ser devido ao número de diferentes cópias do cassete de expressão, integrado no
genoma de Pichia, provenientes de diferentes recombinantes (CREGG, CEREGHINO,
HIGGINS, 2000).
61
Figura 16: Screening dos recombinantes
de Pichia pastoris em Dot blot. Membrana
de PVDF com recombinantes após reação
imunoquímica com anticorpos anti-6xhis,
nos recombinantes. Em quadro preto:
sobrenadante da cultura dos recombinantes,
após indução de pequena escala com
metanol; Em quadro tracejado (C-): controle
negativo, com sobrenadante de cultura sem o
gene induzido; seta indicando clone positivo
baixa intensidade de reação.
5.4 Detecção da proteína recombinante do Capsídeo (rCap) de CVS2 por SDS-PAGE e
Western Blot
Os resultados anteriores possibilitaram a realização de uma indução em maior escala dos
recombinantes de P. pastoris, escolhidos a partir da reação imunoquímica positiva dos
mesmos. A partir disso, os recombinantes induzidos por 72h, foram concentrados em PEG e
submetidos à corrida em SDS-PAGE. Após corrida a rCap foi observada em uma altura de
aproximadamente 39 kDa, após o gel ter sido corado por Nitrato de Prata. Na amostra C- não
foi visualizada nenhuma banda (Figura 18). Este resultado sugeriu que houve produção da
rCap pelo sistema, todavia considerando que no sobrenadante da levedura além de conter a
proteína de interesse, contém também as proteínas próprias de P. pastoris, a presença da rCap
foi confirmada por western-blot.
Alguns sobrenadantes sem tratamento prévio com PEG também foram avaliados em gel
de poliacrilamida, porém não foi possível visualizar a banda de forma conclusiva,
observando-se apenas “rastro de proteínas” no gel (dados não mostrados).
62
Figura 17. Proteína Recombinante (rCap) analisada por
SDS-PAGE. Gel de poliacrilamida corado com Nitrato de
Prata (AgNO3).(C-) : Sobrenadante de P. pastoris contendo
pPICZαA sem o gene; rCap: proteína recombinante, em uma
altura de ~39 kDa, correspondente à corrida de 10µl do
sobrenadante da cultura concentrado por PEG, do clone 7/X33/pPICZαA; M: marcador molecular (Prestained Protein
Pager Ruler - Fermentas).
A banda de aproximadamente ~39 kDa foi detectada no Western blot (Figura 19).
Com o controle negativo, constituído de células de P. pastoris transformadas com o vetor
pPICZαA vazio (sem o gene), não foi visualizada nenhuma reação com o anticorpo. Para
observar se a banda observada no gel de SDS-PAGE tratava-se da proteína rCap de CVS2,
soros de suínos infectados com o CVS2, na diluição de 1:25, foram utilizados como anticorpo
primário e a proteína G utilizada na diluição de 1:45.000.
Estes resultados confirmam a produção secretória da rCap em sobrenadante de clones
de P. pastoris. Anteriormente a este ensaio, os sobrenadantes foram quantificados pelo
método de Bradford em um total de 140 μg/mL (proteínas/mL de meio).
Foram realizadas tentativas de detecção da proteína utilizando anticorpo AU1 nas
concentrações (1:250, 1:1000, 1:3000), anti 6xHis (1:1000), mas não foi possível detectar.
Para atingir a diluição ideal de imunodetecção dos soros, previamente foram testados a rCap
na diluição (1:100, 1:50), assim como, a proteína G também teve seu uso padronizado com
diluições (1:10.000; 1:45.000).
63
Figura 18. Imunodetecção da Proteína recombinante do capsídeo de CVS2 (rCap) em
Western Blot. Detecção da rCap com massa molecular de ~39kDa, usando soro de suínos
infectados com CVS2. rCap TCA: proteína precipitada com TCA; rCap PEG: proteína
concentrada com Polietilenoglicol; Em a: (na ordem esquerda- direita até a coluna 3): diferentes
precipitados da rCap provenientes de clones {6, 14, 27}; penúltima coluna rCap/PEG
concentrado proveniente do clone 7. Em b: Maior detalhe nas bandas melhores visualizadas
após revelação e a diferença na intensidade das bandas. (C-) P. pastoris transformada com
vetor pPICZαA vazio. M: Marcador molecular Prestained Protein Pager Ruler (Fermentas).
