IS Pretorius 3. O potencial das leveduras enológicas

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PARTE 2: LEVEDURAS, PAG. 1
VIDEIRAS E LEVEDURAS ENOLÓGICAS CRIADAS PARA A PRODUÇÃO DE VINHOS DE
QUALIDADE CENTRADOS NO MERCADO
PARTE 2: LEVEDURAS
I.S. Pretorius
The Australian Wine Research Institute, Waite Road, Urrbrae, Adelaide, SA 5064, Australia
Tel: +61 8 8303 6600; Fax: +61 8 8303 6601; E-mail: [email protected]
3. O potencial das leveduras enológicas geneticamente modificadas
3.1 Espécies e estirpes de leveduras
As leveduras são predominantes durante a fermentação do vinho. Nas fermentações espontâneas há um
aumento de leveduras indígenas que têm origem na superfície dos bagos de uva e no equipamento
vitivinícola. Leveduras dos géneros Kloeckera, Hanseniaspora e Candida predominam nas fases iniciais
seguidas nas fases seguintes por variadas espécies de Metschnikowia e Pichia, com o etanol a aumentar para
3-4%. A última etapa das fermentações espontâneas é invariavelmente dominada pelas estirpes S. cerevisiae
que toleram o álcool, universalmente conhecidas como as “leveduras enológicas”. Pensa-se que as leveduras
indígenas presentes na fermentação espontânea do vinho podem produzir vinhos estruturados e redondos na
boca. Contudo, as fermentações espontâneas são normalmente prolongadas e o resultado é muito
imprevisível. Por isso, as fermentações espontâneas só estão a ser usadas em algumas “adegas boutique” que
dependem mais da variabilidade da colheita e que se predispõem a aceitar este risco com o intuito de atingir
estilos distintos de vinhos que reflictam a variedade de leveduras de uma dada região específica.
Nas adegas modernas que produzem grandes volumes, onde fermentações rápidas e seguras são essenciais
para se conseguir um vinho com aroma constante e qualidade definida, são usadas culturas de estirpes de
S. cerevisiae, especialmente seleccionadas e conhecidas pelas suas capacidades. Para além da função de base
destas estirpes de leveduras secas activas enológicas, que consiste em catalisar a conversão rápida, eficaz e
completa dos açúcares da uva (glucose e frutose) em álcool sem o desenvolvimento de aromas indesejáveis,
os viticultores e enólogos que estão hoje na linha da frente exigem das estirpes de culturas starter uma gama
completa de propriedades específicas que podem valorizar o produto final. Esta procura, por parte dos
enólogos, de estirpes de leveduras enológicas optimizadas para tarefas específicas conduziu ao
desenvolvimento e engenharia genética de leveduras.
3.2 Características genéticas e técnicas para a análise e melhoramento das leveduras enológicas
A maioria das estirpes de S. cerevisiae desenvolvidas em laboratório é haploide ou diploide, sendo que, as
estirpes de leveduras enológicas existentes no mercado são predominantemente diploides ou aneuploides e
ocasionalmente poliploides. A sequência completa do genoma de S. cerevisiae é conhecida: tem um genoma
relativamente pequeno e compacto (ca.13 000 Kb), um grande número de cromossomas (16 cromossomas
que variam em comprimento entre 200 a 2200 kb), um reduzido número de genes (ca.6000 genes
codificadores de proteínas), pouco ADN repetitivo e poucos introns.
Existem métodos genéticos e moleculares clássicos com um forte potencial, e através destes, estirpes de
leveduras enológicas podem ser analisadas e modificadas. Inicialmente, foram usadas quatro tipos de
análises com a ajuda de um micro manipulador para a identificação genética, caracterização e o
posicionamento dos genes das leveduras. Recentemente, a tecnologia tem sido desenvolvida para criar uma
ligação directa entre o genoma (todos os genes) e o transcriptoma (cadeia completa de transcritores =
intermediários entre genes e proteínas) de uma estirpe de levedura enológica. A sequência de genes tem
vindo a ser usada para o design e síntese de séries de oligonucleotidos de alta densidade para monitorizar
níveis de expressão de quase todos os genes das células desenvolvidas sob condições de fermentação. Para
além disso, num futuro próximo, quando a corrente decifradora da função de 6000 genes de S. cerevisiae
estiver completa, o proteoma (cadeia completa de proteínas) tornar-se à acessível para a descodificação do
complexo metaboloma (actividades metabólicas e metabolitos) das leveduras enológicas.
