título do resumo

INFLUÊNCIA DO DIÂMETRO FOLICULAR E DO MOMENTO DA CLIVAGEM
NA PRODUÇÃO EMBRIONÁRIA E NO PERFIL DE TRIMETILAÇÃO DA
H3K27 EM BLASTOCISTOS BOVINOS
Fabiana De Dio Sarapião (Bolsista do CNPq – AF), Paula Alvares Lunardelli,
Marcelo Marcondes Seneda, e-mail: [email protected]
Universidade Estadual de Londrina, Centro de Ciências Agrárias,
Departamento de Clínicas Veterinárias.
Área e sub-área do conhecimento: Medicina Veterinária/Reprodução
Animal
Palavras-chave: Início da clivagem, PIVE, epigenética.
Resumo
O diâmetro dos folículos e o tempo de início da clivagem influenciam a
competência e a organização epigenética do desenvolvimento embrionário
inicial. O objetivo foi investigar o desenvolvimento e a ocorrência da
trimetilação na lisina 27 da histona H3 (H3K27me3) em blastocistos de
clivagem precoce (≤28h), intermediária (>28h e ≤34h) e tardia (>34h e ≤54h de
cultivo) a partir da fertilização dos oócitos de folículos pequenos e grandes
(≤2mm e 4-8mm). Ovários Bos indicus de abatedouro (n = 456) foram
aspirados obtendo 324 (4-8mm) e 327 (≤2mm) oócitos. Estes foram maturados
e fecundados in vitro. Os embriões foram cultivados e a taxa de clivagem foi
avaliada. A H3K27me3 foi analisada, por imunofluorescência, aos 7 e 8 dias de
cultivo. As taxas de clivagem foram maiores nos grupos de clivagem tardia em
relação à precoce, para folículos de 4-8mm (4-8mm-tardia: 30,6% vs. 4-8mmprecoce: 22,4%) e para os ≤2mm (≤2mm-tardia: 30,9% vs. ≤2mm-precoce:
19,7%). As taxas de blastocistos dos folículos de 4-8mm (37,2%) foram
maiores do que as taxas dos ≤2mm (20,1%), assim como os grupos de
clivagem precoce e intermediária comparados com o de clivagem tardia (10,9%
e 12,7% vs. 5,1%). Todos os grupos apresentaram marcação para H3K27me3.
As maiores taxas de blastocisto são de embriões que clivam em até 34h pósfertilização e em embriões oriundos de oócitos de folículos de 4 a 8mm. A
presença da H3K27me3 em todos os grupos sugere uma atuação dessa
marcação de histona no desenvolvimento embrionário inicial.
Introdução e objetivo
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A produção in vitro de embriões (PIVE) tem sido um poderoso instrumento para
a multiplicação e disseminação de genética de alta qualidade em animais de
produção. Entretanto, as condições de cultivo in vitro diferem das in vivo.
Uma justificativa para essa diferença pode estar na origem dos oócitos
utilizados (LEQUARRE, et al., 2005). A maior parte dos folículos puncionados
pela Ovum pick up (OPU) é de tamanho pequeno, enquanto que, em eventos
fisiológicos, o oócito a ser fecundado seria proveniente de tamanho grande
(GONÇALVES, et al., 2007). No entanto, a correlação de desenvolvimento e
qualidade do oócito permanece em grande debate.
O tempo em que o embrião termina seu primeiro ciclo de divisão celular
também influencia seu futuro desenvolvimento. A epigenética tem se mostrado
responsável pelo regimento de vários mecanismos celulares. A trimetilação da
lisina 27 da histona H3 (H3K27me3) exerce controle sobre a pluripotência das
células embrionárias e dos genes relacionados ao desenvolvimento e
diferenciação celular (SURFACE et al., 2010).
Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar a distribuição da
H3K27me3, assim como a taxa de blastocistos de clivagem precoce,
intermediária e tardia provenientes da fertilização de oócitos oriundos de
folículos de até 2mm e de 4 a 8mm de diâmetro.
Procedimentos metodológicos
Ovários de vacas Bos indicus (n=456) foram coletados de abatedouro local e
transportados em solução salina 0,9% a 30-35ºC. Os complexos cumulusoophorus (CCOs) foram aspirados de folículos de até 2mm de diâmetro
(n=327) e de 4 a 8mm de diâmetro (n=324). Somente os CCOs graus I e II
foram selecionados para a maturação in vitro (MIV; BASTOS, et al, 2008).
Grupos de 10 a 15 CCOs foram cultivados em 100µL de meio MIV (TCM 199
bicarbonato com 10% (v/v) de soro fetal bovino, 5µg de hormônio luteinizante,
0,5µg de hormônio folículo estimulante, 1µg de estradiol, 2,2µg de piruvato e
50µg de gentamicina/mL de meio), em atmosfera de 5% de CO2, 95% de ar e
umidade saturada a 38.5°C, por 20 a 24h.
A fertilização (FIV) e o cultivo in vitro (CIV) foram realizados de acordo
com Bastos et al (2008), sob as mesmas condições atmosféricas da MIV.
As taxas de clivagem foram avaliadas às 28h, 34h e 54h pós-FIV e os
embriões foram divididos em seis grupos de acordo com o diâmetro folicular do
oócito (≤2mm e 4-8mm) e com o momento de início da clivagem: precoce,
intermediária ou tardia (≤28h; >28h e ≤34h; >34h e ≤54h de cultivo,
respectivamente). As taxas de blastocisto foram avaliadas nos dias 7 e 8 após
a FIV e os embriões foram fixados em paraformaldeído 4%. Posteriormente, os
embriões tiveram os núcleos celulares corados com 4', 6- diamidino-2-
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fenilindole (DAPI) para a localização do DNA e foram submetidos à
imunofluorescência para detecção de H3K27me3.