5.5 Padronização do ELISA indireto
Após imunodetecção por western blot, foi averiguada a imunoreatividade por ELISA da
rCap produzida utilizando-a como antígeno para detectar anticorpos anti-CVS2. Dos dois
sobrenadantes provenientes de dois clones induzidos por 72h (T72), submetidos à diálise com
PEG, foi feito um “pool” e submetidos aos testes. Os sobrenadantes também foram testados
separadamente.
Após várias diluições testadas, como mostra na tabela 1, a diluição ideal de 1:100, 1:20 e
1:90.000 do antígeno, soro e da proteína-G (conjugada a peroxidase), respectivamente, foi
observada alta razão P/N (positivo/negativo) de 597.
Tabela 3. Diluições testadas do antígeno recombinante, do soro e da
proteína-G na padronização do ELISA indireto.
Diluições Seriadas
Antígeno (rCap)
1/25
1/50
1/100
1/200
1/400
1/800
Soro (pool)
1/5
1/10
1/20
1/40
1/50
1/100
Proteína G
1/80.000
1/90.000
1/100.00
64
Nesta razão foi possível discriminar máxima diferença entre as DO 450nm dos soros,
sabidamente positivos e negativos (Figura 19). Nestas condições, o ponto de corte foi
estimado em 0,08, baseando-se no método de Frey et al. (1998). Logo, os valores acima do
ponto de corte, as amostras foram consideradas positivas, e para os valores abaixo, as
amostras foram negativas no teste de ELISA.
Figura 19. Padronização do ELISA recombinante
(ELISAr CVS2). Placa com representação da
revelação do ELISAr; Ag: Antígeno recombinante
diluído {1:25-100}, CP: Soro positivos (pool de 5
soros positivos na IPMC) com diluições de {1:5-40};
CN – controle negativo (pool de 5 soros negativos na
IPMC)
Quanto aos parâmetros intrínsecos ao teste (sensibilidade e especificidade) e a
concordância entre eles, o resultado foi concordante 100%, do ensaio teste com o ensaio de
referência. Todas as 30 amostras positivas na IP foram positivas no ELISA, as 28 amostras
negativas na IPMA, também foram negativas no teste (tabela 4).
Tabela 4. Comparação dos resultados de soros de suínos testados pelo IPMA,
teste de referência, com os resultados da DO450nm do ELISA
IPMA
ELISA
Positivo
Negativo
Total
Positivo
30
0
30
Negativo
0
28
28
Total
30
28
58
(Kappa=k): 100%; sensibilidade (100%); especificidade (100%).
DO450nm: Densidade ótica
65
Sobrenadantes sem tratamento prévio com PEG e sem diluir foram adsorvidos
diretamente na placa de ELISA. O sobrenadante foi proveniente da cultura do recombinante
X-33/clone6, no tempo de indução de T72, frente ao “pool” dos soros negativos e positivos.
Um volume de 100µL destes sobrenadantes não diluídos foi adsorvido na placa e foi
observada reação com o “pool” de soro positivo, com D.O. de 0,337, e ausência de reação
com os soros negativos.
6. DISCUSSÃO
Neste estudo, a proteína recombinante do capsídeo de CVS2 (rCap) foi produzida na
forma secretada em sistema de expressão utilizando a levedura metilotrófica Pichia pastoris,
com o emprego do gene de CVS2 códon otimizado para esta levedura. A imunoreatividade da
rCap foi demonstrada quando a mesma foi submetida à reação com soros de animais positivos
para infecção com CVS2 em ELISA indireto. Para tal, o gene do capsídeo códon otimizado
foi clonado no vetor pPICZαA a fim de que a proteína produzida fosse secretada para o meio,
por sinalização do fator α contido no vetor. A expressão eficaz do gene foi observada em
ensaios de Colony e Dot Blot. A detecção da proteína (rCap) foi averiguada em SDS-PAGE e
western Blot.
