Avaliação do perfil celular esplênico na - IPTSP
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA NEUSA MARIANA COSTA DIAS Avaliação do perfil celular esplênico na lagochilascariose experimental Dissertação de Mestrado Goiânia-GO, 2012 ii Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações Eletrônicas (TEDE) na Biblioteca Digital da UFG Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás–UFG a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações – BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data. 1. Identificação do material bibliográfico: [ X ] Dissertação 2. Identificação da Tese ou Dissertação Autor(a): Neusa Mariana Costa Dias E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? Vínculo Empregatício do autor Agência de fomento: País: Título: [ ] Tese [X] Sim [ ] Não Bolsista Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Sigla: CNPQ Brasil UF: GO CNPJ: Avaliação do perfil celular esplênico na lagochilascariose experimental Palavras-chave: Lagochilascaris minor, Helmintose, Resposta imune, Linfócitos Título em outra língua: Evaluation of the cell profile in the spleen during lagochilascariosis Palavras-chave em outra língua: experimental Lagochilascaris minor, helminths, immune response, lymphocytes Área de concentração: Imunologia Data defesa: (16/02/2012) Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da UFG Orientador(a): Mara Silvia Carvalhaes E-mail: [email protected]; [email protected] Co-orientador(a): Mônica Spadafora Ferreira E-mail: [email protected] 3. Informações de acesso ao documento: Liberação para disponibilização?1 [ x ] total [ ] parcial Em caso de disponibilização parcial, assinale as permissões: [ ] Capítulos. Especifique: __________________________________________________ [ ] Outras restrições: _____________________________________________________ Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação. O Sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat. ________________________________________ Assinatura do(a) autor(a) 1 Data: ____ / ____ / __ Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão sempre disponibilizados. iii NEUSA MARIANA COSTA DIAS Avaliação do perfil celular esplênico na lagochilascariose experimental Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública na área de concentração em Imunologia. Orientadora: Profª. Dra. Mara Silvia Carvalhaes Co-Orientadora: Profª. Dra. Mônica Spadafora Ferreira Goiânia-GO, 2012 iv v Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Aluno (a): Neusa Mariana Costa Dias Orientador (a): Profª. Dra. Mara Silvia Carvalhaes Co-orientador (a): Profª. Dra. Mônica Spadafora Ferreira MEMBROS TITULARES: 1. Profª. Dra. Mara Silvia Carvalhaes 2. Profº. Dra. Lucimeire Antonelli da Silveira 3. Profº. Dr. Marco Tulio Antonio Garcia Zapata Data: 16/02/2012 vi Dedicatória Ao meu maravilhoso e amado Pai: João Dias Silva! Homem no qual admiro imensamente. Através de suas incalculáveis virtudes, sempre mostrou-me o caminho da vida com prontidão. Este homem alegre, mas também às vezes, silencioso e pensativo, homem de fé e de grande luta, sensível e generoso. Obrigada papai, por espalhar em meu caminhar muitas esperanças, sonhos, certezas e confianças. Obrigada por estar presente em todos os momentos da minha vida. Meu grande amigo e conselheiro. Meu pai, meu eterno mestre. Te amo! vii "A excelência pode ser obtida se você se importa mais do que os outros julgam ser necessário; se arrisca mais do que os outros julgam ser seguro, sonha mais do que os outros julgam ser prático, e espera mais do que os outros julgam ser possível." Vince Lombardi viii Agradecimentos Agradeço a Deus pelo dom da vida, pela inspiração e pela sua indispensável misericórdia. À minha orientadora Profª Drª Mara Silvia Carvalhaes, pela disponibilidade e orientação neste trabalho. À minha co-orientadora Profª Drª Mônica Spadafora Ferreira, pela fundamental colaboração e correções neste trabalho. Às pessoas que mais amo. Minha mãe Vitória Costa, sempre presente em minha vida e no meu coração, obrigada pelo seu amor. Meu pai João Dias, pelo exemplo de vida, apoio e incentivo para o meu crescimento intelectual e profissional. Obrigada pela educação e carinho. As palavras não são suficientes para demonstrar meu amor incondicional por vocês. À minha querida irmã Ana Raquel, pela presença amiga e pelas manifestações de carinho em todos os momentos. Aos meus avós, tios e tias, primos e primas, que direta ou indiretamente contribuíram na minha trajetória. Minha gratidão e eterna saudade da minha avó e madrinha Neuza Araújo Costa (in memoriam). Ao meu namorado Wellington Rosa, pelo enorme carinho e por cada palavra de incentivo. À minha querida amiga Vânia Beatriz, pela amizade, disposição em me ajudar e por fazer esses anos mais alegres. Aos meus amigos Juliana Medeiros e Diego Eterno, pela amizade, consideração e carinho. Ao meu amigo Deniel Alencar, pela amizade, colaboração e apoio. ix Aos meus colegas de outros laboratórios: Regiane Morillas, Aline Barbaresco, Lucas Sampaio, Aline Araújo, Yanna Lima, Emerith Mayra, Camila Tavares, Letícia de Almeida pela amizade e convivência. Aos professores do IPTSP/UFG: Profo Clecildo Barreto, Profª Lara Stefania, e Profª Mariane Martins, pela atenção e contribuição para a minha formação. Ao Profº Drº Marco Tulio Zapata, um grande ser humano e profissional. Agradeço pelo apoio e disponibilidade em participar da Banca Examinadora. Aos professores da minha banca de qualificação, pelas valiosas sugestões e contribuições científicas: Profª Ana Paula Kipnis, Profª Liliana Borges, Profo Marco Tulio Zapata, Profo José Clecildo Barreto, Profª Eugênia Emília e Profª Irmtraut Araci. Ao Profº Drº Ruy Lino Júnior, pela colaboração neste trabalho e permissão pelas vezes que utilizei o seu laboratório. Aos meus professores do curso de Biomedicina, PUC-GO, em especial à Profª Maria Paula Perillo, pelos essenciais ensinamentos. Aos funcionários do IPTSP/UFG: Sr. Fernando, Marco Vitor, Alex Borges, Abigair, Kariny e José Clementino, pela atenção e competência. E em especial à Valéria, pela amizade e compreensão. Ao CNPQ, pela bolsa de estudos concedida. Por fim, um sincero agradecimento a todas as pessoas que me ajudaram de alguma forma a realizar esta etapa. x “Vim, vi, venci.” Júlio César (Orador Romano) xi SUMÁRIO LISTA DE TABELAS E FIGURAS xiii LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS xvi RESUMO xix ABSTRACT xx INTRODUÇÃO 1 1 – Lagochilascaris minor 1 1.1 – Ciclo evolutivo natural 2 1.2 – Ciclo evolutivo experimental 4 2 – Lagochilascariose humana e animal 6 2.1 – Patogenia 8 2.2 – Manifestações clínicas 10 3 – Respostas imune aos helmintos 11 JUSTIFICATIVA 25 OBJETIVOS 26 1 – Objetivo Geral 26 2 – Objetivos Específicos 26 MATERIAIS E MÉTODOS 27 1 – Animais e Infecção 27 1.1 – Obtenção de ovos de Lagochilascaris minor 27 1.2 – Infecção experimental 27 2 – Imunoistoquímica (IIQ) 28 3 – Quantificação dos subtipos celulares 29 4 – Análise Estatística 31 xii RESULTADOS 32 1 – Análise imunoistoquímica do baço de camundongos infectados com 32 Lagochilascaris minor 1.1 – Análise quantitativa das células esplênicas F4/80+ 34 1.2 – Análise quantitativa das células esplênicas CD4+ 36 1.3 – Análise quantitativa das células esplênicas CD8+ 38 1.4 – Análise quantitativa das células esplênicas CD19+ 40 DISCUSSÃO 41 CONCLUSÕES 49 CONSIDERAÇÕES FINAIS 50 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 52 ANEXOS Anexo 1 – Aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Instituto 63 Butantan de São Paulo Anexo 2 – Manuscrito 64 Anexo 3 – Regras para publicação de trabalho 84 xiii LISTA DE FIGURAS E TABELAS Figura 1: Ciclo da transmissão da lagochilascariose, adaptado de: Stanford 4 University 2006. Figura 2: Ocorrência de casos de lagochilascariose no Brasil, adaptado de: 7 Palheta-Neto et al. 2002. Figura 3: Resposta imune aos helmintos adapatado de: Maizels et al. 2009. 13 Figura 4: Esquema ilustrativo de imunoistoquímica, adaptado de: LAPAC 2011. 29 Figura 5: Fotografia de um campo de imunoistoquímica representando a 30 quantificação celular nas 30 intersecções da grade. As setas indicam células esplênicas marcadas nas intersecções (aumento de 400X). Figura 6: Imunoistoquímica do baço de camundongos BALB/c infectados, sem 32 anticorpo de marcação (CN, controle negativo) e com os anticorpos antimarcadores celulares F4/80, CD4, CD8 e CD19. As setas apontam para marcação celular localizada na polpa vermelha para o marcador F4/80 e na região folicular da polpa branca do baço para os marcadores CD4, CD8 e CD19; aumento de 100X (Reações padronizadas pela Profa. Dra. Monica Spadafora-Ferreira, Instituto Butantan de São Paulo). Figura 7: Determinação por imunoistoquímica de células F4/80+ no baço dos 34 camundongos BALB/c e C57BL/6 não infectados (controles- linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectadosnegrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células F4/80+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção. Figura 8: Imunoistoquímica com presença de células esplênicas F4/80+. Camundongo BALB/c não infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (A); camundongo BALB/c aos 100 dias após a infecção com quantidade moderada de células F4/80+ (B); camundongo C57BL/6 não 34 xiv infectado (controle) com quantidade acentuada de células marcadas (C); camundongo C57BL/6 aos 100 dias de infecção com quantidade moderada de células F4/80+ (D); aumento de 400X. Figura 9: Determinação por imunoistoquímica de células CD4+ no baço dos 36 camundongos BALB/c e C57BL/6 não infectados (controles- linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectadosnegrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células CD4+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção. Figura 10: Imunoistoquímica com presença de células esplênicas CD4+. 36 Camundongo BALB/c não infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (A); camundongo BALB/c aos 100 dias após a infecção com quantidade moderada de células CD4+ (B); camundongo C57BL/6 não infectado (controle) com quantidade moderada de células marcadas (C); camundongo C57BL/6 aos 100 dias de infecção com quantidade moderada de células CD4+ (D); aumento de 400X. Figura 11: Determinação por imunoistoquímica de células CD8+ no baço dos 38 camundongos BALB/c e C57BL/6 não infectados (controles- linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectadosnegrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células CD8+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção. Figura 12: Imunoistoquímica com presença de células esplênicas CD8+. Camundongo BALB/c não infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (A); camundongo BALB/c aos 35 dias após a infecção com 38 xv quantidade discreta de células CD8+ (B); camundongo C57BL/6 não infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (C); camundongo C57BL/6 aos 35 dias de infecção com quantidade moderada de células CD8+ (D); aumento de 400X. Figura 13: Determinação por imunoistoquímica de células CD19+ no baço dos 40 camundongos BALB/c e C57BL/6 não infectados (controles- linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectadosnegrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células CD19+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção. Figura 14: Imunoistoquímica com presença de células esplênicas CD19+. 40 Camundongo BALB/c não infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (A); camundongo BALB/c aos 150 dias após a infecção com quantidade moderada de células CD19+ (B); camundongo C57BL/6 não infectado (controle) com quantidade acentuada de células marcadas (C); camundongo C57BL/6 aos 150 dias de infecção com quantidade acentuada de células CD19+ (D); aumento de 400X. Figura 15: Esquema representativo da interação das populações celulares 50 F4/80+, CD4+, CD8+, CD19+ durante a lagochilascariose experimental. Os camundongos da linhagem BALB/c apresentaram aumento preferencial de células CD4+ e CD19+. Já os camundongos da linhagem C57BL/6 mostraram aumento preferencial de células CD8+. Tabela 1: Classificação dos campos de imunoistoquímica para os marcadores F4/80, CD4, CD8, CD19 de acordo com a quantidade de células marcadas. 31 xvi LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS AAMs do inglês, Alternatively activated macrophages ADCC do inglês, Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity APCs do inglês, Antigen-presenting cells B0 Células B naives Bm Células B de memória Breg Linfócitos B reguladores btk do inglês, Bruton tyrosin kinase CAMs do inglês, Classically activated macrophages CD do inglês, Cluster of differentiation CO2 ConA Gás carbônico CR3 do inglês, Complement receptor 3 DAI Dias após infecção DCs do inglês, Cells dendritic EB Extrato bruto EBL3 Extrato bruto de larvas L3 EBVA Extrato bruto de parasitos adultos ECP Proteína catiônica eosinofílica EPO do inglês, Eosinophil peroxidase FCB do inglês, Follicular B cells FcR Receptor de Fc FcRε Receptor para Fc de IgE GM-CSF do inglês, Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor h Hora H2O2 Água oxigenada IC Índice de células IFNγ Interferon-γ IFT Imunofenotípica Ig Imunoglobulina IIQ Imunoistoquímica IL Interleucina IL-4Rα Receptor α para IL-4 Concanavalina A xvii iNOS do inglês, NO synthase inducible IPTSP Instituto de Patologia e Saúde Tropical IVT Ivermectina L2 Larvas de segundo estádio L3 Larvas de terceiro estádio L4 Larvas de quarto estádio LN Linfonodo LPS Lipolissacarídeo MBP-1 do inglês, Major basic protein Mcel+ Média de células positivas MHC do inglês, Major histocompatibility complex min Minuto ml Mililitro MMM do inglês, Marginal metalophils macrophages MZ do inglês, Marginal zone MZB do inglês, MZ B cells MZM do inglês, MZ macrophages n Número NK do inglês, Natural killer NKT do inglês, T Natural killer iNKT NKT invariantes NO do inglês, Nitric oxide Nuócitos Células auxiliares inatas PA Parasito adulto PAMPs do inglês, Pathogen-associated molecular pattern PBMC do inglês, Peripheral blood mononuclear cell PBS do inglês, Phosphate buffered salin PBSLD PBS-leite desnatado PMNB Polimorfonuclear basófilo PMNE Polimorfonuclear eosinófilo PMNN Polimorfonuclear neutrófilo RNS do inglês, Reactive nitrogen species ROS do inglês, Reactive oxygen species SE Secretado e excretado SEA do inglês, Secreted egg antigen xviii SFB Soro fetal bovino SNC Sistema nervoso central sp Espécie t.a. Temperatura ambiente Tc T citolítico TCR do inglês, T cell receptor TD Timo dependente TGFβ do inglês, Transforming growth factor-beta Th do inglês, T helper Th0 T naive ThF Th folicular TI Timo independente TLR do inglês, Toll-like receptors TNFα do inglês, Tumor necrosis factor-alpha Tregs do inglês, T regulators TSLP do inglês, Thymic stromal lymphopoietin X Vezes µl Microlitro xix RESUMO A lagoquilascariose é uma parasitose emergente cujo agente etiológico é Lagochilascaris minor. O modelo experimental em camundongos tem sido utilizado no estudo da resposta imune durante a infecção por L. minor. No presente trabalho, avaliaram-se as populações de células esplênicas por imunoistoquímica em camundongos susceptíveis (C57BL/6) e resistentes (BALB/c), experimentalmente infectados por L. minor. A manutenção do ciclo experimental, infecção dos animais, padronização e execução das reações imunoistoquímicas, cortes em criostato, padronização das contagens de células, bem como as fotografias para estas contagens, foram feitas pelos bolsistas do laboratório de Imunoquímica do IPTSP/UFG (Lucas Rangel, Mariana F.S. Prudente, Thayssa Dourado e Leticia de Almeida Leandro) e pelos alunos da Profa. Monica Spadafora-Ferreira, no Instituto Butantan de São Paulo. Esta dissertação refere-se a contagem das células marcadas nas fotografias das lâminas das reações de imunoistoquímica. Camundongos BALB/c exibiram aumento do índice de células esplênicas: F4/80+ aos 100 dias pós-infecção; CD4+ aos 100 e 250 dias após a infecção; células CD8+ aos 35 e 100 dias pós-infecção; CD19+ aos 100, 150 e 250 dias pós-infecção. Nos camundongos C57BL/6 infectados observou-se aumento do índice de células esplênicas: F4/80+ aos 250 dias de infecção; CD4+ aos 150 dias; CD8+ aos 35, 150 e 250 dias; CD19+ aos 150 e 250 dias após infecção. Esses resultados indicam participação dessas células no controle da infecção experimental por L. minor. Palavras-chave: Lagochilascaris minor, helmintose, resposta imune, linfócitos xx ABSTRACT Lagochilascariosis is an emerging parasitic disease whose etiologic agent is Lagochilascaris minor. The experimental model in mice has been used to study the immune response during infection by L. minor. In this study, we evaluated spleen cell populations in susceptible (BALB/c) and resistant (C57BL/6) mice experimentally infected with L. minor. The maintenance of the experimental cycle, infection of the animals, standardization and execution of the immunohistochemistry reactions, cuts in cryostat, standardization of the countings of cells, as well as photographs for these countings, had been made by the scholarship students of the laboratory of Imunoquímica of the IPTSP/UFG (Lucas Rangel, Mariana F.S. Prudente, Thayssa Dourado and Leticia de Almeida Leandro) and students of the Profa. Mônica SpadaforaFerreira in the Butantan Institute of São Paulo. This dissertation concerns the counting of the photos of the cells marked in the specimes of immunohistochemistry reactions. BALB /c mice exhibited increased the index of spleen cells: F4/80+ at 100 days postinfection; CD4 + cells to 100 and 250 days after infection; CD8 + cells at 35 and 100 days post-infection; CD19 + cells at 100, 150 and 250 days post-infection. In C57BL / 6 mice infected showed an increase the index of spleen cells: of F4/80 + to 250 days of infection, increase in CD4 + cells at 150 days, an increase of CD8 + cells at 35, 150 and 250 days and increased CD19 + cells to 150 and 250 days after infection. These results indicate involvement of these cells in the control of experimental infection by L. minor. Keywords: Lagochilascaris minor, helminths, immune response, lymphocytes 1 INTRODUÇÃO A Lagochilascariose é uma infecção cujo agente etiológico é um nematódeo do gênero Lagochilascaris. A doença humana é considerada uma helmintose emergente neotropical, associada à Lagochilascaris minor (Paçô & Campos 1998; Guimarães et al. 2010). A infecção aparece em indivíduos de ambos os sexos, residentes em áreas rurais, que utilizam carne de animais silvestres como alimento (Palheta-Neto et al. 2002). O Brasil lidera a casuística mundial desta antropozoonose com aproximadamente 90% dos casos mundiais descritos (Paçô & Campos 1998). 