HAV Ab - Enzipharma diagnóstica

do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de
fileira a fileira com incubação em cada etapa.
P
HAV Ab
Código: 60456002 Versão: 456/P6
Antes de iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são prédiluídas a 1:50 e adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira
A da Placa Reveladora. O Pente é então colocado nas cavidades
da fileira A. IgG e IgM serão capturados pelos anticorpos anti-IgG
e anti-IgM dos pontos inferiores dos dentes do Pente (Figura 1).
Os componentes não ligados são removidos por lavagem na
fileira B. Na fileira C, os anticorpos IgM e IgG anti-HAV
capturados nos dentes reagirão com antígenos HAV.
Simultaneamente, os antígenos HAV também se ligarão aos
anticorpos anti-HAV no ponto superior (Controle Interno). Na
fileira D os antígenos HAV ligados reagirão com os anticorpos
monoclonais anti-HAV marcados com fosfatase alcalina (FA). Na
fileira E, os componentes não ligados são removidos por
lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com os
componentes cromogênicos. Os resultados são visíveis como
pontos cinza azulados na superfície do dente do Pente.
Formato: 3 x 12 testes
O kit ImmunoComb® II HAV Ab é um teste para a detecção semi
quantitativa dos anticorpos para o vírus de hepatite A (HAV) em
soro ou plasma humano. Trinta e seis testes podem ser
realizados com um kit.
Introdução
A hepatite A é uma doença freqüente em humanos, causada pelo
vírus da hepatite A (HAV). Após um período de incubação de 1440 dias, a infecção por HAV geralmente se manifesta por icterícia,
devido à inflamação aguda do fígado e concentrações elevadas
de bilirrubina no sangue. Não foram reportados casos de infecção
crônica.
A hepatite A é endêmica em todas as partes do mundo. Sua
epidemiologia é acentuadamente influenciada pelo nível local de
saneamento e higiene. A transmissão ocorre por via fecal-oral.
Um alto nível de vírus (até 108 unidades infecciosas por grama) é
excretado nas fezes alguns dias antes da manifestação dos
sintomas clínicos ou icterícia. A disseminação do vírus é, então,
facilitada através do contato direto ou através do consumo de
água ou alimentos contaminados.
A profilaxia bem sucedida da hepatite A é atualmente obtida por
imunização passiva com imunoglobulinas anti-HAV humanas.
Além disso, foram recentemente desenvolvidas vacinas para
HAV.
Diversas causas de origem viral (ex. vírus da hepatite B e hepatite
C) ou não virals podem induzir a hepatite. Conseqüentemente, o
diagnóstico da infecção por HAV baseado apenas nos sintomas
clínicos e na avaliação bioquímica das funções hepáticas, é muito
difícil. Entretanto, o imunodiagnóstico permite a identificação do
agente etiológico.
O ensaio HAV Ab facilita a determinação do estado imune de
indivíduos após exposição ao HAV ou vacina para hepatite A. A
detecção de anticorpos anti-HAV na ausência de anticorpos do
tipo IgM anti-HAV, indica tanto uma infecção precoce com HAV
como uma vacinação bem sucedida. Em geral, um título de 10
UI/L é considerado como a concentração mínima de anticorpos
anti-HAV para indicar imunização do indivíduo.
Princípio do Teste
O teste ImmunoComb® II HAV IgM é um ensaio imunoenzimático
(EIA) em fase sólida, baseado no princípio de imunocaptura. A
fase sólida é um pente com doze projeções (“dentes”). Cada
dente é sensibilizado em duas posições:
Ponto superior – anticorpo monoclonal para HAV (Controle
Interno).
Ponto inferior – anticorpos de coelho para IgG e IgM humanos.
A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada
fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas
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Figura 1. Princípio do Teste
O kit inclui um Controle Positivo (anticorpos anti-HAV) e um
Controle Negativo, para serem incluídos em cada ensaio para
confirmar a validação do teste. Ao término do teste, o dente
usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinzaazulados. O dente usado com o Controle Negativo deve mostrar o
ponto superior e nenhum ponto inferior ou um ponto bem claro. O
ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes,
para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o
teste foi realizado corretamente.
Conteúdo do kit
Pentes
O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um
dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado
com duas áreas reativas:
Ponto superior – anticorpo monoclonal para hepatite A (Controle
Interno).