Muitos sistemas de expressão têm sido utilizados para expressar o gene do capsídeo de
CVS2 e para cada sistema de expressão existem vantagens e desvantagens (WURM, 2004;
KOST, CONDREAY, JARVIS et al., 2005). Alguns autores reportaram que o sistema de
expressão em E. coli não é adequado para expressar o gene do capsídeo de CVS2 (ZHOU et
al., 2005; TRUNDOVA e CELER, 2007). A razão é que neste sistema o gene é somente
expresso quando ocorre a remoção prévia do domínio N-terminal (NLS - nuclear localization
signal), correspondente aos primeiros 40 aminoácidos (YIN et al., 2010). Todavia esta
sequência contém domínios importantes para formação da superfície do virion
(LEKCHAROENSUK et al., 2004; WU et al., 2012), além de conter epítopos
imunodominantes importantes (LOU et al., 2011). O sistema procarioto possui a incapacidade
de realizar modificações pós-traducionais na proteína, dificultando assim a produção de uma
proteína biologicamente ativa (YADAVA et al., 2003). Isto é um dos grandes gargalos da
produção de proteínas recombinantes, visto que, a expressão de proteínas heterólogas em
bactérias não promove uma conformação semelhante à proteína nativa, podendo originar
polipeptídeos mal dobrados (misfolded) e frações celulares insolúveis (GASSER et al., 2008).
66
Este errado dobramento leva a célula a um nível de estresse, que pode gerar conteúdos tóxicos
que degradam a proteína exógena (GASSER et al., 2008).
A expressão do gene Cap de CVS2 quando realizada em hospedeiros eucariotos, como
Saccharomyces cerevisiae (BUCAREY et al., 2009), células de inseto (FAN et al., 2007) e
células de mamíferos (JÚNIOR et al., 2009) vem apresentando boas perspectivas para
produção da referida proteína, para diferentes aplicações. Nestes trabalhos, os autores
concluíram que a proteína foi produzida, semelhantemente, à proteína nativa devido às
modificações pós-traducionais realizadas pelos hospedeiros escolhidos.
A levedura metilotrófica Pichia pastoris sendo utilizada como sistema de expressão
apresenta a capacidade de produzir proteínas secretadas nativas em baixos níveis, o que
facilita a recuperação da proteína heteróloga no meio, possibilitando a aplicação direta em
ensaios de diagnóstico (REES et al., 1999). Neste trabalho, o sobrenadante dos clones de P.
pastoris forma aplicados tanto de forma direta, quanto concentrada em ensaio diagnóstico,
resultando em reações positivas.
Em se tratando da produção da rCap do CVS2 em sistema de levedura, Bucarey et al.
(2009) reportaram a produção dessa proteína em S. cerevisiae após códon otimização do gene,
sugerindo que a não otimização do gene selvagem afeta negativamente a produção da
proteína. Partindo dessa hipótese, neste estudo o gene Cap foi códon otimizado (Capo) para
expressão em P. pastoris. O resultado da análise in silico dos códons entre o gene Cap e a
levedura, mostrou uma redução dos códons raros para P. pastoris de 19% para 10,66%, após
otimização. Este ajuste é importante porque todos os organismos possuem seus códons
preferências de uso (códon usage) (LIU et al., 2012). Tratando-se de uma expressão
heteróloga, o gene inserido pode possuir códons diferentes daqueles preferenciais para o
hospedeiro, de forma que este ajuste pode facilitar a produção da proteína heteróloga (ÇELIK
e ÇALIK, 2011). Para outras produzidas em Pichia pastoris já foi descrita a necessidade de
substituição de códons raros no gene heterólogo (YADAVA et al., 2003, JESUS et al., 2012.)
pelos preferenciais da levedura.
Na análise nucleotídica entre os genes cap selvagem e o cap códon otimizado no
presente trabalho foi obtida uma identidade de 74%, muito próxima à porcentagem de 74,7%,
encontrada por Tu et al. (2012), após códon otimização do gene rCap para P. pastoris. O
conteúdo G+C também foi bem próximo, sendo 41,24% no presente trabalho, comparado a
G+C de 43, 4%. Sreekrishna et al. (1997) recomendam para expressão em P. pastoris que o
conteúdo A+T do gene seja de 55%. Neste estudo o conteúdo A+T foi um pouco superior
67
(58%). Contudo, a razão aqui encontrada se aproxima da razão de 57,53%, descrita no
trabalho Mariz (2012), quando códon otimizou o gene L1 de papiloma vírus humano para
expressão em P.pastoris. Embora o CVS2 possua naturalmente uma composição alta do
conteúdo A+T (LIU et al., 2012), e que genes com alto conteúdo A+T podem não ser
transcrito eficientemente, pois podem produzir RNAm truncados (ROMANOS, 1995), no
presente trabalho estes ajustes não influenciaram negativamente na expressão do gene cap de
CVS2 na levedura. Além disso, Yadava et al. (2003) sugerem que os níveis de expressão de
um gene heterólogo não devem ser associado somente à modificação do conteúdo A+T, e sim,
ao fato do ajuste dos códons para os preferenciais do hospedeiro. E neste aspecto particular,
estes autores concluíram pelos bons níveis de expressão do gene códon otimizado da malária,
mesmo com conteúdo A+T de 72%.
