Baixe o Artigo aqui

Interbio v.1 n.2 2007 - ISSN 1981-3775
30
IMUNIZAÇÃO COM BRADICININA INDUZ DOR E RESPOSTA IMUNE COM
PERFIL TH1
IMMUNIZATION WITH BRADIKININ INDUCE PAIN AND TH1 STANDARD OF
IMMUNE RESPONSE
PAVANELLI, Wander Rogério 1
Resumo
Estudos recentes demonstram que a infecção com T. cruzi está relacionada a atividade da bradicinina
(BK). Esse peptídeo vasoativo é capaz de ativar essas células, promovendo sua maturação e estimulando
o aumento na produção de IL-12, desta forma direcionando para uma resposta de células T antígeno
específico com um perfil Th1 de resposta. Então este trabalho teve por objetivo, analisar o papel da BK
como o adjuvante (polarização da resposta para Th1), e seu efeito hiperalgésico. Camundongos BALB/c
foram tratados com o captopril 1 hora (h) antes da imunização com Ovalbumina (OVA) (10
µg/camundongo) ou com salina em emulsão de hidróxido de alumínio (alum) (50 ml/pata). Bradicinina
BK (1ug/camundongo) foi injetada também em 5 camundongos diluída em emulsão de alum. A
intensidade de hipernocicepção (dor) foi determinada usando o método de Von Frei, e ainda foi
observado a produção das citocinas (IL-12 e IFN-γ) a partir do sobrenadante da cultura de células do baço
de camundongos imunizados. Verificou-se que somente o alum era capaz de induzir dor nos
camundongos tratado com o captopril, sugerindo que o alum possui uma pequena atividade na síntese das
cininas (hiperalgesia induzida) que tende a aumentar quando na presença de bradicinina. Com relação aos
níveis de citocinas, foi verificado que as células estimuladas in vivo com OVA dos camundongos tratados
previamente (captopril) e imunizados com BK, apresentaram altos níveis (p<0.05) para as citocinas IL-12
e o IFN-γ quando na presença de OVA (estímulos) com relação aos outros grupos. Já com relação à
produção dos anticorpos, nós verificamos que para IgG e IgG1, não houve diferenças entre os grupos,
porém quanto para aos níveis de IgG2a, foi possível observar valores significativos para os camundongos
previamente imunizados com BK. Estes dados preliminares indicam que os animais tratados com
captopril e imunizados com BK, apresentaram polarização da resposta para um perfil característico de
células Th1.
Palavras chave: imunização, bradicinina, dor, reposta Th1.
Abstract
Recent studies have been demonstrate that the infection with Trypanossoma cruzi is linked to functional
changes of the bradykinin (BK), that are peptides vasoactive capable to activity of the dendritics cells
directly promoting maturation, and stimulating the increase of the production of IL-12, driven skewing of
Ag-specific T cell response to type 1 cytokine profile. Then this work had for objective to analyze the
paper of the (BK) as adjuvant (polarizing Th1), and to verify your effect hyperalgesic. BALB/c mice were
treated with captopril 1h before immunization with OVA (10 µg/mouse) or saline in alum emulsions (50
ml/footpad). Bradykinin (BK) (1ug/mouse) was also injected in some mice diluted in the emulsion of
alum. The intensity of hypernociception was determined using Von Frei metods, cytokines production
from murine spleens of the mice immunization. It was verified that alum was capable to induce effect
hyperalgesic in mouse treated with captopril, suggesting that the alum possesses a small presence in the
kinins synthesis (hyperalgesia induced) that tends to increase when in the presence bradykinin. In relation
to the cytokines levels obtained from the supernatants of the culture of cells the spleens, we verified that
cells (in vivo priming with OVA) of the mice previously treated (captopril) and immunized with (BK),
they presented strongly levels (p<0.05) for both cytokines IL-12 and IFN-γ when in the presence of OVA
(stimulus) in relation to the other groups. Already in relation to the production of antibody, we verified
that for IgG and IgG1, there were not statistical differences among the groups, however as for the levels
of IgG2a, it was possible to observe that mice previously immunized with (BK) presented values
significant increased (p<0.05). These preliminary data indicate that immunizations with OVA combined
with bradykinin induce polarization of the response anti-OVA for a characteristic profile of cells Th1.