1 – Lagochilacaris minor Parasitas do gênero Lagochilascaris são classificados como membros da subfamília Ascaridinae, portanto pertencentes a família Ascarididae, ordem Secernentea e classe Nematoda (Yamaguti 1961; Sprenti 1971; Palheta-Neto 2002). São conhecidas cinco espécies do gênero Lagochilascaris: Lagochilascaris minor, Lagochilascaris major, Lagochilascaris buckleyi, Lagochilascaris turgida e Lagochilascaris sprenti (Leiper 1909; Fraiha et al. 1989; Prudente et al. 2009a). L. minor foi originalmente descrito pelo helmintologista da Escola de Medicina de Londres, Robert T. Leiper (1909), a partir de espécimes coletados de abscessos subcutâneos de dois pacientes de Trinidad-Tobago. Ao descrever o parasita, o autor chamou a atenção para a morfologia peculiar do helminto: boca com três lábios bem desenvolvidos, separados por interlábios, o que confere a extremidade cefálica um aspecto bem característico, que lembra o lábio leporino (lagos=lebre) (Leão & Neto 1997; Paço & Campos 1998). L. minor é a espécie mais importante do gênero, visto que foram registrados mais de 100 casos de parasitismo humano causados por L. minor (Palheta-Neto 2002). O nematódeo provoca uma infecção com lesões granulomatosas crônicas, que aparecem sob a forma de nódulos, pseudocistos ou abscessos, frequentemente localizados na região do pescoço, mastóide ou ouvido médio (Guimarães et al. 2010; Roig et al. 2010). No interior dos abscessos encontram-se parasitos adultos (PA), ovos e larvas, indicando auto-infecção e favorecendo o desenvolvimento de doença crônica. Algumas vezes o parasita invade o tecido pulmonar e o sistema nervoso central (SNC), levando à morte do hospedeiro (Fraiha et al. 1989; Freitas et al. 2008). 2 A extraordinária capacidade de L. minor para migrar entre diferentes tecidos humanos também foi observada em modelos experimentais, utilizando-se camundongos e gatos (Sakamoto & Cabrera 2002; Semerene et al. 2004; Freitas et al. 2008; Prudente et al. 2009b). Assim, a reprodução completa do ciclo biológico de L. minor utilizando hospedeiros experimentais tem permitido o estudo detalhado da biologia do parasita e da relação parasita-hospedeiro (Barbosa & Campos 2001). 1.1 – Ciclo evolutivo natural O ciclo de vida natural de L. minor e o mecanismo de infecção não estão bem esclarecidos, pois os hospedeiros naturais do parasita, sejam eles definitivos ou paratênicos, ainda não são bem conhecidos, apesar das várias hipóteses e achados já descritos. Leiper, em 1909, sugeriu que algum animal silvestre ou doméstico serviria como hospedeiro definitivo natural de L. minor, sendo o homem apenas hospedeiro acidental deste helminto, visto que a infecção humana é relativamente rara para desempenhar um papel na manutenção deste helminto na natureza. Animais silvestres como canídeos felídeos e roedores são considerados os prováveis reservatórios naturais de L. minor (Paço & Campos 1998; Barbosa et al. 2005; Prudente et al. 2008). Entre os hospedeiros conhecidos, além do homem, há registros de infecção natural por L. minor em cães e gatos domésticos. O cão doméstico foi encontrado naturalmente infectado em Foz do Iguaçú (Barbosa et al. 2005). Volcán & Medrano (1990) relataram a infecção natural por L. minor em um cachorro do mato Speothos venaticus. Fraiha et al. (1989) relataram o único caso de infecção natural em gato doméstico ocorrido no Brasil, ocorrendo associação entre infecção animal e humana, pois ambos, paciente e gato doméstico, habitavam o mesmo ambiente. Sakamoto & Cabrera (2002) registraram gatos com lagochilascariose natural no Uruguai, porém sem associação aparente com a doença humana. Em 1971, Sprent sugeriu que o ciclo evolutivo de L. minor fosse semelhante ao ciclo de Ascaris lumbricóides, desde a ingestão do ovo até a chegada de larvas de 2º estádio (L2) aos pulmões, onde ocorreria a segunda muda. As larvas de 3º estádio (L3) dos pulmões chegariam à traquéia e, ao invés de serem deglutidas, como no ciclo de A. lumbricóides, se estabeleceriam nas criptas das tonsilas, seios nasais e tecidos relacionados. Além desta hipótese, outros autores acreditam que a via hídrica seja a 3 mais importante para infecção através de larvas L2 infectantes, provenientes de felinos silvestres (Prudente et al. 2008). Smith et al. (1983) sugeriram que o ciclo de L. minor deveria envolver um hospedeiro que não o homem, nos estágios precoces do desenvolvimento e que a infecção resultaria da ingestão de larvas encistadas em carnes cruas ou mal cozidas de um mamífero contaminado. As larvas poderiam migrar do estômago para os tecidos que se comunicam com a faringe, e fazer a muda para larvas de 4º estádio (L4) e parasito adulto durante este percurso. De fato, parasitos adultos são encontrados no homem em locais como: tonsilas, seios nasais, seios maxilares, ouvido médio e processo mastóide Em relação ao ciclo de transmissão (Figura 1), hospedeiros naturais (carnívoros silvestres) abrigariam o PA nas primeiras porções do sistema digestório ou respiratório. Os ovos de L. minor seriam eliminados nas fezes desses animais, contaminando o solo. Esses ovos ao se tornarem embrionados contendo larvas L3, quando ingeridos por hospedeiros intermediários (provavelmente roedores silvestres), infectariam esses animais. Durante a infecção desses hospedeiros, são encontradas as formas larvárias encistadas no tecido muscular e tecido subcutâneo. Os hospedeiros definitivos ao se alimentarem desses animais seriam infectados por L3 encistadas, fechando o ciclo enzoótico natural (Sprent 1971; Smith et al. 1983; Leão & Fraiha 1997). Acredita-se que a infecção humana por L. minor seja decorrente da ingestão de carne crua ou mal cozida de animais silvestres contendo larvas L3 encistadas do parasito. O homem, o cão e o gato doméstico ao se infectarem comportariam-se como hospedeiros definitivos acidentais, albergando todos os estágios evolutivos do parasito, que seriam capazes de se reproduzir em ciclos sucessivos (Smith et al. 1983). 4 Figura 1. Ciclo da transmissão da lagochilascariose, adaptado de: Stanford University 2006. 1.2 – Ciclo evolutivo experimental O ciclo evolutivo experimental tem sido descrito para o parasito utilizando-se camundongos e/ou roedores silvestres e gatos domésticos (Paçô et al. 1999). Nesses modelos, o camundongo é considerado como hospedeiro intermediário no ciclo experimental. Além do camundongo, cutia, preá e camundongo silvestre respondem à infecção por L. minor comportando-se como hospedeiros intermediários no ciclo experimental (Volcán & Medrano 1990). Vários autores (Campos et al. 1992, Volcán et al. 1992, Paçô et al. 1999), confirmaram a hipótese formulada por Smith et al. (1983), de que o homem se infectaria através da ingestão de larvas encapsuladas em carnes cruas ou mal cozidas de animais silvestres, os quais funcionariam como hospedeiros intermediários obrigatórios do parasito. Esses autores acreditam que larvas L3 encistadas nos tecidos de roedores (hospedeiros intermediários), ingeridas por felinos ou humanos (hospedeiros definitivos), fazem a muda para larvas L4 e PA, e este migra para as porções superiores do trato digestório e tecidos vizinhos à faringe (tonsila, palato, seios paranasais, conduto auditivo) no hospedeiro definitivo, onde são encontrados na infecção natural humana ou de felinos. Nos felinos (hospedeiros definitivos), os PAs acasalam, dando lugar a postura de ovos que irão para as fezes. Nesses estudos demonstrou-se que Felis domesticus atuam como hospedeiros definitivos no ciclo experimental, confirmando, assim, a natureza heteroxênica do ciclo 5 evolutivo, apesar de ser reconhecida a ocorrência do ciclo autoinfectante. Barbosa et al. (2005) obtiveram 100% de reprodução da infecção experimental em F. domesticus, confirmando a possibilidade de o gato doméstico atuar como reservatório em potencial de L. minor na natureza. No ciclo evolutivo experimental observou-se que em camundongos inoculados com ovos infectantes do parasito (contendo L3 encistadas) por via oral, as larvas L3 do interior dos ovos eclodem nas porções terminais do intestino delgado e ceco, quatro a seis horas após a inoculação, atingindo vasos e parênquima hepático. Em seguida, disseminam para outros tecidos, como pulmões, músculos, tecido subcutâneo, parênquima renal e pâncreas e depois de um a dois dias, encistam-se na musculatura esquelética e tecido subcutâneo de camundongos infectados. Lesões granulomatosas contendo larvas L3 encistadas foram encontradas nos pulmões, músculos esqueléticos, tecido subcutâneo e linfonodos (LN) aos 30 dias após a infecção (DAI) (Campos et al. 1992; Volcán et al. 1992). Quando gatos são alimentados com carcaças de camundongos infectados observa-se a continuidade do ciclo evolutivo do parasito. Nestes hospedeiros, as larvas L3 eclodem dos cistos no estômago e ascendem pelas porções superiores do trato digestório até a orofaringe, e larvas L4 são vistas do segundo ao oitavo dia, atingindo a fase adulta entre nove e quinze DAI, em tecidos da rino e orofaringe, tecido subcutâneo da região cervical, LN cervicais, ouvido, seios nasais, mastóide, face, pulmões e cérebro. Ovos de L. minor são expelidos e encontrados nas fezes de gatos infectados (Campos et al. 1992; Volcán et al. 1992; Paço et al. 1999; Semerene et al. 2004). Freitas et al. (2008) demonstraram pela primeira vez na literatura que camundongos podem ser hospedeiros definitivos deste helminto, pois quando infectados por ovos contendo larvas L3, desenvolveram abscessos purulentos com presença de parasitas adultos, mas sem a postura de ovos no local. Alguns autores consideram o hospedeiro definitivo aquele no qual um parasito de reproduz sexualmente (McGraw 2003); no entanto, outros consideram como hospedeiro definitivo aquele que alberga a fase adulta do parasito (Opperdoes & Hannaert 2006). Por esta definição, camundongos podem ser hospedeiros definitivos de L. minor, apontando para a possibilidade de infecção natural de animais e humanos por ovos de L. minor contendo L3, sem a necessidade da presença de um hospedeiro intermediário (Freitas et al. 2008). Em estudo anterior do nosso grupo, após observação da taxa de mortalidade acumulada no período de um ano de infecção, foi possível classificar as linhagens 6 isogênicas de camundongos, em resistentes (A/J, BALB.xid, BALB/c) e susceptíveis (C57BL/6, B10.A) à infecção experimental por L. minor (Carvalhaes 2002, Carvalhaes et al. 2008, Prudente et al. 2009b, Spadafora-Ferreira et al. 2010). Larvas L3 foram encontradas em animais de todas as linhagens, enquanto que larvas L4 e PAs foram encontrados com maior freqüência em camundongos C57BL/6 e B10.A. O padrão de infecção em camundongos C57BL/6 foi semelhante ao apresentado pelos camundongos B10.A, por outro lado, camundongos A/J infectados mostraram-se mais resistentes. Camundongos BALB/c infectados foram considerados animais com susceptibilidade intermediária ou resistentes. Neste estudo, não foram observadas diferenças ligadas ao sexo em relação à taxa de sobrevivência dos animais infectados e número de L3 recuperadas de nódulos da musculatura esquelética e tecido subcutâneo dos camundongos. Estes resultados demonstraram que a progesterona e outros hormônios ligados ao sexo, não parecem afetar o crescimento e reprodução de L. minor (Prudente et al. 2009b, Spadafora-Ferreira et al. 2010). Na lagochilascariose experimental a resistência ao L. minor não está ligada ao haplótipo H-2ª do complexo principal de histocompatibilidade (MHC), porque ambas as linhagens de camundongos, B10.A e A/J, expressam o haplótipo H-2ª, sendo a primeira suscetível e a última resistente à infecção experimental (Prudente et al. 2009b; Spadafora-Ferreira et al. 2010). Por outro lado, temos padrão semelhante de mortalidade e recuperação de larvas L3 em camundongos susceptíveis (C57BL/6 e B10.A) à infecção por L. minor, que apresentam o mesmo background genético, o que indica que o background é uma característica relevante na susceptibilidade à lagochilascariose experimental (Prudente et al. 2009b). Camundongos BALB/c infectados experimentalmente com L. minor desenvolvem uma infecção com patogenia menos grave, sugerindo que este é um possível modelo experimental do ciclo de vida natural do parasito em hospedeiros intermediários ou paratênicos. Já a linhagem C57BL/6 apresentou uma infecção mais grave, com presença de um maior número de PAs, sugerindo que esta linhagem é o melhor modelo experimental para estudo da doença humana (Freitas et al. 2008). 2– Lagochilascariose humana e animal O parasitismo no homem caracteriza-se pelo desenvolvimento de lesões que parecem tumores, supurativas, de natureza crônica ou recorrente, no pescoço, no ouvido médio e na região mastóidea (Leão & Neto 1997; Campos 2005). A constatação da 7 existência de sítios preferenciais das lesões nessas regiões permanece sem justificativa plausível (Palheta-Neto et al. 2002). A doença humana apresenta distribuição geográfica restrita a países das Américas como México, Costa Rica, Trinidad-Tobago, Colômbia, Venezuela, Suriname, Brasil e mais recentemente Bolívia e Uruguai. A infecção humana por L. minor ainda não constitui um problema de saúde pública em nenhum país do mundo; entretanto, a sua incidência tem aumentado sensivelmente no Brasil, permitindo caracterizá-la como uma helmintose emergente (Campos 2005; Barbosa et al. 2005). O Brasil lidera a casuística da lagochilascariose humana, com muitos casos descritos na Amazônia brasileira (Pará, Rondônia, Tocantins, Acre, Mato Grosso). Isso sugere que o parasito encontra nestes locais, condições ideais para seu desenvolvimento. Os estados de Goiás, Mato Grosso do Sul, São Paulo, Roraima e Paraná, também apresentam raros casos descritos da doença (Figura 2) (Paçô & Campos 1998; Campos 2005; Leão et al. 2005). Figura 2. Ocorrência de casos de lagochilascariose no Brasil, adaptado de: Palheta-Neto et al. 2002. Muitos projetos governamentais determinaram um verdadeiro êxodo urbano, levando milhares de pessoas a abandonar grandes centros, passando a habitar áreas próximas a matas, sendo importante fator de aumento de risco de infecção. Os indivíduos infectados geralmente vivem em habitações precárias ao lado de mata densa, sobrevivendo da ingestão de carne de animais silvestres tais como: tatu, preá, cutia, paca, porco do mato, jabuti e outros animais (Campos et al. 1987; Palheta-Neto 2002). O primeiro caso humano brasileiro foi registrado por Artigas et al. (1968) no estado de São Paulo. Vários casos de abscessos purulentos na região do pescoço (Campos et al. 1987, 1995; Costa et al. 1986; Fraiha et al. 1989; Vieira et al. 2000), região temporo-parieto-occipital (Baracat et al. 1984), ouvido (Rocha et al. 1984; 8 Guimarães et al. 2010), seios paranasais (Draper & Buckley 1963; Volcán et al. 1982), osso mastóide (Brujining 1957; Corrêa et al. 1978; Moraes et al. 1983; Campos et al. 1987; Guimarães et al. 2010; Roig-Ocampos 2010 ), rinofaringe (Leão et al. 1978) alvélolo dentário (Volcán et al. 1982), pulmões (Moraes et al. 1985; Rosemberg et al. 1986), SNC (Campos et al. 1985; Orihuela R et al. 1987; Rosemberg et al. 1986), foram descritos na literatura. Barbosa et al. (2005) demonstraram em gatos experimentalmente infectados por L. minor que: 75% apresentaram lesões que evoluíram para nódulos no tecido subcutâneo da região cervical e orofaringe, havendo eliminação de ovos nas fezes; nos 25% restantes, as lesões estavam presentes em localizações semelhantes às descritas no ser humano. Isso evidenciou a semelhança do padrão de infecção de F. domesticus e do ser humano quanto a: localização das lesões, formação de fístulas na orofaringe, eliminação de ovos nas fezes. Deste modo, felídeos silvestres ou domésticos parecem atuar na natureza como reservatório de L. minor. Os relatos de infecção natural do gato doméstico e a suscetibilidade deste hospedeiro à infecção experimental sugerem que este animal possa atuar como um reservatório de L. minor na natureza. 