Josenildo Segundo Chaves de Araujo Parte 1
Propaganda
UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAIBA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS JOSENILDO SEGUNDO CHAVES DE ARAÚJO INVESTIGAÇÃO DOS EFEITOS CITOTÓXICO, GENOTÓXICO E O POTENCIAL ANTIBACTERIANO ASSOCIADOS AO BIOFILME DENTAL DOS TANINOS ISOLADOS DE Anacardium occidentale Linn E Anadenanthera macrocarpa (Benth.) Brenan Campina Grande - PB 2013 JOSENILDO SEGUNDO CHAVES DE ARAÚJO INVESTIGAÇÃO DOS EFEITOS CITOTÓXICO, GENOTÓXICO E O POTENCIAL ANTIBACTERIANO ASSOCIADOS AO BIOFILME DENTAL, DOS TANINOS ISOLADOS DE Anacardium occidentale Linn E Anadenanthera macrocarpa (Benth.) Brenan Dissertação apresentada a Universidade Estadual da Paraiba – UEPB, em cumprimento dos requisitos necessários para a obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Área de Concentração em Obtenção e Avaliação da Atividade Biológica de Produtos Naturais e Sintéticos de Interesse Farmacêutico do Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profa. Dra. Jozinete Vieira Pereira Coorientadora: Profa. Dra. Hilzeth de Luna Freire Pessoa Campina Grande - PB 2013 É expressamente proibida a comercialização deste documento, tanto na sua forma impressa como eletrônica. Sua reprodução total ou parcial é permitida exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, desde que na reprodução figure a identificação do autor, título, instituição e ano da dissertação FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL – UEPB A659i Araújo, Josenildo Segundo Chaves de. Investigação dos efeitos citotóxico, genotóxico e antibacteriano dos taninos isolados de Anacardium Occidentale Linn e Anadenanthera Macrocarpa (Benth.) Brenan em linhagens de Streptococcus associados ao biofilme dental . [manuscrito] / Josenildo Segundo Chaves de Araújo. – 2013. 81 f. : il. Digitado Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) – Universidade Estadual da Paraíba, Pró-Reitoria de PósGraduação e Pesquisa, 2013. “Orientação: Prof. Dra. Jozinete Vieira Pereira, Departamento de Odontologia”. 1. Planta medicinal. 2. Atividade antimicrobiana. 3. Biofilme dental. 4. Saúde bucal. I. Título. 21. ed. CDD 615.321 DEDICATÓRIA Dedico de todo o meu coração a todas e a todos que estiveram presentes diretamente ou indiretamente para a realização desta etapa da minha vida, principalmente a minha família e meus queridos amigos. AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, por ter me dado coragem de seguir em frente e nunca desistir, pelos seus ensinamentos e sua sabedoria. Aos meus pais, Fátima e Josenildo, por ter me dado um lar, por educar, por amar, pelo apoio, pela cumplicidade, pelo carinho, pelo afeto e pelo respeito, vocês são mais do que vencedores e eu mais ainda por ser filho de vocês. A minha orientadora Jozinete, pela atenção, dedicação e paciência. Foi uma parceria que realmente deu certo. A minha coorientadora Hilzeth, pelo seu acolhimento, bondade, simpatia, conselhos, por nos receber de braços abertos, pela pessoa maravilhosa que você é, sou muito grato. A irmã que eu mais amo nessa vida, Carol, me perdoe pelas dores de cabeça que causei, sem você eu não estaria aqui, pois você também é meu referencial. Ao meu irmão e minha cunhada coisa mais linda, pela simplicidade, bondade e carinho, e também por ter feito eu ser titio, você Américo que está sendo uma das melhores experiências que estou tendo, minha injeção de felicidade. A Crispim, meu anjo da guarda dos animais, valeu pelo companheirismo e pela ajuda que ofereceu, sem você o trabalho não teria sido o mesmo. A toda minha família em geral, minhas queridas avós, Vovó Maria e Vovó Luzia, minhas tias e meus tios, Tia Telma, Tio Papina (in memorian) Tia Kekeda, Tia Jane (lembro muito do seu sorriso), Tia Zélia, Tia Neneda, Tia Branca, Cila, Jau e Aline, Júnior e Joice, Dindo, Gabi e Dindo, Melito pelos bons momentos juntos. Aos meus primos e minhas primas e agregados Dani, Gabi, Cícero, Kadidja, Declieux, Jeaninha, Andinho, Ranyerys, Thárcia, Camila, Gustavo, Bruninho, Toninho, Ariane, Carlianha, Diego, Joyce, Yuri, João Pedro, Victpr, Carlinha, Maria Luiza, Jean, Maíra, Glicia, Ton, Larinha, Milinha, Talinho, Tulinho, Terceiro, Tomaz, Juh Um carinho especial aos meus amigos Leandro Matos, Allan Kardec, Lucio Nunes, Emanuel Frazão, Juliana Carreiro, Jefferson Borges, Guilherme Carneiro, Julinho, Mariana Pires (brigado pela tradução gata), A Zoe, Léo e Bob (sumiu!) que já deram tanto trabalho, e dizem que são os melhores amigos do homem, mas realmente são, de fato. A todos os meus amores EPÍGRAFE "Você é o único responsável pela sua felicidade." Ranyerys Renys RESUMO As plantas são uma rica fonte de novas moléculas biologicamente ativas com reconhecido potencial no desenvolvimento de medicamentos. O Anacardium occidentale Linn é popularmente conhecida como 'cajueiro', é uma planta da família das Anacardiaceae, originária do Nordeste do Brasil e popularmente conhecida por suas propriedades antiinflamatórias e cicatrizantes. O Anadenanthera macrocarpa (Benth.) Brenan ou o "angico" é pertencente a família das Mimosaceae, distribuída pelas regiões tropicais e indicada no tratamento de afeções do sistema respiratório. O objetivo deste estudo consistiu em investigar a citotoxicidade e a genotoxicidade das frações de taninos do extrato etanólico bruto da casca do caule de Anacardium occidentale L. (TAOL) e de Anadenanthera macrocarpa (Benth.) Bernam (TAM) em células eucarióticas, bem como verificar a atividade antibacteriana frente às linhagens de Streptococcus do biofilme dental supragengival. Foi realizado um estudo laboratorial experimental in vitro e in vivo. Os dados estatísticos foram analisados pelo software GraphPad Prism 6.0, utilizando-se os testes t de Student, Bonferroni e ANOVA "two way" para analisar as diferenças entre os grupos, com p<0,05. Foi possível determinar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) dos TAOL e dos TAM utilizando o digluconato de clorexidina como controle positivo frente às linhagens de Streptococcus do biofilme dental: S. mitis ATCC 903, S. mutans ATCC 25175, S. oralis ATCC 10557, S. salivarius ATCC 7073, S. sanguinis ATCC 15300, S. sobrinus ATCC 27609. A atividade antimicrobiana dos TAOL foram caracterizadas como bacteriostática. Na avaliação da citotoxicidade, em nenhuma das concentrações testadas observou-se que os TAOL e os TAM causaram hemólise significativa dos eritrócitos dos grupos sanguíneos humano testados; os taninos não foram capazes de proteger as células eucarióticas quando expostas às soluções hipotônicas de NaCl. As frações de taninos de ambas as plantas em estudo não apresentaram efeito oxidante em nenhuma das concentrações avaliadas. Os TAOL e os TAM também não apresentaram efeito antioxidante. Os TAOL e os TAM também não foram capazes de modificar o material genético em eritrócitos de roedores, ou seja, induzir mutações. Conclui-se que são plantas de utilização popular que apresentaram efetividade para o controle do biofilme dental, e que, de modo geral, não são tóxicas ao organismo, sugerindo que esse possa ser utilizado com eficácia e segurança como um produto fitoterápico para a higiene bucal. PALAVRAS CHAVE: Fitoterapia; Plantas Medicinais; Anacardium occidentale; Anadenanthera macrocarpa; Citotoxicidade; Genotoxicidade; Taninos; Biofilme Dental ABSTRACT Plants are a rich source of new biologically active molecules with recognized potential in drug development. The Anacardium occidentale Linn , popularly known as 'cashew tree' (cajueiro, in Portuguese), is a plant of the family Anacardiaceae, native of the northeast region of Brazil and is popularly known for its anti-inflammatory and healing properties. The Anadenanthera macrocarpa (Benth.) Brenan or "angico" belongs to the Mimosaceae family, distrubuted throughout the tropical regions and indicated for the treatment of respiratory diseases. The aim of this study were to investigate the cytotoxicity and the genotoxicity of the fraction of tannins of the crude ethanol extract of the stem bark from A. occidentalle e A. macrocarpa in eucariotyc cells as well as check the antibacterial activity like Minimum Inhibitory Concentration against Streptococci strains from dental biofilm in relation to the chlorhexidine: S. mitis ATCC 903, S. mutans ATCC 25175, S. oralis ATCC 10557, S. salivarius ATCC 7073, S. sanguinis ATCC 15300, S. sobrinus ATCC 27609. It was performed a experimental laboratory study in vivo and in vitro assay. The statistics were analyzed by the software GraphPad Prism 6.0 using tests like t student, Bonferroni and ANOVA two way to analyses the difference between the groups within p<0,05. The antibacterial activity of the tannins of A. occidentale Linn (TAOL) was characterized as bacteriostatic. In the evaluation of cytotoxicity in any of the tested concentrations, neither TAOL nor TAM caused significant hemolysis of the erythrocytes in human blood in any of the tested groups. They also were not able to protect eucaryotic cells when exposed to hypotonic NaCl solutions. The tannins of the two plants did not show any oxidant effect on concentrations tested and also as did not show antioxidant effects. The TAM and TAOL were not able to modify the genetic material in rodents erythrocytes, in order words, induce mutations. It follows that these plants of popular use showed effectiveness to the biofilm control, and generally weren't toxic to the organism, suggesting that may be able to be used within efficacy and safety like a herbal product for the oral hygiene. KEY WORDS: Phytotherapy; Medicinal Plants; Anacardium occidentale; Anadenanthera macrocarpa; Cytotoxicity, Genotoxicity; Tannins; Dental Biofilm LISTA DE TABELAS E QUADROS Tabela 1. Determinação da CIM in vitro de CLX, TAOL e TAM sobre linhagens bacterianas do biofilme dental...........................................................................39 Tabela 2. Porcentagem de hemólise promovida pelo TAOL em eritrócitos humanos............................................................................................................43 