título do resumo

ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS DE Staphylococcus aureus
PROVOCADAS PELO EXTRATO OBTIDO DE CASCAS DE TRICHILIA
CATIGUA
Sara Gonçalves Paschoal1(bolsista), Audrey Alesandra Stinghen Garcia Lonni2
(Colaboradora), Gerson Nakazato1 (Orientador).
e-mail: [email protected]
1Departamento
de Microbiologia, CCB, Universidade Estadual de
Londrina.
2Departamento de Ciências Farmacêuticas, CCS, Universidade Estadual
de Londrina.
Área e sub-área de conhecimento: Microbiologia, Microbiologia Aplicada.
Palavras-chave: Antimicrobianos naturais, Trichilia catigua, microscopia
eletrônica.
Resumo
Utilizar de drogas vegetais representa uma alternativa de substituição
aos antissépticos convencionais. Trichilia catigua, conhecida como catuaba,
apresenta propriedades anti-inflamatórias e antimicrobianas. Neste estudo a
composição do veículo extrator foi escolhida seguindo um planejamento
experimental Centróide Simplex com quatro componentes, que resultou em
quinze extratos de T. catigua. Partindo desses extratos, foram realizadas as
técnicas de determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e
microscopia eletrônica (ME). Foi testada a amostra de Staphylococcus aureus
ATCC 29213. Os resultados mostraram uma CIM de 500 µg/mL e efeito
bactericida com o composto obtido da solução metanólica. A ME mostrou
alterações morfológicas nas bactérias e um aumento de matriz celular. Esses
resultados indicam que este extrato é um potencial antibacteriano natural.
Introdução e Objetivos
T. catigua A. Juss., conhecida como catuaba, tem sido usada na
medicina popular como afrodisíaca, sendo utilizada para tratamento de
impotência sexual, fadiga e déficit de memória (VAS et al., 1997).
Estudos fitoquímicos realizados com T. catigua têm revelado a presença
de diversos compostos que apresentam propriedades anti-inflamatória
(QUINTÃO et al., 2008) e antimicrobiana (PIZZOLATTI et al., 2002a, 2002b),
entre outras atividades farmacológicas.
Neste estudo foi utilizado do Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)
para analisar a ação do extrato frente ao microorganismo. O objetivo foi
1
analisar alterações morfológicas em S. aureus ATCC 29213 provocada pela
ação de extrato de Trichilia catigua e esclarecimentos acerca de possíveis
mecanismos de ação do extrato.
Material e Métodos
Caracterização da matéria-prima vegetal
As cascas secas de T. catigua A. Juss., família Meliaceae, foram doadas
pelo Laboratório Catarinense S/A. Foi realizado o controle de qualidade da
droga vegetal de acordo com método farmacopeico (F. BRAS. V, 2010).
Preparo dos extratos brutos de Trichilia catigua (LONNI et al., 2012)
Os extratos brutos foram preparados de acordo com Lonni e
colaboradores (2012). O sistema extrator foi escolhido seguindo um
planejamento experimental do tipo centróide simplex com quatro solventes
puros, sendo: água, metanol, acetona e etanol. Foram obtidos quinze extratos
brutos de T. catigua (ETC).
Amostras bacterianas
Neste trabalho foram testadas amostras de S. aureus ATCC 29213. As
amostras foram armazenadas em meio BHI contendo 20% de glicerol a -80ºC.
Curva de crescimento e morte
As culturas foram crescidas em meio Mueller Hinton Ágar (MH) durante
24 horas. Um novo inóculo foi realizado diluindo a bactéria em um novo meio
MH caldo até obter 106 células/mL. Em seguida foi adicionado ETC na
concentração desejada. Em outro meio (controle) foi adicionado além da
bactéria apenas o solvente. A nova cultura foi então cultivada a 37ºC sob
aeração (150 rpm). Alíquotas foram retiradas, diluídas e plaqueadas em meio
MH Ágar (inóculo inicial), em diferentes tempos de incubação (1, 2, 5, 7, 10 e
24 horas) para posterior contagem de unidades formadoras de colônias (UFC).
Os resultados foram comparados com cultura cultivada nas mesmas condições
anteriores, mas sem o composto (controle negativo).
Microscopia Eletrônica de Varredura
Para o teste, 106 células/mL foram testadas para o extrato de T. catigua
na CIM em tempo de incubação determinado de acordo com os resultados da
curva de crescimento e morte. Alíquotas de 20 μL dos tratamentos foram
transferidas para lâminas de vidro previamente revestidas com poli-lisina e
colocadas em estufa a 28°C por 1 h para secagem, em seguida, as lâminas
foram fixadas em uma solução contendo 2,5% glutaraldeído, 2%
2
paraformaldeído em tampão cacodilato de sódio 0,1 M (pH 7,2) por um período
de 12 h. Após a fixação, as lâminas foram lavadas com tampão cacodilato de
sódio 0,1 M (pH 7,2) e pós-fixadas em uma solução de tetróxido de ósmio 1%
em tampão cacodilato de sódio por 2 h. As amostras foram desidratadas em
etanol nas concentrações de 70, 80, 90 e 100%, e posteriormente secas em
ponto crítico de CO2 (BALTEC CPD 030 Critical Point Dryer). Após a secagem
as lâminas foram revestidas com ouro (BALTEC SDC 050 Sputter Coater), e
finalmente visualizadas no microscópio eletrônico de varredura (FEI Quanta
200) (Oliveira et al., 2010). O procedimento foi realizado com a colaboração da
Profa. Dra. Célia Guadalupe Tardeli de Jesus Andrade do Laboratório de
Microscopia e Microanálise, Departamento de Biologia Geral, Universidade
Estadual de Londrina.
Resultados e Discussão
Ao se avaliar o efeito do extrato de T. catigua sobre cepas de S. aureus,
verificou-se que um dos extratos apresentou atividade contra a cepa. No teste
in vitro, o extrato 2 (metanol) teve um efeito bactericida a 500 μg/ml. Outros
extratos (frações) apresentaram valores acima de 500 μg/ml.
As imagens revelaram uma grande diminuição no número de células em
poucas horas (Figura 1B), comparadas com o controle (Figura 1A), e
alterações morfológicas tridimensionais na superfície bacteriana (Figura 1B).
Além, disso foi possível observar um aumento na matriz celular destas
bactérias pela atividade do composto (Figura 1B). Essas alterações indicam
que diferentes mecanismos podem estar associados ao composto.
Figura 1 - Imagens de microscopia electrônica do efeito antibacteriano do
extrato Trichilia catigua 2 contra S. aureus ATCC 29213 em momentos
diferentes. A: controle negativo (3 h sem extrato) B: Extrato de Trichilia catigua
2 (3 h).
Conclusões
Estes resultados mostram que o extrato de Trichilia catigua é um
potencial antibacteriano natural.
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Agradecimentos
Agradeço à Fundação Auraucária/UEL. Agradeço ao Prof. Gerson
Nakazato, às profas. Audrey Alesandra Stinghen Garcia Lonni e Renata
Kobayashi por todo ensino e, a todos do Laboratório de Microbilogia Aplicada
da Universidade Estadual de Londrina.
Referências
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mixture design selective extraction of compounds with antioxidant activity and
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