Neste estudo, foram observadas diferenças na intensidade da expressão do gene Capo no
imunoensaio Dot blot. A diferença de intensidade pode se dever ao fato de que o número de
cópias do cassete de expressão (pPICZαA/CVS2Capo) integrado no genoma da levedura não
tenha sido igual para todos os clones recombinantes expressos positivamente (CREGG,
CEREGHINO,HIGGINS et al., 2000). As cepas com múltiplas cópias do cassete de expressão
são sugestivas de terem maior nível de proteínas, segundo Romanos (1995). Todavia,
rendimentos finais de proteínas heterólogas parecem não depender unicamente desse
parâmetro para serem efetivamente produzidas, visto que é descrita uma grande variação
mesmo selecionando clones múltiplas cópias (ROMANOS, 1995).
Vassileva et al. (2001) descreveram que quanto maior a concentração de Zeocina no meio,
proporcionalmente será o número de cópias do cassete de expressão nos clones
recombinantes. Muito embora uma única cópia integrada seja suficiente para produzir a
proteína de interesse, ao mesmo tempo em que, muitas cópias parecem influenciar
negativamente para produção (SREEKRISHNA et al., 1997). Neste trabalho, não foi feito este
tipo de screening e testou-se apenas uma concentração de Zeocina (100µg/mL). Assim, o
padrão de escolha foi observando a intensidade da reação, sugestiva de um reconhecimento
imunoquímico com maior avidez do anticorpo anti-his contra a etiqueta de histidina contida
no gene, sugestionando que tratam-se de clones fortemente positivos. Esta sugestão é
concordante com a interpretação dos autores Pinheiro et al. (2006), quando inferiram as
reações dos seus resultados no dot blot por observação de reações do gene heterólogo, sendo a
mais intensa e a menos intensa, considerado forte positivo ou fraco positivo, respectivamente.
Assim, os clones que apresentaram uma reação mais intensa foram os escolhidos para
indução de maior escala. Os clones observados como positivos no dot blot, foram também
68
positivos no colony blot. Importante salientar que o controle negativo da expressão (vetor sem
o gene) em ambos os ensaios, não apresentou reação alguma com o anticorpo, concluindo que
houve integração eficiente por recombinação entre o plasmídeo e o genoma da levedura.
Muitas proteínas têm sido produzidas com graus de sucesso variados em P. pastoris e
alguns experimentos falharam pelo fato do gene alvo não ter sido expresso no sistema ou pela
expressão ter ocorrido em níveis baixos, insuficientes até mesmo de serem visualizadas em
SDS-PAGE (CREGG, CEREGHINO,HIGGINS et al., 2000). Nos resultados aqui alcançados
a expressão foi satisfatória e pode ser associada a um bom nível de expressão da proteína
recombinante. A rCap de CVS2 foi detectada em SDS-PAGE e Western Blot, com peso
aproximado de 39 kDa. Este peso molecular difere do descrito em alguns estudos (30 kDa),
mas este fato pode ser justificado pela presença de sítios de glicosilação estarem presentes
nesta proteína (HAMEL et al., 1998). Além disso, uma variação na mobilidade da proteína foi
observada quando produzida em diferentes hospedeiros heterólogos, incluindo a levedura S.
cerevisiae, células de inseto e na bactéria E. coli (BUCAREY et al., 2009). Todavia, nossos
resultados estão em acordo com o trabalho de Tu et al. (2012) que também expressaram a Cap
em P. pastoris e detectaram a rCap com peso de 40 kDa.