Tabela 3. Porcentagem de hemólise promovida pelo TAM em eritrócitos humanos............................................................................................................43 Tabela 3. Frequência de eritrócitos micronucleados em eritrócitos de sangue periférico de camundongos Swiss machos e fêmeas........................................52 Quadro1. Valores do CIM da CLX, TAOL e TAM sobre linhagens bacterianas de Streptococcus sp. do biofilme dental............................................................40 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1. Efeito Antibacteriano da CLX, dos TAOL e dos TAM sobre linhagens do gênero Streptococcus do biofilme dental.....................................................................41 Gráfico 1. Efeito Antibacteriano da CLX, dos TAOL e dos TAM sobre linhagens do gênero Streptococcus do biofilme dental.....................................................................42 Gráfico 2. Efeito hemolítico dos TAOL em eritrócitos humanos do sistema ABO. (n=3)..............................................................................................................................44 Gráfico 3. Efeito hemolítico dos TAM em eritrócitos humanos do sistema ABO. (n=3)..............................................................................................................................45 Gráfico 4. Efeito antihemolítico dos TAOL em eritrócitos humanos do sistema ABO. Foram utilizados o teste ANOVA "two way" seguido de Bonferroni, p<0,05 (controle x taninos)..........................................................................................................................47 Gráfico 5. Efeito antihemolítico dos TAM em eritrócitos humanos do sistema ABO. Foram utilizados o teste ANOVA "two way" seguido de Bonferroni, p<0,05 (controle x taninos)..........................................................................................................................48 Gráfico 6. Efeito dos TAOL na formação de metHb em eritrócitos humanos (n=3). As colunas e barras representam a média ± e.p.m e analisados pelo teste t student, com p < 0,05 comparado ao controle positivo (Ph)..................................................................50 Gráfico 7. Efeito dos TAM na formação de metHb em eritrócitos humanos (n=3). As colunas e barras representam a média ± e.p.m e analisados pelo teste t student, com p < 0,05 comparado ao controle positivo (Ph)..................................................................50 Gráfico 8. Efeito dos TAOL na proteção da formação de metHb em eritrócitos humanos (n=3). As colunas e barras representam a média ± e.p.m. e analisados pelo teste t student, com p < 0,05 comparado a Ph........................51 Gráfico 9. Efeito dos TAM na proteção da formação de metHb em eritrócitos humanos (n=3). As colunas e barras representam a média ± e.p.m. e analisados pelo teste t student, com p < 0,05 comparado a Ph........................51 LISTA DE FIGURAS E FOTOGRAFIAS Figura1. Ilustração e imagens microscópicas mostrando os eventos da formação do biofilme dental...............................................................................24 Fotografia 1. Imagem de cajueiro......................................................................20 Fotografia 2. Imagem de angico........................................................................21 Fotografia 3. Teste de micronúcleo in vivo em camundongos Wistar swiss.Controle positivo......................................................................................53 Fotografia 4. Teste de micronúcleo in vivo em camundongos Wistar swiss.Controle negativo.....................................................................................53 Fotografia 5. Teste de micronúcleo in vivo em camundongos Wistar swiss.TAOL sem micronúcleo............................................................................54 Fotografia 6. Teste de micronúcleo in vivo em camundongos Wistar swiss . TAM sem micronúcleo.......................................................................................54 LISTA DE ABREVIATURAS BHI - Brain Heart InfusionCIM - Concentração Inibitória Mínima CLX - digluconato de clorexidina 0,12% DNA - Ácido Desoxirribonucleico H2O2 - Peróxido de Hidrogênio Hb - Hemoglobina HClO - Ácido Hipocloroso mHb - Metahemoglobina MIC - Concentração Inibitória Mínima Na2HPO4 - Fosfato Dissódico Na2HPO4.12H2O - Fosfato de Sódio Dodecahidratado NaH2PO4.2H2O - Fosfato Diidrogenado de Sódio OMS - Organização Mundial de Saúde PBS - Tampão Fosfato Salino Ph - Fenilidrazina ROS - Espécies Reativas de Oxigênio rpm - Rotações por Minuto TAM - Taninos de Anadenanthera macrocarpa (Benth.) Brenan TAOL - Taninos de Anacardium occidentale Linn SUMÁRIO 1 Introdução ................................................................................................ 14 2 Fundamentação Teórica .......................................................................... 16 2.1 Plantas Medicinais ..................................................................................... 16 2.2 Anacardium occidentale L.- Cajueiro ......................................................... 20 2.3 Anandenanthera macrocarpa (Benth.) Bernan- Angico ............................. 21 2.4 Considerações sobre os Taninos............................................................... 22 2.5 Atividade Antimicrobiana de Extratos Vegetais sobre Bactérias do Biofilme Dental ................................................................................................... 23 2.6 Biofilme Dental ........................................................................................... 23 2.7 Estresse Oxidativo ..................................................................................... 26 2.8 Dano Oxidativo .......................................................................................... 27 2.9 Importância de Estudos Citotóxicos e Genotóxicos ................................... 28 3 OBJETIVOS .............................................................................................. 32 3.1 Objetivo Geral ............................................................................................ 32 3.2 Objetivos Específicos ................................................................................. 32 4 METODOLOGIA ........................................................................................ 33 4.1 Delineamento do Estudo ............................................................................ 33 4.2 Local da Pesquisa...................................................................................... 33 4.3 Material Botânico ....................................................................................... 33 4.4 Preparação da Amostra ............................................................................. 34 4.5 Eritrócitos Humanos ................................................................................... 34 4.6 Avaliação do Potencial Hemolítico em Eritrócitos Humanos ...................... 34 4.7 Avaliação da Fragilidade Osmótica de Eritrócitos Humanos ..................... 35 4.8 Avaliação do Potencial Oxidante e Antioxidante em Eritrócitos Humanos. 35 4.9 Linhagens Bacterianas Ensaiadas ............................................................. 36 4.10 Avaliação da Concentração Inibitória Mínima (MIC) .................................. 37 4.11 Determinação da Atividade Antimicrobiana ............................................... 37 4.12 Investigação do Potencial Clastogênico e Aneugênico em Eritrócitos de Roedores in vivo ............................................................................38 5 RESULTADOS .......................................................................................... 39 5.1 Avaliação do Efeito Antibacteriano dos TAOL e dos TAM frente à Linhagens de Importância Odontológic .............................................................. 39 5.2 Caracterização do Efeito Antibacteriano dos TAOL e dos TAM ................ 40 5.3 Efeito Hemolítico dos TAOL e dos TAM em Eritrócitos Humanos do Sistema ABO ...................................................................................................... 43 5.4 Efeito Antihemolítico dos TAOL e dos TAM em Eritrócitos Humanos do Sistema ABO ...................................................................................................... 46 5.5 Investigação do Efeito Oxidante dos TAOL e dos TAM em Eritrócitos Humanos ............................................................................................................ 49 5.6 Investigação do Efeito Antioxidante dos TAOL e dos TAM em Eritrócitos Humanos ........................................................................................... 49 5.7 Investigação dos Efeitos Clastogênico e Aneugênico dos TAOL e dos TAM através do Teste de Micronúcleo em Eritrócitos de Roedores in vivo ....... 50 6 DISCUSSÃO.............................................................................................. 55 7 CONCLUSÃO ............................................................................................ 62 REFERÊNCIAS.................................................................................................. 63 ANEXOS ............................................................................................................ 