A informação obtida através da análise dos genomas completos, transcriptomas, proteomas e metabolomas
das leveduras enológicas irá aumentar, sem dúvida, a especificidade dos correntes métodos com os quais as
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estirpes de arranque são geneticamente seleccionadas e “talhadas à medida” para a produção de tipos e de
estilos de vinho particulares. Actualmente, a selecção clássica das estirpes e os métodos de modificação, tais
como a selecção de variantes, a mutagénese, a hibridação (cruzamento, cruzamento esporo-célula,
citoducção e fusão de esferoplastos), são baseados principalmente numa aproximação pouco específica. Com
esta aproximação grandes regiões genómicas ou genomas completos são recombinados e reestruturados.
Contudo, estes métodos não são suficientemente específicos para alterar as leveduras enológicas de uma
forma bem controlada e podem provocar o desenvolvimento de algumas propriedades das estirpes de
leveduras, comprometendo, no entanto, outras características desejáveis. As únicas vantagens destes métodos
são que eles podem ser usados para melhorar e combinar características sob controlo poligénico, bem como,
não dar origem a produtos que são incluídos nas definições estatutárias dos OGMs. Por isso, variantes,
mutantes, híbridos, e resultantes de citoducção e fusão não são objecto das mesmas regulações estatutárias
rígidas aplicáveis aos OGMs e também não são tratados com o mesmo nível de suspeição pública como são
as leveduras que foram transformadas com ADN de outra proveniência. Contudo, a engenharia genética
continua a ser o único método fiável que oferece a possibilidade de alterar uma propriedade existente,
introduzir uma característica nova e de eliminar uma característica indesejada sem afectar adversamente
outras propriedades desejáveis. Vários métodos de transformação e vectores plasmídicos, bem como cassetes
de expressão e secreção para a expressão de genes heterólogos e a secreção das suas proteínas codificadas,
foram desenvolvidos para S. cerevisiae. Este facto veio trazer uma aplicabilidade mais vasta e um grau mais
elevado de especificidade no desenvolvimento de leveduras enológicas melhoradas.
3.3 Objectivos para o melhoramento genético das leveduras enológicas
Geralmente, os objectivos do desenvolvimento de estirpes estão todos relacionados com a melhoria dos
custos de produção, bem como, da qualidade do vinho. A tabela 2 demonstra algumas das melhorias que
podem ser alcançadas através do uso de leveduras enológicas geneticamente alteradas. Estes objectivos
incluem um aumento da eficiência do processo de fermentação, do tratamento do vinho e do controlo de
contaminações microbianas, bem como, um acentuar do carácter e das qualidades sensoriais do vinho.