2.1 – Patogenia O fenômeno de auto-infecção foi registrado em animais e no homem, podendo ser decorrente da reprodução do PA no local das lesões, visto que podem ser encontrados todos os estádios evolutivos do helminto, simultaneamente, às vezes em grande número (Moraes et al. 1985, Campos et al. 1987, 1995). Durante a lagochilascariose humana ocorre o desenvolvimento de reações granulomatosas crônicas. Histologicamente, as lesões apresentam numerosos abscessos interligados por fistulas, envolvidos por tecido de granulação, células gigantes multinucleadas, áreas densas de fibrose, presença de edema, restos parasitários e infiltrado difuso de células mononucleares. PA, larvas e ovos foram encontrados no interior de granulomas primários, secundários ou terciários (Moraes et al. 1983; Veloso et al. 1992; Leão & Fraiha 1997; Palheta-Neto et al. 2002). Moraes et al. (1985) observaram grande quantidade de ovos embrionados no interior de microabscessos e granulomas, em pulmão de paciente que foi a óbito por lagochilascariose. Também foram vistos parasitos adultos no centro dos granulomas ou de áreas de necrose, e restos larvários circundados por fibrose; no restante do 9 parênquima pulmonar, os alvéolos mostravam-se repletos de macrófagos vacuolizados, neutrófilos e fibrina; ao redor e na luz dos brônquios, observou-se lesão intensa com presença de exsudato contendo linfócitos e plasmócitos. É importante ressaltar que esses autores observaram a ocorrência do ciclo autoinfectante e ausência de eosinófilos nos tecidos e sangue periférico. Em um caso de otomastoidite por L. minor, o exame histopatológico mostrou granuloma contendo acentuado infiltrado linfohistioplasmocitário e lesão granulomatosa, englobando fragmentos parasitários com camada quitinosa. Porém, devido à fragmentação do parasito este não foi identificado com precisão no material estudado (Guimarães et al. 2010). Diferentes linhagens isogênicas de camundongos foram avaliadas quanto à histopatologia encontrada durante a infecção por L. minor. Semerene et al. (2004) demonstraram que, em camundongos da linhagem C57BL/6, a infecção por L. minor induz uma reação granulomatosa nos pulmões, constituída por células gigantes a partir dos 13 DAI, com presença de eosinófilos e neutrófilos, em meio ao infiltrado inflamatório perivascular, evoluindo para encistamento com fibrose concêntrica aos 61 DAI. Durante a infecção experimental por L. minor, foram observadas por Freitas et al. (2008) diferenças histopatológicas entre as linhagens BALB/c e C57BL/6. Nos camundongos BALB/c, observou-se nos pulmões, uma reação granulomatosa pouco organizada ao redor de larvas L3/L4 intactas ou fragmentadas, alguns polimorfonucleares neutrófilos (PMNN), raros polimorfonucleares eosinófilos (PMNE) e discreta fibrose durante o período de 45-210 DAI. Já os animais C57BL/6 apresentaram inflamação granulomatosa organizada em torno das larvas L3/L4 intactas, áreas com fibrose central e necrose, PMNN e alguns PMNE, nos pulmões no período estudado. Essas lesões de camundongos C57BL/6 infectados foram semelhantes às descritas por Semerene et al. (2004), porém apresentaram maior número de neutrófilos. Camundongos BALB.xid (deficientes de linfócitos B1), mais resistentes à infecção experimental que camundongos BALB/c, apresentaram reações granulomatosas menos intensas contendo larvas L3 localizadas no centro dos granulomas e poucas áreas de inflamação intersticial com prevalência de células mononucleares (Freitas et al. 2009; Prudente et al. 2009a). Nos estudos histopatológicos realizados por Spadafora-Ferreira et al. (2010) foram descritas diferenças nas reações granulomatosas dos pulmões entre as linhagens 10 B10.A e A/J durante a lagochilascariose experimental. Nos camundongos B10.A, na fase inicial da infecção (7-30 DAI), observou-se granuloma primário com infiltrado inflamatório difuso, composto de macrófagos e neutrófilos. Na fase intermediária (4590 DAI) foram observados granulomas secundários em torno de larvas L3/L4 e presença de intenso infiltrado inflamatório com predomínio de macrófagos e neutrófilos. Na fase tardia (120 DAI ou mais) foram detectados granulomas terciários com fibrose concêntrica e infiltrado inflamatório moderado composto por macrófagos e poucos neutrófilos. Nos camundongos da linhagem A/J, linhagem mais resistente, na fase inicial da infecção foram visualizados granulomas primários em volta de larvas intactas e infiltrado inflamatório moderado composto de macrófagos e discreto infiltrado de neutrófilos. Na fase intermediária, observou-se a presença de granulomas secundários com infiltração menor em volta das larvas L3 fragmentadas ou intactas e discreta fibrose nos pulmões. Granulomas terciários foram encontrados na fase tardia, contendo larvas L3 fragmentadas, tecido com necrose moderada e fibrose concêntrica (Spadafora-Ferreira et al. 2010). Essa diferença observada na susceptibilidade à infecção em diferentes linhagens isogênicas de camundongos, com formação distinta de granulomas, pode ser influenciada pelo background genético do hospedeiro e pela resposta imune ao parasita (Freitas et al. 2008). 2.2 – Manifestações Clínicas A lagochilascariose, no homem, instala-se geralmente de forma insidiosa, apresenta caráter crônico e evolui com períodos de remissões e recidivas, às vezes evoluindo para o óbito. A infecção é caracterizada pelo desenvolvimento de nódulos subcutâneos, pseudocistos ou abscessos e aparecimento de novas lesões em locais próximos aos iniciais, na maioria das vezes com drenagem de material purulento ou serossanguinolento e eliminação de diferentes estágios evolutivos do parasito, causando sérios problemas sociais (Moraes et al. 1983; Campos 2005). A localização das lesões direciona a gravidade da doença, sendo relatados desde casos fatais até casos em que as lesões pouco influem no estado geral do paciente (Campos 2005). Assim sendo, os sintomas clínicos da doença dependem: da localização tecidual dessas lesões; da carga parasitária; e da resposta imune do hospedeiro, que pode minimizar ou bloquear os processos patogênicos, bem como o surgimento de novas 11 lesões (Fraiha et al. 1989; Campos et al. 1992; Prudente et al. 2009b; Guimarães et al. 2010). Na fase inicial da doença, alguns pacientes relatam febre diária, inapetência, perda ponderal e adenopatia. Nos casos de comprometimento cervical, observam-se nódulos que aumentam gradativamente de tamanho, podendo atingir cerca de 10 cm de diâmetro, fistulando-se espontaneamente. Existem relatos de quadros de otalgia, mastoidite e rinite. Entre as manifestações neurológicas existem relatos de cefaléia intensa, distúrbios de comportamento, tetraparesia de membros inferiores, rigidez da nuca, sinais de irritação meníngea, crises convulsivas e óbito (Campos 2005). O comprometimento pulmonar pode ser acompanhado de febre e dificuldade respiratória, podendo evoluir para cianose e óbito. A letalidade tem sido observada em pacientes com comprometimento pulmonar ou do SNC. Isto se deve a falta de diagnóstico parasitológico adequado e da utilização de terapêutica específica (Leão & Fraiha 1997; Palheta-Neto et al. 2002). A infecção humana pode ter evolução crônica, com 5 a 20 anos de duração, ou levar o indivíduo ao óbito, três meses após o início dos sintomas (Paço & Campos 1998). Existem indivíduos que permanecem infectados por cinco a dez anos, havendo melhora do quadro clínico e em seguida reagudização dos processos parasitários após a interrupção do tratamento (Campos 2005). Existem dez casos fatais registrados na literatura (Leão et al. 2005). No parasitismo humano, não é raro se observar comprometimento do SNC, rino e orofaringe, na ausência de lesões no tecido subcutâneo, ouvido médio ou seios nasais. Nessas condições, o diagnóstico é extremamente difícil de ser realizado; mas comumente, o paciente relata a eliminação de parasitos vivos através da cavidade oral, conduto auditivo externo e fossas nasais (Campos 2005; Barbosa et al. 2005). 3 – Resposta imune aos helmintos incluindo a lagochilascariose Respostas imunes desempenham um papel central na determinação da evolução de uma infecção, estabelecendo um balanço crítico destinado a garantir a sobrevivência do hospedeiro e/ou do patógeno. No entanto, muitos patógenos desenvolveram complexas estratégias de evasão a esses mecanismos de defesa e capacidade de imunomodulação dessa resposta. O sistema imunológico dos mamíferos evoluiu com mecanismos especializados, pois distintos órgãos linfóides, populações celulares e 12 componentes humorais compõem os sistemas inato e adaptativo, para proteção do hospedeiro (Allen & Maizels 2011). Antígenos derivados de helmintos podem ser drenados para órgãos linfóides secundários, ou interagir com as células no local da infecção, incluindo células epiteliais ou células dendríticas (DCs). O baço é o maior órgão linfóide secundário nos mamíferos, que desempenha funções imunológicas essenciais, sendo o principal local de resposta a antígenos provenientes do sangue. Esse órgão é microanatomicamente organizado em: polpa branca, com áreas segregadas de linfócitos T (região linfóide perioarteriolar) e folículos com células B, que fornecem um ambiente para o início eficiente de respostas imunes específicas; e em polpa vermelha, constituída por grande número de eritrócitos, macrófagos, linfócitos, DCs e células plasmáticas. As áreas linfóides da polpa branca estão confinadas por uma zona marginal (MZ) que separa a polpa branca da polpa vermelha (Aichele et al. 2003; Mebius & Kraal 2005). Uma ampla variedade de espécies de helmintos parasita os vertebrados, apresentando um ciclo de vida que pode ser direto, com transmissão de um hospedeiro definitivo para outro, ou complexo, envolvendo distintos ciclos e estágios de desenvolvimento, como ovos, larvas ou parasitos adultos, em diferentes espécies de hospedeiro. Nesses estágios, estes parasitas muitas vezes são capazes de migrar através de diferentes órgãos, sistemas e tecidos dentro do hospedeiro parasitado (Riet et al. 2007; Jackson et al. 2008). As infecções por helmintos são as mais comuns nos seres humanos, afetam bilhões de pessoas em todo o mundo, são responsáveis por altos índices de morbilidade e em alguns casos podem levar a morte (Riet et al. 2007). Todavia, o cuidado efetivo com a saúde e medidas de saneamento podem eliminar muitas infecções por helmintos, e intervenções imunológicas podem se tornar um importante tratamento. Ainda assim, vacinas ou outras imunoterapias efetivas não foram desenvolvidas e o entendimento da resposta imune para esses importantes patógenos permanece em um estágio rudimentar. (Gause et al. 2003). As moléculas e células envolvidas na ativação da resposta imune contra helmintos permanecem imunorreguladores enigmáticas. “mestres”, visto Parasitas que helmintos normalmente são chamados ativam de macrófagos alternativamente ativados (AAMs), células T helper 2 (Th2) e T reguladoras (Tregs). Os níveis elevados de imunoglobulina (Ig)E, mastocitose e eosinofilia são consideradas 13 características da infecção por helmintos (Figura 3) (Hewitson et al. 2009; Maizels et al. 2009; Cadman & Lawrence 2010). Figura 3. Resposta imune aos helmintos adapatado de: Maizels et al. 2009. Os componentes celulares da imunidade inata incluem células de origem hematopoética e não hematopoética, como macrófagos, DCs, mastócitos, neutrófilos, eosinófilos, monócitos, células natural killer (NK), células da pele como macrófagos e mastócitos, células do trato respiratório, gastrointestinal e geniturinário (Turvey et al. 2009). O sistema imune inato possui uma família de receptores que reconhecem padrões moleculares associados à patógenos (PAMPs) dos diversos microorganismos e sinalizam a presença dos patógenos. PAMPs são moléculas vitais para os microorganismos e altamente conservadas, sendo representadas por carboidratos, proteínas, lipídios e ácidos nucléicos. Entre estes receptores, os receptores similares à Toll (TLR) representam importantes moléculas para a identificação de microorganismos. Os TLR são expressos em várias células do sistema imune inato, tais como, monócitos, macrófagos, mastócitos, PMNN, PMNE, polimorfonuclear basófilo (PMNB) e DCs em diferentes estágios de maturação e subtipos (Trujillo et al. 2007; Friberg et al. 2010). PAMPs de helmintos estimulam a atividade de células da imunidade inata (eosinófilos, basófilos, mastócitos ou células do epitélio intestinal) que por sua vez, 14 influenciam DCs ou mesmo células T naives (Th0). PAMPs de helmintos também direcionam a maturação de DCs induzindo uma resposta Th2 ou Treg e podem suprimir a expressão ou função de TLRs (Jackson et al. 2008; Cadman & Lawrence 2010). Durante a resposta imune inata, granulócitos são ativados e podem agir como células imunes efetoras durante a infecção por helmintos. Estudos in vitro mostram que a imunidade mediada por eosinófilos contra helmintos pode levar a citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC): o anticorpo se liga ao receptor Fc (FcR) na superfície do granulócito e esta célula inicia degranulação e extrusão do conteúdo de grânulos tóxicos contra o parasita. In vivo são observadas alterações na fisiologia do intestino e produção de muco por células caliciformes mediada por granulócitos durante infecções por helmintos no intestino (Cadman & Lawrence 2010; Paul & Zhu 2010; Allen & Maizels 2011). Eosinófilos apresentam papel crucial na produção precoce de interleucina (IL) 4. Os anticorpos IgE se ligam à superfície dos helmintos e os eosinófilos então aderem por meio de receptores FcRε, sendo ativados para secretar grânulos com enzimas que destroem os parasitas. Eosinófilos armazenam em seus grânulos proteínas tóxicas contra o parasita como: proteína básica principal (MBP-1), peroxidase eosinofílica (EPO) e proteína catiônica eosinofílica (ECP). Os grânulos também contêm uma série de proteínas pré-formadas como quimiocinas e citocinas (IL4, IL13), que podem ser rápida e seletivamente liberadas. A liberação de eosinófilos da medula óssea para a circulação periférica é mediada por IL5 (Cadman & Lawrence 2010). Camundongos IL5-/- com infecção por Trichinella spiralis mostraram cargas maiores de parasitas adultos e expulsão lenta em infecções secundárias. No entanto, durante a infecção experimental por Nippostrongylus brasiliensis, embora camundongos apresentem eosinofília dependente de IL5 e aumento de IgE, nenhum desses fatores desempenharam um papel na expulsão parasitária na infecção primária. Camundongos deficientes em eosinófilos exibiram expulsão normal do parasita em infecção primária por N. brasiliensis. Esses animais montaram respostas Th2, acumulo de basófilos e produção de IgE inalteradas, demonstrando que eosinófilos desempenham um papel pequeno durante a infecção por N. brasiliensis (Cadman & Lawrence 2010). Estudos recentes sobre a expressão de IL4 e IL13 em camundongos mostraram que um número significativo de células não-B, não-T produtoras dessas citocinas, são encontrados durante infecção por helmintos. Essas células denominadas de nuócitos (innate helper cell) foram identificadas no modelo experimental de infecção por N. 15 brasiliensis (Allen & Maizels 2011). A proliferação dessas células foi mimetizada pela estimulação com IL25 e IL33, tanto in vitro quanto in vivo. Os nuócitos não expressam marcadores de superfície característicos de nenhuma linhagem leucocitária conhecida, incluindo linfócitos T e B, NK, DCs, neutrófilos, eosinófilos, mastócitos, basófilos ou macrófagos. A transferência de nuócitos de animais selvagens para camundongos deficientes em IL4-/- e IL13-/- foi capaz de restaurar a capacidade desses animais em controlar a infecção e expulsar o helminto, demonstrando um papel importante para esse tipo celular na infecção (Neill et al. 2010). Vários tipos de células epiteliais não-linfóides produzem linfopoietina estromal tímica (TSLP), IL25 e IL33 em resposta a helmintos. Essas citocinas influenciam a imunidade inata e adaptativa associada à resposta Th2. As DCs ativadas por TSLP produzem CXCL8 e CCL24 que atraem neutrófilos e eosinófilos, respectivamente. As quimiocinas CCL17 e CCL22 atraem células Th2 para o sítio de infecção e também podem ser produzidas por DCs ativadas por TSLP (Smits et al. 2010; Koyasu & Moro et al. 2011). Os polimorfonucleares podem ser rapidamente recrutados para os sítios de infecção e linfonodos de drenagem, onde produzem IL4 e/ou IL13. PMNN atuam na fagocitose e produzem espécies reativas do oxigênio (ROs) em fagolisossomos destruindo microorganismos. Também podem agir sobre larvas de helmintos; contudo, os helmintos são demasiadamente grandes para a fagocitose e alguns possuem o tegumento espesso, o que os torna resistentes aos mecanismos microbicidas durante essa resposta imune inata (Cadman & Lawrence 2010; Allen & Maizels 2011). A capacidade fagocitária dos neutrófilos é estimulada por TLRs que reconhecem PAMPs presentes na superfície dos microrganismos, receptores para opsoninas, receptores para Fc de IgG e receptores para C3b. O chamado sistema de oxidase dos fagócitos é composto por múltiplas subunidades enzimáticas, muitas das quais presentes na membrana fagolisossomal de fagócitos ativados e sua função é reduzir o oxigênio molecular a ROs, que são bastante tóxicos para bactérias, mas pouco efetivos contra helmintos. Outra via de ação neutrofílica é mediada por grânulos secretados no meio extracelular, pelo processo de degranulação. Existem três classes de grânulos liberados por estas células: grânulos primários, também conhecidos como grânulos azurófilos, que contêm mieloperoxidase, defensinas, elastase neutrofílica, proteína de aumento da permeabilidade e as catepsinas G; grânulos secundários, que apresentam componentes 16 secretados especificamente por neutrófilos, sendo a lactoferrina o principal exemplo; grânulos terciários, contendo catepsinas e gelatinases (Mesquita-Júnior et al. 2010). No modelo experimental de filariose murina, o encapsulamento da filaria em nódulos inflamatórios é essencial para a morte das mesmas, e estes nódulos são ricos em PMNN. Neutrófilos, mas não macrófagos ou eosinófilos, controlam a formação destes nódulos e a eliminação do parasito, na dependêndia de interferon γ (IFNγ) (Saeftel et al. 2001). Basófilos também são células da imunidade inata que produzem altos níveis de IL4 e TSLP, e auxiliam na amplificação da resposta de células Th2 nas helmintoses humanas e em camundongos. Essas células expressam CD40L, bem como IL4 e IL13, e por isso podem induzir as células B para produção de IgE (Cadman & Lawrence 2010; Voehringer 2011). Imunocomplexos e IgE ativam basófilos e mastócitos, desencadeando a secreção de citocinas, quimiocinas, histamina, heparina, serotonina e proteases, o que resulta na contração do músculo