Ponto inferior – anticorpos de coelho para IgG e IgM humanos.
Figura 2. Pente
Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo
dessecante.
Placas Reveladoras
O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de
alumínio.
Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes
necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6
fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é:
1
2.
Fileira A
Fileira B
Diluente de amostra
Solução de lavagem
Fileira C
Fileira D
Antígeno HAV
Anticorpo monoclonal anti-HAV marcado com
fosfatase alcalina
Solução de lavagem
Solução substrato cromogênico contendo 5bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de
nitrotetrazolium (NBT)
Fileira E
Fileira F
Figura 3. Placa Reveladora
Controle Positivo – 1 frasco (tampa vermelha) de 0,2 ml de
plasma humano, inativado pelo calor, diluído a um título de 100
UI/L para anticorpos HAV.
Controle Negativo – 1 frasco (tampa verde) de 0,2 ml de plasma
humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anti-HAV.
Diluente de amostra – 1 frasco (tampa branca) de 20 ml de
diluente.
Perfurador – para a perfuração da folha de alumínio que cobre as
cavidades da Placa Reveladora.
CombScaleTM – para leitura dos resultados do teste.
Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por
45 minutos.
3. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser
descartado como resíduo bioinfectante no final do teste.
4. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora.
Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora.
Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da
pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado nas
instruções do Teste.
Preparando o Pente
Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste,
não tocar nos dentes do pente.
1. Rasgar o saco de alumínio do Pente na extremidade
marcada. Remover o Pente.
2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou
parcialmente. Para usar parte de um pente:
a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as
amostras e controles. Você precisa de um dente para cada
teste. Cada dente mostra o número “56” do código do kit,
para permitir a identificação dos dentes destacados.
b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a
tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário
de dentes (nº de testes incluindo 2 controles).
c. Retornar a parte do Pente não utilizada para a embalagem
de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem,
por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o
Pente na caixa original do kit de 2 – 8ºC para uso posterior.
Segurança e Precauções
•
•
•
•
•
•
•
Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro.
Todos os materiais de origem humana usados na
preparação do kit foram testados e considerados não
reativos para antígeno de superfície da hepatite B,
anticorpos para o vírus da hepatite C e anticorpos para HIV.
Como nenhum teste pode garantir completamente a
ausência de contaminação viral, todas as soluções de
referência e amostras humanas devem ser manipuladas
como potencialmente infectantes.
Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos
aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma.
Não pipetar com a boca.
Descartar todas as amostras, Pentes, Placas Reveladoras e
outros materiais utilizados com o kit como resíduo
bioinfectante.
Não misturar reagentes de lotes diferentes.
Não usar o kit após o vencimento.
Armazemamento do Kit
Armazenar o kit em sua embalagem original de 2 – 8ºC. Nestas
condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do
rótulo. Não congelar o kit.
Manipulação das amostras
Tanto o soro como o plasma podem ser testados.
As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2 – 8ºC antes
do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as
amostras a –20ºC ou inferior.
Centrifugar as amostras de soro após descongelamento.
Testar o sobrenadante.
Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
Procedimento do Teste
Material Necessário
•
Pipetas de precisão ajustáveis e ponteiras descartáveis para
dispensar 10 µL, 25 µL e 490 µL.
•
Tesoura.
•
Cronômetro ou relógio de laboratório.
•
Microtubos
Preparando o Teste
1. Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, pentes,
reagentes e amostras à temperatura ambiente.
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Figura 4. Quebrando o Pente
Instruções do Teste
Pré-diluição de Amostras e Controles
1. Para cada amostra e controle, dispensar 490 µL do diluente
de amostra em um microtubo.
2. Para cada microtubo, adicionar 10 µL de uma amostra ou do
Controle Positivo ou Controle Negativo fornecidos no kit.
Misturar enchendo e esvaziando a solução diversas vezes.
Captura de Anticorpos (Fileira A da Placa Reveladora)
Nota: Realizar as incubações a 37ºC. As etapas de lavagem
devem ser realizadas à temperatura ambiente (22 - 26ºC).
3. Pipetar 25 µL de uma amostra pré-diluída. Perfurar a tampa
de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa
Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e
dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar
repetidamente enchendo e esvaziando a ponteira com a
solução. Descartar a ponteira da pipeta.