Melhoria da performance da fermentação: as fermentações enológicas ocorrem, geralmente, mais
rapidamente do que se desejava e são normalmente controladas por uma diminuição da temperatura de
fermentação. As fermentações “galopantes” têm implicações comerciais, visto que o espaço no depósito de
fermentação é reduzido devido à espuma e são perdidos compostos voláteis por acção do dióxido de carbono
rapidamente libertado. Por outro lado, a fermentação enológica por vezes cessa prematuramente ou ocorre de
forma muito lenta. Fermentações paradas, lentas ou incompletas têm habitualmente consequências
financeiras que derivam de uma utilização ineficaz do depósito de fermentação e da contaminação do vinho
como resultado de uma protecção reduzida por um baixo teor dióxido de carbono e de quantidades elevadas
de açúcares residuais. Assim, a previsibilidade da fermentação e da qualidade do vinho estão directamente
dependentes das qualidades da levedura enológica que assenta no estabelecimento rápido da população numa
primeira fase da fermentação enológica, e que, determina a capacidade de conduzir a fermentação de forma
eficaz e regular com um nível desejável de açúcares residuais. Inúmeros factores afectam a performance das
leveduras enológicas. Entre os objectivos geralmente visados para a melhoria da sua performance estão o
aumento da elasticidade e da resistência ao stress das células de levedura secas activas; uma melhoria na
assimilação e consumo do azoto e do açúcar da uva; um desenvolvimento da resistência ao etanol e outros
metabólitos e toxinas microbianas; resistência ao sulfuroso, metais pesados e resíduos agro químicos, assim
como, uma formação reduzida de espuma (Tabela 2). Visto que os esteróis, a trealose, o glicogénio e as
aquaporinas desempenham múltiplos papéis no aumento da sobrevivência das células de S. cerevisiae
expostas a vários factores de stress, físico e químico, eles têm implicações importantes na tolerância geral ao
stress, na elasticidade da membrana, e sobre a forma e vigor das culturas starter de leveduras enológicas
secas activas depois da reactivação. Como resultado, há um forte incentivo para desenvolver estirpes de
levedura enológicas com uma capacidade superior para acumular estes compostos. Contudo, devido ao
complexo mecanismo de resposta ao stress encontrado nas leveduras não é ainda possível explicar se a
supressão do gene de ATH1 trealase e a alteração de expressão dos níveis de genes envolvidos no
metabolismo da trealose (TPS1, TPS2, ATH1), glicogénio (GSY1, GSY2) e esteróis (SUT1 e/ou SUT2), e na
síntese de aquaporinas (AQY1, AQY2) (tabela 2) irão resultar na melhoria da viabilidade e vitalidade das
leveduras.
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Um desequilíbrio entre os altos níveis de carbono e baixos níveis de azoto no mosto é a causa mais comum
para o aparecimento de fermentações difíceis. As fermentações lentas ou paragens de fermentação ocorrem
devido a uma diminuição da concentração em azoto assimilável limitando de forma irreversível o transporte
dos açúcares (hexoses). É portanto essencial, para aumentar a eficácia da utilização dos açucares da uva
(glucose e frutose) sob condições de carência em azoto, aumentar o fluxo glicolítico substituindo todos os
alelos mutantes não funcionais de genes que codificam as enzimas glicolíticas chave, com o objectivo de
optimizar a eficácia do consumo das hexoses (particularmente a frutose) e de diminuir a assimilação da
prolina e da arginina (que representam de 30 a 65 % do conteúdo total em ácidos aminados do mosto de uva)
por repressão catabólica do azoto (tabela 2). No caso das fermentações incompletas, a preferência das
leveduras enológicas pela glucose em detrimento da frutose pode conduzir a níveis excessivos de frutose
residual que comprometem a qualidade do vinho. Admite-se a hipótese de que a taxa de produção de álcool
pelas leveduras enológicas é limitada, principalmente, pela taxa de consumo de açúcar (especialmente pelo
consumo de frutose em presença de níveis de açúcar elevados no início de fermentação) e durante a fase final
com azoto e nutrientes limitados. Assim, vários laboratórios focaram o seu trabalho na fosforilação dos
açúcares e das hexoquinases codificadas por HXK1 e HXK2, das glucoquinases codificadas por GLK, bem
como, o transporte das hexoses codificado por HXT1-HXT18 e SNF3. Parece ser evidente de que a
sobrrexpressão de S. pastorianus FSY1codificada pelo transporte de frutose / H+ juntamente com alguns
outros transportadores de hexoses codificados por HXT1-HXT18 e SNF3 e pela hexoquinase codificada por
HXK1 (com uma maior afinidade pela frutose e uma afinidade significativamente mais baixa pela glucose)
resulta num melhoramento do consumo de frutose e glucose durante a fermentação. Para além disso, a
supressão do repressor URE2 da prolina oxidase, codificado por PUT1e da pirrolina-5-carboxilato
desidrogenase codificada por PUT2 representa a primeira etapa no desenvolvimento de estirpes enológicas
que podem assimilar eficientemente a prolina e a arginina em sumo de uva nas condições de fermentação.
