Rubéola IgG - Enzipharma diagnóstica

Princípio do Teste
P
Rubéola IgG
Código: 60400002 Versão: 400/P5
O teste ImmunoComb® II Rubella IgG é um ensaio
imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um
pente com doze projeções (“dentes”). Cada dente é sensibilizado
em duas posições:
Ponto superior – Imunoglobulina humana (Controle Interno).
Ponto inferior – Antígenos de Rubéola inativados.
A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada
fileira contendo reagente pronto para uso em diferentes etapas do
ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de
fileira a fileira com incubação em cada etapa.
Antes de iniciar o teste, amostras de soro ou plasma são prédiluídas 1:11 e adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A
da Placa Reveladora. O Pente é então colocado nas cavidades da
fileira A. Anticorpos contra o vírus da Rubéola, se presentes na
amostra, irão ligar-se especificamente aos antígenos de rubéola
nos pontos inferiores dos dentes do Pente (Figura 1). Os
componentes não ligados são removidos por lavagem na fileira B.
Na fileira C, os IgG anti-Rubéola capturados nos pontos inferiores
dos dentes, e a imunoglobulina humana dos pontos superiores
(Controle Interno), reagirão com anticorpos anti-IgG humano
marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras,
os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na
fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com componentes
cromogênicos. Os resultados são visíveis como pontos cinza
azulados na superfície do dente do Pente.
Formato: 3 x 12 testes
O kit ImmunoComb® II Rubella IgG é um teste para a
determinação quantitativa de anticorpos IgG para o vírus da
Rubéola em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta
e seis testes com o kit.
Introdução
O vírus da Rubéola é um membro da família Togaviridate,
encontrado principalmente em populações humanas. A
transmissão se dá principalmente por aerossóis ou por contato
direto, com um pico de incidência da doença na faixa etária de 514 anos. Em geral, a infecção se manifesta como uma doença
benigna
e
autolimitante,
caracterizada
por
erupção
maculopapoular (sarampo), febre tênue e linfoadenopatia. Podem
ocorrer ocasionalmente artralgia provisória e artrite suave.
Ao contrário, a infecção primária por Rubéola contraída durante o
início da gravidez, pode resultar em danos severos ao feto,
natimorto ou aborto. Os sintomas de crianças com infecção
congênita incluem anormalidades anatômicas e neuro-sensoriais
sérias, tais como surdez, defeitos cardíacos, catarata, glaucoma e
retardo mental. O retardo no crescimento e a diabete mellitus
também foram associados com complicações posteriores da
rubéola congênita.
A vacinação em massa tem reduzido significativamente a
incidência de Rubéola em todas as faixas etárias. Entretanto, 10 a
20% de jovens adultos ainda são suscetíveis ao vírus.
A triagem de anticorpos IgG para o vírus da rubéola é uma
ferramenta útil para o diagnóstico da doença e para a
determinação do estado da imunização. Os anticorpos para o
vírus aparecem à medida que a erupção diminui. Nos adultos, os
anticorpos IgG geralmente, persistem por toda a vida.
Conseqüentemente, um título estável de IgG anti-rubéola
demonstra a exposição prévia ao vírus, enquanto um aumento
quadruplicado ou maior é diagnóstico de infecção recente.
Entretanto, um aumento no título de IgG na ausência de sintomas
clínicos, pode também indicar reinfecção. Como os anticorpos
IgM não são produzidos na reinfecção, esta possibilidade deve
ser excluída por um resultado negativo em um teste anti-rubéola
IgM.
A produção de anticorpos IgG circulantes contra o vírus da
Rubéola por crianças infectadas congenitamente, geralmente
persiste até 3-4 anos após o parto. A determinação seriada do
nível de IgG anti-rubéola na criança, no entanto, irá ajudar na
diferenciação entre Rubéola congênita (nível estável) ou Rubéola
neonatal (aumento no título).
400/P5
Figura 1. Princípio do Teste
O kit inclui um Controle Positivo (IgG anti-Rubéola) e um Controle
Negativo para serem incluídos em cada ensaio. Ao término do
teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2
pontos cinza-azulados. O dente utilizado com o Controle Negativo
deve mostrar o ponto superior e nenhum ponto inferior, ou um
ponto bem claro. O ponto superior deve aparecer também em
todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando
adequadamente e se o teste foi realizado corretamente.