liso, aumento da permeabilidade vascular e recrutamento de células inflamatórias. O recrutamento de mastócitos está relacionado à liberação de IL9 produzida por células Th2. Mastócitos, PMNE, PMNB são células da resposta imune inata responsáveis pela iniciação de uma resposta do tipo Th2, e que reforçam essa resposta ao longo da infecção (Paul & Zhu 2010). Macrófagos classicamente ativados (CAMs) surgem em resposta: ao IFNγ, que pode ser produzido durante uma resposta imune adaptativa por células Th1 ou células T citolíticas (Tc) CD8, ou durante uma resposta imune inata por células NK de origem tímica (NKTi) ou não (NK); e ao fator de necrose tumoral alfa (TNFα), que pode ser produzido por macrófagos (Mosser & Edwards 2008). Esses macrófagos estão associados com respostas nas infecções virais e bacterianas, e atuam na destruição de microrganismos por meio de vias que são dependentes de ROS, de espécies reativas nitrogênio (RNS), e da síntese de óxido nítrico (NO) (Mantovani et al. 2002). O NO derivado de CAMs é citotóxico para as larvas de metazoários (Ahmed et al. 1997).Estudos comprovam a importância de CAMs e produção de NO na resistência à Taenia crassiceps (Trujillo et al. 2007). Vários estudos demonstram a presença de AAM, pelo estímulo de IL4 ou IL13, que podem ser produzidas durante uma resposta imune adaptativa por células Th2, ou durante uma resposta imune inata por basófilos e mastócitos (Mosser & Edwards 2008). Após a ativação, estes macrófagos são recrutados para os sítios da infecção durante respostas Th2 a helmintos, e aumentam a expressão de arginase-1, receptor para manose 17 (CD206), receptor α para IL4 (IL4Rα), e são rapidamente recrutados para os sítios da infecção (Anthony et al. 2007; Hesse et al. 2001). Um dos melhores marcadores utilizados para identificar macrófagos é o F4/80 (Austyn & Gordon 1981) cuja expressão pode variar durante a ativação e maturação dessas células (Van den Berg & Kraal 2005). A imunidade adaptativa envolve componentes celulares e humorais, sendo que os linfócitos T e B são as principais células de defesa que mediam esta imunidade. Em contraste com o número reduzido de repertório dos receptores utilizados pelas células da imunidade inata, a imunidade adaptativa possui uma grande diversidade de receptores sendo estes bastante específicos. Após o encontro com o patógeno, linfócitos T e B sofrem expansão clonal e diferenciação, tentando armar uma resposta imune capaz de eliminar o patógeno invasor (Turvey et al. 2009). As infecções por helmintos intestinais em seres humanos e nos modelos experimentais induzem uma resposta forte e polarizada tipo Th2, mediada por IL3, IL4, IL5, IL9, IL10, IL13, IL21, IL25 e IL33, que levam a mecanismos efetores que incluem produção dos isótipos de anticorpos IgE, IgA, IgG1 e IgG4, ativação de mastócitos, basófilos, eosinófilos, diferenciação de AAMs, contração da musculatura lisa e produção de muco intestinal. As IL4 e IL13 são fatores críticos que mediam a imunidade protetora contra nematódeos gastrointestinais. Ambas citocinas são produzidas por células Th2, mas também por uma variedade de tipos de células da resposta inata (Trujillo et al. 2007; Jackson et al. 2008; Maizels et al. 2009; Allen & Maizels 2011). N. brasiliensis e Heligmosomoides polygyrus, são usados como modelos de infecções gastrointestinais por helmintos e caracterizam uma forte polarização de resposta Th2 (Finkelman et al. 1997). Essa resposta é atribuída à propensão dos helmintos de estimular linfócitos Th2, os quais secretam IL4, que permitem aos linfócitos B produzirem IgE, e a IL5 que, estimulam o desenvolvimento e a ativação de eosinófilos. Por ação direta sobre as células epiteliais (através de IL4, IL9 e IL13) e células musculares lisas (através de IL4 e IL13), as células Th2 induzem a produção de muco pelas células caliciformes (Paul & Zhu 2010; Allen & Maizels 2011). Linfócitos Th2 sintetizam IL4 e IL13, que estimulam AAMs. Esses macrófagos produzem moléculas como arginase-1, que contribuem diretamente para regulação e resistência à infecção, reparação de tecidos, pois geram prolina, que é essencial para a síntese de colágeno, e poliaminas para o crescimento celular. A arginase é uma potente 18 supressora da ativação de células T, devido à sua capacidade de esgotar a L-arginina local, que é essencial para a ativação de células T. A L-arginina também é metabolizada pela iNOS para a síntese de NO por CAMs. Assim, competindo com o substrato necessário para a produção de NO, a arginase-1 é uma molécula antiinflamatória (Maizels et al. 2009; Allen & Maizels 2011). As células Th foliculares (ThF) produzem IL4 e induzem células B a produzirem IgG1 e IgE (Figura 3). Durante a fase inicial da resposta imune para helmintos, basófilos expressam moléculas de MHC-classe II e entram nos órgãos linfóides auxiliando na polarização de uma resposta Th2. IgE pode então, ativar basófilos, que por sua vez produzem citocinas (IL4, IL5, IL13) que ativam macrófagos de forma alternativa (Maizels et al. 2009). O perfil humoral da imunidade do tipo Th2 é baseado na elevação dos níveis de anticorpos dos isótipos de IgG1, IgG4 e IgE (em humanos). Embora dependentes de citocinas de células das respostas inata e adaptativa, células da imunidade inata não podem substituir o papel essencial de células T mediada pelo CD40 ligante (CD40L) na co-estimulação das células B. (Cadman & Lawrence 2010; Allen & Maizels 2011). IgE, comumente encontrada em helmintoses, não desempenha um papel essencial na imunidade protetora durante infecções por H. polygyrus, N. brasiliensis, e Shistossoma mansoni, em camundongos, visto que as células B e os anticorpos secretados por plasmócitos não interferem na expulsão eficaz de N. brasiliensis (Maizels et al. 2009). Por outro lado, a ausência de células B está correlacionada com aumento da carga parasitária nas infecções secundárias por S. mansoni, Litomosoides sigmodontis, Trichuris muris e H. polygyrus (Harris & Gause 2011). As proteínas de membrana caracterizam os precursores e os estágios de diferenciação de células B. CD19 é um co-receptor que amplifica a cascata de sinalização em células B, estando presente na superfície de praticamente todos os linfócitos B, incluindo células pré-B, células B maduras, plasmócitos e células B de memória (Bm) (Tedder et al. 1995; Mesquita-Junior et al. 2010). A resposta imune humoral ao envolver células B1, promove uma resposta imune inata; enquanto que, células B da zona marginal do baço (MZB), que são células B2 foliculares, estão relacionadas com uma resposta imune adaptativa. As células B possuem uma variedade de funções imunes, incluindo a produção de anticorpos, apresentação de antígenos, e produção de citocinas. Em camundongos células Th1 e 19 IFNγ medeiam a produção de IgG2a, células Th2 e IL4 de IgE,e IgG1, e células Treg e TGFβ de IgA (Schimidt-Weber et al. 2007). Em modelos de inflamação crônica parasitária, como a esquistossomose crônica e filariose, células B produtoras de IL10 parecem associadas com a patologia reduzida e modulação de respostas das células T (Smits et al. 2010). A infecção por S. mansoni promove a expansão de células B1 peritoneais e células B esplênicas, onde oligossacarídeos derivados do ovo do parasito promovem a proliferação de células B e produção de IL10 (King & Mohrs 2009). Infecções por helmintos são reconhecidamente de natureza crônica, com algumas espécies de parasitos sobrevivendo no seu hospedeiro por muitos anos, ou mesmo décadas. Para facilitar esta sobrevivência a longo prazo, estes organismos desenvolveram estratégias de sobrevivência sofisticadas, incluindo a capacidade de modelar e manipular o sistema imunológico (Helmby 2009). Essas infecções parasitárias em humanos estão associadas com uma forte resposta imunomodulatória (Loukas & Prociv 2001). Os helmintos podem interagir com o sistema imune do hospedeiro levando á imunossupressão da imunidade inata e adquirida, com a indução de linfócitos Tregs (CD4+ CD25+FOXP3), linfócitos B regulatórios (Bregs) e citocinas anti-inflamatórias como IL10, TGFβ, ou outro tipo de célula T, incluindo células T CD8 com atividade supressora independente de citocinas (Riet et al. 2007; Jackson et al. 2008). Em pacientes com filariose, o agravamento da patologia está associado com deficiência de células Tregs (Allen & Maizels 2011). Durante infecção experimental foi demonstrado que o parasita H. polygyrus induziu a diferenciação de células Th0 em linfócitos Tregs ao secretar um produto que se liga aos receptores de TGFβ do hospedeiro (Maizels et al. 2009). Apesar da participação de células com fenótipo Th2 ser evidente em infecções por helmintos intestinais, outras populações de células T CD4 podem expandir durante essas infecções, e a população de células Th2 podem diminuir ao longo do tempo, refletindo respostas mistas e constantes competições entre as distintas subpopulações de linfócitos Th (Allen & Maizels 2011). Desde a criação do paradigma de Th1-Th2, na década de 1980, muitos tipos de células Th especializados, incluindo Th1, Th2, Th17, Th9, ThF, e Treg, já foram identificados. Evidências recentes sugerem que sob certas condições, as células Th CD4 possuem plasticidade, e podem se converter em outros tipos de células efetoras. Uma ampla variedade de respostas induzidas por parasitas 20 apresentam um padrão de produção de citocinas, derivadas desses subtipos de linfócitos Th (Wan 2010). Um perfil de linfócitos Th9 foi descrito em murinos com células produtoras de grandes quantidades de IL9, citocina importante nas respostas contra parasitas intestinais. Foi demonstrado também que elas são o resultado da polarização de linfócitos Th2 estimulados na presença de TGFβ e IL4, e que não apresentam nenhum dos fatores de transcrição característicos das vias Th1, Th2, Th17 ou Treg. Dependendo do ambiente de citocinas, essas células também podem ser originadas de células Th0. Estudos comprovam a participação de células Th9 na resistência à infecção experimental por Trichuris sp (Veldhoen et al. 2008). Durante a esquistossomose mansônica murina foi descrito o papel de Th17 e TGFβ na resistência ao parasita (Tallima et al. 2009). Outros estudos descrevem células Th17 com participação no agravamento da patologia na esquistossomose em camundongos (Rutitzky & Stadecker 2006). Estudos mais elaborados da resposta imune em modelos murinos revelaram que as respostas Th1 são induzidas em vários estágios da infecção com nematóides intestinais, e a indução seqüencial de Th1 seguida de respostas Th2 também é um fato bem estabelecido durante a esquistossomose (Helmby 2009). Respostas Th2 durante a esquistossomose experimental podem agravar a hepatoesplenomegalia (Maizels et al. 2009). As infecções granulomatosas crônicas estão associados com respostas inflamatórias do tipo Th1 que se desenvolvem em volta de um microorganismo ou parasita invasor. Na esquistossomose experimental, o granuloma no início da infecção é do tipo Th1. Essa resposta Th1 é caracterizada pelo aumento dos níveis de citocinas pro-inflamatórias, tais como TNFα, IL1, IL6 e IFNγ. Entretanto, ocorre a transição para uma resposta do tipo Th2 logo após a postura dos ovos, sendo as moléculas coestimulatórias e células B necessárias para esta mudança. A resposta imune desenvolvida difere conforme a fase de desenvolvimento do parasito. A falha no desenvolvimento de uma resposta Th2 em função do desenvolvimento de uma resposta imune com perfil Th1 ou Th17 pode levar a morte do hospedeiro. No entanto, a fibrose tecidual, que é em grande parte estimulada pela IL13, também pode se tornar patológica e, portanto, representa uma desvantagem potencial da resposta do tipo Th2 durante a esquistossomose crônica (Anthony et al. 2007). Respostas Th1 em infecções por S. mansoni e Fascíola hepática, com a participação de NO, determinam a eliminação dos parasitas durante as infecções 21 experimentais (Moreau & Chauvin 2010). Mecanismos efetores da resposta Th1 podem estar implicados na resistência, sendo importantes principalmente na destruição das larvas que estão migrando nos tecidos do hospedeiro (Jackson et al. 2008). A resposta Th1 também pode contribuir na expulsão de algumas espécies de helmintos adultos viáveis por meio da produção de IFNγ, que está relacionada com na geração de CAMs com produção de ROS e RNS que destroem o parasita (Finkelman et al. 1997). A produção aumentada de IFNγ é importante para ativar a produção de NO e pode contribuir para a eliminação de cisticercos de T. crassiceps (Trujillo et al. 2007). Classicamente, as respostas do tipo Th2/Treg associadas com componentes celulares e humorais, estão relacionadas com a proteção durante as helmintoses. No entanto, vários relatos sugerem que esta afirmação não é sempre verdadeira, principalmente quando os parasitas estão localizados nos tecidos extra-intestinais (Trujillo et al. 2007). Muitos helmintos migram através dos tecidos epiteliais, tecido muscular, nos pulmões, e cérebro, onde poucos mecanismos de proteção dependem de uma resposta tipo Th2 (Mulcahy et al. 2005). A presença de células TCD8+ durante a esquistossomose experimental parece relacionada com a redução do tamanho dos granulomas. Foi demonstrado in vivo que a imunização de camundongos com antígeno do ovo de schistosoma (SEA) é capaz de estimular a resposta de células TCD8+ esplênicas produtoras de IFNγ e IL2, sugerindo uma resposta do tipo 1 (Tc1) ao SEA (Pedras-Vasconcelos et al. 1996; Pancrι et al. 1999). Muitas outras interações potenciais entre imunidade por Th, subpopulações de células T não CD4 + e células CD19+ ainda têm de ser devidamente exploradas durante as infecções por helmintos. A expansão de células TCD8+, populações de células NKT e componentes humorais já foram descritas durantes essas infecções (Mallevaey et al. 2006; Allen & Maizels 2011). A importância relativa de cada tipo de célula do hospedeiro depende tanto do tecido em questão como do perfil de susceptibilidade do hospedeiro às infecções (Allen & Maizels 2011). É evidente que muitos estudos, são conduzidos com base em uma resposta simplista da resposta imunológica aos helmintos, que tendem a ser geralmente agrupadas em uma resposta Th2 /Treg, não levando em consideração características como: as diferentes espécies, nichos biológicos dentro do hospedeiro, e os distintos estágios da infecção (Helmby 2009). 22 Animais BALB.xid, deficientes em células B1 que conhecidamente secretam IL10, produzem preferencialmente IFNg. Durante a infecção experimental por L. minor, foi observado que na ausência de células B1 e baixa produção de anticorpos, camundongos BALB.xid infectados apresentam baixo nível sérico de IL10 quando comparados ao camundongos BALB/c infectados, e maior nível sérico de IFNg quando comparado aos camundongos BALB/c infectados. Essa alta produção de IFNg em camundongos BALB.xid infectados poderia estar atuando no controle do número de larvas L3 e no desenvolvimento de lesões pulmonares durante evolução da lagochilascariose experimental (Prudente et al. 2009b). Essa diferença de susceptibilidade à infecção por L. minor entre as linhagens BALB/c e BALB.xid pode ser decorrente dos perfis diferentes de citocinas e de anticorpos, visto que ambas as linhagens apresentam o mesmo background genético e MHC (H-2d), diferindo apenas em uma mutação no gene Btk (Prudente et al. 2009a). Em estudo anterior do nosso grupo, ao avaliar a resposta imune de camundongos A/J e B10.A imunizados com EBL3 de L. minor, Spadafora-Ferreira et al. (2010) demonstraram que linfócitos esplênicos de camundongos A/J imunizados e posteriormente estimulados com antígenos do extrato bruto (EB) do parasito ou concanavalina A (ConA) apresentaram uma melhor resposta proliferativa e aumento significativo na produção de IL10 e IFNγ, quando comparados aos camundongos B10.A. A produção de IL10 e IFNγ em camundongos A/J na lagochilascariose experimental poderia controlar as lesões de tecidos e o número de parasitas, limitando o dano tecidual causado por uma resposta imune antiparasitária exacerbada. Em outro estudo do nosso grupo, por Freitas et al. (2008) demonstraram uma reação inflamatória no fígado e baço de camundongos BALB/c e C57BL/ 6 infectados por L. minor, indicando que o helminto e seus antígenos secretados e excretados (SE) induzem uma resposta forte e constante, que é mais acentuada em camundongos C57BL/6. Nos pulmões de camundongos C57BL/6 infectados (45-210 DAI), foram observadas lesões granulomatosas com muitos neutrófilos. Este infiltrado inflamatório pode sugerir a participação de IL17 durante a lagochilascariose experimental, tal como foi demonstrado em camundongos com esquistossomose (Rutitzky et al. 2005). Nesse mesmo estudo, a análise de citocinas séricas nas linhagens (BALB/c e C57BL/6) aos 90 DAI, (período com maior número de larvas L3 recuperadas), demonstrou o aumento das taxas de IL10, porém pequeno, nos animais infectados em 23 relação aos respectivos controles, e isso pode refletir um mecanismo de controle das lesões inflamatórias, mediado por células Th2 ou Treg. Camundongos BALB/c (resistentes à infecção por L. minor) apresentaram maior nível sérico de IFNγ. Assim, células Th1 (e outras) ao produzirem IFNγ durante a infecção poderiam estar atuando na evolução da lagochilascariose, controlando o número de larvas L3 e permitindo uma maior taxa de sobrevivência destes animais (Freitas et al. 2008). Durante a lagochilascariose experimental verificou-se que camundongos C57BL/6 (linhagem susceptível) produziram IgM, IgA e IgG contra o EB de L. minor. IgM foi detectada durante todo o período de estudo (15-210 DAI). IgA também foi detectada no início da infecção, mas com redução após 90 DAI; e IgG foi detectada somente depois de 60 DAI, possivelmente em decorrência do tempo necessário para a ativação de