Uma outra forma de melhorar as performances fermentativas das leveduras enológicas é aumentar a sua
resistência aos metabolitos microbianos tóxicos (por exemplo etanol, acido acético, ácidos gordos de cadeia
média, etc.), às zimocinas (toxinas killer das leveduras), aos conservantes químicos (p.ex. sulfuroso) e aos
produtos agroquímicos que contenham metais pesados (tais como o cobre) (tabela 2). Por exemplo, a
alteração da expressão dos genes SUT1, SUT2, PMA1 e PMA2 resultou no aumento da acumulação de
esteróis e da actividade ATPase das células da membrana aumentando, assim, a resistência ao etanol. Para
além disso, os determinantes genéticos e micovirais, bem como outros genes codificadores para as toxinas
killer (péptidos zimocidais) e factores de imunidade podem ser incorporados nas leveduras enológicas para
as tornar mais insensíveis às zimocinas das leveduras contaminantes. No que respeita à resistência a
agroquímicos, um aumento do número de cópias do gene CUP1 – que permite a quelatação do cobre,
permite à levedura enológica tolerar níveis elevados de resíduos de cobre no mosto de uva.
Melhoria na eficácia do processo: os principais objectivos da colagem (adição de compostos absorventes
seguida das etapas de floculação ou precipitação) e clarificação (tais como a sedimentação, trasfega,
centrifugação, filtração, etc.) durante a elaboração do vinho retiram quantidades excessivas de certos
componentes e células microbianas com o objectivo de obter um vinho claro e límpido e de assegurar a
estabilidade físico-química. A colagem e clarificação do vinho envolvem práticas dispendiosas e laboriosas e
que originam grandes volumes de borras a eliminar causando, por isso, uma perda de vinho e de compostos
aromáticos e gustativos importantes para a qualidade do produto final. Com o intuito de minimizar as
desvantagens das práticas de colagem e clarificação, preparações enzimáticas comerciais, relativamente
onerosas (tais como as proteases, pectinases, glucanases, xilanases, arabinofuranosidases, etc…), são
frequentemente adicionadas ao mosto e ao vinho. Como alternativa à adição das preparações de enzimas, que
muitas vezes contem actividades contaminantes ou actividades secundárias não desejadas, estão a ser
desenvolvidas leveduras enológicas com o objectivo de segregarem enzimas proteoliticas e polissacaroliticas
que suprimirão respectivamente as proteínas responsáveis pela turbidez e os polissacáridos que colmatam os
filtros. Com este objectivo a sobrexpressão de vários genes de bactérias, fungos, e leveduras resultou no
desenvolvimento de estirpes de levedura enológicas proteolíticas, pectinolíticas, glucanolíticas e xilanolíticas
(tabela 2).
Um segundo objectivo para a melhoria da clarificação e filtração visa a eficácia na remoção de todas as
células das leveduras da fase líquida da cuba ou da barrica. Uma expressão regular dos genes de floculação é
importante para garantir, por um lado, uma boa suspensão das células que permitam uma velocidade de
fermentação rápida, e por outro lado, facilitar o fim do processo de sedimentação para minimizar os
problemas de clarificação do vinho. A floculação das leveduras é especialmente importante na produção de
vinhos espumantes fermentados em garrafa, e o início controlado da floculação da levedura no momento
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apropriado durante a produção de vinho espumante pode simplificar este processo dispendioso. A expressão
do gene de floculação FLO1 ligado com o promotor tardio da fermentação HSP30 pode ser provocada por
um choque térmico, confirmando que o controlo da floculação durante a fermentação é, de facto, possível. A
agregação das células assume também um papel primordial na produção de vinhos de “jerez”, durante a qual
um processo celular dá origem à flutuação das células das leveduras formando, assim, um véu (biofilm) na
superfície do vinho. Colocando o gene da mucina - MUC1 (também conhecido por FLO11) sob o controlo
do promotor HSP30, a formação do biofilm pode ser promovida no final da fermentação simplificando,
assim, o desenvolvimento desta levedura.