4. Repetir o passo 3 para as outras amostras pré-diluídas, e os
dois controles pré-diluídos. Usar uma nova cavidade da fileira
A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle.
5. a) Colocar o Pente (o lado impresso de frente para você)
nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles.
Misturar: Retirar e inserir o Pente nas cavidades várias
vezes.
b) Deixar o Pente na fileira A e incubar por 2 horas a 37ºC.
Ajustar o cronômetro. Misturar mais três vezes (a cada 30
minutos) durante a incubação. Próximo ao final de 2 horas,
perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não
abrir mais cavidades que o necessário.
c) Ao final de 2 horas, retirar o Pente da fileira A. Absorver o
líquido residual nas pontas dos dentes em papel
absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos dentes.
Primeira lavagem (Fileira B)
6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e
inserir vigorosamente o Pente nas cavidades e deixar no
mínimo 10 segundos para obter uma lavagem apropriada.
Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos;
neste intervalo perfurar as coberturas da fileira C. Após 2
minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como
no passo 5c.
Reação antígeno-anticorpo (Fileira C)
2
7.
Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no
passo 5a. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 30
minutos (ajustar o cronômetro) a 37ºC. Perfurar as
coberturas da fileira D. Misturar mais uma vez durante a
incubação. Após os 30 minutos, retirar o Pente e absorver o
líquido residual.
Ligação do Conjugado (Fileira D)
8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar. Incubar a
Placa Reveladora com o Pente por 20 minutos (ajustar o
cronômetro) a 37ºC. Perfurar as coberturas da fileira E.
Misturar mais uma vez durante a incubação. Após 20
minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual.
Segunda Lavagem (Fileira E)
9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar
repetidamente durante 2 minutos, como no passo 6. Perfurar
as coberturas da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e
absorver o líquido residual.
Reação de Cor (Fileira F)
10. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Incubar
a Placa Reveladora com o Pente por exatamente 10 minutos
(ajustar o cronômetro) a 37ºC. Após 10 minutos retirar o
Pente.
Reação de Parada (Fileira E)
11. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar
o Pente e deixar secar ao ar livre.
Descarte do lixo
Descartar as Placas Reveladoras utilizadas, ponteiras,
microtubos, papel absorvente e luvas, como lixo bioinfectante.
Figura 6. CombScale
1.
2.
Armazenamento da parte não utilizada do kit
Placa Reveladora
Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas,
podem ser guardadas para uso posterior:
•
Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a
evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido
esvaziada.
Outros materiais do kit:
•
Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes,
perfurador, controles e instruções de uso ao kit.
Armazenar de 2 - 8ºC.
Interpretação dos Resultados
Validação
Para confirmar o correto funcionamento do teste e demonstrar
que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem
ser cumpridas (veja Figura 5).
1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do
Pente.
2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior
(Controle interno). O ponto inferior não irá aparecer ou
aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos
resultados.
3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior
(Controle interno).
Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados
são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados.
Controle
Positivo
Controle
Negativo
Resultados
Inválidos
Figura 5. Validação dos testes.
Leitura e Interpretação dos Resultados
Interpretação Semiquantitativa por Leitura Visual
O nível de anticorpos anti-HAV em cada amostra pode ser
estimado pela comparação da intensidade de cor do ponto inferior
de cada dente, com a escala de cor do CombScale fornecido com
o kit:
Calibrar o CombScale. Colocar o ponto inferior do dente de
Controle Positivo sob a intensidade de cor mais semelhante
à escala de cores. Ajustar a régua de modo que “100; C+”
apareça na janela acima da intensidade de cor selecionada.
Ler os resultados sem alterar a posição de calibração da
régua. Comparar a intensidade de cor de cada ponto inferior
com a intensidade de cor mais semelhante ao da escala. Um
ponto com intensidade maior ou igual à do ponto do cutoff
(10 UI/L) indica a presença de um título de proteção de
anticorpos anti-HAV. Um ponto com uma coloração
ligeiramente inferior à do cutoff deve ser considerada como
resultado duvidoso e a amostra deve ser retestada. Um
ponto com intensidade menor que a do cutoff deve ser
considerado como resultado negativo.
Leitura no Equipamento
O refletômetro do CombScanTM (ver o Manual de Uso do
Combscan para instruções detalhadas) permite uma leitura rápida
e objetiva da intensidade da cor dos pontos no ImmunoComb. Ler
os resultados como absorbância relativa usando o programa # 92
do CombScan, determinando a leitura do ponto inferior digitando
“1” quando aparecer a mensagem “pontos: 1,2,3” na tela.
