Replicação do DNA

Replicação do DNA
 A replicação do DNA deve acontecer antes que uma célula se
divida em duas células-filhas geneticamente idênticas
(mitose) ou antes que uma célula antecessora dê origem aos
gametas (meiose).
 A replicação é um mecanismo semiconservativo – ao final do
processo as duas moléculas de DNA produzidas serão
compostas de uma fita antiga (fita molde) e uma fita nova.
 O experimento de Meselson-Stahl
Esses
dois
pesquisadores
em
1958
demonstraram
experimentalmente o caráter semiconservativo da duplicação do
DNA.
Três hipóteses eram propostas na época, mas o modelo
semiconservativo já era defendido por Watson e Crick desde 1953.
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 Como Meselson e Stahl chegaram nessa resposta?
 Marcando o DNA recém sintetizado com 15N (isótopo pesado
do nitrogênio) foi possível separar as moléculas de DNA
através das diferenças no seu peso molecular.
 Somente a replicação semiconservativa poderia gerar o
padrão de bandas observado na figura acima.
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Conceitos básicos sobre a replicação
 O pareamento entre as bases nitrogenadas é a chave para a
fidelidade do processo de replicação.
 A molécula de DNA deve abrir para que a seqüência de cada
uma das duas fitas possa ser copiada.
 A replicação é um processo assimétrico – a DNA polimerase
(ou DNA pol) só adiciona novos nucleotídeos na direção 5’ –
3’.
 Esse processo só pode ser iniciado nas origens de replicação
do DNA.
 A célula só dispara as suas origens de replicação uma vez a
cada evento de replicação.
A Síntese do DNA (mediada pela DNA polimerase)
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A Replicação em Procariontes
 Tomando a bactéria E. coli como procarionte modelo, sabese que existem três DNA polimerases diferentes:
a) DNA pol I – possui três atividades: polimerisação do DNA (5’3’), atividade de exonuclease (3’-5’) e atividade de exonuclease (5’3’).
b) DNA pol II – participa do sistema de reparo do DNA.
c) DNA pol III – também está envolvida na replicação.
 Origem de replicação (Replicação teta - )
Em E. coli existe uma única origem de replicação denominada
oriC.
Quando a dupla fita de DNA se abre a partir da oriC as
forquilhas de replicação se movem bidirecionalmente.
Ao final da replicação, as duas forquilhas se encontram em um
local específico de término do genoma.
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Características da oriC
Possui um tamanho total de 245 pb, onde algumas seqüências
específicas podem ser reconhecidas:
a) uma seqüência consenso (5’GATCTNTTNTTTT3’) repetida
três vezes,
b) sítios de ligação para a proteína Dna A – a ligação dessa
proteína a oriC promove a abertura do DNA.
A Replicação em Eucariontes
 Em procariontes a replicação se processa em um período de
40 minutos. Mas em eucariontes esse processo dura entre 1,4
à 24 horas.
 Essa demora tem basicamente três razões: (i) o tamanho do
genoma, (ii) a existência de vários cromossomos individuais,
(iii) a maquinaria de replicação precisa lidar com a estrutura
de cromatina.
 Eucariontes possuem várias origens de replicação em cada
cromossomo que vão sendo disparadas progressivamente.
 A orientação da replicação também é bidirecional e ao
mesmo tempo em que a forquilha de replicação se abre a
nova fita de DNA vai sendo sintetizada.
 Em eucariontes existem cinco tipos diferentes de DNA
polimerases: DNA pol e.
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O Mecanismo da Replicação
 Por causa da orientação antiparalela da molécula de DNA e
do fato de que a DNA polimerase só adiciona novos
nucleotídeos à cadeia na direção 5’ – 3’ a síntese das duas
novas fitas de DNA é diferente para cada cadeia que está se
formando – fita contínua e fita descontínua.
SSB
DNA Helicase
Fita contínua – sua síntese segue a direção da forquilha de
replicação.
Fita descontínua – é sintetizada no sentido oposto ao da forquilha.
 Nenhuma DNA pol é capaz de iniciar a síntese de uma cadeia
de DNA sem que já exista uma extremidade 3’ livre para a
reação de polimerização – a DNA primase sintetiza um
pequeno primer (ou iniciador) com 10 nucleotídeos de RNA
na direção 5’-3’ e depois pára dando lugar a DNA pol.
 A síntese do iniciador de RNA ocorre uma vez na fita
contínua e várias vezes na fita descontínua.
 Fragmentos de Okazaki (200 nucleotídeos) – só são
observados na fita descontínua.
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 O iniciador de RNA é degradado e uma cadeia de DNA é
sintetizada. Por fim a DNA ligase promove a ligação
covalente entre os dois nucleotídeos adjacentes.
 Mas por que a necessidade de um iniciador de RNA? A DNA
primase não poderia sintetizar um iniciador de DNA?
 As DNA helicases abrem a dupla hélice do DNA – essa
enzima desfaz as pontes de hidrogênio entre as duas fitas do
DNA (numa taxa de 1000 bases por segundo).
 As proteínas de ligação a fita simples do DNA (SSB) se ligam
ao DNA que acabou de ser aberto pela DNA helicase. Isso é
importante por alguns motivos:
a) proteção à fita molde,
b) previne a formação de estruturas secundárias – principalmente
na fita descontínua,
c) estabiliza a fita de DNA impedindo a reestruturação da duplahélice.
 DNA topoisomerases – a abertura da hélice do DNA molde
pela DNA helicase gera pontos de grande tensão a frente da
forquilha – as topoisomerases eliminam essa tensão
induzindo quebras de fita simples ou dupla.
 Atividade de exonuclease (3’-5’) das DNA pol I e III – retira
bases incorretas por hidrólise.
 Mas por que não existe nenhuma DNA pol com capacidade
de síntese 3’-5’?
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O Problema da Replicação das Terminações do DNA Linear
 A maquinaria de replicação é capaz de replicar o DNA
integralmente?
 Como a replicação das extremidades do DNA acontece?
 Que conseqüências o encurtamento dos telômeros tem na
célula?
 Mas não existe um mecanismo para prolongar os telômeros?
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A Enzima Telomerase
 Mas se nós envelhecemos, então quando e onde a telomerase
está ativa?
a) durante a embriogênese,
b) nos indivíduos adultos – nas células germinativas e nos tipos
celulares de divisão rápida.
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Exercícios:
1. Quais são os dois tipos principais de ligações químicas que
formam uma molécula de DNA e como elas podem ser
comparadas em termos de forca de ligação?
2. Explique o que significa uma replicação semiconservativa,
conservativa e dispersiva.
3. Qual é a função do iniciador de RNA na replicação do DNA?
4. Tendo como base a Regra de Chargaff determine quais são os
percentuais das bases A, T, C e G em uma molécula de DNA com
um conteúdo de 56% do par CG.
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