Melhoria do controlo biológico dos microorganismos de contaminação: um crescimento microbiano não
controlado antes, durante, ou após a fermentação alcoólica pode alterar a composição química do produto
final e diminuir as propriedades sensoriais de aparência, aroma e gosto. Uvas com boa qualidade sanitária,
uma boa higiene da cave e as práticas enológicas são, requisitos essenciais para uma estratégia contra a
proliferação de microorganismos de contaminação. Uma segurança complementar é conseguida através da
adição de conservantes químicos tais como sulfuroso, dimetildicarbonato (DMDC), ácido benzóico, ácido
fumárico e o ácido sórbico que controlam o crescimento de contaminantes microbianos indesejados.
Contudo, o uso excessivo destes conservantes químicos é prejudicial para a qualidade do vinho e encontra
resistências nos consumidores. Com efeito, a preferência dos consumidores vai para vinhos de boa qualidade,
com menos conservantes e logo mais naturais e não prejudiciais à saúde. Assim, a bio preservação com
metabolitos derivados da levedura (por exemplo formação de SO2 ou peróxido de hidrogénio durante a
fermentação enológica), com as enzimas antimicrobianas (por exemplo lisosima, chitinases, endoglucanases,
etc) e péptidos (zimocinas e bactériocinas) é actualmente considerada como uma estratégia alternativa à
conservação química. Contudo, o uso de enzimas purificadas antimicrobianas e de bacteriocinas é
dispendioso, o que provoca um aumento no preço de venda do vinho. Este problema poderá ser contornado
através do uso de enzimas antimicrobianas eficazes e péptidos na estirpe de levedura enológica, o que
permite responder às necessidades do mercado que pede vinhos com maior qualidade e pureza. Para este fim
o gene da lisozima da clara de ovo (HEL1), o gene pediocin Pediococcus acidilactici (PED1), e o gene
Leuconostoc carnosum leucocin (LCA1) foram usados para a optimização das leveduras bactericidas. Os
genes antifúngicos CTS1 codificados pela chitinase e EXG1 codificados pela exoglucanase também se
expressaram na levedura S. cerevisiae. O principal procedimento na construção de leveduras zimocidais
baseia-se na introdução de uma combinação de genes codificados pelas toxinas killer microvirais de
S. cerevisiae (e.g. a K1/K2 duplamente killer) e de genes codificadores da zimocina de outras leveduras (e.g.
Hanseniaspora, Kluyveromyces, Pichia, etc.) nas leveduras enológicas. O ideal seria incorporar todas as
actividades antimicrobianas numa só levedura enológica combatendo, assim, todas as bactérias de
contaminação (e.g. Acetobacter, Gluconobacter, Lactobacillus, Pediococcus, etc.), leveduras (e.g.
Brettanomyces, Pichia, Zygosaccharomyces, etc.) e fungos (Aspergillus, Botrytis, Penicillium, Trichoderma,
etc.) que se encontram no vinho.
Melhoria do carácter do vinho: é geralmente aceite que o consumo moderado de vinho pode ser
socialmente benéfico, que pode ser uma forma eficaz de combate ao stress e de diminuição de doenças
coronárias. Os principais compostos protectores encontrados no vinho incluem os compostos fenólicos,
reveratrol, ácido salicílico, e álcool. Contudo, os consumidores prudentes de vinho estão cada vez mais
exigentes no que concerne à presença de compostos indesejáveis nos vinhos. Estes compostos indesejáveis
incluem carcinogénicos potenciais, tais como carbamato de etilo, neurotoxinas, como as aminas biogénicas, e
conservantes químicos que podem produzir reacções alérgicas, tais como sulfitos. Os consumidores mais
meticulosos entre estes consumidores de vinho preocupam-se até com os níveis elevados de álcool. No
desenvolvimento das estirpes de levedura é de importância maior focar estes aspectos relativos à saúde e
desenvolver leveduras que realcem estes benefícios (por exemplo a produção de reveratrol, carnitina, etc.) e
que reduzam os riscos associados ao consumo moderado de vinho (por exemplo eliminando o carbamato de
etilo e as aminas biogénicas e reduzindo os níveis de álcool).