linfócitos T e geração de células T de memória e células plasmáticas de longa vida. Vale lembrar que células B1 que interagem com antígenos que apresentam epítopos repetidos, em geral produzem grande quantidade de IgM, IgA e IgG3 (Prudente et al. 2009c). Prudente et al. (2009c) também avaliaram a resposta de anticorpos contra os antígenos SE do parasita na linhagem C57BL/6. Foi demonstrada uma baixa produção de anticorpos, visto que IgA e IgM tornaram-se positivas por curto período da infecção, e IgG foi detectada somente aos 45 DAI. Assim, a linhagem C57BL/6 parece responder melhor aos antígenos do EB do que aos produtos SE de L. minor (Prudente et al. 2009c). As imunoglobulinas (IgG, IgM e IgA) produzidas contra os antígenos EB e SE de L. minor nas linhagens A/J e B10.A foram analisadas por Prudente et al. 2011. Foi demonstrado que camundongos A/J infectados produzem altos níveis dessas imunoglobulinas contra os antígenos do parasita, quando comparados a quantidade produzida por camundongos B10.A infectados, refletindo um mecanismo de resistência durante a lagochilascariose experimental. Camundongos BALB.xid apresentam deficiência de linfócitos B1 e, em menor proporção de células B2. As células B1 constituem uma pequena fração da população de células B no baço e não são detectados nos LN de camundongos. No entanto, representam a principal população de células B das cavidades peritoneal e pleural destes animais (Freitas et al. 2009; Prudente et al. 2009a). Ficou demonstrado que camundongos BALB/c produziram IgM, IgG, IgA e IgE contra o EB e antígenos SE do parasito; mas camundongos BALB.xid não produziram IgM, produziram baixos níveis 24 de IgG e IgA, e quantidades semelhantes de IgE. Os anticorpos IgA e IgE foram os primeiros a tornar-se positivos (30-45 DAI) e permaneceram positivos durante o período de estudo (210 DAI), indicando a importância da IgA e IgE para a detecção de infecção recente em camundongos; mas não funcionaram como marcador de susceptibilidade ou resistência à infecção experimental (Freitas et al. 2009). Na lagochilascariose experimental as linhagens BALB/c e BALB.xid produzem quantidades semelhantes de IgE (Freitas et al. 2009) e a linhagem B10.A, linhagem mais susceptível, produz quantidades maiores de IgE contra os produtos SE de L. minor que camundongos A/J (Prudente et al. 2011). Diante disso, os níveis de IgE não demonstram ter papel na susceptibilidade ou resistência à infecção experimental. As diferenças geneticamente determinadas entre indivíduos de uma população afetam diretamente a eficácia da resposta imune e, portanto, o fenótipo de susceptibilidade do hospedeiro (Spadafora-Ferreira et al. 2010). A diferença na susceptibilidade de diferentes linhagens de camundongos à infecção por L. minor pode ser influenciada pela resposta imune individual ao parasito (Prudente et al. 2009b). 25 JUSTIFICATIVA Pouco se sabe a respeito da biologia e do mecanismo da infecção pelo helminto L. minor e o modelo experimental em camundongos tem sido utilizado no estudo do ciclo evolutivo do parasita e da patogenia da infecção. A interação parasita-hospedeiro, desde a manipulação da resposta imune do hospedeiro por antígenos dos helmintos com indução de distintas células F4/80+, CD4+, CD8+, CD19+ e outras células da imunidade inata e adaptativa apresentando diferentes marcadores e funcionalidades podem ser determinantes na susceptibilidade ou resistência de um hospedeiro durante uma infecção. Com o intuito de elucidar alguns dos mecanismos envolvidos na patogênese da lagochilascariose, ainda tão pouco estudados, e compreender melhor os mecanismos imunopatológicos de resistência ou susceptibilidade à infecção por L. minor, o presente estudo teve como meta principal avaliar as populações celulares do baço de camundongos BALB/c (resistentes) e C57BL/6 (susceptíveis) durante a lagochilascariose experimental. Os trabalhos do grupo da Profa. Mara Carvalhaes são os primeiros a avaliar a resposta imune nesta helmintose. 26 OBJETIVOS 1 – Objetivo Geral Avaliar as populações de células esplênicas em camundongos susceptíveis e resistentes à lagochilascariose experimental. 2 – Objetivos Específicos a) Avaliar o perfil imunofenotípico (IFT) por imunoistoquímica (IIQ) das células F4/80+ esplênicas de camundongos BALB/c e C57BL/6 infectados e controles, dos 35 aos 250 dias após infecção (DAI); b) Avaliar o perfil IFT por IIQ das células CD4+ esplênicas de camundongos BALB/c e C57BL/6 infectados e controles, dos 35 aos 250 dias após infecção (DAI); c) Avaliar o perfil IFT por IIQ das células CD8+ esplênicas de camundongos BALB/c e C57BL/6 infectados e controles, dos 35 aos 250 dias após infecção (DAI); d) Avaliar o perfil IFT por IIQ das células CD19+ esplênicas de camundongos BALB/c e C57BL/6 infectados e controles, dos 35 aos 250 dias após infecção (DAI). 27 MATERIAIS E MÉTODOS 1 – Animais e Infecção Os procedimentos deste projeto foram avaliados e aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Instituto Butantan de São Paulo (Anexo 1). Para manutenção do ciclo de L. minor, camundongos C57BL/6 foram utilizados como hospedeiros intermediários, e gatos domésticos (Felis domesticus) como hospedeiros definitivos experimentais. A manutenção do ciclo de L. minor nos camundongos e gatos foi realizada no biotério do IPTSP, pelos bolsistas do Laboratório de Imunoquímica-IPTSP/UFG (Lucas Rangel, Mariana Felix de Souza Prudente, Thayssa Dourado). A infecção dos animais e coleta do material para imunoistoquímica (IHQ) foram realizadas no Instituto Butantan de São Paulo, pelas alunas Mariana F.S. Prudente e Lara Priscila Guirão, sob orientação da pesquisadora Profa. Dra. Mônica Spadafora-Ferreira. 1.1 – Obtenção de ovos de L. minor Felinos foram individualmente alimentados com carcaças de camundongos C57BL/6 infectados, contendo 50 a 100 nódulos encistados no tecido subcutâneo com larvas L3 de L. minor. Os ovos do parasita foram colhidos das fezes dos felinos após 30 dias de inoculação e submetidos ao método de Hoffman e Faust (Oliveira et al. 2002). Estes ovos foram mantidos em tubo de polipropileno contendo solução de formalina a 1%, por 40 dias à temperatura de 25°C. Em seguida, os tubos foram centrifugados 3 vezes em salina tamponada com fosfatos (PBS), retirando-se 3 alíquotas de 1µl para serem examinadas entre lâmina e lamínula com auxilio de microscópio óptico comum (aumento de 100X). A concentração de ovos por ml foi calculada sobre o resultado da média aritmética das contagens. Os ovos foram mantidos em formalina 1%, sendo lavados e ressuspendidos em PBS para a inoculação. Os ovos foram obtidos pelos alunos: Lucas Rangel, Mariana F.S. Prudente, Thayssa Dourado. 1.2 – Infecção experimental Para análise imunoistoquímica, foram utilizados camundongos isogênicos, machos, das linhagens BALB/c (n=50) e C57BL/6 (n=50), obtidos do Biotério Central do Instituto Butantan. Os camundongos foram inoculados por gavagem com 1000 ± 200 ovos infectantes do parasito por animal. Grupos de 5 animais foram eutanasiados em 28 câmara de CO2, em diferentes períodos pós-infecção (35, 100, 150 e 250). Igual número de camundongos não infectados (inoculados com PBS por via oral) foram eutanasiados no mesmo período, servindo como controles. Realizou-se evisceração e coleta do baço desses animais, destinados ao congelamento para reação imunoistoquímica. Estes animais foram inoculados, eutanasiados e seus materiais processados no Biotério do Laboratório de Imunoquímica, no Instituto Butantan de São Paulo, em estante ventilada, com caixa, maravalha, água, bebedouro e ração autoclavadas. 2 – Imunoistoquímica (IIQ) As reações de IIQs foram padronizadas e efetuadas pela equipe da Dra. Mônica Spadafora-Ferreira do Laboratório de Imunoquímica, Instituto Butantan - São Paulo com a colaboração da Profa. Dra Mara Carvalhaes, e analisadas no Laboratório de Imunoquímica-IPTSP-UFG, com a colaboração do Prof. Dr. Ruy Lino Júnior do Laboratório de Patologia Experimental-IPTSP-UFG. Para avaliar o perfil imunofenotípico (IFT) por IIQ de células esplênicas, fragmentos de baço dos diferentes períodos (35, 100, 150 e 250 dias) após a infecção, foram embebidos em meio de inclusão para congelamento de tecidos (OCT, Aotec), imersos em isopentano gelado (Vetec, Brasile) e imediatamente congelados em nitrogênio líquido e posteriormente, armazenados em freezer -80oC. Os fragmentos foram cortados em criostato e fixados em acetona gelada por 10 minutos, sendo mantidos congelados a -80 oC. Antes de fazer a incubação com os diferentes anticorpos, cada lâmina seguiu dois bloqueios de 15 min. O bloqueio da peroxidase endógena foi feito por tratamento com H2O2 (30 Volumes) a 1/1000 em metanol. Após lavagem com PBS seguiu-se o bloqueio dos sítios livres com soro normal de cabra. Em seguida, sem lavar as lâminas, retirou-se o excesso de soro e foram adicionados os anticorpos diluídos. Estas reações foram efetuadas no Instituto Butantan pelas alunas Lara Guirão e Mariana F.S. Prudente. Foram utilizados os seguintes anticorpos de rato para camundongos: anti-F4/80 (clone, A3-1, Serotec, EUA), anti-CD19 (clone 1D3, BD Biosciences), anti-CD4 (clone H129.19, BD Biosciences), e anti-CD8 (clone 53-6.7, BD Biosciences), não marcados. Os anticorpos foram diluídos em PBS contendo 2% de soro fetal bovino (SFB), conforme titulação prévia. Após incubação por 18h (overnight) a 4ºC em câmara úmida, as lâminas foram lavadas com PBS e posteriormente incubadas com anticorpo secundário anti-IgG de rato biotinilado (BD Biosciences). A seguir, foi adicionado o 29 complexo ABC-peroxidase (Dako, Dinamarca) por 30 min à t.a. As lâminas foram reveladas com diaminobenzidina-H2O2 (DAB-BD Biosciences) como cromógeno precipitante e substrato, e contracoradas com hematoxilina de Mayer (Merck, Alemanha) (Figura 4). Figura 4. Esquema ilustrativo de imunoistoquímica, adaptado de: LAPAC 2011. 3 – Quantificação dos subtipos celulares Em cada ponto da infecção (35, 100, 150 e 250 DAI), foram coletados baços de cinco camundongos e para cada camundongo fez-se uma lâmina de IIQ (feito pelas alunas Lara Guirão e Mariana F.S. Prudente). Para cada lâmina foram fotografados 30 campos na objetiva de 40X. As imagens dos campos para quantificação foram capturadas por meio de uma câmera (Cyber shot DSC-S85) acoplada ao microscópio e ao computador para digitalização. As fotografias foram efetuadas pela Profa. Mara Carvalhaes e pelas alunas Thayssa Dourado e Leticia de Almeida Leandro. A análise e quantificação das células foram realizadas no sistema analisador de imagens Image J (NIH/EUA). Foram quantificadas as células marcadas positivamente, nas 30 intersecções da grade em cada um dos 30 campos analisados, e calculada a média acumulada (Teixeira et al. 2005) (Figura 5). Os resultados foram expressos em mediana e desvio médio do número de células marcadas por campo. Foi também determinado o índice de células (IC) marcadas por campo, dividindo-se a média aritmética do número de células marcadas presentes nos animais infectados (Мcel+Inf), pela média aritmética do número de células marcadas encontradas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes DAI [IC = (Мcel+Inf) / (Мcel+Cont)]. 30 Figura 5. Fotografia de um campo de imunoistoquímica representando a quantificação celular nas 30 intersecções da grade. As setas indicam células esplênicas marcadas nas intersecções (aumento de 400X). No presente trabalho foram selecionados campos de imunoistoquímica representativos dos valores da mediana obtidos na quantificação celular. Esses campos foram classificados de acordo com a quantidade de células marcadas para cada anticorpo (anti-F4/80, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD19). Os campos com células esplênicas F4/80+ foram classificados em quantidade discreta, menos que 4 células; moderada, entre 4-6 células e acentuada, mais que 6 células. Os campos com células esplênicas CD4+ foram classificados em quantidade discreta, menos que 3 células; moderada, entre 3-5 células e acentuada, mais que 5 células. Os campos com células esplênicas CD8+ foram classificados em quantidade discreta, menos que 3 células; moderada, entre 3-5 células e acentuada, mais que 5 células. Os campos com células esplênicas CD19+ foram classificados em quantidade discreta, menos que 6 células; moderada, entre 6-7 células e acentuada, mais que 7 células (Tabela 1). 31 Tabela 1. Classificação dos campos de imunoistoquímica para os marcadores F4/80, CD4, CD8, CD19 de acordo com a quantidade de células marcadas. Marcador Quantidade Quantidade Quantidade discreta moderada acentuada F4/80 < 4 células marcadas 4-6 células marcadas > 6 células marcadas CD4 < 3 células marcadas 3-5 células marcadas > 5 células marcadas CD8 < 3 células marcadas 3-5 células marcadas > 5 células marcadas CD19 < 6 células marcadas 6-7 células marcadas > 7 células marcadas 4– Análise Estatística A análise estatística das contagens de IIQ foi realizada por meio do programa Prisma 4.0. Todas as variáveis foram testadas quanto à distribuição normal e variância homogênea. Para análise de uma variável utilizou-se a mediana e desvio médio seguido de teste Mann Whitney (não paramétrico). Para mais de uma variável: ANOVA seguido de teste Tukey. As diferenças observadas foram consideradas significantes quando p < 0,05. 32 RESULTADOS A disponibilidade de linhagens isogênicas de camundongos com diferentes background genéticos tem contribuído para o estudo da relação parasita-hospedeiro que é crucial no entendimento da resposta imune aos diversos parasitos. Com o intuito de caracterizar as populações celulares no baço de camundongos BALB/c e C57BL/6 controles e experimentalmente infectados com L. minor, foi realizada a análise IIQ da presença de células positivas para os marcadores F4/80 (marcador de macrófagos), CD19 (marcador de linfócitos B), CD4 (marcador de linfócitos T auxiliares), CD8 (marcador de linfócitos T citolíticos). 1 – Análise imunoistoquímica do baço de camundongos infectados com L. minor A marcação das células esplênicas nos camundongos BALB/c e C57BL/6 com os anticorpos de rato anti-F4/80+, CD4+, CD8+ e CD19, seguida de incubação com conjugado anti-rato e mistura substrato-cromógeno, mostrou-se positiva e específica, quando comparada ao controle negativo (CN) efetuado sem adição de anticorpos contra os marcadores. Notar a localização predominante destas células na região da polpa vermelha para o marcador F4/80 e região folicular da polpa branca do baço para os outros marcadores (Figura 6). Figura 6. Imunoistoquímica do baço de camundongos BALB/c infectados, sem anticorpo de marcação (CN, controle negativo) e com os anticorpos anti-marcadores celulares F4/80, CD4, CD8 e CD19. As setas apontam para marcação celular localizada na polpa vermelha para o marcador F4/80 e na região folicular da polpa branca do baço para os marcadores CD4, CD8 e CD19; aumento de 100X. 33 1.1 – Análise quantitativa das células esplênicas F4/80+ Nos animais da linhagem BALB/c não foi observada variação significativa na quantidade de células esplênicas F4/80+. Nos camundongos da linhagem C57BL/6, aos 100 dias após a infecção, as células F4/80+ nos animais infectados apresentaram número reduzido de células marcadas por campo em relação aos controles (Controles: 7,0+1,8; Infectados: 4,0+2,0; p< 0,05) e aos 250 dias apresentaram número aumentado em relação aos controles (Controles: 6,0+1,7; Infectados: 9,0+1,8; p< 0,05). A cinética desta população celular foi parecida nas duas linhagens de camundongos infectados, com queda aos 100 dias de infecção, e posterior aumento, dependente do tempo, que foi mais acentuado nos animais C57BL/6 infectados. Considerando o índice de células esplênicas F4/80+, a linhagem BALB/c apresentou aumento somente aos 100 DAI (IC = 1,2), enquanto nos animais C57BL/6 houve aumento do índice de células F4/80+ aos 250 DAI (IC = 1,3) (Figura 7). Na figura 8 são visualizados campos de imunoistoquímica de baços marcados com o anticorpo anti-F4/80, representativo da quantificação celular aos 100 DAI. Camundongos BALB/c não infectados apresentaram quantidade discreta de células marcadas (Figura 8A) e camundongos BALB/c infectados apresentaram quantidade moderada dessas células (Figura 8B). Para os animais controles da linhagem C57BL/6 foi observada intensa presença de células F4/80+ (Figura 8C) e nos animais C57BL/6 infectados por L. minor foi moderada a presença das mesmas (Figura 8D). 34 F4/80-BALB/c F4/80-C57BL/6 Controle Controle Infectado 17.5 15.0 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 35 100 150 250 Infectado 20.0 Número de células/campo Número de células/campo 20.0 17.5 15.0 12.5 * 10.0 * 7.5 5.0 2.5 0.0 35 Dias após infecção IC 0,9 1,2 0,9 100 150 250 Dias após infecção 1,0 IC 1, 0 0,9 1,0 1,3 Figura 7. Determinação por imunoistoquímica de células F4/80+ no baço dos camundongos BALB/c e C57BL/6 não infectados (controles- linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectados- negrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células F4/80+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção. Figura 8. Imunoistoquímica com presença de células esplênicas F4/80+. Camundongo BALB/c não infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (A); camundongo BALB/c aos 100 dias após a infecção com quantidade moderada de células F4/80+ (B); camundongo C57BL/6 não infectado (controle) com quantidade acentuada de células marcadas (C); camundongo C57BL/6 aos 100 dias de infecção com quantidade moderada de células F4/80+ (D); aumento de 400X. 35 1.2 – Análise quantitativa das células esplênicas CD4+ As células esplênicas CD4+ durante o período de 100 DAI, apresentaram-se aumentadas nos camundongos BALB/c infectados em relação aos animais controles (Controles: 2,0+1,5; Infectados: 3,0+1,9; p< 0,05). Na linhagem C57BL/6, foi observado aumento aos 150 DAI nos animais infectados em relação aos seus controles (Controles: 4,0+0,8; Infectados: 5,0+1,4; p< 0,05). Nos animais da linhagem BALB/c infectada a cinética de células CD4+ foi crescente em relação ao tempo; entretanto, os camundongos da linhagem C57BL/6 infectada apresentaram cinética oscilante dessas células. O índice de células CD4+ no baço demonstrou que os camundongos da linhagem C57BL/6 apresentaram aumento aos 150 DAI (IC = 1,4); enquanto nos animais BALB/c houve aumento do índice dessas células marcadas aos 100 (IC = 1,2) e 250 DAI (IC = 1,3) (Figura 9). Na figura 10 observam-se os campos de imunoistoquímica com células CD4+ referente aos 100 DAI. Nos tecidos esplênicos de camundongos controles da linhagem BALB/c visualizou-se quantidade discreta de células marcadas, já os animais infectados apresentaram quantidade moderada de células CD4+ (Figura 10A, 10B). Nos camundongos da linhagem C57BL/6 observou-se quantidade moderada de células CD4+ nos baços de camundongos não infectados e camundongos infectados (Figura 10C, 10D). 