70 - 14 - 1 INTRODUÇÃO Várias são as espécies vegetais que possuem um interesse clínico, partindose do princípio do uso popular. O Anacardium occidentale L., da família das Anacardiaceae, é conhecida popularmente como cajueiro, é uma planta nativa do Norte e Nordeste do Brasil (CHAVES; CITÓ et al., 2010; PIO CORRÊA, 1926). Conhecido devido suas castanhas e pelo seu pseudofruto, o caju. É uma planta rica em taninos, que são seus maiores responsáveis por suas ações biológicas e farmacológicas, dentre as mais relatadas, as antiinflamatória, cicatrizante e antibacteriana (LIMA JÚNIOR; VIEIRA et al., 2005). Anadenanthera macrocarpa (Benth.), o angico-vermelho, da família Fabaceae, subfamília mimosoideae, bastante representativa nas caatingas, com utilização bem diversificada e indicada popularmente para tratamento de doenças respiratórias, úlceras e afecções do peito. Fornece resina semelhante à goma arábica, que é usada em xaropes, também age como expectoreante (LORENZI e MATOS, 2002). Apesar de as duas espécies serem diferentes, ambas são ricas em taninos. Os taninos são substâncias fenólicas solúveis em água e uma de suas características está na habilidade de formar complexos insolúveis em água com alcalóides, gelatina e outras proteínas. Esta complexação com as proteínas é uma característica que determina algumas de suas ações biológicas como o controle de insetos, fungos e bactérias assim como suas atividades farmacológicas. Eles também são os responsáveis pela a adstringência de muitos produtos vegetais (SIMÕES; SCHENKEL et al., 2003). Diante deste fato, é de grande importância a pesquisa de novas substâncias, preferencialmente de origem natural, e que tenha um uso popular, afim de, definir as que menos possuam efeitos adversos ou que não prejudiquem a saúde do indivíduo levando a uma melhor qualidade de vida. Desta forma optou-se por utilizar em vez do extrato bruto, a fração de taninos isolados do Anacardium occidentale L., e Anandenanthera macrocarpa (Benth), com o intuito de chegar cada vez mais perto do princípio ativo responsável e o seu mecanismo de ação. - 15 - A cárie, atualmente, é um bom exemplo das questões da Saúde Pública do Brasil, caracterizada principalmente pela formação do biofilme dentário, este abrange vários microrganismos agregados uns aos outros, posteriormente em camadas formando uma superfície, que são espacialmente organizados em uma estrutura tridimensional e envolvidos por uma matriz de polissacarídeos extracelulares que podem ser derivadas tanto do metabolismo das células quanto do meio ambiente (ALLAKER, 2010; MARSH e MARTIN, 2005; SPRATT e PRATTEN, 2003). O biofilme dental é o responsável pela maioria das doenças localizadas na cavidade oral, como a cárie, gengivite e periodontite (KROL e NEDLEY, 2007). A clorexidina (CLX) é atualmente o fármaco de escolha na Odontologia para a remoção química do biofilme dental, contudo, devido aos seus efeitos adversos como, manchamento dentário, alteração do paladar ou o desequilíbrio da microbiota oral, busca-se por novas alternativas terapeuticas. Por esse motivo têm-se aumentado cada vez mais a pesquisa de novos agentes antimicrobianos, incluindo os de origem natural (LAWRENCE; ZHU et al., 2008). O importante crescimento mundial da fitoterapia dentro de programas preventivos e curativos tem estimulado a avaliação da atividade de diferentes extratos de plantas para o controle do biofilme dental bem como de outras afecções orais (KROL e NEDLEY, 2007). Muitos estudos tem sido desenvolvidos, especialmente com o cajueiro para avaliar a citotoxicidade em células de linhagens tumorais, porém estes estudos são realizados com extratos brutos das plantas, onde estão presentes diversos compostos. Baseado nesse contexto é de grande importância avaliar a atividade antimicrobiana de taninos isolados da casca do caule do cajueiro e angico sobre os microrganismos formadores do biofilme dental, uma vez que na Literatura vem se estudando o extrato bruto da planta. Mutações gênicas estão relacionadas nas etapas do processo da carcinogênese. Diante desse pressuposto os estudos que detectam componentes genotóxicos permitem identificar substâncias com risco potencial em organismos vivos. Também fazem parte dessa pesquisa a realização de testes de toxicidade celular, como os testes de hemólise, antihemólise e estresse oxidativo, como forma de avaliar a citotoxicidade das substâncias envolvidas. - 16 - 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1 Cárie dentária A saúde bucal reflete a saúde geral do indivíduo, até por ser a porta de entrada de diversas doenças. Os biofilmes contêm várias espécies de microorganismos. Estima-se que haja em torno de 700 espécies de microorganismos diferentes na cavidade oral (AAS; PASTER et al., 2005; FILOCHE; WONG et al., 2010; KROL e NEDLEY, 2007; MARSH, 2010). A cárie dentária representa um problema de Saúde Pública que tem elevada prevalência e tem sido objetivo de especial atenção por parte da Organização Mundial de Saúde através da realização de programas de prevenção (MELO; SOUZA et al., 2011). A cavidade oral representa uma interface multifatorial com o meio ambiente externo. As superfícies dentárias e mucosas estão constantemente expostas a uma vasta gama de agentes agressivos de natureza física, química ou microbiana cujos efeitos podem ser neutralizados por sistemas de proteção complexos dependentes da saliva.. Todas as superfícies de interface do nosso corpo são expostas à colonização por uma grande variedade de microorganismos. De um modo geral, a microbiota estabelecida vive em harmonia com o hospedeiro, apesar de uma pequena parte serem agentes patogênicos oportunistas e causarem o aparecimento de doença. A superfície dentária encontra-se colonizada por bactérias constituindo o biofilme dental, como é o caso do Streptococcus mutans e do Lactobacillus (AOBA e FEJERSKOV, 2002). A colonização por microorganismos específicos compreende várias fases que englobam a deposição, adesão, coagregação, crescimento e reprodução dos microorganismos aderidos sobre a película adquirida. Após a formação da película adquirida esta será colonizada por microorganismos que residem na cavidade oral (SAINI; SAINI et al., 2011). O Streptococcus é um tipo de bactéria que se encontra presente na microbiota da cavidade oral e o principal agente etiológico da cárie dentária. Dentro - 17 - do grupo dos Streptococcus podemos salientar o Streptococcus mutans e o sobrinus, e ambos são importantes no desenvolvimento do processo cariogênico (SEKI; YAMASHITA et al., 2006). O Strepcococcus mutans é um dos maiores fatores para o desenvolvimento de cárie dentária, acumulação de placa bacteriana e consequentemente inflamação gengival. Alguns estudos revelaram que a prevalência de encontra-se associada com um nível elevado de atividade cariogênica relativamente ao Streptococcus sobrinus, o que atribui ao Streptococcus mutans um caráter mais acidogênico (NAGASHIMA; YOSHIDA et al., 2007). Diferentes espécies de microrganismos foram encontradas na cavidade oral sob a forma de biofilme. Esse biofilme é formado principalmente por fungos e bactérias e pode causar diversas doenças, como cárie dentária, doença periodontal, candidose, infecções endodônticas, ortodôndicas e em implantes (ALLAKER, 2010), sendo o Streptococcus mutans um dos principais agentes da cárie (FILOCHE; WONG et al., 2010). O biofilme é compreendido por vários microrganismos agregados, nos quais a ele se aderem uns aos outros, posteriormente em camadas em uma superfície. O biofilme dental é formado quando microrganismos sejam eles fungos ou bactérias se aderem a uma superfície sólida envolvida por uma matriz de polissacarídeos extracelulares (ALLAKER, 2010; PAN; HARPER et al., 2010; SPRATT e PRATTEN, 2003; SUTHERLAND, 2001). - 18 - Figura 1. Ilustração e imagens microscópicas da formação do biofilme. Etapas: 1) As bactérias começando a se formar e fixar no extrato dentário; 2) Mais e mais bactérias aderem-se, multiplicando-se cada vez mais resultando em microcolônias. 3) Agora as bactérias se multiplicam por todas as direções formando as macrocolônias, elas agora também multiplicam-se em camadas, e 4) As macrocolônias de bactérias multiplicam-se sobreponde-se uma as outras, completando assim uma camada completa de biofilme. Fonte: sageproducts.com O biofilme oral se acumula tanto em tecidos moles quanto nos duros, porém é composto por microrganismos envolto de uma matriz formada por componentes bacterianos, proteínas salivares, peptídeos e restos de alimentos. Dessa forma o biofilme faz com que haja condições ideais para o crescimento bacteriano e a sobrevivência das espécies. Têm-se observado que as bactérias inseridas no biofilme dental passam a assumir características fenotípicas distintas, fazendo com que este passe a possuir um certo grau de resistência aos antimicrobianos (SUTHERLAND, 2001). A cavidade oral possui uma considerável diversidade anatômica, e, por estas estruturas serem interdependentes favorecem a formação do biofilme. Enquanto que as mucosas estão em constante descamação e renovação da parede epitelial, os microrganismos são continuamente renovados. Enquanto que a aracda dentária constitui uma superfície dura que é favorável à maturação e formação do biofilme bacteriano. A gênese patológica ocorre devido a um desequilíbrio no ecossistema do biofilme dental formado (TESSAROLI, 2010; VON OHLE; GIESEKE et al., 2010). A composição da microflora oral varia significativamente nos distintos microecosistemas da boca, como a parte superior ou inferior da língua, dentes, - 19 - gengivas, tonsilas, etc (MARSH, 2010). O biofilme dental no seu estágio inicial possui uma pequena diversidade de microrganismos comparando-se com a microbiota do biofilme maduro. Dentre os microrganismos que o colonizam inicialmente estão: Streptococcus oralis, Streptococcus sanguinis e Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus. Após esta fase inicial, novas bactérias, principalmente Gram-negativas, se coagregam formando uma camada mais espessa do biofilme, dentre estes microrganismos encontram-se: Eikenella corrodens, Veillonella atypica e Provotella loescheii. Geralmente a divisão entre o biofilme imaturo e maturo ocorre devido a coagregação de Fusobacterium nucleatum. Entre os actinomycetemcomitans, últimos Treponema colonizadores denticola e estão: Aggregatibacter Porphyromonas gingivalis (ALLAKER, 2010; KOLENBRANDER, 2000). Dentre as bactérias do biofilme dental supragengival, e que é objeto deste estudo, as mais representativas são as S. mutans, S. mitis, S. salivarius (AAS; PASTER et al., 2005) A cárie é uma doença muito comum e está intimamente relacionada com a formação do biofilme dental, e a prevenção está em justamente na