Valores de absorbância relativa de 350 (< 10 UI/L) ou inferiores
são soronegativos para anticorpos para HAV.
Valores de 350-400 são duvidosos e a amostra deve ser
retestada. Valores de 401 ou superiores são considerados como
resultados positivos (> 10 UI/L).
Documentação dos resultados
Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem
ser guardados para documentação.
* Baseado na calibração usando o padrão da OMS de
imunoglobulina anti-HAV W1041.
Limitações
O kit ImmunoComb® II HAV IgM é um teste de triagem.
Resultados do teste que indicam que uma amostra é reativa para
anticorpos para HAV não devem ser considerados como
diagnóstico de infecção por hepatite A ou imunização para HAV.
Os resultados dos testes devem ser avaliados em conjunto com
todos os sintomas, históricos clínicos e outros testes laboratoriais
realizados para o paciente.
Características de Desempenho*
A sensibilidade e a especificidade do kit do ImmunoComb II HAV
Ab foram avaliados pela comparação com kits EIA de referência
em 690 amostras: 596 amostras de doadores de sangue
voluntários, 94 amostras de pacientes com infecção aguda ou
passada por HAV. Os resultados destes testes estão resumidos
na Tabela 1.
Tabela 1. Comparação do ImmunoComb HAV Ab com EIA de
referência na determinação de anticorpos para vírus da
hepatite A.
EIA de
Referência
•
•
•
456/P6
ImmunoComb II HAV Ab
Positivo
Positivo
257
Negativo
7
Negativo
7
419
Sensibilidade – 97,3%
Especificidade – 98,3%
Concordância geral: 98,0%
3
As reações cruzadas com amostras positivas de hepatites
causadas por agentes, tais como o vírus da hepatite B ou C,
citomegalovírus, vírus Epstein Barr, herpes simples e toxoplasma
foram encontradas insignificantes.
A interferência com amostras hemolisadas, lipêmicas e com
bilirrubina alta foi encontrada insignificante. Amostras de
pacientes com fator reumatóide (FR) e doenças autoimunes não
interferem no teste.
Os anticoagulantes testados, como heparina, EDTA e citrato de
sódio não tiveram nenhum efeito nos resultados do teste.
P.O.Box 360 Yavne 70650, Israel
http://www.orgenics.com
* Informação detalhada disponível mediante solicitação.
Bibliografia
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1993 Hepatitis A antibody titres after infection and immunization;
Implications for passive and active immunization.JMéd.Virol
40:22-27
Produzido por:
ORGENICS LTD.
P.O.Box 360, Yavne
70650 - ISRAEL
Registro e Distribuição:
ORGENICS DO BRASIL LTDA.
Alameda dos Ubiatans, 257 - Planalto Paulista
04070-030 São Paulo - SP
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Atendimento ao consumidor
SAC: (11) 5589-4622
FAX: (11) 5581-3279
e-mail: [email protected]
Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro"
Registro ANVISA nº 10348680035
Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva
CRF-SP 13020
CONSERVAR ENTRE 2 - 8ºC
456/P6
4
Resumo dos Principais Procedimentos do Teste
Resumo do Procedimento de Teste
As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II HAV Hb.
(Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo)
1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 45 minutos.
2. Pré-diluir 10 µL de cada amostra e controle misturando com 490 µL do diluente da amostra.
3. Dispensar 25 µL de cada amostra e controle pré-diluídos nas cavidades da fileira A da Placa
Reveladora.
4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1.
Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste
Etapa
Captura de anticorpos
Fileira
A
Proceder como a seguir
Misturar; incubar por 2 horas a 37ºC; absorver.
Lavagem
B
Agitar; incubar por 2 minutos; absorver.
Reação antígeno –
anticorpo
C
Misturar; incubar por 30 minutos a 37ºC; absorver.
Ligação do conjugado
D
Agitar; incubar por 20 minutos a 37ºC; absorver.
Lavagem
E
Agitar; incubar por 2 minutos; absorver.
Reação de cor
F
Misturar; incubar por 10 minutos a 37ºC.
Reação de parada
E
Incubar por 1 minuto; secar ao ar livre.
456/P6
5