36 CD4-C57BL/6 CD4-BALB/c Controle Controle Número de células/campo Infectado 17.5 15.0 12.5 10.0 * 7.5 5.0 2.5 0.0 35 100 150 Número de células/campo 20.0 20.0 Infectado 17.5 15.0 12.5 10.0 * 7.5 5.0 2.5 0.0 35 250 Dias após infecção IC 0,9 1,2 0,9 100 150 250 Dias após infecção 1,3 IC 1,0 1,0 1,4 1,0 Figura 9. Determinação por imunoistoquímica de células CD4+ no baço dos camundongos BALB/c e C57BL/6 não infectados (controles- linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectados- negrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células CD4+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção. Figura 10. Imunoistoquímica com presença de células esplênicas CD4+. Camundongo BALB/c não infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (A); camundongo BALB/c aos 100 dias após a infecção com quantidade moderada de células CD4+ (B); camundongo C57BL/6 não infectado (controle) com quantidade moderada de células marcadas (C); camundongo C57BL/6 aos 100 dias de infecção com quantidade moderada de células CD4+ (D); aumento de 400X. 37 1.3 – Análise quantitativa das células esplênicas CD8+ A quantificação das células CD8+ no baço de camundongos BALB/c infectados apresentou, somente aos 100 DAI, valores acima dos controles (Controles: 0,0+1,0; Infectados: 1,0+1,2; p< 0,05). Nos camundongos C57BL/6 as células CD8+ apresentaram-se aumentadas em relação aos controles, aos 35 (Controles: 2,0+1,0; Infectados: 3,0+1,2; p< 0,05) e 150 DAI (Controles: 4,0+1,1; Infectados: 5,0+2,3; p< 0,05). Camundongos BALB/c e C57BL/6 infetados apresentaram cinética semelhante da quantidade de células esplênicas CD8+; no entanto, camundongos da linhagem C57BL/6 mostraram maior quantidade de linfócitos TCD8+ esplênicos dos 35 aos 150 dias de infecção, quando comparado aos BALB/c. Considerando o índice de células CD8+ no baço, os camundongos da linhagem BALB/c apresentaram aumento do índice de células marcadas aos 35 (IC = 1,1) e 100 DAI (IC = 1,3), enquanto nos animais C57BL/6 houve aumento índice dessas células aos 35 (IC = 1,2), 150 (IC = 1,5) e 250 dias (IC = 1,1) pós-infecção (Figura 11). Os campos de imunoistoquímica na figura 12 mostram células CD8+ referente aos 35 DAI. Nos camundongos não infectados e infectados da linhagem BALB/c, foi visualizado quantidade discreta de células CD8+ esplênicas (Figura 12A, 12B). Nos tecidos esplênicos de camundongos controles da linhagem C57BL/6 visualizou-se quantidade discreta de células marcadas, já os animais infectados apresentaram quantidade moderada de células CD8+ (Figura 12C, 12D). 38 CD8-BALB/c CD8-C57BL/6 Número de células/campo 20.0 Infectado 17.5 15.0 12.5 10.0 7.5 * 5.0 2.5 0.0 35 100 150 Número de células/campo Controle 20.0 Controle 17.5 Infectado 15.0 12.5 10.0 * 7.5 5.0 * 2.5 0.0 35 250 IC 1,1 1,3 1,0 100 150 250 Dias após infecção Dias após infecção 0,9 IC 1,2 0,9 1,5 1,1 Figura 11. Determinação por imunoistoquímica de células CD8+ no baço dos camundongos BALB/c e C57BL/6 não infectados (controles- linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectados- negrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células CD8+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção. Figura 12. Imunoistoquímica com presença de células esplênicas CD8+. Camundongo BALB/c não infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (A); camundongo BALB/c aos 35 dias após a infecção com quantidade discreta de células CD8+ (B); camundongo C57BL/6 não infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (C); camundongo C57BL/6 aos 35 dias de infecção com quantidade moderada de células CD8+ (D); aumento de 400X. 39 1.4 – Análise quantitativa das células esplênicas CD19+ O número de células CD19+ no baço de camundongos BALB/c infectados estava aumentado aos 100 (Infectados: 4,0+2,4; Controles: 5,0+1,8; p< 0,05), 150 (Controles: 5,0+1,5; Infectados: 7,0+2,0; p< 0,05) e 250 DAI (Controles: 4,0+1,9; Infectados: 6,0+2,0; p< 0,05) em relação aos animais controles. Aos 250 DAI na linhagem C57BL/6, o número das células CD19+ estava aumentado em relação aos controles (Controles: 5,0+1,0; Infectados: 9,0+1,8; p< 0,05). A cinética do número de células CD19+ nas duas linhagens de camundongos infetados foi diferente, pois nos animais BALB/c observamos aumento gradativo desta população celular até os 150 DAI e posterior queda, e na linhagem C57BL/6 uma cinética oscilante nos diferentes dias de infecção. Verificou-se aumento do índice de células CD19+ aos 100 (IC = 1,2), 150 (IC = 1,3) e 250 DAI (IC = 1,6) nos camundongos BALB/c e aos 150 (IC = 1,1) e 250 DAI (IC = 1,1) nos camundongos da linhagem C57BL/6 (Figura 13). Na figura 14 são apresentados campos de imunoistoquímica de baço com células CD19+ aos 150 DAI. Camundongos BALB/c não infectados apresentaram quantidade discreta de células marcadas (Figura 14A) e camundongo BALB/c infectados apresentaram quantidade moderada dessas células (Figura 14B). Observou-se quantidade acentuada de células CD19+ esplênicas nos camundongos não infectados e infectados da linhagem C57BL/6 (Figura 14C, 14D). 40 CD19- C57BL/6 CD19- BALB/c Infectado 17.5 15.0 12.5 * 10.0 * 7.5 * 5.0 2.5 0.0 35 100 150 Número de células/campo 20.0 20.0 Número de células/campo Controle Controle Infectado 17.5 15.0 12.5 * 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0 35 250 Dias após infecção IC 1,0 1,2 1,3 100 150 250 Dias após infecção 1,6 IC 1,0 0,9 1,1 1,1 Figura 13. Determinação por imunoistoquímica de células CD19+ no baço dos camundongos BALB/c e C57BL/6 não infectados (controles- linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectados- negrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células CD19+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção. Figura 14. Imunoistoquímica com presença de células esplênicas CD19+. Camundongo BALB/c não infectado (controle) com quantidade discreta de células marcadas (A); camundongo BALB/c aos 150 dias após a infecção com quantidade moderada de células CD19+ (B); camundongo C57BL/6 não infectado (controle) com quantidade acentuada de células marcadas (C); camundongo C57BL/6 aos 150 dias de infecção com quantidade acentuada de células CD19+ (D); aumento de 400X. 41 DISCUSSÃO Em estudo anterior do grupo foi demonstrado que camundongos da linhagem C57BL/6 são mais susceptíveis à infecção por L. minor do que os da linhagem BALB/c, com diferenças histopatológicas importantes (Freitas et al. 2008). Posteriormente foi mostrado que esplenócitos de camundongos imunizados com antígenos de L. minor respondem a estes e produzem IFNg e IL-10 (Spadafora-Ferreira et al. 2010). A caracterização IFT das células presentes no baço por IIQ, mostrou que a infecção por L. minor envolve diferentes populações celulares. A disposição anatômica das células apresentadoras de antígenos (APCs), células B e células T da polpa branca do baço promove as interações necessárias para o desenvolvimento eficiente de respostas imunes. A MZ do baço recebe parte do fluxo sanguíneo que entra neste órgão e antígenos são liberados para este local por DCs circulantes ou são capturados por macrófagos da zona marginal (MZM) que apresentam alta capacidade fagocítica. Os macrófagos metalófilos marginais (MMM), com menor capacidade fagocítica, estão localizados no lado interno da MZ (Aichele et al. 2003; Nolte et al. 2004; Mebius & Kraal 2005). MZM foram descritos primeiramente por sua capacidade de reter e interiorizar haptenos polissacarídicos. São caracterizados pela expressão de CR3 (receptor heterodimérico para os produtos de clivagem do C3) em abundância; enquanto que macrófagos da polpa vermelha são desprovidos de CR3. Receptores scavenger I e II, CD36 e receptor de manose também são expressos nos MZM. MZM e MMM são F4/80-, enquanto que macrófagos da polpa vermelha são F4/80+. Macrófagos da polpa vermelha removem auto-antígenos e fagocitam eritrócitos (Nolte et al. 2004; Mebius & Kraal 2005;Van den Berg & Kraal 2005). Aos 100 dias pós-infecção, na linhagem C57BL/6 os animais infectados apresentaram número reduzido de células F4/80+ em relação aos controles, enquanto na linhagem BALB/c apesar de não significativo observou-se um aumento destas células nos animais infectados em relação aos controles no mesmo período. Resultados publicados anteriormente mostraram que aos 90 dias na lagochilascariose experimental, camundongos BALB/c apresentaram lesões pulmonares menos intensas e um menor número de nódulos subcutâneos contendo larvas L3 encistadas em relação à linhagem C57BL/6 (Freitas et al. 2008). Como no presente estudo, camundongos BALB/c, linhagem mais resistente a infecção, apresentaram 42 aumento de células F4/80+ aos 100 DAI, sugerimos um papel importante dessas células na resistência à infecção por L. minor. Kurotaki et al. (2010) em estudo com população purificada de macrófagos com fenótipo F4/80(hi)Mac-1(low) residentes da polpa vermelha no baço de camundongos, demonstraram que essas células produzem citocinas imunossupressoras como TGFβ e IL10 e induzem a diferenciação de linfócitos Th0 em Tregs CD4+Foxp3+. Os autores sugerem que esta subpopulação pode atuar na homeostase imune periférica. As células F4/80+ no baço dos animais BALB/c infectados apresentaram aumento do índice aos 100 DAI e nos animais C57BL/6 aos 250 DAI. O anticorpo monoclonal F4/80 tem sido amplamente utilizado como um marcador para macrófagos de camundongos (Van den Berg & Kraal 2005). A molécula F4/80 é expressa em vários subgrupos de macrófagos, incluindo células de Kupffer do fígado, macrófagos residentes da medula óssea, macrófagos da região cortical do timo, macrófagos da polpa vermelha, macrófagos da região medular de LNs e células da microglia no cérebro. Baixa expressão de F4/80 pode ser encontrada em monócitos, e determinados subconjuntos de macrófagos maduros, incluindo aqueles das áreas de células T dos tecidos linfóides secundários. Células de Langerhans e algumas DCs mielóides CD8-, são F4/80+, muito embora a expressão de F4/80 aparentemente seja reduzida com a interiorização do Ag e a migração para o tecido linfóide, visto que DCs maduras das zonas de células T não expressam níveis detectáveis desse marcador. Existem evidências de que eosinófilos apresentam o marcador F4/80+ (Van den Berg & Kraal 2005). No baço, particularmente os macrófagos da polpa vermelha apresentam o marcador F4/80+, mas também devemos considerar que macrófagos residentes com diferentes características fenotípicas e funcionais, e seus precursores no sangue, os monócitos que infiltram os tecidos, podem estar respondendo ao L. minor durante a infecção. Assim, fica clara a importância dos macrófagos na lagochilascariose experimental, no sentido de possivelmente direcionar as respostas imunes inata ou adquirida, para: produção de citocinas pro-inflamatórias com ativação de PMNN, citocinas regulatórias, que modulem a inflamação exacerbada; e para citocinas que auxiliem na diferenciação dos diferentes perfis de linfócitos CD4+. Para investigar o possível papel das células F4/80+ na evolução da infecção experimental por L. minor, seria necessária a investigação de outros marcadores celulares como CD11, CD68, 43 Foxp3, Gr1, MR, CD68, CD301, e analisar diferencialmente a presença dessas células em regiões específicas do baço como polpa branca e vermelha do baço, e zona marginal e outros órgãos. Os helmintos possuem vários carboidratos, lipídeos e glicoproteínas na superfície, e produtos que podem ser excretados ou secretados, e que têm um importante papel na regulação da resposta imune (Hewitson et al. 2009). Estes constituintes de patógenos são capazes de direcionar a ativação de macrófagos para um perfil CAMs, via TLR-2, 4, 5, 6 e 11, induzindo a produção de IL1, 6 e TNFα (Medeiros et al. 2010, Kogiso et al. 2011). Entre os constituintes de L. minor, já foram descritas uma molécula LPS-like, quitina, e glicoproteínas ricas em manose (Silva et al. 2008, Carvalhaes 2002; Carvalhaes et al. 2008). A quitina é um polímero de N-acetilglicosamina, que, depois da celulose, é o segundo polissacarídeo mais abundante na natureza e está presente em fungos, insetos e parasitas sendo encontrada na bainha de microfilárias e no ovo de nematódeos, incluindo L. minor. É um PAMP que regula a produção de IL17 e a expressão do receptor para IL17A (IL17AR) por macrófagos murinos in vitro, e induzem inflamação aguda in vivo com produção de IL12p/40, IL23 e TNF por macrófagos, através de uma via que depende de TLR-2 e MyD88. Estudos in vitro demonstram que a quitina também induz respostas inflamatórias agudas ricas em neutrófilos (Silva et al. 2008). A heterogeneidade de antígenos e produtos SE de helmintos influenciam a ativação de macrófagos e o perfil de células TCD4+ (Th1, Th2, Th17, Treg), associado com uma variedade de moléculas co-estimulatórias e citocinas (Noel et al. 2004). A maior detecção de IFNg no soro dos camundongos BALB/c observada por Freitas et al. (2008) sugere a participação de células Th1. Por outro lado, a presença de neutrófilos nas lesões granulomatosas observada na linhagem C57BL/6 sugere a participação de células Th17 nesta linhagem. A análise por IIQ do índice de células esplênicas CD4+ neste trabalho demonstrou que camundongos BALB/c infectados apresentaram aumento significativo na quantidade dessas células aos 100 e 250 DAI, enquanto que camundongos C57BL/6 apresentaram aumento de células esplênicas CD4+ somente aos 150 DAI. Deve-se ressaltar que camundongos BALB/c apresentam maior percentagem no baço de células CD4+ (20,8%) em relação aos camundongos C57BL/6 (13,6%) (The Jackson Laboratory 2011) isso pode favorecer o aumento dessas células na linhagem BALB/c. A molécula CD4 é uma glicoproteína de superfície celular que funciona como 44 co-receptor importante na ativação das células T induzida pelos antígenos restritos ao MHC-II, sendo expressa em linfócitos T maduros que apresentam receptores TCRαβ (Gaubin et al. 1996). A modulação de diferentes subpopulações de linfócitos CD4+ foi observada em muitos modelos experimentais de helmintoses (Noël et al. 2004). Uma resposta Th2 não está necessariamente sempre associada à resistência durante uma helmintose, mas pode significar uma resposta favorável ao parasita e estar associada a um aumento na susceptibilidade de camundongos infectados por helmintos que se localizam em tecidos fora do intestino. A resposta Th1 parece estar envolvida na resistência de camundongos A/J à lagochilascariose experimental, visto que linfócitos esplênicos dos animais infectados, estimulados com o EB do parasita ou ConA, apresentaram maior produção de IFNγ em relação aos camundongos susceptíveis, da linhagem B10.A (Spadafora-Ferreira et al. 2010). De forma semelhante, RodriguezSosa et al. (2004) observaram nos estágios iniciais da infecção experimental por cisticerco de T. crassiceps, que células esplênicas de camundongos ao serem estimuladas com ConA produzem preferencialmente citocinas do perfil Th1, e isto está associado a uma maior destruição do parasito e uma carga parasitária baixa. Na lagochilascariose experimental, Dias et al. (2011) descrevem nos camundongos A/J (resistentes) aumento na produção de IFNγ, TNFα e IL10 em relação aos animais B10.A (susceptíveis), após 30-60 dias de infecção. Nesse mesmo período não foi detectada diferença significativa na produção de IL-4 entre os animais infectados. Chamamos atenção para a ausência de polarização de uma resposta do tipo Th2 associada com a resistência ou susceptibilidade na infecção por L. minor. Em estudo realizado por Amri et al. (2007) com células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de pacientes com hidatidose incubadas com IFNγ e em cocultura com a forma larval de Echinococcus granulosus indicaram que uma provável resposta Th1 fosse eficaz na eliminação do parasita. A participação de células Treg (CD4+CD25+ ou CD4+CD25+Foxp3+) na infecção por helmintos foi mostrada em diferentes modelos experimentais, e aparece vinculada à indução de um estado de imunossupressão que piora a evolução da infecção; e outras vezes, regula as lesões induzidas durante a infecção (Finney 2007; McSorley 2008). Na esquistossomose experimental murina, em camundongos TLR3-/foi observada redução de citocinas e quimiocinas ligadas à resposta Th1 e maior quantidade de células T CD4+CD25+pulmonares, que parecem estar relacionadas com a resistência à infecção (Joshi et al. 2008). 