Até o momento, o trabalho de Tu et al. (2012) representa o único trabalho que descreve a
expressão do gene Cap de CVS2 em P. pastoris. Nele foi relatado que não houve sucesso de
produção secretória da proteína, pela ausência de detecção da mesma no sobrenadante da
cultura. De acordo com os autores, o insucesso da exportação/secreção da rCap se deu pela
presença do domínio NLS na região N-terminal da proteína que direciona a proteína para o
núcleo. O presente trabalho contradiz esta hipótese, visto que não foi necessária a produção
truncada da rCap. A rCap total, não truncada e com 233aminoácidos, foi secretada
eficientemente neste estudo e demonstrou boa antigenicidade em imunoensaios (Western blot
e ELISA), muito embora o controle da indução sob o domínio do promotor AOX1 e a secreção
da proteína com o direcionamento do fator-α de S. cerevisiae presente no vetor, tenham sido
adotados nos dois trabalhos. Sugere-se que a detecção no sobrenadante observada no presente
trabalho, seja devido à aplicação da precipitação com PEG e o TCA. Ambos precipitam
proteínas e podem ser aplicados em produtos biotecnológicos, sem que haja interferência na
funcionalidade final da proteína recombinante (BOERIS et al., 2007).
Nesse trabalho a rCap foi quantificada no sobrenadante em 140µg/mL. Contrapondo
com o presente resultado, no trabalho de Tu et al. (2012), no qual produziram a rCap de CVS2
em P.pastoris, foi alcançada uma concentração de 174ug/mL da rCap. Vale salientar que Tu
69
et al. (2012) quantificaram a rCap no extrato intracelular, contrariamente ao presente estudo
que quantificou o extrato resultante de uma produção secretória. Extratos intracelulares são
caracteristicamente reconhecidos por reter maior quantidade de proteínas (ROMANOS,
1992). Gonçalves et al. (2010) comparando a produção da proteína recombinante de
coronavírus, produzida em P. pastoris, pelas vias intracelular e secretória, observaram que a
concentração da proteína pela via secretória foi 3 vezes menor que a concentração daquela
produzida pela outra via, mesmo após concentração da proteína com PEG. Coutinho et al.
(2012) detectaram 250µg/mL da proteína recombinante p26 em P. pastoris, produzida pela
via secretória, mas concluiu que a produção poderia ter sido maior. Estes trabalhos reforçam
a eficiência da via secretória utilizada neste trabalho.
A opção de utilizar o sistema de expressão por uma via secretória, ao invés de uma via
intracelular, está relacionada à facilidade de recuperação dessa proteína exógena. A proteína
estando presente no sobrenadante pode evitar protocolos de purificação e constar como
primeiro passo para sua aplicação (LIN-CEREGHINO et al., 2006). Os resultados aqui
apresentados acerca da produção da rCap são considerados satisfatórios, primeiro pela
vantagem associada à via escolhida. Segundo, pela compatibilidade com o tipo de cultivo
realizado em frascos, considerando que cultivos em fermentadores são recomendáveis e
utilizados para obtenção de maior rendimento e concentração de uma proteína heteróloga
(COS et al., 2006). Estes procedimentos de cultivo com o uso de biorreatores que fornece um
sistema melhor controlado quanto aos parâmetros de oxigenação, pH e biomassa e pode ser
empregado futuramente para um maior rendimento da proteína heteróloga.
É válido citar que outros autores que tem priorizado esta via tem relatado algumas
dificuldades detectá-las no sobrenadante (RESINA et al., 2005; GASSER et al., 2006;
GASSER et al., 2007). Gonçalves et al. (2010) concluíram que a ausência de secreção da
glicoproteína S1, do vírus da bronquite infecciosa da galinha, em sobrenadante de P. pastoris
foi decorrida de uma alta produção de polipeptídeos não equivalentes ao processamento da
proteína, provocando a sua retenção no RE. Este processo, denominado de UPR (Unfolded
Protein Response), foi descrito para P. pastoris por Hohenblum et al. (2004). Outros estudos
mais recentes têm averiguado que mutações em aminoácidos estritos, que compõem o fator-α
(fator de sinalização secretória) fazem total diferença no potencial secretório da proteína
(LIN-CEREGHINO et al., 2013). Lin-Cereghino et al. (2013) apontam que a levedura é
frequentemente incapaz de secretar algumas proteínas devido à retenção da proteína no RE
(retículo endoplasmático) ou aparelho de Golgi, o que interrompe ou diminui o nível de
70
secreção da proteína heteróloga. Gibertoni et al. (2010) e Liu et al. (2004) também reportaram
a ausência de secreção da proteína recombinante de Coronavírus neste sistema. Todos estes
fatores que podem interromper o trânsito da proteína para o meio extracelular são válidos de
serem apresentados, pois isto pode estar ligado ao empacotamento maduro da proteína
produzida. Um empacotamento incorreto direciona um “retrocesso” da proteína para o citosol
na forma ubiquitinizada, e esta marcação sinaliza uma degradação protéica (GASSER et al.,
2008).