Conteúdo do Kit
Pentes
O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um
dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado
com duas áreas reativas:
Ponto superior – Imunoglobulina humana (Controle Interno).
Ponto inferior – Antígenos de Rubéola inativados.
Figura 2. Pente
Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo
dessecante.
Placas Reveladoras
O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de
alumínio.
1
Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes
necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6
fileiras (A-F) de 12 cavidades cada.
O conteúdo de cada fileira é:
Fileira A
Fileira B
Fileira C
Fileira D
Fileira E
Fileira F
Diluente de amostra
Solução de lavagem
Anticorpos de cabra anti-IgG humano marcados com
fosfatase alcalina.
Solução de lavagem
Solução de lavagem
Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo-4cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium
(NBT)
Preparando o Teste
Trazer todos os reagentes, Placas Reveladoras, pentes,
reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste a
temperatura de 22 – 26º C.
Preparando a Placa Reveladora
1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por
20 minutos; ou deixar à temperatura ambiente (22 – 26ºC)
por 3 horas. Trazer todos os outros componentes (pentes,
diluente de amostra, controles e amostras) à temperatura
ambiente.
2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser
descartado como resíduo bioinfectante ao final do teste.
3. Misturar os reagentes agitando a Placa reveladora.
Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora.
Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da
pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado, nas
instruções do Teste.
Figura 3. Placa Reveladora
Controle Positivo – 1 frasco (tampa vermelha) de 0,2 mL de
plasma humano, inativado pelo calor, diluído para um nível de
cutoff de 15 IU/mL de anticorpos IgG para o vírus da Rubéola.
Controle Negativo – 1 frasco (tampa verde) de 0,2 mL de plasma
humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anticorpos
para o vírus da Rubéola.
Diluente da amostra – 1 frasco (tampa transparente) de 5 mL.
Perfurador – para perfurar a folha de alumínio que cobre as
cavidades da Placa Reveladora.
CombScaleTM – para a leitura dos resultados.
Preparando o Pente
Precaução: Para assegurar o correto funcionamento do teste,
não tocar nos dentes do pente.
1. Rasgar o saco de alumínio do Pente na extremidade
marcada. Remover o Pente.
2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou
parcialmente. Para usar parte de um pente:
a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as
amostras e controles. Você precisa de um dente para cada
teste. Cada dente mostra o número “00” do código do kit,
para permitir a identificação dos dentes destacados.
b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a
tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário
de dentes (nº de testes incluindo 2 controles).
c. Retornar a parte do Pente não utilizada para a embalagem
de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem,
por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o
Pente na caixa original do kit de 2 – 8ºC para uso posterior.
Segurança e Precauções
•
•
•
•
•
•
•
Este kit é somente para uso diagnóstico in vitro.
Os materiais de fonte humana usados na preparação do kit
foram testados e considerados não-reativos para o antígeno
de superfície de hepatite B e para anticorpos para hepatite C
e para HIV. Como nenhum teste pode garantir
completamente a ausência de contaminação viral, todas as
soluções de referência e amostras humanas devem ser
manipuladas como potencialmente infectantes.
Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos
aceitos de laboratório para trabalhar com soro ou plasma.
Não pipetar com a boca.
Descartar todas as amostras, Pentes (a menos que sejam
guardados
para
documentação
posterior),
Placas
Reveladoras e outros materiais usados com o kit como
resíduo bioinfectante.
Não misturar reagentes de lotes diferentes.
Não usar o kit após o vencimento.
Armazemamento do Kit
Armazenar o kit em sua embalagem original de 2 - 8ºC. Nestas
condições, o kit permanecerá estável até a data de validade do
rótulo. Não congelar o kit.
Manipulação das amostras
Tanto o soro como o plasma podem ser testados.
As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2 - 8ºC antes
do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as
amostras a –20ºC ou inferior.
Centrifugar as amostras após o descongelamento. Testar o
sobrenadante.
Evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento.
Procedimento do Teste
Material Necessário
•
Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar
10 µL, 25 µL e 100 µL.
•
Tesoura.
•
Cronômetro ou relógio de laboratório.
•
Microtubos ou cavidades de microtitulação.
400/P5
Figura 4. Quebrando o Pente
Instruções do Teste
Pré-diluição de Amostras e Controles
1. Para cada amostra e controle, dispensar 100 µL do diluente
de amostra em um microtubo ou cavidade de microtira.