desorganização do biofilme por remoção mecânica e ação de agentes químicos, por isso a importância em se estudar novos agentes antimicrobianos que ajam com eficácia na eliminação dos microrganismos (PAN; HARPER et al., 2010; TESSAROLI, 2010; WONG; HÄGG et al., 2010). Quando o controle mecânico não puder ser realizado ou estiver sendo feito de forma inadequada, utiliza-se do controle químico como forma complementar ao tratamento. No caso do controle químico, seja ele terapêutico ou profilático, existem na Literatura diversas substâncias capazes de inibir o crescimento bacteriano, sejam eles pelo seu mecanismo de ação, maneira como são veiculadas ou sua eficácia clínica, dentre estes agentes, encontra-se a CLX, que tem se mostrado muito eficiente para esta finalidade (PAN; HARPER et al., 2010; TESSAROLI, 2010; WONG; HÄGG et al., 2010). Porém a CLX, sob forma de colutório a 0,12%, agrega consigo alguns efeitos adversos como a pigmentação dos esmalte dentário, a formação de cálculos e a alteração do paladar (MENEZES, 2012). - 20 - 2.2 Plantas Medicinais As plantas medicinais são utilizadas com o intuito terapêutico desde o início da humanidade para o alívio da dor e no melhora do processo saúde-doença, sendo ainda o mais utilizado no planeta, principalmente no mundo não ocidental, possivelmente por se tratar de um recurso natural e de fácil acesso, comparado à falta de acesso aos medicamentos industrializados e também ao alto custo dos mesmos (PINTO; SILVA et al., 2002; VEIGA JUNIOR; PINTO et al., 2005). Os registros do uso de plantas medicinais datam de 3.000 a.C. nos papiros egípcios que indicavam o uso de quinhentas plantas medicinais. Sob a forma da utilização de métodos de extração mais eficientes surgem na alta idade média quando Paracelsus utilizou o éter etílico aumentando assim a concentração dos princípios ativos nas preparações tornando-as mais eficientes no processo de cura de algumas enfermidades. Posteriormente, no período das grandes navegações, houve uma disseminação do uso das plantas nas mais diversas sociedades dos diferentes continentes, deixando assim um valioso arsenal terapêutico para o mundo moderno e contemporâneo (PINTO; SILVA et al., 2002; SIMÕES; SCHENKEL et al., 2003). O Brasil compreende o país com a maior biodiversidade vegetal de todo o planeta, abrigando aproximadamente cerca de 22% das espécies conhecidas até o momento, sendo a maior parte destes vegetais encontrados na floresta amazônica e na mata atlântica com cerca de cinquenta e cinco mil espécies catalogadas (SIMÕES; SCHENKEL et al., 2003). Pelo metabolismo natural de todos os seres vivos, os organismos produzem substâncias a partir de nutrientes obtidos do meio ambiente, alguns destes compostos químicos fazem parte de todas ou quase todas as espécies, ao passo que outras refletem as particularidades de cada uma. Entre os compostos de primeira classe, os metabólitos primários, se encontram as proteínas, glicídios e lipídeos, aproveitados na alimentação. Os compostos e uso terapêutico, ao contrário, correspondem normalmente aos compostos secundários e são obtidos a partir de organismos específicos. Os fitoterápicos podem conter excipientes, além dos ingredientes ativos. Se ao material vegetal estão associadas substâncias ativas, definidas do ponto de vista químico, sintéticas ou isoladas de plantas, o produto final - 21 - não é considerado um fitoterápico. Assim, planta medicinal não é fitoterápico. Fitoterápico é medicamento vegetal, que, como tal, está submetido aos preceitos éticos enunciados pela Organização Médica Mundial e aos requisitos legais definidos pela legislação, no caso do Brasil é regulamentada pela ANVISA (BRASIL, 2002). As plantas medicinais e os fitoterápicos têm um papel importante na terapêutica. Entretanto, a ideia básica da indicação do uso de fitoterápicos na medicina humana não é substituir medicamentos já registrados e comercializados com eficácia comprovada, mas sim, aumentar a opção terapêutica dos profissionais de saúde, ofertando medicamentos bioequivalentes, também registrados e com eficácia comprovada, para as mesmas indicações terapêuticas e, eventualmente, com indicações complementares às existentes (RATES, 2001). Entretanto, são vistas na maioria das vezes pela população como uma alternativa aos elevados custos dos medicamentos convencionais e não como uma opção terapêutica devido às propriedades curativas das plantas (SANTOS; DANTAS et al., 2009). Contudo, o uso desses recursos naturais é estimulado, muitas vezes, de maneira pouco criteriosa. Os conhecimentos empíricos acumulados no passado, advindos da tradição cultural aliado aos científicos desenvolvidos ao longo do tempo, mostram que as plantas medicinais e os medicamentos fitoterápicos também podem causar efeitos adversos, apresentar toxicidade e contra indicações de uso. O princípio de que o benefício advindo da utilização de um produto com finalidade medicamentosa deve superar seu risco potencial deve ser aplicados também aos produtos da medicina tradicional/popular (ALEXANDRE; GARCIA et al., 2005). O aumento do uso indiscriminado desses recursos naturais, aliado ao conhecimento limitado sobre a ação dessas plantas, faz surgir questionamentos acerca da eficácia e segurança da utilização de fitoterápicos, assim, para garantir melhores respostas a estas lacunas, questionamentos, os testes clínicos devem ser conduzidos de acordo com alguns requisitos fundamentais: os medicamentos fitoterápicos devem ser elaborados com extratos padronizados, ou seja, com constituintes químicos conhecidos tanto do ponto de vista qualitativo como quantitativo. Deve-se realizar um diagnóstico preciso dos pacientes a serem incluídos no teste? a população de estudo deve ser adequada para que os - 22 - resultados possam ser extrapolados para a população total; os processos de randomização e cegamento devem ser adequados para minimizar os vieses e a superestimativa dos resultados (ALEXANDRE; GARCIA et al., 2005). Como etapa prévia ao desenvolvimento de fitoterápicos faz-se necessário a realização de estudos etnobotânicos, os quais segundo Rodrigues; Carvalho (2003) são estudos concernentes à relação mútua entre populações tradicionais e as plantas, apresentando como característica básica de estudo, o contato direto com as as mesmas, procurando uma aproximação e vivência com o fim de resgatar todo conhecimento possível sobre a relação de afinidade entre o homem e as plantas de uma comunidade (RODRIGUES e CARVALHO, 2001; TOLEDO; HIRATA et al., 2003). De posse do levantamento etnobotânico, define-se espécie vegetal a ser estudada, bem como o local da coleta. Nesta fase inicial do trabalho científico, o pesquisador deve estar completamente inteirado da literatura sobre a planta escolhida, sequencialmente, coleta-se um espécime da planta, prepara-se uma exsicata e faz-se a identificação botânica e o registro em um museu ou herbário. A segunda etapa de coleta, destinada ao estudo fitoquímico (o qual compreende as etapas de isolamento, elucidação estrutural e identificação dos constituintes mais importantes do vegetal, principalmente de substâncias originárias do metabolismo secundário, responsáveis, ou não, pela ação biológica), nesta etapa, escolhe-se a parte da planta que será investigada (raiz, caule, galhos, folhas, flores, frutos). Posteriormente, são realizados testes de atividade biológica para investigar o efeito farmacológico e toxicológico das substâncias isoladas, de frações obtidas ou extratos totais da fármaco vegetal (MACIEL; PINTO et al., 2002; TOLEDO; HIRATA et al., 2003). O estudo das plantas medicinais, tradicionalmente utilizadas, é válido em dois aspectos: primeiramente, como uma pesquisa de fármacos com potencial quimioterapêutico, e em segundo, como medida de segurança para o uso popular. A utilização de espécies nativas pode ser considerado uma alternativa econômica para o aproveitamento sustentável da região, devido elas terem uma importância biológica e socioeconômica. São várias as espécies de valor econômico nas comunidades e muitas delas enquadram-se em diferentes usos. Só que deve-se - 23 - tomar o devido cuidado pelo uso regional se dar de forma extrativista, podendo esta espécie correr o risco de extinção. Na literatura, é possível encontrar relatos sobre a utilização de plantas medicinais para problemas bucais. Essas apresentam propriedades antiinflamatórias, anti-hemorrágicas, analgésicas, dentre outras. Como exemplo, pode-se citar: os óleos de cajueiro (Anacardium occidentale L.) e do cravo (Eugenia caryophyllata T.), indicados para odontalgias, a romã (Punica granatum Linn.) que possui atividade antimicrobiana sobre o Streptococcus mutans, microrganismo associado à formação do biofilme dental, além de apresentar atividade antisséptica e antibiótica usada no tratamento de gengivite e úlceras bucais (LIMA JÚNIOR; VIEIRA et al., 2005). Uma extensa revisão de literatura acerca de indicações de plantas medicinais na odontologia em afecções como cáries, estomatites, gengivites e periodontites. Foram encontradas 132 espécies, distribuídas em 52 Famílias Botânicas, citadas como úteis no tratamento de afecções odontológicas. As plantas medicinais mais indicadas foram Punica granatum L., Althaea officinalis, Salvia officinalis, Calendula officinalis L., Malva sylvestris L. e Plantago major L. Mais um motivo para se estudar as atividades relacionadas as duas espécies em questão. Cavalcante et al. (2010) realizaram um levantamento etnobotânico em sete cidades da 1ª regional de saúde do Estado da Paraíba e as plantas mais citadas pelos usuários de serviços públicos de saúde, raizeiros e os cirurgiões-dentistas, foram a romã (Punica granatum), o cajueiro roxo (Anacardium occidentale), aroeira (Schinus terebinthifolius), barbatimão (Stryphnodendron (OLIVEIRA; GOBIRA et al., 2007). adstringens), dentre outras - 24 - 2.3 Anacardium occidentale L.