Entretanto, em outros trabalhos a proteína foi eficazmente secretada, como a proteína
do vírus da anemia infecciosa equina (COUTINHO et al., 2013), proteína de Coronavírus
(HAN et al., 2004), proteína equistatina (OUTCHKOUROV et al., 2002), proteína de
birnavírus (WU et al., 2005). A justificativa sugerida para estes resultados eficientes de
secreção pode-se dever ao fato da tendência inerente de P. pastoris para secreção ou
exportação de proteínas. Até mesmo a secreção daquelas de alto peso molecular,
diferentemente de outras leveduras como S. cerevisiae, em que a maioria das proteínas tende a
permanecerem retidas no periplasma (Çelik e Çalik 2011).
Acerca da antigenicidade observada no western blot, podemos sugerir a manutenção
dos epítopos imunoreativos na rCap produzida conforme os descritos na literatura, visto que
foi usado soro de animais infectados para reconhecimento do antígeno produzido. Observouse no western blot um rastro protéico após a revelação. Isto pode ser indicativo de algum nível
de degradação da proteína, inerente ao microambiente onde ela foi produzida, ou ao
procedimento de precipitação protéica realizado. Os rastros observados correspondem às
amostras precipitadas com o reagente TCA. No trabalho de Coimbra (2012) este padrão se
repetiu com a proteína L1 de papilomavírus humano produzida em P. pastoris. No entanto,
isto não invalida sequer a produção da rCap, visto que além de ter sido corretamente
secretada, reagiu especificamente com os soros de animais infectados com o vírus. Além
disso, no controle negativo da expressão não houve reação imunoquímica do soro com o
extrato analisado.
A funcionalidade da rCap foi confirmada frente a soros de animais positivos para
infecção com o CVS2, provenientes de rebanho com histórico da SMDS, em ELISA indireto.
O sobrenadante contendo a rCap após diálise com PEG foi usado diretamente na microplaca
de ELISA, sem a necessidade de protocolos de lise celular, ou qualquer procedimento
cromatográfico de purificação para recuperação da proteína no sobrenadante. A rCap
mostrou-se um produto eficientemente capaz de discriminar soros sabidamente positivos para
o vírus, dentre os sabidamente negativos para infecção com CVS2. Nas diluições de 1:100 do
71
antígeno e 1:20 do soro foi obtida uma alta razão discriminatória P/N (positivo/negativo) de
597. O teste padronizado dessa forma permitiu um maior rendimento dos reagentes,
justificando o baixo custo para aplicação desse sistema imunoenzimático para detecção de
anticorpos anti-CVS2.
O uso do antígeno recombinante utilizado neste estudo parte do pressuposto que o
emprego de antígenos recombinantes em diagnóstico sorológico apresenta vantagens, pois são
menos laboriosos para uma produção em larga escala (NAWAGITGUL et al., 2002) e de
definida estabilidade antigênica (WU et al., 2008, LIU et al., 2001). A produção de antígenos
recombinantes quando comparado à produção de antígenos em cultura celular é contrastante
pelo tempo consumido e pela prática morosa requerida. O elevado cuidado a cada passagem
pelo risco de contaminação imininente, que podem ser bem numerosas para manter o vírus
replicando, colabora com a morosidade da técnica.