No que diz respeito à produção de reverastrol durante a fermentação já foram feitos progressos através de
uma levedura enológica que exprime a co-enzima A ligase 4CL9/21 e o estilbeno sintetase VST1. O
desenvolvimento de uma levedura bactericida, em que o gene codificado para a arginase CAR1 será
eliminado (bloqueando assim a secreção de ureia, percursora para a formação de carbamato de etilo) ou
transformado com genes de urease heterologos (permitindo a degradação da urease) iriá reduzir os níveis de
sulfuroso a adicionar, de carbamato de etilo derivado da levedura e de aminas biogénicas formadas a partir
de contaminantes de bactérias. A redução biológica dos níveis de álcool em bebidas fermentadas pode ser
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atingida através do desvio de uma parte do fluxo de carbono da fermentação a favor da produção de glicerol
e ácido glucónico. Da mesma forma, um aumento significativo no nível de glicerol extracelular acumulado e
a concomitante diminuição das concentrações de etanol tem sido conseguido através da superexpressão dos
genesGPD1 e GPD2 codificados pelas isoenzimas do glicerol-3-fosfato desidrogenase da S. cerevisiae, e a
expressão constitutiva do seu do gene FPS1 codificado por um facilitador de transporte do glicerol.
Decréscimos similares nos níveis de etanol têm sido conseguidos através da expressão do gene da glucose
oxidase de Aspergllus niger GOX1 na S. cerevisiae.
Melhoria das qualidades sensoriais do vinho: o factor mais importante na produção do vinho é a qualidade
organoléptica (aparência, aroma e gosto) do produto final. A variedade infinita de gostos deriva de um
sistema de interacções complexo e não linear que surge entre centenas de componentes. O bouquet de um
vinho é determinado pela presença de uma relação bem equilibrada de compostos de sabores desejados, de
metabolitos e de não conter sabores indesejados. Á excepção de terpenos nas variedades de uvas aromáticas
e de alkoxipirazinas nas variedades herbáceas, o gosto perceptível é o resultado de quantidades absolutas e
relações específicas destes compostos interactivos, mais do que o resultado de um único composto.
Combinações subtis de componentes vestigiais (metabolitos secundários acumulados) derivados das uvas são
habitualmente responsáveis pelo gosto característico e notas aromáticas do vinho, ao passo que os produtos
da fermentação das leveduras (por exemplo esteres e álcoois superiores) contribuem para o pano de fundo de
gosto e aroma, bem como para a complexidade e intensidade do aroma e gosto do produto final. As
leveduras podem também ser responsáveis pela produção de subprodutos indesejáveis, tais como o sulfito de
hidrogénio.
Há uma necessidade óbvia de desenvolvimento de leveduras enológicas que podem trazer características
desejáveis para o vinho (tabela 2). Para este fim foram feitos progressos significativos na produção de
leveduras produtoras de enzimas que libertam cor e aroma (tais como as pectinases, glicosidases, glucanases,
arabinofuranosidases, etc.) e de enzimas que modificam os esteres (tais como as transferases de acetil-álcool,
as esterases, enzimas que hidrolizam o acetato de isoamilo, etc.). Para além disso, foram desenvolvidas
leveduras que produzem níveis óptimos de glicerol (devido à sobrexpressão dos genes GPD1, GPD2 e FPS1,
ligado à supressão do gene desidrogenase acetaldeído ALD6), alcoóis superiores (e.x. álcool isobutílico,
álcool isoamílico, etc.), e ácidos fenólicos (expressão modificada do gene PAD1 de levedura codificada para
a descarboxilase do ácido fenil-acrilico, assim como a expressão dos genes bacterianos pdc e padc
codificados respectivamente para a decarboxilase de ρ-cumárico e para a decarboxilase de ácidos fenólicos).
Foram ainda construídas leveduras enológicas transportando alelos de MET14 adenosilfosfosulfato quinase
ou MRX1 metionina sulfoxido reductase.