Key-Words: immunization, bradikinin, pain, Th1 response.
1
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Faculdade de Medicina-Universidade de São PauloRibeirão Preto-SP-Brasil
PAVANELLI, Wander Rogério
Interbio v.1 n.2 2007 - ISSN 1981-3775
Introdução
A bradicinina é nonapeptídio que
exerce suas ações, em concentração
nanomolar, após interagir com receptores
específicos (B1R e B2R) na membrana
plasmática de células-alvo (ROCHA E
SILVA et al., 1949). Recentes estudos
têm sugerido que a infecção com T. cruzi
está ligada a mudanças funcionais da
atividade de potentes mediadores
vasoativos, as cininas peptídeos proinflamatórios que medeiam diversas
respostas vasculares e de dor no tecido
danificado (LEE-LUNDBERG et al.,
2005). Del Nery et al. (1997)
descreveram a cruzipaina como uma
cininogenase, enzima que degrada o
cininogênio e da origem a bradicinina,
sendo este o ponto de partida para uma
série de estudos sobre o papel do sistema
cinina na relação parasita hospedeiro. Tal
processo ocorre pela clivagem dos
cininogênios de alto peso molecular que,
se encontram aderidos às células
endoteliais ou disperso no plasma, pela
atividade enzimática da kalicreína
plasmática ou por outras cininogenases
como a cruzipaína (DEL NERY et al.,
1997) liberando peptídeos vasoativos,
dentre eles a bradicinina (GUO et al.,
2005).
Alguns anos atrás foi demonstrado
que formas tripomastigotas de T. cruzi,
sinalizam
e
invadem
células
(cardiomiócitos e células endoteliais) que
expressam receptores (B1R e B2R) de
bradicinina (LIMA et al., 2002;
SCHARFSTEIN et al., 2000; TORRICO
et al., 1991). A análise do mecanismo de
sinalização subjacente ao processo de
infecção in vitro revelou que o parasita
depende da cruzipaína para processar
moléculas de cininogênios adsorvidas na
superfície das células alvo. Uma vez
liberada as cininas (ex: bradicinina)
ligam-se aos receptores constitutivos
(B2R), estimulando a formação de uma
grande quantidade de íons Ca+, estes íons
31
acionam uma cascata de eventos
intracelulares, promovendo aumento da
atividade endocítica da célula alvo,
tornando-a mais susceptível a infecção
pelo parasita. Todorov et al., (2003);
Scharfstein et al., (2000), observaram
através da microscopia vital que a
aplicação tópica de tripomastigotas no
tecido da bolsa da bocecha de hamster,
induz um vigoroso aumento da
permeabilidade capilar. A análise desse
processo revelou que o envolvimento da
cruzipaína na formação de cininas só
ocorre nas etapas mais tardias, quando
ocorre um substancial acumulo de
cininogênio (precursor de cininas) no
local onde esta o parasita.
Ainda foi verificado que BK é
capaz de estimular aumento na produção
de IL-12 e de moléculas coestimulatórias (CD80/86) em células
dendríticas imaturas (iDCs) isoladas do
baço. No entanto, as iDCs isoladas de
animais genéticamente deficientes do
receptor B2R não foram responsivas
(SCHARFSTEIN et al., 2000). Em
estudos realizados por (ALIBERTI et al.,
2003) foi observado que camundongo
BALB/c
imunizados
com
OVA
combinada a BK, desenvolviam forte
polarização da resposta de células T
CD4+ anti-OVA para um perfil
característico de células Th1. Estes dados
sugerem que a BK liberada nos sítios
inflamatórios poderia interagir com
ambos os receptores B1R e B2R nas
células dentríticas e passar a estimular
essas células, que com o aumento na
produção de IL-12, direcionavam a
resposta para o perfil Th1. Baseado neste
contexto verificou-se, imunizações com
BK/OVA e alum seriam capazes de
ativar reposta do padrão Th1, com
produção de IL-12 e IFN-γ, e ainda
observamos se essas imunizações
induziriam dor (efeito hiperalgésico).