Em soros de animais com doenças infecciosas, pode haver diferentes anticorpos,
devido aos animais terem sido sensibilizados imunologicamente por diferentes patógenos. No
caso de uma doença como a SMDS que para o animal desenvolver a doença são necessárias
coinfecções com outros patógenos (virais, bacterianos), pode possibilitar uma infecção
cruzada (MAGAR et al., 2000). A reação cruzada entre CVS1 e CVS2 já foi descrita. A
demonstração de epítopos imunoreativos comuns da ORF1 com ambos os tipos virais foi
observada, porém nenhuma reação cruzada entre a ORF2 e o CVS1 foi demonstrada (SUN et
al., 2010; LIU et al., 2004). Isto assegura o uso da rCap como reconhecedora de anticorpos em
infecções causadas pelo CVS2, visto que ela reconhece somente a ORF2. Enfraquecendo o
uso de antígenos clássicos, se considerarmos que trabalhar com o vírus completo implica na
obtenção de todas as proteínas virais do patógeno (NAWAGITGUL et al., 2002).
Anticorpos para CVS2 circulantes em rebanhos antes de a SMDS ser conhecida
(MAGAR et al., 2000), demonstram que o antígeno viral está presente em rebanhos com
sinais clínicos aparentes, e também em rebanhos que não possuem sinais equivalentes à
doença (RODRIGUEZ-ARRIOJA et al., 2000; PINTO et al., 2011). Isso destaca o panorama
das infecções sub-clínicas, em que o número de anticorpos é menor que em uma doença
estabelecida. Logo, um teste que tenha alta sensibilidade é se suma importância para sua
aplicação, pois detectar anticorpos em animais aparentemente sadios levaria a medidas de
controle para impedir a disseminação do vírus.
Um ensaio sorológico de IF para circovirose utilizando antígenos tradicionais e
antígeno baseado no gene Cap foi desenvolvido e observou-se que o antígeno recombinante
72
detectou maior número de amostras positivas (RACINE et al., 2004). Entretanto, a IF é um
ensaio não muito prático e muito laborioso (SUN et al., 2010).
A IP é um ensaio sensível para detecção de anticorpos anti-CVS2, mas a falta de
automoção da técnica e a produção do antígeno baseada em cultura in vitro, torna o ensaio
não aplicável em larga escala (SUN et al., 2010). Entretanto, o fato de ser amplamente
utilizado para circoviroses, parece estar relacionado com a vantagem de através de seus
resultados fornecerem a observação do padrão da infecção, além da presença do antígeno viral
nos rebanhos (FAUSTO, 2010).
O ELISA utilizando antígeno recombinante já tem sido reconhecido para diagnóstico
sorológico da circovirose suína 2 (BLANCHARD et al., 2003), devido a sua maior
sensibilidade, praticidade de execução e interpretação dos resultados, comparado a outros
testes (RACINE et al., 2004).
Similar ao nosso estudo, antígenos recombinantes de CVS2 produzidos em sistemas
recombinantes, eucarióticos e procarióticos, têm confirmado essas vantagens descritas para o
ELISAr (GE et al., 2012; SHANG et al., 2009; LIU et al. 2001; NAWAGITGUL et al., 2002).
Liu et al. (2001) e Nawagitgul et al. (2002) observaram risco menor de dupla interpretação
dos resultados, que ocorre devido ao uso do antígeno clássico nos testes de IF e IPMA,
quando realizaram um ELISA utilizando rCap produzida em sistema de Baculovírus.
A presença de falso-positivos já foi observada quando comparadas as técnicas de IF e
ELISA, utilizando antígeno de células fixadas e a rCap, respectivamente. Vários soros
positivos na IF foram negativos no ELISA (SUN et al., 2010). Segundo os autores, este
padrão discordante pode ser devido à fonte do antígeno utilizado na IF. Este padrão
discordante, também foi apresentado quando a rCap foi produzida em baculovírus e o teste de
referência foi a IP. Foram observadas que as amostras negativas no teste, foram positivas no
teste de referência, levando os autores a concluírem que um antígeno solúvel utilizado no
ELISA, comparado ao um antígeno fixado, promove uma ligação mais forte e mais específica
do antígeno com o anticorpo (LIU et al., 2003). No trabalho de Walker et al. (2000) este
padrão também foi repetido.