O ajustamento biológico da acidez do vinho pode ser conseguida através de leveduras enológicas
recombinantes contendo combinações de genes clonados de Schizosaccharomyces pombe e de bactérias de
ácido láctico. Uma levedura enológica S. pombe que contenha o gene mae1 codificado para o malato
permease e o gene mae2 codificado para a enzima málico converte o ácido málico em etanol (fermentação
maloetanólica). Enquanto que uma levedura recombinante portadora do gene mae1 assim como do gene da
enzima maloláctica de Oenococcus oeni (mleA), ou de Lactococcus lactis (mleS) ou de Lactobacillus
delbrueckii (mleS) converte o ácido málico em ácido láctico (fermentação maloláctica). A levedura enológica
maloetanólica seria preferida para vinhos com pH baixo provenientes das regiões mais frias, enquanto que e
levedura enológica maloláctica seria a melhor solução para vinhos com pH elevado de regiões mais quentes.
No caso dos vinhos com níveis de pH elevados, a produção de ácido láctico suplementar durante a
fermentação pode ser conseguida através da incorporação do gene Lactobacillus casei LDH1 codificado pela
lacticodesidrogenase na estirpe de levedura enológica maloláctica. Estas leveduras permitem evitar a
utilização de bactérias malolácticas (fontes de aminas biogénicas) em vinhos tintos e alguns vinhos brancos
que necessitem da realização da fermentação maloláctica.
Nova edição de TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, Vol 20, 2002, pp426-432, Pretorius et al, "Meeting
the Customer..." and Vol 20, 2002, pp472-478, Vivier et al, "Genetically Tailored Grapevines..."
Copyright (2002), com a permissão de Elsevier
Continua …
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Tabela 2 Objectivos do melhoramento genético de estirpes de leveduras enológicas
Propriedades desejáveis
Melhoria da performance
de fermentação
Temas de investigação
Exemplos de genes potenciais - objectivo
Resposta ao stress,
acumulação de esteróis,
glicogénio e trealose
Transportadores de hexoses
e hexoquinases.
Melhoria na utilização de
fontes de azoto menos
eficientes
Formação de esterois,
actividade ATPase
Resistência as toxinas
killer, sulfuroso e agro
químicos
Proteínas da superficie
celular
Modificação do metabolismo do glicogénio ou trealose [por
exemplo actuando sobre GSY1 e GSY2 (síntese de glicogénio), TPS1
(síntese de trealose-6-fosfato), TPS2 (fosfatase trealose-6.fosfato)
Sobrexpressão e modificação de HXT1-HXT18, SNF3, FSY1 e uso
de transportadores heterogéneos e quinases
Catabolismo da prolina [PUT1 (oxidase da prolina) e PUT2
(pirrolina-5-carboxilato desidrogenase)] e uso de genes catabólicos
heterogéneos
Modificação da expressão de PMA1 e PMA2 (ATPase), genes
anobólicos de esterois
Inclusão de KIL2 (zimocina e factores de imunidade),
sobreexpressão de CUP1
Melhoria na clarificação de
proteínas
Melhoria na clarificação de
polissacáridos
Proteases
Sobreexpressão de PEP4 (protease A) e secreções de outras
proteases
Sobre expressão de END1 (endoglucanase), EXG1 (exoglucanase),
CEL1 (cellodextrinase), BGL1 (β-glucosidase, cellobiase), PEL5
(pectato liase) e PEH1 (poligalacturonase), XYN1-5 (xilanases),
ABF2 (arabinofuranosidase)
Controlo da sedimentação e
floculação das células
Floculinas
Controlo da flutuação de células
e formação de flor
Proteínas hidrófilas da
parede celular
Melhoria da elasticidade geral e
da tolerância ao stress
Melhoria da eficiência na
utilização de açúcar
Melhoria da eficiência na
assimilação de azoto.