45 No presente estudo, encontramos preferencialmente um aumento de células CD4+ na linhagem BALB/c. As células CD4+ esplênicas detectadas podem ser células residentes do baço ou linfócitos que chegam da corrente sanguínea para a MZ. Freitas et al. (2008) detectaram nessa linhagem aumento de IFNγ e IL10 no soro. Não podemos excluir a ativação de células TCD4+ com fenótipo Th1, Treg, Tγδ, NK, NKT, durante a infecção. Também foi observado durante infecção experimental por L. minor, alta produção de IL17 nos camundongos B10.A, associada à susceptibilidade desta linhagem (Dias et al. 2011). IL17A e IL17F são duas das várias citocinas produzidas por células Th17 que são capazes de induzir indiretamente o recrutamento de neutrófilos (Pelletier et al. 2010), e PMNN estão presentes em grande quantidade nas lesões pulmonares de camundongos B10.A e C57BL/6, susceptíveis a infecção experimental por L. minor (Prudente et al. 2009a). Além de células CD4+ serem produtoras de IL17, os linfócitos Tγδ e células NKT também podem ser fontes de IL17 (Roark et al. 2008). No modelo de neurocisticercose experimental com Mesocestoides corti observou-se a produção de citocinas do tipo Th1 no SNC, e do tipo Th2 no sangue periférico. Fato interessante foi que neste modelo, células Tγδ predominaram no infiltrado inflamatório extraparenquimal (Cardona et al. 1999). Outras células como as NK e NKT também podem ser ativadas durante infecções helmínticas. Estudos demonstram que a incubação do produto SE de N. americanus com células NK esplênicas de camundongos estimulou o aumento de IFNγ dependente da presença de IL2 e IL12 (Hsieh et al. 2004). A expansão de células iNKT in vivo induzida por SEA de S. mansoni foi descrita por Zaccone et al. (2007). Células NKT invariantes (iNKT) reconhecem glicolipídeos apresentados por CD1d, podendo secretar citocinas como: IL2, IL4, IL5, IL13, IFNγ, TNFα e fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF). A avaliação de células CD8+ ao longo da infecção experimental por L. minor, demonstrou que camundongos da linhagem BALB/c apresentaram aumento do índice de células aos 35 DAI e aumento significativo aos 100 DAI de forma semelhante aos achados para CD4+; no entanto, camundongos C57BL/6 apresentaram aumento do índice de células esplênicas CD8+ aos 35, 150 e 250 DAI. A molécula CD8 é uma glicoproteína expressa em células hematopoiéticas que pode estar presente em duas diferentes configurações, CD8αβ e CD8αα. A primeira atua 46 como co-receptor do TCR e é expressa de maneira constitutiva em linfócitos T restritos por moléculas do MHC-I. Já a isoforma CD8αα pode ser expressa de maneira transitória ou permanente em diferentes linhagens de linfócitos T, independentemente da restrição pelo MHC ou da presença de co-receptores convencionais. A expressão de CD8αα já foi descrita em linfócitos Tγδ (Cheroutre & Lambolez 2008), e células Tγδ já foram descritas em helmintoses, podendo ser produtoras de IFNγ ou IL17 (Hogg et al. 2009; Neves et al. 2010. Ribot et al. 2009). A molécula CD8 também pode estar expressa nas células dendríticas. Segundo Kushwah & Hu (2011), DCs linfóides são encontradas em órgãos linfóides como o baço e são divididas de acordo com a expressão variada de CD4 e CD8. Subconjuntos de DCs linfóides incluem DCsCD8-CD4-, DCsCD8-CD4+ e DCsCD8+CD4+. DCs CD8+ podem ser observadas nas áreas de células T dos tecidos linfóides e DCsCD8- são encontrados no interior das MZs de tecidos linfóides e somente migram para as áreas de células T após estimulação. DCsCD8+são potentes indutores de resposta de células TCD8 à antígenos exógenos, enquanto que DCsCD8- são indutores de uma resposta TCD4+. Diante disso, é importante estudarmos futuramente a participação de linfócitos TCD8+, não citolíticos, através da produção de citocinas pró-inflamatórias e regulatórias durante o curso da infecção por L. minor. O aumento preferencial dessas células nos camundongos da linhagem C57BL/6 parece estar associado com a susceptibilidade à lagochilascariose experimental. A participação de células CD8+ também foi estudada em outras infecções por helmintos. Humphreys et al. (2004) descreveram uma grande quantidade de células TCD8+ produtoras de IFNγ nos linfonodos mesentéricos e mucosa cecal, e associaram tal fato a susceptibilidade de camundongos na infecção crônica por T. muris. Metwali et al. (2006) demonstraram que H. polygyrus induz células TCD8+ na mucosa intestinal de camundongos, as quais inibem a proliferação de células T. Neste mesmo estudo, as células TCD8+ reverteram o quadro de colite induzida em camundongos Rag-/- - (deficientes em células T e B) reconstituídos com células T IL10 / . Em humanos com helmintoses a imunofenotipagem por citometria de fluxo demonstrou decréscimo de células TCD4+ e aumento de células TCD8+ no sangue periférico associada com a cronicidade das infecções (Kalinkovich et al. 1998). A ativação de linfócitos TCD8+ também foi relatada em pacientes com equinococose 47 alveolar (EA). Pacientes com EA crônica que apresentavam lesão hepática exibiram um aumento da ativação dessas células no sangue periférico quando comparado aos pacientes com EA sem lesões e controles saudáveis. A ativação policlonal de células CD8+ nesses pacientes sugeriu uma hiporeatividade aos antígenos persistentes, estando associada com a cronicidade da doença (Manfras et al. 2002). No baço de camundongos BALB/c infectados por L. minor foram detectados aumento na quantidade de células CD19+ dos 100 aos 250 dias após a infecção quando comparados aos animais controles. Observamos no grupo infectado aumento gradativo desta população celular esplênica até os 150 DAI e posterior queda. Na linhagem de camundongos C57BL/6 infectados por L. minor, somente aos 250 DAI, observou-se aumento significativo na porcentagem de células CD19+ em relação ao grupo controle. Esses resultados são condizentes com a análise dos índices celulares, visto que camundongos da linhagem BALB/c apresentaram aumento dessas células CD19+ aos 100, 150 e aos 250 DAI, enquanto que a linhagem susceptível C57BL/6 apresentou discreto aumento nos índices celulares aos 150 e 250 DAI. Assim podemos concluir que camundongos da linhagem BALB/c apresentaram aumento preferencial de células CD19+. As principais populações de linfócitos B efetores do baço são os linfócitos B foliculares (FCB) e os MZB. Os FCB atuam na geração de Bm e plasmócitos por meio da resposta humoral timo dependente (TD). Os MZB geram as chamadas respostas humorais timo independentes (TI), podendo responder avidamente a estímulos antigênicos e se diferenciarem em células secretoras de anticorpos sem a necessidade de auxilio de linfócitos T. MZB também medeiam o transporte de antígenos dos imunocomplexos para os folículos esplênicos (Aichele et al. 2003; Allman & Pillai 2008). Fenotipicamente, estes linfócitos são muito semelhantes aos linfócitos convencionais, sendo classificadas também no grupo de linfócitos B2 (Allman & Pillai 2008). Células MZB são fenotipicamente CD19 mid , CD1dhi, CD23-, CD43-, IgMhi, IgDlow, CD5-, CD21hi e constituem 15% das células B esplênicas. Já as células FCB apresentam um fenótipo mid CD19 , CD1dhi, CD23+, CD43-, IgMlow, IgDhi, CD5- e constituem mais de 70% das células B esplênicas (Baumgarth et al. 2011). Além de linfócitos B foliculares e linfócitos B da zona marginal, os linfócitos B naives (B0) que são fenotipicamente IgM+, IgD+, CD23+,CD21+, CD19+ migram para o baço. A diferenciação dessas células em Bm e plasmócitos ocorre no centro germinativo, 48 após os processos de proliferação, hipermutação somática dos genes da região variável (V) de imunoglobulina e troca de classes. Sinais de linfócitos Th através da interação CD40L-CD40 e produção de citocinas são essenciais nessa troca de isótipos de Ig durante respostas TD (Cariappa & Pillai 2002). Os linfócitos B1, que se localizam predominantemente nas cavidades pleurais e peritoneais, também representam uma subpopulação minoritária de células B esplênicas (Lundy & Boros 2002; Allman & Pillai 2008). Camundongos congenitamente asplênicos ou esplenectomizados apresentam redução de células B1 e de IgM contra Ags polissacarídicos de bactérias, indicando que o baço também apresenta um papel na geração e manutenção de linfócitos B1 (Wardemann et al. 2002). Linfócitos B1a são CD19hi, CD23-, CD43+, B220lo, CD11b+, IgMhi, IgD(variable), CD1dmid, CD5+, constituindo cerca de 2 % das células B esplênicas. Células B1b constituem menos de 1%, e diferem dos linfócitos B1a pela ausência do marcador CD5. Diferente de linfócitos B2, linfócitos B1 não sofrem mutação somática, não requerem auxílio de linfócitos T e produzem anticorpos de baixa afinidade que incluem IgM, IgA e IgG3, sendo responsáveis pela produção da maior parte das IgMs naturais. Juntos, MZB e linfócitos B1 fazem parte das chamadas repostas de memória natural, pois geram rapidamente células efetoras nos estágios iniciais da resposta imune (Zaccone et al. 2007; Allman & Pillai 2008; Baumgarth et al. 2011). Diante disso sugerimos que as células CD19+ quantificadas no baço incluem na sua maioria os linfócitos B foliculares e da zona marginal, não excluindo a possibilidade de parte destes serem linfócitos B1. Os resultados aqui apresentados sugerem que a maior quantidade de células CD19+ no baço de camundongos BALB/c possa estar associada com funcionalidade dessas células e melhor produção de anticorpos que participam na resistência a infecção por L. minor. Destacamos que este é o primeiro trabalho que avalia a participação de células F4/80+, CD4+, CD8+ e CD19+ esplênicas durante a infecção experimental por L. minor. 49 CONCLUSÕES · Os camundongos BALB/c, mais resistentes a lagochilascariose experimental, apresentaram aumento preferencial de células CD4+ e CD19+ esplênicas; já os C57BL/6, mais susceptíveis exibiram aumento preferencial de células CD8+ esplênicas. · Os camundongos da linhagem BALB/c apresentaram aumento dos índices de células F4/80+ aos 100 DAI e a linhagem C57BL/6 aos 250 DAI. · Os camundongos da linhagem BALB/c apresentaram aumento dos índices de células CD4+ aos 100 e 250 DAI e a linhagem C57BL/6 aos 150 DAI. · Camundongos BALB/c apresentaram aumento dos índices de células CD8+ aos 35 e 100 DAI, enquanto que os camundongos C57BL/6 aos 35,150 e 250 DAI. · Camundongos BALB/c apresentaram aumento dos índices de células CD19+ aos 100, 150 e 250 DAI, enquanto que camundongos C57BL/6 aos 150 e 250 DAI. · Camundongos BALB/c apresentaram aumento no índice celular para todos os marcadores aos 100 DAI. 50 CONSIDERAÇÕES FINAIS Diante dos resultados encontrados, neste e em outros trabalhos do grupo da Profa. Mara Carvalhaes sugere-se que PAMP’s como quitina, LPS-Like, glicoproteínas ricas em manose e antígenos presentes nos produtos SE e EB de L. minor, estejam envolvidos na modulação da resposta imune, e consequentemente na indução das diferentes populações celulares descritas, (F4/80+, CD4+, CD8+, CD19+), durante o curso da infecção (Figura 15). Figura 15. Esquema representativo da interação das populações celulares F4/80+, CD4+, CD8+, CD19+ durante a lagochilascariose experimental. Os camundongos da linhagem BALB/c apresentaram aumento preferencial de células CD4+ e CD19+. Já os camundongos da linhagem C57BL/6 mostraram aumento preferencial de células CD8+. Diante disto sugerimos que a resistência à infecção por L. minor, na linhagem BALB/c pode estar relacionada com aumento preferencial de células CD4+, células CD19+ esplênicas. Vale destacar que as populações F4/80+, CD4+, CD8+, CD19+ esplênicas exibiram índices celulares aumentados aos 100 DAI nos camundongos BALB/c, período em que estes apresentam lesões pulmonares menos intensas e menor 51 número de nódulos subcutâneos contendo larvas L3 encistadas em relação à linhagem C57BL/6 (Freitas et al.2008). A interação celular com a produção de citocinas como IFNγ e IL10 por células CD4+ dos perfis Th1 e Treg e o aumento de células CD19+ associada à produção de anticorpos IgG, IgA e IgM (Prudente et al. 2009b, 2009c, 2011), contra o EB e os produtos SE do parasita, na linhagem BALB/c, mais resistente à infecção por L. minor, devem contribuir na melhor evolução da infecção. Sugerimos que o aumento de células CD8+ esplênicas esteja associado com susceptibilidade durante a infecção experimental por L. minor nos camundongos C57BL/6. É possível que células CD4+ do perfil Th17, células CD8+ e produção de IL17 induzidas pela quitina e outros antígenos presentes ou secretadas por larvas L3 estejam associadas à presença de intenso processo inflamatório com recrutamento de PMNN nas lesões pulmonares de camundongos C57BL/6. 52 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1 1 Referências bibliográficas de acordo com as normas da revista Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. Ahmed SF, Oswald IP, Caspar P, Hieny S, Keefer L, Sher A, James SL 1997. Developmental differences determine larval susceptibility to nitric oxide-mediated killing in a murine model of vaccination against Schistosoma mansoni. Infect Immun 65: 219-226. Aichele P, Zinke J, Grode L, Schwendener RA, Kaufmann SHE, Seiler P 2003. Macrophages of the splenic marginal zone are essential for trapping of blood-borne particulate antigen but dispensable for induction of specific T cell responses. J Immunol 171: 1148-1155. Allen JE & Maizels RM 2011. 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E-mail: [email protected]; [email protected] 1- Laboratório de Imunoquímica, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública/UFG. 2- Laboratório de Imunoquímica, Instituto Butantãn de São Paulo. ÓRGÃO FINANCIADOR: Fundação de amparo à pesquisa do estado de Goiás (FAPEG) e Fundação de amparo à pesquisa do estado de São Paulo (FAPESP). Artigo formatado de acordo com as normas da revista de Patologia Tropical 65 RESUMO A lagoquilascariose é uma parasitose emergente cujo agente etiológico é Lagochilascaris minor. O modelo experimental em camundongos tem sido utilizado no estudo da resposta imune durante a infecção por L. minor. No presente trabalho, avaliaram-se as populações de células esplênicas em camundongos susceptíveis (C57BL/6) e resistentes (BALB/c), experimentalmente infectados por L. minor. Camundongos BALB/c exibiram aumento do índice de células esplênicas: F4/80+ aos 100 dias pós-infecção; CD4+ aos 100 e 250 dias após a infecção; células CD8+ aos 35 e 100 dias pós-infecção; CD19+ aos 100, 150 e 250 dias pós-infecção. Nos camundongos C57BL/6 infectados observou-se aumento do índice de células esplênicas: F4/80+ aos 250 dias de infecção; CD4+ aos 150 dias; CD8+ aos 35, 150 e 250 dias; CD19+ aos 150 e 250 dias após infecção. Esses resultados indicam participação dessas células no controle da infecção experimental por L. minor. DESCRITORES Lagochilascaris minor, Helmintose, Resposta imune, Linfócitos INTRODUÇÃO A lagochilascariose é uma antropozoonose causada por Lagochilascaris minor, que pode ser o agente etiológico da infecção humana (4), e eventualmente é encontrado em animais domésticos, como cão e gato (21). Apesar de não constituir um problema de saúde pública, a lagochilascariose pode ser considerada uma doença emergente no Brasil, que lidera a casuística mundial com 90% dos casos descritos (4). A lagochilascariose é uma doença crônica caracterizada pela presença de lesões granulomatosas na região da oro-naso-faringe que provoca abscessos exsudativos com presença de ovos, parasitos adultos e larvas, indicando a ocorrência de auto- 66 infecção. A letalidade nesta infecção tem sido observada quando o parasita invade o tecido pulmonar e o sistema nervoso central (9, 19). O ciclo de vida natural de L. minor e o mecanismo de infecção não estão bem esclarecidos, pois pouco se sabe a respeito da biologia desse parasito. Animais silvestres como canídeos felídeos e roedores são considerados os prováveis reservatórios naturais de L. minor (2). O ciclo experimental heteroxênico do parasita foi descrito utilizando-se camundongos como hospedeiros intermediários e felinos domésticos como hospedeiros definitivos (3, 29). A extraordinária capacidade de L. minor para migrar entre diferentes tecidos humanos também foi observada em modelos experimentais (17). Em camundongos inoculados com ovos infectantes do parasita, contendo larvas de terceiro estádio (L3), larvas eclodidas podem ser observadas durante a migração no trato intestinal e em seguida, a disseminação destas ocorre para outros tecidos, tais como os pulmões, músculos esqueléticos e tecidos subcutâneos. Quando gatos são alimentados com carcaças de camundongos infectados, as larvas L3 eclodem dos cistos no estômago e ascendem até a orofaringe, onde larvas de quarto estádio (L4) são encontradas. Ovos de L. minor podem ser expelidos e encontrados nas fezes de gatos infectados (22). A relação parasita-hospedeiro durante a infecção experimental por L. minor tem sido estudada em linhagens de camundongos isogênicos com diferentes background genéticos. Em estudos anteriores, após observação da taxa de mortalidade acumulada no período de um ano de infecção, foi possível classificar as linhagens de camundongos em resistentes (A/J, BALB.xid, BALB/c) e susceptíveis (C57BL/6 e B10.A) à infecção experimental por L. minor. As linhagens susceptíveis apresentaram: menor tempo de sobrevida; maior quantidade de larvas L3 e parasitos adultos; e granulomas mais intensos (6, 17, 24). 