2. Para cada microtubo ou cavidade, adicionar 10 µL de uma
amostra ou do Controle Positivo ou Controle Negativo
fornecido no kit.
Misturar aspirando e dispensando a solução repetidamente.
Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora)
3. Pipetar 25 µL de uma amostra pré-diluída. Perfurar a
cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa
Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e
dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar
aspirando e dispensando repetidamente a ponteira com a
solução.
Descartar a ponteira da pipeta.
4. Repetir o passo 3 para as outras amostras pré-diluídas, e os
dois controles pré-diluídos. Usar uma nova cavidade da fileira
A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle.
5. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas
cavidades da fileira A contendo as amostras e controles.
Misturar: Inserir e retirar o Pente nas cavidades várias
vezes.
b) Deixar o Pente na fileira A por 30 minutos. Ajustar o
cronômetro. Próximo ao final dos 30 minutos, perfurar a
cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais
cavidades que o necessário.
c) Ao final dos 30 minutos, retirar o Pente da fileira A.
Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em
2
papel absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos
dentes.
Primeira lavagem (Fileira B)
6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Inserir e
retirar o Pente vigorosamente das cavidades e deixar
inserido por pelo menos 10 segundos para obter uma
lavagem correta. Repetir a agitação várias vezes no período
de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C.
Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido
residual como no passo 5c.
Ligação de Conjugado (Fileira C)
7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no
passo 5a. Ajustar o cronômetro para 20 minutos. Perfurar a
cobertura da fileira D. Após 20 minutos, retirar o Pente e
absorver o líquido residual.
Segunda lavagem (Fileira D)
8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar
repetidamente por 2 minutos, como no passo 6. Neste
intervalo, perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos,
retirar o Pente a absorver o líquido residual.
Terceira Lavagem (Fileira E)
9. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar
repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a
cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente a
absorver o líquido residual.
Reação de Cor (Fileira F)
10. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Ajustar o
cronômetro para 10 minutos. Após 10 minutos retirar o
Pente.
Reação de Parada (Fileira E)
11. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar
o Pente e deixar secar ao ar livre.
Descarte do lixo
Descartar as Placas Reveladoras, ponteiras, microtubos ou
cavidades de microtitulação, papel absorvente e luvas usadas,
como lixo bioinfectante.
Armazenamento da parte não usada do kit
Placa Reveladora
Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas,
podem ser guardadas para uso posterior:
•
Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva de forma que
nada possa respingar de dentro delas, mesmo que a Placa
Reveladora tenha sido esvaziada.
Outros materiais do kit:
•
Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes,
Controles, perfurador, diluente de amostra e instruções de
uso à caixa original. Armazenar entre 2 – 8ºC.
Resultados dos Testes
Validação
Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar
que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem
ser cumpridas (veja figura 5).
1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do
Pente.
2. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior
(Controle Interno). O ponto inferior não irá aparecer ou
aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos
resultados.
3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior
(Controle interno).
Caso alguma destas condições não seja cumprida, os resultados
são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados.
Figura 5. Validação dos testes.
Leitura e Interpretação Qualitativa dos Resultados
Triagem
Comparar a intensidade do ponto inferior de cada dente de
amostra com o ponto inferior do dente do Controle Positivo
(Figura 6).
400/P5
•
•
Um ponto com intensidade maior ou igual a do controle
positivo indica a presença de anticorpos IgG para o vírus da
Rubéola.
Nenhum ponto ou um ponto com intensidade menor que a
do Controle Positivo é considerado um resultado negativo.
Figura 6. Resultados do Teste
Interpretação Semiquantitativa por Leitura Visual
O nível de IgG anti-rubéola em cada amostra pode ser estimado
comparando-se a intensidade de cor do ponto inferior de cada
dente com a escala de cor do CombScale fornecido com o kit.
Esta comparação se dá como a seguir:
Figura 7. CombScale
1.
2.
Calibrar o CombScale. Colocar o ponto inferior do dente do
Controle Positivo sob a intensidade de cor mais semelhante
ao da escala. Ajustar a régua de modo que “15; C+” apareça
na janela acima da intensidade de cor selecionada.
Ler os resultados sem alterar a posição calibrada da régua.
Absorbância Relativa
Título (IU/mL)*
0 –799
<15
800 – 1150
15
1151 – 1550
30
1551 – 1850
60
1851 – 2100
120
≥ 2101
≥ 240
Comparar a intensidade de cor de cada ponto inferior com a
intensidade mais parecida da escala de cor. Marcar a
concentração (em UI/mL) que aparece acima daquela janela
como sendo o nível aproximado de anticorpos IgG para vírus
da Rubéola para aquela amostra.