- Cajueiro Fotografia 1. Imagem de cajueiro. Fonte: wikimedia.org/wikipedia/commons/Anacardium_occidentale_0009.jp A árvore do cajueiro, Anacardium occidentale Linn. é brasileira, tipicamente nordestina da família das Anacardiaceae, rica em taninos, os quais lhe conferem atividades cicatrizantes, antibióticas, antiinflamatórias e hemostáticas importantes. A decocção das cascas e a infusão das folhas são usadas como tônico, antidiabético e antiinflamatóro. Esta planta também possui a capacidade de impedir a formação do biofilme dental (MELO; SANTOS et al., 2006). O cajueiro é usado como depurativo, cicatrizante e adstringente, indicado para úlceras da boca, na forma de cozimento de suas cascas (LIMA JÚNIOR; VIEIRA et al., 2005). No estudo etnobotânico realizado por (SANTOS; DANTAS et al., 2009) no município de João Pessoa-PB, o cajueiro roxo foi a segunda planta mais utilizada pelos usuários do serviço público de saúde – sendo a romã a mais comercializada – e uma das plantas mais vendidas pelos raizeiros (erveiros), cuja principal indicação foi para o tratamento de processo inflamatórios, através da ingestão da infusão preparada. Existem vários relatos na literatura demonstrando o uso de folhas, cascas, caule e frutos desta espécie na medicina popular. A casca do tronco é adstringente, rica em tanino, o que justificaria sua indicação popular como cicatrizante. Também é indicada no combate à hipertensão, no tratamento de distúrbios gástricos, como antiinflamatório (FALCÃO; LIMA et al., 2005) e bactericida (SILVA; SOUZA et al., 2007). - 25 - Barcelos et al (2007) estudaram os efeitos do extrato de Anacardium occidentale Linn e perceberam que na dose de 2000μg/mL apresentaram efeito protetor do DNA. Konan et al (2007) também realizaram testes de genotoxicidade, não apresentando efeitos tóxicos na concentração de 2000mg/Kg em relação a ciclosfofamida no teste de micronúcleo, assim como não apresentou atividade genotóxica pelo teste de Ames. O Anacardium occidentale Linn também apresenta efeito antioxidante, antimutagênico e anticlastogênico (MELO-CAVALCANTE; DANTAS et al., 2011) Pereira et al. (2006) mostram que o cajueiro possuem atividades antimicrobianas e antiaderentes em relação ao biofilme dental (PEREIRA; SAMPAIO et al., 2006), sugerindo um maior aprofundamento das pesquisas em saúde bucal, visto ser um problema de saúde pública. 2.4 Anandenanthera macrocarpa (Benth.) Bernan- Angico Fotografia 2. Imagem de angico. Fonte: http://www.repams.org.br/rppns.php?cod=21 O Angico pertence a família Mimosaceae, que se constitui como a menor subfamília das Leguminosae, com cerca de 50-60 gêneros e mais de 2.000 espécies distribuídas nos trópicos, subtrópicos e regiões de clima temperado, sendo a América Tropical, África e Ásia-Austrália centros de grande diversidade do grupo (DIAS; XAVIER et al., 2012; SILVA e BARBOSA, 2000). O angico vermelho é uma espécie arbórea com até 20m alt., bastante representativa nas caatingas, com - 26 - utilização muito diversificada: extração de tanino, uso na medicina popular, fabricação de móveis, forragens das folhas fenadas, ornamentação e carvão, entre outras. O angico vermelho é a espécie de angico com maior abrangência geográfica no Brasil, por apresentar expressiva regeneração natural, ocorrendo indiferentemente em solos secos e úmidos, apresentando crescimento de moderado a rápido (CARVALHO, 2003). De acordo com (LORENZI e MATOS, 2002) a característica de rápido crescimento torna esta espécie interessante para ser aproveitada em reflorestamentos de áreas degradadas, bem como para a produção de lenha e carvão de alta qualidade. Do tronco pode ser extraída uma resina avermelhada que é indicada no tratamento de várias afecções do sistema respiratório, como tosse e bronquite. A casca, embora amarga, é utilizada como remédio no combate a diarréias, disminorréias e úlceras, além de ser utilizada como anti-inflamatório (LIMA, 1989). Espera-se que a ação antioxidante e a redução da peroxidação lipíca possam estarem relacionados aos efeitos farmacológicos desta espécie (DESMARCHELIER; LISBOA ROMÃO et al., 1999) Figueiredo et al. (2013) avaliou a sua ação antimicrobiana através de testes de concentração inibitória mínima com cepas multirresistentes de Staphylococcus aureus e Escherichia coli, sendo eficaz contra essas linhagens, e que, em associação com outros antibióticos de escolha na clínica foi possível identificar o sinergismo destas substâncias (FIGUEREDO; FERREIRA et al., 2013). Poucos são os estudos com a Anadenanthera macrocarpa (Benth.) Brenan, porém estudos com o gênero da espécie mostram elas podem ser utilizadas como fonte de antioxidantes e de proteção do DNA, possuindo uma alta capacidade de inibirem espécies restivas de oxigênio, além de serem capazes de repararem danos ao DNA induzidos por radicais hidroxila (DA SILVA; DA SILVA JÚNIOR et al., 2011). A atividade antioxidante estão relacionadas quanto ao seu maior conteúdo de compostos fenólicos, sendo uma rica fonte de compostos bioativos devido suas capacidades de manutenção de equilíbrio do potencial redox, ou seja, do equilíbrio entre compostos pró-oxidantes e antioxidantes (DA SILVA; DA SILVA JÚNIOR et al., 2011). Devido os taninos serem compostos fenólicos e também são majoritários nesta espécie, optou-se por utilizar a fração destes compostos neste estudo. - 27 - 2.5 Considerações sobre os Taninos Os compostos fenólicos são um dos mais abundantes no reino vegetal em todo o mundo. Sendo considerada uma das principais classes de metabólitos secundários que desempenham uma função biológica no organismo vegetal. Estes compostos ainda subdividem-se nas mais diversas classes, dentre elas, os flavan-3óis, que constitui as protocianidinas, que são os taninos condensados. Os polifenóis ou taninos são compostos fenólicos de maior peso molecular e também apresentam a capacidade de interagir com proteínas (FEDELI; BERRETTINI et al., 2004). Os taninos lideram a quarta posição no ranking mundial quando o assunto é a abundância em relação aos outros compostos, perdendo para a celulose, hemicelulose e a lignina. Os taninos são compostos fenólicos, solúveis em água, com elevados pesos moleculares que variam de 500 a 20000 Daltons. Estes compostos são divididos em quatro grupos distintos: galotaninos, elagitaninos e os taninos complexos e condensados (ou proantocianidinas). Os dois primeiros são compostos hidrolisáveis, os taninos condensados são formados por unidades de flavonoides, possuindo um elevado peso molecular, e os condensados combinam características tanto de um quanto do outro. Exemplos dos condensados são as ligninas (LI; KAI et al., 2006). Por serem compostos fenólicos, são quimicamente reativos e formam ligações de hidrogênio intra e intermoleculares, são facilmente oxidados por enzimas vegetais específicas e influenciados por metais como o cloreto férrico (que causa a sua coloração enegrecida). Os taninos pertencem a um grupo de substâncias químicas que possuem em comum um anel aromático com uma ou mais hidroxilas substituintes que se encontram formando glicosídeos. São componentes vegetais que estão condicionados a interagir com as proteínas da pele ou mucosa transformando-as em substâncias insolúveis e resistentes. Também são classificadas como polímeros fenólicos de elevado pesos moleculares (MENDIZÁBAL, 2011). As plantas ricas em taninos são comumente utilizadas na medicina popular contra males como a diarreia, a hipertensão arterial, reumatismo, hemorragias, - 28 - úlceras, queimaduras, problemas estomacais, renais e urinários, além do processo inflamatório (SIMÕES; SCHENKEL et al., 2003). 2.6 Atividade Antimicrobiana de Extratos Vegetais Vários são os agentes antimicrobianos que são utilizados para determinado fim. Entretanto, vários são os estudos que comprovam o surgimento de efeitos adversos assim como a resistência antibacteriana para muitos destes agentes, que, nas últimas décadas vêm se tornando um grave problema de saúde pública, principalmente devido à automedicação, as prescrições abusivas e o uso indiscriminado dos antibióticos. Diante deste fato é imprescindível a pesquisa de novos agentes antibacterianos, principalmente de origem natural, que venham a melhorar a saúde das coletividades, de forma que eles hajam cada vez mais eficazmente quanto ao seu efeito farmacológico, evitando assim os efeitos adversos e a resistência antimicrobiana, tratando-se apenas a doença em questão (ALVES; QUEIROZ et al., 2009). 2.7 Estresse Oxidativo Quimicamente, todo composto que é capaz de receber elétrons são chamados de oxidantes ou agentes oxidativos, os que são capazes de doar elétrons, agentes redutores. Oxidação é o processo em que ocorre a perda de elétrons. Quando um redutor doa um elétron faz com que a outra molécula seja reduzida, e o oxidante recebe os elétrons e fazendo com que a outra substância seja oxidada. Os agentes redutores agem por doação de elétrons, geralmente por doarem um hidrogênio ou removerem o oxigênio. Devido a termos biológicos, os agentes redutores e oxidantes serão chamados de antioxidantes ou pró-oxidantes (ou oxidantes). Em geral os oxidantes se referem as Espécies Reativas de Oxigênio (ROS), que podem ser classificados em dois tipos distintos: radicais e não radicais (KOHEN e NYSKA, 2002). - 29 - Estas espécies são classificadas como radicais porque contêm pelo menos um par de elétrons não pareado. A ocorrência deste fato faz com que haja uma alta reatividade destas moléculas por terem uma afinidade em doar ou receber elétrons para se manterem estáveis. O grupo dos não radicais também contém uma grande variedade de substâncias, e algumas delas extremamente reativas (em contraste com a definição de não radical), exemplos delas são: o ácido hipocloroso (HClO), peróxido de hidrogênio (H2O2), peróxidos orgânicos, O3, O2, conforme a tabela. Os antioxidantes também podem ser classificados como compostos capazes de prevenir um processo oxidativo. O organismo tem de controlar continuamente a presença tanto dos pró-oxidantes (ou oxidantes) como dos antioxidantes. Sabe-se que o balanço entre eles é de extrema importância à manutenção da vida celular e das funções bioquímicas. Este balanço, geralmente referido como potencial redox, que é específico para cada organela ou sítio biológico (intracelular), e qualquer alteração em qualquer sentido pode se dar de forma deletéria para a célula ou para o organismo (HRBAC e KOHEN, 2000). Devido os ROS terem um curto intervalo de “vida”, eles reagem rapidamente com outras moléculas. Se não há nenhum alvo biológico adjacente ao seu local de produção, estes radicais não causariam um dano oxidativo. A alta reatividade destes radicais em seu curto período de tempo de existência ilustra o potencial efeito tóxico e a dificuldade de prevenir um dano oxidativo. Para prevenir a interação entre radicais e alvos biológicos, agentes antioxidantes devem estar presentes nos locais onde os radicais estão sendo produzidos, para assim poder competir com o substrato biológico (JONES; CARLSON et al., 2000). 