Baseado em nossos resultados, é
possível sugerir que imunizações com
BK, pode ser uma maneira importante de
PAVANELLI, Wander Rogério
Interbio v.1 n.2 2007 - ISSN 1981-3775
induzir a resposta imune do hospedeiro,
no sentindo de eliminar o patógeno no
sítio da infecção.
Material e Métodos
Animais
Foram utilizados camundongos
machos BALB/c, com 6 a 8 semanas de
idade em todos os experimentos. Os
animais foram obtidos junto ao Biotério
Central que é mantida e criada nesse
Departamento de Imunologia - USP.
Imunização e desafio
Os animais foram previamente
tratados
com
captopril
(10mg/Kg/animal), para aumentar o
32
tempo de ação da BK, e logo em seguida
foram imunizados (na pata), 2x com
intervalos de 15 dias, com uma solução
contendo BK (1µg/animal), OVA (10
µg/animal) em emulsão de alum
(50µL/pata). O grupo controle negativo
recebeu apenas salina, já o grupo controle
positivo recebeu carraginina. Logo em
seguida, o efeito hiperalgésico (dor) foi
avaliado pelo método de Von Frei
(Cunha, T.M., 2005) nos períodos (1, 3 e
5 horas), após a primeira imunização.
Após o termino das imunizações, a
material foi coletado, sendo o soro
utilizado pra dosagem de anticorpos, e as
células do baço obtidas para realização
do ensaio de cultura, onde o sobrenadante
foi coletado e utilizado para dosagem de
citocinas. (quadro-1).
Quadro1 – Protocolo de tratamento dos camundongos machos BALB/c
Obtenção do soro
imunizados com BK
dos
animais
O sangue de animais imunizados
foi coletado via punção venosa no 31º dia
após as imunizações. O soro obtido
através da centrifugação do sangue total a
1000 x g por 5 minutos foi aliquotado
(100 µL), congelado e armazenado a uma
temperatura de -20ºC.
Dosagem de anticorpos
Placas para ELISA de baixa
afinidade (Corning, New York) foram
recobertas (50µL/poço) com tampão
carbonato-bicarbonato 0,06M, pH 9.5,
contendo antígeno de T. cruzi. Incubamos
a placa por 24 horas a 4oC em câmara
úmida. As placas foram lavadas 3 vezes
com solução tamponada de fosfato
(PBS), pH 7,2, contendo 0,05% de
Tween 20 (PBS-T) em lavador
automático de placas (Immunowash
1575, Bio-Rad Laboratories, Hercules,
CA, USA) e, incubadas com solução de
PBS acrescido de 5% de leite em pó
(PBS-M), durante 1 a 2 horas à
temperatura ambiente. Após esse período
de incubação, a solução de PBS-M foi
descartada e a placa lavada 1 vez com
PBS-T no lavador de placas. Aos poços
da placa foram adicionadas, em
duplicata, as amostras de soro em
PAVANELLI, Wander Rogério
Interbio v.1 n.2 2007 - ISSN 1981-3775
diferentes diluições (1/10 a 1/20) em
PBS-M, e incubamos por 2 horas a 37ºC
em câmara úmida. A placa foi lavada 6
vezes com PBS-T e adicionaremos os
anticorpos
anti-imunoglobulina
de
camundongo. Utilizamos anticorpo antiIgG feito em cabra marcado com
peroxidase (Pierce, Rockford, USA) e,
para dosagem de IgG1 e IgG2a
utilizamos anticorpos anti-IgG1 ou antiIgG2a não marcado feito em coelho
(ZIMED, Califórnia, USA), os quais
foram detectados utilizando-se anticorpo
anticoelho feito em cabra conjugado com
peroxidase (Life Technologies Inc.,
