título do resumo

ANÁLISE “IN VITRO” DA ATIVIDADE BIOLÓGICA DA CONCANAVALINA-A
EM PBMC NA LEISHMANIOSE
Cayo Julius Cesar de Oliveira (PIBIC/CNPq-UEL), Ana Paula dos Santos
Thomazelli, Ivete Conchon-Costa (Orientadora), e-mail: [email protected]
Universidade Estadual de Londrina/Centro de Ciências Biológicas
Área e sub-área do conhecimento: Ciências Biológicas, Parasitologia
Palavras-chave: Monócito, imunomodulação, iNOS
Resumo
A Leishmaniose Tegumentar Americana é uma zoonose de grande prevalência,
considerada uma enfermidade polimórfica, espectral da pele e das mucosas,
agrupadas nas diferentes formas clínicas: a leishmaniose cutânea, a cutâneomucosa e a cutânea difusa. Seu tratamento limita-se a antimoniais, anfotericina
B e pentamidinas, drogas que possuem vários efeitos adversos. Com relação à
patologia, os fagócitos têm sido descritos como a primeira linha de defesa na
leishmaniose experimental. Estas células além da sua capacidade fagocítica
são produtoras de quimiocinas e citocinas que influenciam a resposta imune à
infecção por Leishmania. A concanavalina-A (Con-A), uma lectina que
apresenta ação imunomoduladora no sistema imunológico de camundongos,
ativa uma gama de células a produzir citocinas, como a INF-γ, IL1β, TNF-α,
citocinas do perfil imunógico Th1. Essas citocinas por sua vez, possui a
capacidade induzir a expressão de iNOS, enzima responsável pela geração de
óxido nítrico. Em ensaios in vitro com PBMC humano e Leishmania
amazonensis, verificou-se que a Con-A possibilitou o aumento da expressão da
enzima iNOS. Em tese, se há o aumento da expressão e síntese da iNOS é
esperado que ocorra o aumento da molécula NO, com o consequente aumento
das moléculas microbicidas, dióxido de nitrogênio e peroxinitrito, que são
fundamentais na eliminação de parasitos Leishmania.
Introdução e objetivo
A Leishmaniose Tegumentar Americana é uma doença de caráter zoonótico
que afeta o homem e diversas espécies de animais silvestres e domésticos.
Causada por protozoários do gênero Leishmania, caracteriza-se por apresentar
inflamações crônicas de pele e mucosas (GENARO, 2005). As manifestações
clínicas são polimórficas classificadas como leishmaniose cutânea (localizada
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ou não), leishmaniose cutânea-mucosa e leishmaniose cutânea difusa
(CIMERMAN, B., et al, 1999).
A quimioterapia desta doença no Brasil limita-se ao uso da N-metilglucamina
(Glucantime), anfotericina B ou pentamidina (NETO, et al., 2008), os quais
apresentam grande toxicidade.
Concanavalina-A (Con-A) é uma lectina extraída da semente de Canavalia
ensiformis, apresenta capacidade em estimular a mitose celular, influenciar na
resposta imune por estimular linfócitos T e células do sistema imune na
indução e síntese de citocinas (SODHI; KESHERWANI, 2007).
A óxido nítrico sintase induzida (iNOS) não é detectável em condições basais.
O LPS ou endotoxinas bacterianas, junto com citocinas, como TNF-α, IL-1 ou
IFN- γ, induzem a síntese de iNOS, de 2 a 4 horas após a exposição ao agente.
O óxido nítrico (NO) é o produto da iNOS, é uma molécula citotóxica e modula
reações inflamatórias ou antiinflamatórias, dependendo do tipo celular e do
estímulo (ADAMS, 1996).
O objetivo foi analisar a expressão de iNOS em PBMC de indivíduos saudáveis
tratados ou não com Con-A após infecção com L. amazonensis.
Procedimentos metodológicos
Foram obtidas células mononucleares de sangue periférico (PBMC) a partir da
centrifugação do sangue de doadores humanos saudáveis, incubados por 60
minutos a 37°C em estufa de CO2 a 5% com 10 mg/mL de Con-A, incubados
por 18 horas.
Células promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis mantidas em
meio de cultura 199 foram adicionadas às células PBMC na proporção 5:1 em
meio RPMI e incubadas a 37oC por 24 horas. Após esse período as placas
foram lavadas com PBS para retirar os parasitas livres e as células aderentes
foram utilizadas para avaliação dos marcadores iNOS por imunocitoquímica..
As amostras foram incubadas overnight a 4ºC com os anticorpos primários de
interesse, posteriormente com anticorpo secundário e reveladas pela adição do
substrato (H2O2 e 3,3'-diaminobenzidine, DAB, Sigma). Em seguida, foram
contra-coradas por Hematoxilina de Harris (Merk).
Os resultados obtidos foram analisados pelo programa estatístico Prism 5.04
(graphpad Software, San Diego, CA) utilizando análise de variância (ONE-WAY
ANOVA) seguido do teste de comparações múltiplas de Bonferroni ou Tukey
utilizando.
Resultados e discussão
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A avaliação dos marcadores iNOS pela imunocitoquímica permitiu avaliar a
expressão deste composto na interação do protozoário L. amazonensis com
PBMC de doadores saudáveis após pré tratamento com a lectina Con-A.
No Gráfico 1 pode-se observar que as células infectadas com L. amazonensis
e tratadas com Con-A apresentou diferença estatística significativa (P<0,005),
quando comparada ao grupo controle.
A indução da alta produção iNOS geralmente ocorre em um ambiente oxidativo
e, assim, altos níveis de NO tem a oportunidade de reagir com superóxido
formando o ânion peroxinitrito e toxicidade celular. Estas propriedades podem
definir os papéis de iNOS na imunidade do hospedeiro, permitindo sua
participação em atividades anti-microbianas como parte do “burst oxidativo” de
macrófagos (NOZAKI et al, 1997).
Estudos com murinos knockouts para iNOS e IL-1 mostram que sua eficácia
imunológica e microbicida frente a um patógeno torna-se reduzida, isso
vulnerabiliza o animal levando a morte do mesmo em um curto período de
tempo (KALNS et at., 2002). Em camundongos knockouts para iNOS e NADPH
oxidase de fagócitos (PHOX), observou-se que quando infectados com
Leishmania donovani, o parasita apresentou replicação acelerada, formação de
granulomas e resposta ineficaz ao tratamento com o antimonial (MURRAY,
2006)
iNOS
Pontuação
2.0
*
1.5
1.0
0.5
Tr
at
+
In
f
In
fe
ct
ad
o
C
on
tr
ol
e
0.0
Gráfico 1 – Scores da imunocitoquímica para a iNOS. Dados representam a média  SD de
dez análises independentes. *Significativamente diferente do controle (P <0,005).
Conclusão
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PBMC humanos pré tratados com Con-A apresentaram diferenças na
expressão da iNOS indicando efeito imunomodulador desta lectina na
leishmaniose.
Agradecimentos
SETI, CNPq, Fundação Araucária, Universidade Estadual de Londrina
Referências
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