2.8 Dano Oxidativo Todas as membranas biológicas são especialmente vulneráveis à oxidação devido a suas altas concentrações de ácidos graxos insaturados. O dano aos lipídeos geralmente é chamado de peroxidação lipídica. Uma simples iniciação pode acarretar numa reação em cadeia capaz de atingir todos os lipídios insaturados na membrana (KOHEN e NYSKA, 2002). - 30 - Os lipídios, os maiores constituintes das membranas biológicas, são alvos fáceis para o ROS. Entre todos os ROS, o OH-, RO- e o nitrogênio reativo estão entre os radicais que mais causam danos as proteínas. A consequência do dano proteico como um mecanismo de resposta ao estresse é a perda da atividade enzimática, alterando funções celulares como a produção de energia, interferência com o potencial formador de membrana e diferenças nos tipos e concentrações de proteínas celulares (KOHEN e NYSKA, 2002). Mesmo o DNA sendo uma molécula bastante estável, uma molécula muito bem rearranjada e protegida, o ROS ainda consegue interagir e causar alguns tipos de danos. Modificação das bases do DNA, quebra das fitas, perda de purinas, dano ao açúcar, ao sistema de reparo, etc. nem todos os ROS podem causar danos, sendo mais atribuído aos radicais hidroxila. Uma exposição do DNA à radicais de hidroxila, como os induzidos por radiação iônica, uma variedade de produtos são formados, podendo ter vários efeitos diferentes (HRBAC e KOHEN, 2000). 2.9 Importância de Estudos Citotóxicos e Genotóxicos Se populações dos países mais pobres utilizam as plantas medicinais por tradição e/ou ausência de alternativas econômicas viáveis, nos países mais desenvolvidos observa-se um maior uso de fitomedicamentos influenciado pelo modismo de consumo de produtos naturais. Este modismo favoreceu a difusão das promessas de cura através das plantas medicinais para males como a impotência, a ansiedade e a obesidade, algumas vezes em um único extrato. O conceito mais perigoso surgido na mesma época foi o de que as plantas medicinais não representam quaisquer riscos para a saúde humana por serem naturais e terem sido testadas através de séculos de utilização pela população de todo o mundo (VEIGA JUNIOR; PINTO et al., 2005). Infelizmente, a maior parte dos fitoterápicos que são utilizados atualmente por automedicação ou por prescrição médica não tem o seu perfil tóxico bem conhecido (CAPASSO; IZZO et al., 2000; VEIGA JUNIOR e MELLO, 2008). Por outro lado, a utilização inadequada de um produto, mesmo de baixa toxicidade, pode - 31 - induzir problemas graves desde que existam outros fatores de risco tais como contra-indicações ou uso concomitante de outros medicamentos. Com base nisso, é de grande importância realizar estudos de toxicidade em extratos a base de plantas, pois alguns de seus constituintes biologicamente ativos podem ser tóxicos para o organismo e conterem substâncias químicas conhecidas como mutagênicas ou carcinogênicas. A detecção de atividade citotóxica de um fitoterápico constitui uma medida prioritária, uma vez que vários compostos químicos podem ser capazes de causar efeitos tóxicos. Portanto, experimentos capazes de fornecer, com razoável margem de segurança, indicações sobre os riscos envolvidos na sua utilização são fundamentais (BENIGNI, 2005). O eritrócito é um tipo de célula que contém alta concentração de ácidos graxos poliinsaturados, oxigênio molecular e íons ferro no estado ligado. Por esta razão, espera-se que eles sejam altamente vulneráveis a reações que envolvem radicais livres e podem ser muito suscetíveis a peroxidação dos lipídios de membrana e hemólise. Dessa forma, a avaliação do potencial citotóxico em eritrócitos humanos constitui um poderoso sistema que pode ser utilizado como um modelo experimental in vitro para investigar os efeitos tóxicos e protetores de uma grande variedade de substâncias (NIKI; YAMAMOTO et al., 1991). Os agentes genotóxicos são aqueles que interagem com o DNA produzindo alterações em sua estrutura ou função e quando essas alterações se fixam de forma capaz de serem transmitidas, denominam-se mutações. As mutações são a fonte de variabilidade genética de uma população, sendo, portanto fundamentais para a manutenção das espécies. É fato que a sociedade contemporânea está exposta a vários tipos de substâncias químicas de origem sintética ou natural. Muitos destes compostos estão presentes como uma forma de garantir a saúde, conforto e segurança das populações, exemplos destas substâncias são os medicamentos, corantes, conservantes, cosméticos, agrotóxicos, dentre muitos outros. Por outro lado, muitos deles podem causar transtornos a sociedade poluindo o ar, a água e o solo, como também afetar os indivíduos que dela fazem parte, devido a uma série de doenças estarem relacionadas ao uso destas substâncias (BARCELOS; SHIMABUKURO et al., 2007; BRAMBILLA; MATTIOLI et al., 2010; VARANDA, 2006). Mutações gênicas estão relacionadas nas etapas do processo da carcinogênese. Diante deste pressuposto os estudos que detectam componentes - 32 - genotóxicos permitem identificar substâncias com o risco potencial em organismos vivos, com uma ênfase especial, em nós, seres humanos. Estas substâncias genotóxicas possuem propriedades físicas e químicas que permitem interações com os ácidos nucleicos. Como estes agentes possuem uma alta reatividade, podem causar danos hereditários através de mutações em células germinativas. Porém, quando estas mutações ocorrem em células somáticas, a consequência mais comum é a formação de tumores, sejam eles benignos ou malignos. Além disso, sabe-se que estas mutações em células somáticas podem acarretar na gênese de algumas doenças crônico degenerativas, como as doenças cardiovasculares, neurodegenerativas, dentre outras (ROSS e MARGOLIS, 2005). Devido estes fatos, já bem documentados, é de extrema importância que o desenvolvimento de novas fármacos requeira uma completa investigação da eficácia e segurança, tendo como objetivo principal a saúde do indivíduo. Como a maioria das substâncias possuem certa reatividade com o organismo, podendo causar algum efeito adverso, o potencial de risco e benefício delas deve ser cuidadosamente levado em consideração, de modo que os benefícios do novo fármaco superem os seus riscos (KRISHNA; URDA et al., 1998). Vários são os estudos de caracterização biológica dos princípios ativos das fármacos de origem vegetal, além de ter sido intensificado os testes de elucidação de efeitos colaterais devido a demanda para a descoberta de novas fármacos (MEI; GUO et al., 2005; RIETJENS; BOERSMA et al., 2005), visto que apenas 25% dos produtos farmacêuticos prescritos são de origem vegetal. Além de algumas classes de substâncias como os antimicrobianos, associado ao uso indiscriminado, tornam estes microrganismos cada vez mais resistentes devido a estas mutações que ocorrem, dando origem ao que denomina-se de resistência bacteriana, tornando-os resistentes a esta substância. É tanto que muitas são as substâncias que possuem um valor biológico reconhecido, porém não podem ser utilizados na terapêutica por possuírem propriedades tóxicas, carcinogênica e mutagênica (AMES, 1983; TAVARES; VARANDA et al., 1999). Dessa forma, na produção de uma nova fármaco, as pesquisas tanto no setor público quanto privado têm um considerável peso no tocante aos resultados dos testes de genotoxicidade in vivo e in vitro. - 33 - Devido a facilidade do acesso as plantas medicinais e ao seu baixo custo, a fitoterapia abre um amplo leque para melhorar a qualidade de vida da população carente, no que diz respeito à cura de doenças e alívio da dor. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) houve um aumento marcante nestas últimas décadas do uso de plantas medicinais voltada para a atenção básica de saúde, e isto reflete diretamente na melhoria da qualidade de vida de populações, principalmente com baixo poder aquisitivo. Sendo assim, o interesse em plantas com propriedades terapêuticas tem crescido bastante, devido às perspectivas de isolar substâncias que apresentem eficácia significativa e menor índice de desvantagens quando levado em conta o custo-benefício (MELO; SANTOS et al., 2006). Baseado neste contexto se faz necessário a realização deste estudo para a avaliação efeito antibacteriano dos TAOL e dos TAM sobre bactérias que compõem o biofilme dental, uma vez que são agentes fitoterápicos, que além de produzirem menos agressões ao organismo, apresentam-se como terapia alternativa frente aos microrganismos resistentes ao tratamento antimicrobiano normalmente utilizado. Da mesma forma que muitas espécies de plantas medicinais são utilizadas na medicina popular para o tratamento de doenças, a maioria delas não foi suficientemente compreendida, e a presença de substâncias citotóxicas e/ou mutagênicas em sua composição ou decorrentes de seu metabolismo podem causar danos à saúde da população. Os testes de de citotoxicidade e de genotoxicidade, como os testes de micronúcleo, fornecem dados mais consistentes e confiáveis sobre os reais riscos ao material genético dos organismos. Estes efeitos mutagênicos causados por tais substâncias resultam em alterações cromossômicas que podem comprometer a saúde dos indivíduos, podendo gerar um grave problema de saúde pública. - 34 - 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral Investigar a citotoxicidade e a genotoxicidade das frações de taninos do extrato etanólico bruto da casca do caule de Anacardium occidentale L. (TAOL) e de Anadenanthera macrocarpa (Benth.) Bernam (TAM) em células eucarióticas, bem como verificar a atividade antibacteriana frente às linhagens de Streptococcus do biofilme dental. 