Os parâmetros intrínsecos ao teste, sensibilidade e especificidade, observados nesse
estudo foram de 100% em ambos, o que levou a 100% de concordância entre os testes. Liu et
al. (2004), também observaram boa concordância entre estes dois testes. Outro estudos
também avaliaram estes parâmetros, Yin et al. (2010) empregando a rCap truncada com
antígeno em ELISA, encontrou boa concordância comparado ao teste padrão IF, entretanto o
fato de somente ocorrer através desse sistema, a produção da proteína rCap após o
73
truncamento da mesma, parece ser desvantajoso sua aplicação, visto que pode modificar
alguns epítopos da proteína e diminuir a sensibilidade geral do imunoensaio na detecção de
anticorpos anti-CVS2 (Ge et al., 2012). Outro estudo bem sucedido de Liu et al. (2004)
utilizando a rCap em ELISA também já foi relatado, porém este sistema eucarioto utilizando
células de insetos, é deveras mais dispendioso que o uso de leveduras.
A relevância de um estudo sorológico para circoviroses pode incluir o monitoramento em
rebanho suspeito de infecção, devido a alta soroprevalência em animais de diferentes idades já
observada (YIN et al., 2010; TRUONG et al., 2001). Além disso, uma caracterização
sorológica também pode fornecer informações importantes para adaptação aos programas de
vacinação, como uma medida de controle da Circovirose Suína 2 (GERBER et al., 2009).
Muito embora haja a necessidade de um maior número de soros para comparação mais
segura entre os testes, a medida de análises de 58 soros, sendo 30 positivos e 28 negativos,
tem cobertura do índice estatístico de 95% de confiança, segundo método proposto por Frey et
al. (1998). Entretanto, esses dados devem ser considerados preliminares, mas com boas
perspectivas de uso do ELISAr associada à potencial imunoreatividade apresentada pela rCap.
Ensaios futuros comparando o ELISAr padronizado com um ELISA comercial, poderão ser
aplicados para validar este ensaio sorológico. Mas é importante saber que muitas etapas são
estritamente necessárias para validar um sistema qualquer proposto (CROWTHER e
VILJOEN, 2006).
Assim pode-se afirmar que a utilização da produção da proteína rCap obtida pelo sistema
de expressão utilizando células de P. pastoris em ensaio diagnóstico sorológico como o
ELISA, proporciona: baixo custo, com fácil recuperação da proteína em sobrenadante, um
sistema sorológico prático em sua execução e sensível em detectar baixos níveis de
anticorpos. É interessante destacar que o antígeno recombinante foi testado quando produzido,
e retestado após um ano e meio, utilizando a mesma alíquota dos soros utilizados na
padronização, com a observação da DO450nm no pool de soros positivos de aproximadamente
0,400, o que atesta a preservação de sua estabilidade e imunoreatividade.
Logo, a aplicação do ensaio ELISAr para detecção de CVS2 para estas primeiras análises
é animador, pois foi demonstrado um potencial imunoreativo da proteína do capsídeo de
CVS2 produzida pela via secretória de P.pastoris, reforçando tanto a viabilidade do sistema
de expressão, quanto aplicabilidade da proteína recombinante no teste sorológico empregado.
74
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÃO

O gene Cap teve seu códon otimizado e ajustado para expressão em P.
pastoris, de forma que foi expresso com sucesso na levedura;

A rCap foi eficazmente produzida pela via secretória, haja vista à sua
detecção em sobrenadante da cultura dos clones recombinantes de P. pastoris

A rCap demonstrou ser imunoreativa ao reconhecer soros positivos de
animais infectados com CVS2 em ensaios de western blot e ELISA indireto

Foi possível padronizar um ensaio prático e sensível utilizando o
antígeno recombinante produzido, pela conferência da antigenicidade da rCap em
uma diluição ideal que discriminasse soros positivos e negativos

Foi identificado de maneira preliminar, parâmetros concordantes e
discordantes entre os testes ELISA e IPMC e a demonstração de concordância de
100% entre eles.
Logo, conclui-se que a proteína do Capsídeo de Circovírus Suíno 2 produzida e secretada
em sistema recombinante da levedura Pichia pastoris, apresenta potencial imunoreativo para
detecção de anticorpos anti-CVS2, sugerindo que sua conformação nativa foi preservada.
75
8. PERSPECTIVAS

Será testado um número maior de soros sabidamente negativos e positivos,
determinado pela IMPC, de animais com histórico de SMDS. Isto irá
proporcionar dados mais robustos para comparação entre os testes. O resultado
implicará em testes futuros para validação do teste ELISAr indireto.

A partir dessas análises será proposta uma publicação.
76
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