Leitura no Equipamento
O refletômetro CombScanTM (ver o Manual do Usuário do
CombScan para instruções detalhadas) permite uma leitura
rápida e objetiva da intensidade da cor dos pontos do
ImmunoComb. Ler os resultados dos testes como absorbância
relativa usando o programa # 92 do CombScan, designando a
leitura do ponto inferior digitando “1” quando aparecer a
mensagem “pontos: 1,2,3” na tela. Converter as unidades de
absorbância relativa obtidas em valores de título de acordo com a
Tabela 1.
Tabela 1. Conversão das leituras de absorbância relativa em
títulos IgG.
* Baseado na calibração utilizando o 2º padrão Inglês para soro
anti-rubéola (67/182).
3
Documentação dos resultados
Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem
ser armazenados para documentação posterior.
Limitações
Como em outros testes destinados ao uso diagnóstico in vitro, os
resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com
todos os sintomas, histórico clínico e outros dados laboratoriais
realizados para o paciente.
Características de Desempenho*
A sensibilidade e a especificidade do kit ImmunoComb II Rubella
IgG foram avaliadas em um painel de 398 amostras de soro, em
comparação com um teste EIA de referência.
Os resultados estão resumidos na Tabela 2.
Teste de
Referência
ImmunoComb II Rubella IgG
Positivo
Positivo
301
Negativo
24
Negativo
7
66
Tabela 2. Resultados dos Testes
Foram calculadas as seguintes características de desempenho:
•
Sensibilidade – 92,6%
•
Especificidade – 90,4%
* Informação detalhada disponível mediante solicitação.
Bibliografia
Chernesky MA. Mahony JB. 1991. Rubella Vírus. In: Balows A,
Hausler WJ, Hermann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ, eds.
Manual of Clinic microbiology, Fifth Edition. American society for
Microbiology, Washington, DC, pp. 918-923.
Frenkel LD, Bellanti JA. 1982. Immunology of measles, mumps
and rubella virusars. In:Nahmias AJ, O’Reilly RJ, eds.
Immunology of Human Infection. Part II: Virusars and parasites;
Immunodiagnosis and Prevention of Infectious Diseases. Plenum
Medical Book Co., New York. Pp. 135-163.
Ray CG. 1984. Virusars of mumps and childhood exanthemes. In:
SherrisJC, ed. Medical Microbiology- na introduction to Infectious
Diseases, Elsevier, New York. Pp. 383-387.
Produzido por:
ORGENICS LTD.
P.O.Box 360, Yavne
70650 - ISRAEL
Registro e Distribuição:
ORGENICS DO BRASIL LTDA.
Alameda dos Ubiatans, 257 - Planalto Paulista
04070-030 São Paulo - SP
CNPJ : 01.767.606/0001-10
Atendimento ao consumidor
SAC: (11) 5589-4622
FAX: (11) 5581-3279
e-mail: [email protected]
Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro"
Registro ANVISA nº 10348680025
Resp. Técnico : Wellington Staduto Braga da Silva
CRF-SP 13020
CONSERVAR ENTRE 2 - 8ºC
P.O.Box 360 Yavne 70650, Israel
http://www.orgenics.com
400/P5
4
Resumo dos Principais Procedimentos do Teste
Resumo do Procedimento de Teste
As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II Rubella IgG.
(Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo).
1. Trazer todos os reagentes e amostras para a temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de
22 – 26ºC.
2. Pré-diluir 10 µL de cada amostra e controle com 100 µL de diluente de amostra.
3. Dispensar 25 µL de cada amostra e controle pré-diluídos nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora
e misturar.
4. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1:
Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste.
Etapa
Reação antígeno-anticorpo
Fileira
A
Proceder como a seguir
Misturar; incubar 30 minutos;
absorver.
Agitar; incubar 2 minutos; absorver.
Lavagem
B
Ligação do Conjugado
C
Lavagem
D
Misturar; incubar 20 minutos;
absorver.
Agitar; incubar 2 minutos; absorver.
Lavagem
E
Agitar; incubar 2 minutos; absorver.
Reação de cor
F
Misturar; incubar 10 minutos.
Reação de parada
E
Incubar 1 minuto; secar ao ar livre.
400/P5
5