3.2 Objetivos Específicos Avaliar a atividade citotóxica dos TAOL e TAM em eritrócitos humanos dos tipos sanguíneos A, B e O; Avaliar o efeito dos TAOL e dos TAM sobre a fragilidade osmótica em eritrócitos humanos dos tipos A, B e O; Avaliar a atividade oxidante e antioxidante dos TAOL e dos TAM em eritrócitos humanos; Avaliar o potencial clastogênico e aneugênico dos TAOL e dos TAM através do teste de micronúcleo in vivo em eritrócitos de camundongos; Avaliar a Concentração Inibitória Mínima (CIM) efeito antibacteriano dos TAOL e TAM frente às linhagens de Streptococcus sp. do biofilme dental; Caracterizar o efeito antibacteriano dos TAOL e dos TAM, em bacteriostática e/ou bactericida, frente às linhagens de Streptococcus do biofilme dental. - 35 - 4 METODOLOGIA 4.1 Delineamento do Estudo Foi realizado um estudo laboratorial experimental in vitro e in vivo. 4.2 Local da Pesquisa O teste da atividade antimicrobiana assim como os testes de citotoxicidade foram realizados no Laboratório de Bioquímica, Genética e Radiobiologia do Departamento de Biologia Molecular da Universidade Federal da Paraiba/UFPB, João Pessoa/PB, e os de genotoxicidade no Biotério Prof. Thomas George do Centro de Biotecnologia desta mesma instituição. 4.3 Material Botânico Os taninos isolados das cascas do caule do Anacardium occidentale Linn. (cajueiro) e da Anadenanthera macrocarpa (angico) foram oriundos do Núcleo de Pesquisas do Semi Árido (NUPEÁRIDO) da Universidade Federal de Campina Grande, Patos/PB. A exsicata da planta utilizada está depositada no Herbário Caririensis Dárdano de Andrade Lima, da Universidade Regional do Cariri – URCA, Crato/ CE. - 36 - 4.4 Preparação da Amostra Os taninos liofilizados foram solubilizados em água destilada na concentração de 10mg/mL para os testes citotóxicos e 25mg/mL para o teste antibacteriano. 4.5 Eritrócitos Humanos Os eritrócitos humanos (A, B, O) foram oriundos de sangue que não poderiam mais serem utilizados para transfusão (sangue a ser descartado) obtido da Unidade Transfusional do Hospital Universitário Lauro Wanderley - HULW/UFPB. A manipulação e o descarte do sangue foram realizados de acordo com as Normas de Biosegurança seguidas pela referida Unidade. Os procedimentos experimentais foram analisados pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos do HULW/UFPB, através da Plataforma Brasil no site do Ministério da Saúde nº.206.295/2013. 4.6 Avaliação do Potencial Hemolítico em Eritrócitos Humanos Uma amostra de sangue humano foi misturado com NaCl 0,9 % na proporção de 1:30 e centrifugada a 2500 rpm durante 5 minutos para obtenção dos eritrócitos. Este procedimento foi repetido por mais duas vezes e o sedimento da última centrifugação foi ressuspenso em NaCl 0,9% para obter uma suspensão a 0,5% de sangue. As amostras dos taninos das duas espécies em diferentes concentrações (1, 10, 100 e 1000μL/mL) foram adicionadas à 2 mL da suspensão de eritrócitos para um volume final de 2,5 mL. Uma suspensão de eritrócitos foi utilizada como controle negativo (0 % de hemólise) e uma suspensão de eritrócitos acrescida de Triton X-100 a 1% como controle positivo (100 % de hemólise). Após isso, as amostras foram incubadas por 1 hora à 22 ± 2 ºC sob agitação lenta e constante - 37 - (100 rpm). Decorrido este tempo as amostras foram centrifugadas a 2500rpm durante 5min e a hemólise foi quantificada por espectrofotometria em comprimento de onda de 540nm (RANGEL; MALPEZZI et al., 1997). Todos os experimentos foram realizados em triplicata e expressos como a média mais ou menos o erro padrão da média 4.7 Avaliação da Fragilidade Osmótica de Eritrócitos Humanos A avaliação da fragilidade osmótica (ou efeito antihemolítico) dos eritrócitos humanos foi realizada com uma suspensão de eritrócitos a 0,5%. Uma solução do produto teste em diferentes concentrações (1, 10, 100 e 1000μL/mL) foi incubada em tubos contendo 2 mL de uma suspensão de eritrócitos por 1h a 22 ± 2 °C. Decorrido este tempo, as preparações foram centrifugadas a 2500 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi descartado. Os eritrócitos foram então ressuspensos em soluções hipotônicas de cloreto de sódio (0,12; 0,24; 0,36; 0,48; 0,60; 0,72; 0,84 e 0.96%) e agitadas a 100 rpm, por mais 20min a 22±2°C. Após este período, as amostras foram centrifugadas a 2500 rpm por 5 minutos e a hemólise foi quantificada por espectrofotometria em comprimento de onda de 540nm (DACIE e LEWIS, 2001). Todos os experimentos foram realizados em triplicata e os resultados expressos como a média mais ou menos o erro padrão da média. 4.8 Avaliação do Potencial Oxidante e Antioxidante em Eritrócitos Humanos Para investigar o potencial oxidante do produto teste foi preparada uma suspensão de eritrócitos a 30% em PBS (11,35g NaH2PO4.2H2O; 24,36g Na2HPO4 e 7,18g NaCl para 1 L; pH 7,4) suplementado com glicose (200 mg/dL), pH 7,6. Em seguida, as amostras do produto teste em diferentes concentrações (1, 10, 100 e 1000μL/mL) foram adicionadas a 2mL da suspensão de eritrócitos e incubados por um período de 1h sob agitação lenta e constante (100 rpm) a 22±2°C. Em seguida as amostras foram centrifugadas a 2500rpm durante 5min e a porcentagem de - 38 - metahemoglobina (metHb) em relação a hemoglobina (Hb) total foi quantificada por espectrofotometria em comprimento de onda de 630nm e 540nm, respectivamente. A porcentagem de metHb formada foi comparada com os valores obtidos para a fenilhidrazina (Ph), agente oxidante (WEFFORT-SANTOS; ARBOS et al., 2008). Para investigar o potencial antioxidante, após o período de incubação de 1h referente a etapa descrita anteriormente, foi adicionado um 1mmol/L do agente oxidante fenilhidrazina. As suspensões foram aeradas e mantidas sob agitação lenta e constante (100 rpm) por mais 20 minutos a 22±2 °C. Decorrido este período, as amostras foram centrifugadas a 2500 rpm durante 5 minutos, diluídas em tampão fosfato (9g Na2HPO4.12H2O, 5,7g KH2PO4 para 1 L) e a porcentagem de metHb em relação a Hb total foi quantificada por espectrofotometria a 630 nm e 540 nm. Os valores de metHb entre 1,9 e 2,0% foram considerados normais enquanto que valores acima de 4% foram considerados elevados (CAMARGO; ALVES et al., 2007). A porcentagem de metHb formada foi comparada com os valores obtidos para a vitamina C (20 mmol/L), agente anti-oxidante (WEFFORT-SANTOS et al., 2008). Todos os experimentos foram realizados em triplicata e expressos como a média mais ou menos o erro padrão da média. - 39 - 4.9 Linhagens Bacterianas Ensaiadas Para a avaliação defeito antibacteriano em bactérias formadoras do biofilme dental foram utilizadas linhagens padrão da ATCC (American Type Culture Collection). As linhagens utilizadas foram as seguintes; Streptococcus mitis ATCC 903; Streptococcus mutans ATCC 25175; Streptococcus oralis ATCC 10557; Streptococcus salivarius ATCC 7073; Streptococcus sanguinis ATCC 15300; Streptococcus sobrinus ATCC 27609. As linhagens foram obtidas mediante solicitação na Fundação Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro/RJ), remetidas em Ágar Sangue Inclinado "slants", e posteriormente reativadas no Laboratório de Microbiologia da Universidade Federal da Paraíba. Os microrganismos foram inoculados em caldo BHI (HIMEDIA) e incubados a 37ºC/24h, a fim de se obter uma turvação indicando o crescimento bacteriano. Os meios de cultura utilizados para o crescimento das bactérias nos experimentos foram preparados de acordo com as instruções do fabricante. 4.10 Avaliação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) Para a avaliação da CIM, foram realizados testes em placas de microdiluição de 96 poços. As linhagens de Streptococcus do biofilme dental foram suspensas nos poços contendo o meio BHI (Brain Heart Infusion) preparado de acordo com informações do fabricante. Soluções de clorexidina 0,12%, TAOL e TAM em - 40 - diferentes concentrações de 1:1 até 1:2.024 partindo da concentração inicial de 25mg/mL. Foi feito a leitura em espectrofotometria de ultravioleta ELIZA e submetidos por 24h em estufa a 36±1ºC. Após as 24h foi realizado uma nova leitura. O resultado foi obtido através da média±epm das diferenças dos valores obtidos no leitor ELIZA. 4.11 Caracterização da Atividade Antimicrobiana Para determinar se efeito antibacteriano era bacteriostática ou bactericida, uma alíquota (5μL) da amostra que não apresentou crescimento (CIM) foi plaqueada em BHI Agar na ausência das substâncias em seguida incubadas a 37 ºC por 24h. A atividade dos taninos será considerada bacteriostática quando decorrido este tempo evidenciarmos crescimento, e bactericida, quando este não ocorrer (MADIGAN e MARTINKO, 2004). 