Melhoria da tolerância ao etanol
Aumento da tolerância a
compostos anti microbianos
Redução da formação de espuma
Eliminação de FRO1 e FRO2 (proteínas de espuma)
Melhoria na eficiência do
processo
Glucanases, pectinases,
xilanases,
arabinofuranosidases
Expressão tardia dos genes de floculação (FLO1, FLO5,
MUC1/FLO11) sob o controlo de promotores (HSP30) originando a
expressão desejada
Expressão tardia de MUC1/FLO11 sob controlo de promotores
(HSP30)
Melhoria do controlo
biológico de
microorganismos
contaminantes
Leveduras enológicas produtoras
de enzimas microbianas
Leveduras enológicas produtoras
de péptidos antimicrobianos
Leveduras enológicas produtoras
de dióxido de enxofre
Lizosimas , glucanases e
quitinases
Bacteriocinas
Metabolismo de enxofre e
formação de SO2
Expressão de HEL1 (lizosima de clara de ovo), CTS1 (quitinase),
EXG1 (exoglucanase) e outras enzimas antimicrobianas
Expressão de PED1 (pedocina), LCA1 (leucocina) e outros genes
heterogéneos de bactereocinas e zimocinas
Sobrexpressaõ de MET14 (adenosilfosfosulfato quinase) eMET16
(fosfo adenosilfosfosulfato reductase), e eliminação de MET10
(sulfito reductase)
Melhoria das características do
vinho
Melhoria da produção de
reveratrol
Redução da formação do
carbamato de etilo
Redução da formação de aminas
biogénicas
Grau alcoólico mais baixo
Síntese de estilbeno
Metabolismo dos amino
ácidos, formação de ureia
Enzimas bacterioliticas,
bacteriocinas
Fluxo do carbono,
metabolismo do glicerol e
oxidação da glucose
Expressão do 4CL9/216 (co-enzima A ligase), VST1 (estilbeno
sintetase)
Eliminação de CAR1 (arginase) ou expressão de URE1 (urease)
Expressão de HEL1 (lizosima da clara de ovo), PED1 (pediocina),
LCA1 (leucocina) e outras bacteriocinas
Sobreexpressão de GPD1 e GPD2 (glicerol-3-fosfato
desidrogenase), modificação de FPS1 (transportador de glicerol),
expressão de GOX1 (glucose oxidase)
Melhoria dos aromas do vinho
e outras qualidades sensoriais
Aumento da libertação de
terpenoides da uva
Glicosidases, glucanases,
arabinofuranosidases
Aumento da produção de esters
voláteis desejáveis
Optimização da produção de
alcoois superiores
Esterases
Metabolismo dos amino
ácidos
VINIDEA.NET – REVISTA INTERNET TÉCNICA DO VINHO, 2003, N.7
Sobreexpressão de END1 (endoglucanase), EXG1 (exoglucanase),
CEL1 (cellodextrinase), BGL1 (β-glucosidase, cellobiase), PEL5
(pectato liase) ePEH1 (poligalacturonase), ABF2
(arabinofuranosidase)
Expressão modificada de ATF1 (álcool acetil transferase) e outros
álcoois transferases, IAH1 (esterase) e outras esterases
Eliminação dos genes ILE, LEU e VAL
PRETORIUS - VIDEIRAS E LEVEDURAS ENOLÓGICAS CRIADAS PARA A PRODUÇÃO DE VINHOS DE QUALIDADE CENTRADOS NO MERCADO
PARTE 2: LEVEDURAS, PAG. 7
Aumento da produção de glicerol
Metabolismo do Glicerol
Ajustamento biológico da acidez
do vinho
Fermentação maloetanólica
e maloláctica, produção de
ácido láctico
Metabolismo dos ácidos
fenólicos
Optimização dos fenois
Redução da produção de sulfito e
de sulfídrico
Metabolismo do enxofre
Formação de H2S
VINIDEA.NET – REVISTA INTERNET TÉCNICA DO VINHO, 2003, N.7
Sobreexpressão de GPD1e GPD2 (glicerol-3-fosfato desidrogenase),
FPS1 (transportador facilitator do glicerol), e eliminação de ALD6
Expressão de MAE1 (malato permease), ligado com MAE2 (enzima
maloláctica) ou mleS (enzima maloláctica), ou LDH1
(lacticodesidrogenase)
Expressão modificada de PAD1 (ácido fenilacrilico decarboxilase),
pdc (ácido ρ-cumárico decarboxilase), padc (ácido fenólico
decarboxilase)
Eliminação de MET14 (adenosilfosfosulfato quinase) e MRX1
(metionina sulfato reductase)