67 É evidente que a diferença na susceptibilidade de camundongos à lagochilascariose experimental possa ser influenciada pela resposta imune individual ao parasito, que desempenha um papel essencial na evolução da infecção, minimizando ou bloqueando os processos patológicos (17). Recentemente foi demonstrado que o nível sérico de interleucina (IL) 10 em camundongos C57BL/6 e BALB/c infectados pelo parasito foi semelhante entre as linhagens, aos 90 dias após a infecção (DAI); porém, os animais BALB/c apresentaram níveis elevados de interferon-γ (IFN-γ). Nesse período observaram-se lesões pulmonares menos intensas e um menor número de nódulos subcutâneos contendo L3 encistadas nos camundongos BALB/c em relação aos camundongos C57BL/6 (8). Assim, consideramos importante avaliar as populações de células esplênicas durante a infecção experimental por L. minor. Como o perfil de células esplênicas durante a lagochilascariose experimental nunca foi estudado, realizamos a imunofenotipagem de células F4/80+, CD4+, CD8+ e CD19+ do baço de camundongos BALB/c e C57BL/6 controles e experimentalmente infectados com L. minor, com o intuito de saber quais populações celulares apresentam-se alteradas na lagochilascariose experimental. MATERIAL E MÉTODOS Obtenção de ovos Gatos domésticos (Felis domesticus) foram individualmente alimentados com carcaças de camundongos C57BL/6 infectados, contendo 30 a 100 nódulos encistados no tecido subcutâneo contendo larvas de terceiro estádio (L3) de L. minor. Os ovos do parasita foram colhidos das fezes dos felinos após 30 dias de inoculação e submetidos aos métodos de Hoffman e Faust (16). A suspensão de ovos foi mantida a temperatura 68 ambiente (t.a.), em solução de formalina a 1%, por 40 dias. Após lavagem exaustiva, a suspensão de ovos destinada à preparação do inóculo foi ajustada para 1000 ovos/ml. Os ovos foram mantidos em formalina 1%, sendo lavados e ressuspendidos em PBS para a inoculação. Infecção experimental Foram utilizados camundongos isogênicos, machos, das linhagens BALB/c (n=50) e C57BL/6 (n=50), obtidos do Biotério Central do Instituto Butantan. Os camundongos foram inoculados por gavagem com 1000 ± 200 ovos infectantes do parasito por animal. Grupos de 5 animais foram eutanasiados em câmara de CO2, em diferentes períodos pós-infecção (35, 100, 150 e 250). Igual número de camundongos não infectados (inoculados com PBS por via oral) foram eutanasiados no mesmo período, servindo como controles. Realizou-se evisceração e coleta do baço desses animais, destinados ao congelamento para reação imunoistoquímica. Os procedimentos deste projeto foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Instituto Butantan de São Paulo, protocolo nº 403/07. Imunoistoquímica Fragmentos de baço colhido dos animais nos diferentes períodos após a infecção, foram embebidos em meio de inclusão para congelamento de tecidos (OCT, Aotec), imersos em isopentano gelado (Vetec, Brasile) e imediatamente congelados em nitrogênio líquido e posteriormente, armazenados em freezer -80oC. Os fragmentos foram cortados em criostato e fixados em acetona gelada por 10 minutos, sendo mantidos congelados a -80 oC. Em seguida, os fragmentos foram submetidos ao bloqueio com H2O2 30 volumes diluída a 1/1000 em metanol (15 minutos), e com soro normal de cabra (15 minutos). Em seguida, sem lavar as lâminas, retirou-se o excesso de soro, os cortes foram incubados com os anticorpos diluídos em PBS contendo 2% de 69 soro fetal bovino, em câmara úmida durante 18h a 4ºC. Foram utilizados os seguintes anticorpos de rato para camundongos: anti-F4/80 (marcador de macrófagos), clone, A31 (Serotec, EUA); anti-CD19 (marcador de linfócitos B), clone 1D3 (BD Biosciences); anti-CD4 (marcador de linfócitos T helper), clone H129.19 (BD Biosciences); e antiCD8 (marcador de linfócitos T citolíticos); clone 53-6.7 (BD Biosciences), não marcados. Posteriormente as lâminas foram lavadas com PBS e incubadas com anticorpo secundário anti-IgG de rato biotinilado (BD Biosciences). A seguir, foi adicionado o complexo ABC-peroxidase (Dako, Dinamarca) por 30 minutos à t.a. A revelação da reação foi realizada com diaminobenzidina-H2O2 (DAB - BD Biosciences), e a contracoloração com hematoxilina de Mayer (Merck, Alemanha). Quantificação dos subtipos celulares Para cada camundongo fez-se uma lâmina de IIQ e para cada lâmina foram fotografados 30 campos na objetiva de 40X. As imagens dos campos para quantificação foram capturadas por meio de uma câmera (Cyber shot DSC-S85) acoplada ao microscópio e ao computador para digitalização e a análise das células foi realizada no sistema analisador de imagens Image J (NIH/EUA). Foram quantificadas as células marcadas positivamente, nas 30 intersecções da grade em cada um dos 30 campos analisados, e calculada a média acumulada (26), sendo os resultados expressos em mediana e desvio médio. Também foi determinado o índice de células (IC) marcadas, dividindo-se a média aritmética do número de células marcadas presentes nos animais infectados (Мcel+Inf), pela média aritmética do número de células marcadas encontradas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes DAI [Índice= (Мcel+Inf) / (Мcel+Cont)]. Análise estatística A análise estatística das contagens de IIQ foi realizada por meio do programa 70 GraphPas Prism 4.0. Todas as variáveis foram testadas quanto à distribuição normal e variância homogênea. Para análise de uma variável utilizou-se a mediana e desvio médio seguido de teste Mann Whitney (não paramétrico). Para mais de uma variável: ANOVA seguido de teste Tukey. As diferenças observadas foram consideradas significantes quando p < 0,05. RESULTADOS Observou-se ausência de marcação positiva no controle negativo (CN) efetuado sem adição de anticorpos contra os marcadores e a localização predominante de células esplênicas marcadas na região folicular da polpa branca do baço com os anticorpos de rato anti-F4/80+, CD4+, CD8+ e CD19+, na análise qualitativa (Figura 1). Nos animais da linhagem BALB/c não houve variação significativa na quantidade de células esplênicas F4/80+. Aos 100 dias após a infecção, as células F4/80+ nos animais infectados da linhagem C57BL/6 apresentaram número reduzido de células marcadas por campo em relação aos controles (p< 0,05), e aos 250 dias apresentaram número aumentado em relação aos controles (p< 0,05). O índice de células (IC) F4/80+ esplênicas da linhagem BALB/c apresentou aumento aos 100 DAI (IC = 1,2); e nos animais C57BL/6 aos 250 DAI (IC = 1,3) (Figura 2A e B). As células esplênicas CD4+ apresentaram-se aumentadas nos camundongos BALB/c infectados em relação aos animais controles aos 100 DAI (p< 0,05). Na linhagem C57BL/6, foi observado aumento de células CD4+ aos 150 DAI nos animais infectados em relação aos seus controles (p< 0,05). Detectamos IC CD4+ esplênicas aumentados em camundongos BALB/c aos 100 DAI (IC = 1,2) e 250 DAI (IC = 1,3); e nos animais C57BL/6 aos 150 DAI (IC = 1,4) (Figura 3A e B). A quantificação das células CD8+ no baço de camundongos BALB/c 71 infectados apresentou, somente aos 100 DAI, valores acima dos controles (p< 0,05). Nos camundongos C57BL/6 as células CD8+ apresentaram-se aumentadas em relação aos controles, aos 35 e 150 DAI (p< 0,05). O IC CD8+ esplênicas de camundongos BALB/c aumentou aos 35 DAI (IC = 1,1) e 100 DAI (IC = 1,3); e nos camundongos C57BL/6, aos 35 DAI (IC = 1,2), 150 DAI (IC = 1,5) e 250 DAI (IC = 1,1) (Figura 4A e B). O número de células CD19+ no baço de camundongos BALB/c infectados aumentou aos 100, 150 e 250 DAI (p< 0,05) em relação aos animais controles. Aos 250 DAI na linhagem C57BL/6, o número das células CD19+ estava aumentado em relação aos controles (p< 0,05). O IC CD19+ esplênicas nos camundongos BALB/c aumentou aos 100 DAI (IC = 1,2), 150 DAI (IC = 1,3) e 250 DAI (IC = 1,6); e nos animais C57BL/6 aumentou aos 150 DAI (IC = 1,1) e 250 DAI (IC = 1,1) (Figura 5A e B). DISCUSSÃO O índice de células F4/80+ no baço de camundongos infectados exibiu aumento aos 100 DAI na linhagem BALB/c e na linhagem C57BL/6 aos 250 DAI. Os macrófagos da polpa vermelha são F4/80+ e apresentam a função de remover autoantígenos e fagocitar eritrócitos e determinados subconjuntos de macrófagos maduros, das áreas de células T do baço apresentam baixa expressão da molécula F4/80+. Devemos considerar que macrófagos residentes com diferentes características fenotípicas e funcionais, e seus precursores no sangue, os monócitos que infiltram os tecidos, podem estar respondendo ao helminto no local de infecção e a expressão de F4/80 pode variar durante a ativação e maturação de macrófagos (28). Células F4/80+ durante a infecção experimental por L. minor, podem ser importantes no sentido de direcionar a resposta imune, para: produção de citocinas pro-inflamatórias com ativação 72 de neutrófilos, citocinas regulatórias, que modulem a inflamação exacerbada; e para citocinas que auxiliem na diferenciação dos diferentes perfis de linfócitos CD4+. No baço de camundongos, foi identificada uma população de macrófagos com o fenótipo F4/80(hi) Mac-1(low) que produz citocinas imunossupressoras como TGFβ e IL10 (12). Alguns estudos têm demonstrado que macrófagos alternativamente ativados (AAMs) estão associados à resistência em infecções parasitárias e liberação de citocinas e fatores de crescimento angiogênicos durante infecções por helmintos (14). Macrófagos classicamente ativados (CAMs) que produzem óxido nítrico (NO), citotóxico para larvas de metazoários (1) parecem ser importantes na resistência à helmintoses (27). Camundongos BALB/c exibiram aumento do índice de células CD4+ esplênicas aos 100 e 250 DAI, e os camundongos da linhagem C57BL/6 somente aos 150 DAI. Acredita-se que essas células CD4+ esplênicas detectadas possam ser células residentes do baço ou linfócitos que chegam da corrente sanguínea para a zona marginal (MZ) do baço (13). A modulação de diferentes subpopulações de linfócitos CD4+ foi observada em muitos modelos experimentais de helmintoses (15). A maior detecção de IFNg no soro dos camundongos BALB/c sugere a participação de células com perfil Th1 (8). Vários estudos descrevem células Th17 com participação no agravamento da patologia na esquistossomose em camundongos (20); e de fato, a presença de neutrófilos nas lesões granulomatosas observadas na linhagem C57BL/6 sugere a participação de células Th17 nesta linhagem (8). Nossos resultados demonstraram um aumento nos índices de células CD8+ esplênicas nos camundongos C57BL/6 aos 35, 150 e 250 DAI. A susceptibilidade de camundongos na infecção crônica por Trichuris muris está associada com grande quantidade de células TCD8+ (10). A molécula CD8 na configuração CD8αα pode ser 73 expressa em linfócitos Tγδ (7) e essas células já foram descritas em outras helmintoses (5). Assim é importante a avaliação futura da participação de linfócitos CD8+ não citolíticos, produtores de citocinas pró-inflamatórias e regulatórias, durante o curso da infecção por L. minor. O aumento preferencial dessas células nos camundongos da linhagem C57BL/6 parece estar associado com a susceptibilidade à infecção experimental. Os camundongos na linhagem BALB/c apresentaram índices aumentados de células CD19+ esplênicas aos 100, 150 e aos 250 DAI. A molécula CD19+ está presente na superfície de praticamente todos os linfócitos B, funcionando como um coreceptor que amplifica a cascata de sinalização (25). Linfócitos B possuem uma variedade de funções imunes, incluindo a produção de anticorpos, apresentação de antígenos e produção de citocinas, colaborando com uma imunidade protetora durante infecções por helmintos (11). Durante infecção experimental por Heligmosomoides polygyrus os anticorpos impedem a invasão intestinal nos primeiros dias de infecção (23). Ficou demonstrado que camundongos BALB/c produziram IgM, IgG, IgA e IgE contra o extrato bruto (EB) e antígenos secretados e excretados (SE) do parasito (8), já os camundongos da linhagem C57BL/6 produziram as imunoglobulinas: IgA, IgM, IgG respondendo melhor aos antígenos do EB do que aos produtos SE de L. minor (18). Os resultados aqui apresentados sugerem que a maior quantidade de células CD19+ no baço de camundongos BALB/c possa estar associada com funcionalidade dessas células e melhor produção de anticorpos que participam na resistência a infecção por L. minor. Aos 100 DAI na linhagem BALB/c foi verificado aumento no índice de células F4/80+, CD4+, CD8+ e CD19+ esplênicas. Neste dia de infecção descrevemos anteriormente lesões pulmonares menos intensas e um menor número de nódulos 74 subcutâneos contendo L3 encistadas nos camundongos BALB/c, em relação aos camundongos linhagem C57BL/6 infectados. Os achados da avaliação por IHQ considerando os índices de células marcadas possibilitaram associar o aumento preferencial de células CD4+ e CD19+ esplênicas com resistência a lagochilascariose experimental nos camundongos BALB/c e o aumento preferencial de células CD8+ esplênicas com susceptibilidade nos animais C57BL/6. IMMUNOPHENOTYPING OF SPLEEN CELLS IN SUSCEPTIBLE AND RESISTANT MICE WITH EXPERIMENTAL LAGOCHILASCARIOSIS Lagochilascariosis is an emerging parasitic disease whose etiologic agent is Lagochilascaris minor. The experimental model in mice has been used to study the immune response during infection by L. minor. In this study, we evaluated spleen cell populations in susceptible (BALB/c) and resistant (C57BL/6) mice experimentally infected with L. minor. BALB /c mice exhibited increased the index of spleen cells: F4/80+ at 100 days post-infection; CD4 + cells to 100 and 250 days after infection; CD8 + cells at 35 and 100 days post-infection; CD19 + cells at 100, 150 and 250 days postinfection. In C57BL / 6 mice infected showed an increase the index of spleen cells: of F4/80 + to 250 days of infection, increase in CD4 + cells at 150 days, an increase of CD8 + cells at 35, 150 and 250 days and increased CD19 + cells to 150 and 250 days after infection. These results indicate involvement of these cells in the control of experimental infection by L. minor. KEY WORDS Lagochilascaris minor, helminths, immune response, lymphocytes 75 REFERÊNCIAS 1. Ahmed SF, Oswald IP, Caspar P, Hieny S, Keefer L, Sher A, James SL. Developmental differences determine larval susceptibility to nitric oxide-mediated killing in a murine model of vaccination against Schistosoma mansoni. Infect Immun 65: 219- 226, 1997. 2. Barbosa CAL, Barbosa AP, Campos DMB. Gato doméstico (Felis catus domesticus) como possível reservatório de Lagochilascaris minor Leiper, 1909. Rev Patol Trop 34: 205- 211, 2005. 3. Campos DMB, Freire Filha LG, Vieira MA, Paçô JM, Maia MA. Experimental life cycle of Lagochilascaris minor Leiper, 1909. Rev Inst Med Trop S.Paulo 34: 277- 287, 1992. 4. Campos DMB. Lagochilascaris. In: David PN(ed) Parasitologia humana. 11ªedição. Atheneu, São Paulo, 443- 446, 2005. 5. Cardona AE, Restrepo BI, Jaramillo JM, Teale JM. Development of an animal model for neurocysticercosis: immune response in the central nervous system is characterized by a predominance of gamma delta T cells. J Immunol 162: 995- 1002, 1999. 6. Carvalhaes MS, Spadafora-Ferreira MS, Portaro F, Mortara R, Tambourgi DV. A CRT-like molecule from L3 L.minor larvae. In: ImmunoRib, Ribeirão Preto. Anais da SBI: 77- 77, 2008. 7. Cheroutre H & Lambolez F. Doubting the TCR coreceptor function of CD8 alpha alpha. Immunity 28: 149- 159, 2008. 8. 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Determinação por imunoistoquímica de células F4/90+ no baço dos camundongos BALB/c (A) e C57BL/6 (B) não infectados (controles - linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectados - negrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células F4/80+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção. Figura 3. Determinação por imunoistoquímica de células CD4+ no baço dos camundongos BALB/c (A) e C57BL/6 (B) não infectados (controles- linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectados - negrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células CD4+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção. 80 Figura 4. Determinação por imunoistoquímica de células CD8+ no baço dos camundongos BALB/c (A) e C57BL/6 (B) não infectados (controles- linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectados - negrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células CD8+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção. Figura 5. Determinação por imunoistoquímica de células CD19+ no baço dos camundongos BALB/c (A) e C57BL/6 (B) não infectados (controles - linha fina) ou infectados com 1.000 ovos de Lagochilascaris minor por via oral (infectados - negrito), em diferentes dias após a infecção. Os resultados foram expressos em mediana do número de células por campo, com coluna indicando desvio médio, e barra determinando o valor mínimo e máximo de células marcadas (* p< 0,05, Teste Mann Whitney). IC: Índice de células CD19+, considerando a média aritmética do número de células marcadas por campo nos animais infectados (Мcel+Inf), dividida pela média aritmética do número de células marcadas nos controles não infectados (Мcel+Cont), nos diferentes dias após a infecção. 81 FIGURAS 82 83 84 ANEXO 3 – Regras do Convênio Butantan-UFG para publicação de trabalho A- Segundo termos do convenio entre os laboratórios de Imunoquímica do Instituto Butantan de São Paulo e do Laboratório de Imunoquímica da UFG, a ordem dos autores nos trabalhos a serem publicados obedecerá a ordem quantitativa de trabalho, salvo quando um dos pesquisadores solicitar a primeira autoria, seguindo as regras Nacionais e Internacionais de publicação; B- Para fins de participação em Congressos, a Profa. Monica Spadafora-Ferreira será sempre última autora, e Profa. Mara Silvia Carvalhaes a penúltima. O nome dos alunos deve obedecer a ordem quantitativa de trabalho, exceto quando para fins de solicitação de verba para participação em evento esta ordem necessitar de modificação, com a anuência dos corrdenadores do projeto, seguindo as regras Nacionais e Internacionais de participação em Congressos e eventos. Profa. Dra Mara Carvalhaes Sub-coordenadora do convênio entre os laboratórios de Imunoquímica do Instituto Butantan e UFG Profa. Dra. Mara Carvalhaes Lab. Imunoquimica IPTSP-UFG Atentar para a RESOLUÇÃO – CEPEC/UFG Nº 1037Seção II Do Desligamento Art. 47. Além dos casos previstos no Regimento Geral da UFG, será desligado do Programa o aluno que: VIII - ferir protocolo de programa de convênio nacional ou internacional ao qual o projeto do estudante esteja vinculado