Resultados e discussão
O momento da clivagem influenciou a taxa de blastocisto, que foi maior nos
grupos em que os embriões clivaram mais cedo (4-8mm-precoce: 12,6% vs. 48mm-tardia: 7,6% e ≤2mm-precoce: 9,2% vs. ≤2mm-tardia: 2,5% ou precoce:
10,9% vs. tardia: 5,1%). Resultados semelhantes foram obtidos por outro grupo
de pesquisadores, que obtiveram taxas de 40% (clivagem até 30 horas pósFIV) e 10% (clivagem 30-36 horas pós-FIV; HUMBLOT, et al., 2005), em
concordância com relatos anteriores e estudos nos quais embriões de clivagem
tardia resultaram em menores taxas de blastocisto e de prenhez.
As razões pelas quais os embriões de clivagem precoce têm maior
viabilidade do que os de clivagem tardia não são completamente conhecidas,
mas sabe-se que embriões que completam o primeiro ciclo celular de forma
mais lenta possuem maior incidência de anormalidades cromossômicas e
mixoploidia do que os que completam o ciclo mais rapidamente (SUGIMURA,
et al., 2012).
A taxa de clivagem foi maior para os embriões provenientes de folículos
de 4-8mm (85,5%) em relação aos ≤2mm de diâmetro (75,8%). O grupo de
folículos de 4-8mm também apresentou maior taxa de blastocisto em relação
ao número de zigotos cultivados (37,2%) e aos embriões clivados (43,5%)
quando comparadas ao grupo ≤2mm (20,1% e 26,5%, respectivamente), o que
está de acordo com Bastos et al. (2008), em que a taxa de blastocisto de
partenotos do grupo de folículos com 4-8mm foi de 34,3% contra 18,9% do
grupo de 1-2mm, confirmando a influência positiva do maior diâmetro folicular
no desenvolvimento até o estágio de blastocisto defendida por vários autores.
Possivelmente, a maior competência de oócitos oriundos de folículos
maiores sobre os menores deve-se ao menor efeito inibitório exercido pelos
folículos dominantes (CASTILHO, et al., 2007). Ainda, a capacidade oocitária
de completar a maturação nuclear e citoplasmática e de suportar o
desenvolvimento embrionário é adquirida progressivamente até a fase final de
crescimento folicular (GONÇALVES, et al., 2007). Portanto, é possível que os
oócitos provenientes de folículos maiores possuam maior quantidade de RNAm
e, consequentemente, sejam mais aptos a concluir as fases iniciais do
desenvolvimento embrionário, passando com mais facilidade períodos críticos.
À imunofluorescência, os blastocistos de todos os grupos apresentaram
marcações para H3K27me3, indicando que essa marcação é essencial ao
desenvolvimento embrionário inicial de bovinos.
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Conclusão
Taxas de blastocistos são mais altas em embriões PIV que clivam em até 34
horas pós-fertilização e em embriões provenientes de folículos de 4 a 8 mm
quando comparados aos provenientes de folículos de até 2 mm de diâmetro. A
presença de H3K27me3 em todos os embriões sugere uma atuação dessas
modificações de histonas no desenvolvimento embrionário inicial de bovinos.
Referências
BASTOS, Guilherme Medeiros.; GONÇALVES, Paulo Bayard Dias;
BORDIGNON, Vilceu. Immunolocalization of the high-mobility group N2 protein
and acetylated histone H3K14 in early developing parthenogenetic bovine
embryos derived from oocytes of high and low developmental competence.
Molecular Reproduction and Development, Hoboken, v. 75, n. 2, ago. 2008.
Disponível em: http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1002/(ISSN)1098-2795.
Acesso em: 03 set. 2015.
CASTILHO, Caliê; ASSIS, Guilherme Souza; GARCIA, Joaquim Mansano.
Influência do diâmetro e da fase folicular sobre a competência in vitro de
oócitos obtidos de novilhas da raça nelore. Arquivo Brasileiro de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Belo Horizonte, v. 59, n. 2, fev. 2007. Disponível em:
www.scielo.org/. Acesso em: 03 set. 2015.
GONÇALVES, Paulo Bayard D. et al. Produção in vitro de embriões bovinos: o
estado da arte. Revista Brasileira de Reprodução Animal, Belo Horizonte, v.
31, n. 2, abr/jun. 2007. Disponível em: www.cbra.org.br. Acesso em: 03 set.
2015.
HUMBLOT, Patrice. et al. Effect of stage of follicular growth during
superovulation on developmental competence of bovine oocytes.
Theriogenology, Cambridge, v. 63, n. 4, jun. 2005. Disponível em:
www.journals.elsevier.com/theriogenology/. Acesso em: 03 set. 2015.
LEQUARRE, Anne-Sophie. et al. Influence of antral follicle size on oocyte
characteristics and embryo development in the bovine. Theriogenology,
Cambridge, v. 63, n. 3, maio. 2005. Disponível em:
www.journals.elsevier.com/theriogenology/. Acesso em: 03 set. 2015.
SUGIMURA, Satoshi. et al. Promising System for Selecting Healthy In Vitro
Fertilized Embryos in Cattle. PLoS One, Califórnia, v. 7, n. e36627, maio. 2012.
Acesso em: http://www.plosone.org/. Acesso em: 03 set. 2015.
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