4.12 Investigação do Potencial Clastogênico e Aneugênico em Eritrócitos de Roedores in vivo Para a realização dos modelos experimentais, foram utilizados camundongos Mus musculus albinos machos e fêmeas, linhagem Swiss pesando entre 25-35g, todos provenientes o Biotério Prof. Thomas George da UFPB. Os animais foram aclimatados às condições do biotério local, sob temperatura (25 ± 2ºC) e ciclos claro-escuro controlado de 12-12h. Os animais foram alimentados com ração e água ad libitum. A utilização desses animais na pesquisa, foi somente realizada após a aprovação pela Comissão de Uso de Animais do Centro de Biotecnologia – CEUA/CBioTec/UFPB Nº 0307/12, tendo como forma de diminuir a dor, estresse ou outro sofrimento dos animais envolvidos, xilazina 2% foi aplicado intraperitonialmente. - 41 - Os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a Resolução Nº 90 – 16/04/2004 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA - Grupos de três machos e três fêmeas receberam, por via oral, doses de 2000 mg/Kg da solução do produto teste. Um grupo controle (negativo) recebeu apenas o dispersante da amostra e o controle (positivo) recebeu o agente mutagênico ciclofosfamida numa dose de 50 mg/Kg de peso do animal. Vinte e quatro horas após a administração da substância, os animais foram sacrificados e uma amostra de sangue foi colhida para o preparo de lâminas. As lâminas foram analisadas para observação da presença ou não de micronúcleos nos eritrócitos de cada animal. Foram contados cerca de 2000 eritrócitos por animal. As lâminas foram coradas com corante panótico e observadas ao microscópio óptico no aumento de 1000x para a contagem dos micronúcleos (HAYASHI; TICE et al., 1994). Os resultados foram expressos como a média mais ou menos o erro padrão da média. - 42 - 5 RESULTADOS 5.1 Avaliação do Efeito Antibacteriano dos TAOL e dos TAM frente à Linhagens de Importância Odontológica Os TAOL inibiu o crescimento de todas as linhagens bacterianas testadas sendo S. mitis e S. mutans os mais sensíveis. Os TAM não foi capaz de inibir o crescimento de nenhuma das linhagens testadas. Os valores de CIM para a CLX, os TAOL e os TAM frente a cada uma das linhagens de Streptococcus estão apresentadas no Quadro 1. Tabela 1. Determinação da CIM in vitro de CLX, TAOL e TAM sobre linhagens bacterianas do biofilme dental. Obs. "+" houve crecimento, "-" não houve crescimento bacteriano S. mitis S. mutans CLX/TAOL / TAM CLX/TAOL / TAM Diluição 1:1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 + + + + + 1:2048 + CLX = Clorexidina + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + S. oralis CLX/TAOL / TAM + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + S. salivarius CLX/TAOL / TAM + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + S. sanguinis CLX/TAOL / TAM + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + S. sobrinus CLX/TAOL / TAM + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - 43 - Quadro 1. Valores da CIM da CLX, TAOL e TAM sobre linhagens bacterianas de Streptococcus sp. do biofilme dental Linhagens Clorexidina 2% (μg/mL) TAOL (μg/mL) TAM (μg/mL) S. mitis S. mutans 0,781 3,125 3,125 3,125 > 25 > 25 S. oralis 1,562 6,25 > 25 S. salivarius 0,390 6,25 > 25 S. sangunis 1,562 6,25 > 25 S. sobrinus 1,562 6,25 > 25 5.2 Caracterização do Efeito Antibacteriano dos TAOL e dos TAM O efeito antimicrobiano dos TAOL foi caracterizado como bacteriostático. Não foi possível caracterizar o efeito antimicrobiano dos TAM devido não ter sido encontrado o CIM. - 44 - Absorbância (630nm) S. mitis 2.0 CLX TAM TAOL 1.5 1.0 0.5 0.0 12 10 8 6 4 poço Absorbância (630nm) S. mutans 2.0 CLX TAM TAOL 1.5 1.0 0.5 0.0 12 10 8 6 4 poço Absorbância (630nm) S. oralis 2.0 CLX TAM TAOL 1.5 1.0 0.5 0.0 12 10 8 6 4 poço Gráfico 1. Efeito Antibacteriano dos TAOL, dos TAM e da CLX, sobre linhagens do gênero Streptococcus. Poços de 1 a 12 representa diluições seriadas de 1:1 à 1:2048 - 45 - Absorbância (630nm) S. salivarius 2.0 CLX TAM TAOL 1.5 1.0 0.5 0.0 12 10 8 6 4 2 poço Absorbância (630nm) S. sanguinis 2.0 CLX TAM TAOL 1.5 1.0 0.5 0.0 12 10 8 6 4 poço Absorbância (630nm) S. sobrinus 2.5 CLX TAM TAOL 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 12 10 8 6 4 poço Gráfico 1. Efeito Antibacteriano dos TAOL, dos TAM e da CLX, sobre linhagens do gênero Streptococcus. Poços de 1 a 12 representa diluições seriadas de 1:1 à 1:2048 - 46 - 5.3 Efeito Hemolítico dos TAOL e dos TAM em Eritrócitos Humanos do Sistema ABO Os TAOL não foram capazes de induzir hemólise em eritrócitos humanos pertencentes aos tipos sanguíneos A, B e O (Tabela 1). O efeito hemolítico não se apresentou dependente de concentração. (Gráfico 1). Os TAM foram capazes de induzir hemólise em eritrócitos humanos pertencentes aos tipos sanguíneos A, B e O, entretanto em porcentagens baixas (Tabela 2). O efeito hemolítico se apresentou dependente de concentração e os eritrócitos do tipo A e do tipo O se mostraram mais susceptíveis a tal efeito (Gráfico 2). Tabela 2. Porcentagem de hemólise promovida pelo TAOL e pelo TAM em eritrócitos humanos Tipo Sanguíneo A B O 1 TAOL 5,1 7,7 2,2 TAM 5,1 15,5 16,6 % Hemólise [µg/mL] 10 100 TAOL TAM TAOL TAM 5,1 5,1 3,5 3,5 8,2 19 6,6 17,7 9,7 26,2 1,1 22,4 1000 TAOL TAM 3,6 3,6 5 24,5 6,2 36,2 - 47 - A) Ensaio hemolítico sangue A 1.0 Hemólise (%) 0.8 0.6 0.4 0.2 10 00 10 0 10 1 C C + 0.0 TAOL [g/mL] B) Ensaio hemolítico sangue B 1.0 0.8 Hemólise (%) 0.6 0.4 0.2 10 00 10 0 10 1 C C + 0.0 TAOL [g/mL] C) Ensaio hemolítico sangue O Hemólise (%) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 10 00 10 0 10 1 C - C + 0.0 TAOL [g/mL] Gráfico 2. Efeito hemolítico dos TAOL em eritrócitos humanos do sistema ABO. (n=3) - 48 - A) Ensaio hemolítico sangue A Hemólise (%) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 10 00 10 0 10 1 C C + 0.0 TAM [g/mL] B) Ensaio hemolítico sangue B Hemólise (%) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 10 00 10 0 10 1 C C + 0.0 TAM [g/mL] C) Ensaio hemolítico sangue O Hemólise (%) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 10 00 10 0 10 1 C C + 0.0 TAM [g/mL] Gráfico 3. Efeito hemolítico dos TAM em eritrócitos humanos do sistema ABO. (n=3) - 49 - 5.4 Efeito Antihemolítico dos TAOL e dos TAM em Eritrócitos Humanos do Sistema ABO Os TAOL não apresentaram efeito sobre a fragilidade osmótica frente aos eritrócitos humanos de três tipos sanguíneos (A, B e O) não reduzindo significativamente a taxa de hemólise em sangue previamente tratado com os TAOL à 1000mg/mL (gráfico 4), maior concentração testada no teste hemolítico. O Gráfico 5 apresenta o efeito biológico dos TAM sobre a fragilidade osmótica eritrocitária, que, semelhante ao TAOL, este não modificou a fragilidade da membrana dos eritrócitos humanos nos três tipos sanguíneos, portanto não reduziram significativamente a taxa de hemólise. - 50 - A) Antihemólise sangue A D.O. (540nm) 1.0 Sangue A Controle 0.8 0.6 0.4 0.2 0. 96 0. 84 0. 72 0. 60 0. 48 0. 36 0. 24 0. 12 0.0 Nacl (%) B) Antihemólise sangue B D.O. (540nm) 1.0 Sangue B Controle 0.8 0.6 0.4 0.2 0. 96 0. 84 0. 72 0. 60 0. 48 0. 36 0. 24 0. 12 0.0 Nacl (%) C) Antihemólise sangue O D.O. (540nm) 1.0 Sangue O Controle 0.8 0.6 0.4 0.2 0. 96 0. 84 0. 72 0. 60 0. 48 0. 36 0. 24 0. 12 0.0 Nacl (%) Gráfico 4. Efeito antihemolítico dos TAOL em eritrócitos humanos do sistema ABO. Foram utilizados o teste ANOVA "two way" seguido de Bonferroni, p<0,05 (controle x taninos) - 51 - Ensaio antihemolítico sangue A 1.0 Sangue A Controle 0.8 0.6 0.4 0.2 0. 96 0. 72 0. 48 0.0 0. 24 % mHb DP (630nm) A) Nacl (%) Sangue B Controle 0.8 0.6 0.4 0.2 0. 96 0. 72 0. 48 0.0 0. 24 % mHb DP (630nm) Ensaio antihemolítico sangue B 1.0 Nacl (%) % mHb DP (630nm) Ensaio antihemolítico sangue O 1.0 Sangue O Controle 0.8 0.6 0.4 0.2 0. 96 0. 72 0. 48 0. 24 0.0 Nacl (%) Gráfico 5. Efeito antihemolítico dos TAM em eritrócitos humanos do sistema ABO. Foram utilizados o teste ANOVA "two way" seguido de Bonferroni, p<0,05 (controle x taninos) - 52 - 5.5 Investigação do Efeito Oxidante dos TAOL e dos TAM em Eritrócitos Humanos Os TAOL e os TAM não apresentaram efeito oxidante nas concentrações testadas (1, 10, 100 e 1000μg/mL), uma vez que a quantidade formada de metHb não foi significativamente diferente do controle negativo (Hb), ou seja, a quantidade de metHb formada na ausência e na presença dos TAOL em todas as concentrações testadas não apresentou diferença significativa (Gráficos 6 e 7). 5.6 Investigação do Efeito Antioxidante dos TAOL e dos TAM em Eritrócitos Humanos Os TAOL e os TAM não foram capazes de inibir o efeito oxidante da Ph nas concentrações testadas (1, 10, 100 e 1000μg/mL) uma vez que a quantidade de metHb formada não foi significativamente diferente quando comparada com o controle positivo (Ph) (Gráficos 8 e 9). - 53 - Estresse Oxidativo Efeito Oxidante MetHb (%Hb) 40 30 20 10 10 00 10 0 10 1 C - C + 0 TAOL [g/mL] Gráfico 6. Efeito dos TAOL na formação de metHb em eritrócitos humanos (n=3). As colunas e barras representam a média ± e.p.m e analisados pelo teste t student, com p < 0,05 comparado ao controle positivo (Ph) Estresse Oxidativo Efeito Oxidante metHb(%Hb) 40 30 20 10 00 10 10 0 10 1 C C + 0 TAM (g/m L) Gráfico 7. Efeito dos TAM na formação de metHb em eritrócitos humanos (n=3). As colunas e barras representam a média ± e.p.m e analisados pelo teste t student, com p < 0,05 comparado ao controle positivo (Ph) - 54 - Estresse Oxidativo Efeito Antioxidante MetHb (%Hb) 60 40 20 10 00 10 0 10 1 C C + 0 TAOL (g/mL) Gráfico 8. Efeito dos TAOL na proteção da formação de metHb em eritrócitos humanos (n=3). As colunas e barras representam a média ± e.p.m. e analisados pelo teste t student, com p < 0,05 comparado ao controle positivo (Ph) Estresse Oxidativo Efeito Antioxidante MetHb (%Hb) 1.5 1.0 0.5 10 00 10 0 10 1 C C + 0.0 TAM (g/mL) Gráfico 9. Efeito dos TAM na proteção da formação de metHb em eritrócitos humanos (n=3). As colunas e barras representam a média ± e.p.m. e analisados pelo teste t student, com p < 0,05 comparado ao controle positivo (Ph) - 55 - 5.7 Investigação dos Efeitos Clastogênico e Aneugênico dos TAOL e dos TAM através do Teste de Micronúcleo em Eritrócitos de Roedores in vivo Os TAOL na concentração de 2000mg/Kg e nas condições testadas não induziram um aumento estatisticamente significativo na frequência de micronúcleos em relação ao controle negativo. Os TAM na concentração de 2000mg/Kg e nas condições testadas não induziram um aumento estatisticamente significativo na frequência de micronúcleos em relação ao controle negativo. Tabela 3. Frequência de eritrócitos micronucleados em eritrócitos de sangue periférico de camundongos Swiss machos e fêmeas Substâncias testadas Água Ciclofosfamida (50mg/Kg)** TAOL (2000mg/Kg) TAM (2000mg/Kg) Eritrócitos micronucleados (média ± e.p.m.) 0,83 ± 0,17 9,27 ± 1,42 0,78 ± 0,14 0,73 ± 0,16 - 56 - Fotografia 3. Micrografia (aumento 100x) do teste de micronúcleo mostrando eritrócito de camundongos Wistar swiss após tratamento com cilosfofamida (50mg/Kg) Fotografia 4. Micrografia (aumento 100x) do teste de micronúcleo mostrando eritrócito de camundongos Wistar swiss após tratamento com água, evidenciando a ausência de micronúcleo