Gaithersburg, MD). Novamente as placas
foram incubadas por 1 hora a 37oC em
câmara úmida e lavadas 6 vezes com
PBS-T. Adicionamos às placas o
substrato da peroxidase, o ortofenildiamina-2HCl
(OPD)
(Abbot
Laboratories, Abbot Park, IL, USA). A
reação colorimétrica foi bloqueada após
10 minutos com ácido sulfúrico (Merck)
1N e a leitura realizada a 490nm em
leitor de microplacas (EMAX, Molecular
Devices Corporation, Sunnyvale, CA,
USA). A densidade óptica obtida no soro
de camundongos não infectados em uma
diluição de 1:20 foi utilizado como cutoff
para cada isotipo. A densidade óptica de
cada diluição do soro dos animais
infectados foram comparadas com a
densidade óptica dos animais controles e
o título para cada amostra expresso
segundo a maior diluição conseguida.
Cultura de células do baço
Células do baço dos camundongos
imunizados
foram
cultivadas
em
triplicatas em placas com 48 poços, na
concentração de 1 x106 cells/mL em
meio contendo RPMI 1640, soro bovino
fetal 10%, e ainda com ou sem antígeno
(OVA) adicionado na concentração de 50
µg/ml. As células foram cultivadas por
48 horas em estufa de 5% CO2 a 37ºC. O
sobrenadante da cultura foi coletado e
armazenados em -80°C até que IFN-γ e
33
IL-12 foram dosados usando o método de
ELISA.
Dosagem das citocinas por ELISA
A concentração das citocinas (IFNγ, IL-12) presentes nos sobrenadantes da
cultura de células do baço, foi dosada
pelo método imunoenzimático (ELISA)
utilizando-se “kit” comercial (OpTEIA,
BD Biosciences, San Diego, CA)
seguindo
as
recomendações
do
fabricante. A leitura da reação
colorimétrica foi realizada a 450 nm em
leitor de microplacas (EMAX, Molecular
Devices Corporation, Sunnyvale, CA,
USA). A concentração das citocinas nos
sobrenadantes analisados foi determinada
a partir dos valores obtidos com a curvapadrão realizada com as diferentes
diluições da proteína recombinante.
Analise Estatística
Os resultados foram expressos
como média e desvio padrão (SD) dos
resultados obtidos para cada grupo. A
análise estatística foi realizada utilizandose o programa Instat (INSTAT software,
GraphPad, San Diego, CA). Valores de
p<0.05 e p<0.01 foram considerados
como indicativo de significância.
Resultados e Discussão
Imunização com bradicinina induz
efeito hiperalgésico
Foi possível observar que as
imunizações com BK induziram dor, nos
três
períodos
analisados,
quando
comparado com o grupo controle (Salina)
(figura-1), um efeito não desejado
quando se pensa em utilizá-la como
estratégias pra eliminação do parasita.
Este efeito foi também ampliado ao fazer
uso do captopril, um inibidor da Enzima
Convertedora de Angiotensina (ECA), na
resposta edematogênica induzida por
tripomastigotas,
cepa
DM28c
(TODOROV et al., 2002).
PAVANELLI, Wander Rogério
Interbio v.1 n.2 2007 - ISSN 1981-3775
34
Figura 1 - Imunização com bradicinina induz dor (efeito hiperalgésico). Os camundongos foram
divididos em 5 grupos, sendo o grupo (A) - Tratados com Captopril ( 10 µg) 1 hora antes + 1 µg de BK +
10 µg OVA + 0.05 mL Alum, grupo (B) - 1 µg de BK + 10 µg OVA + 0.05 mL de Alum, e grupo (C) Tratados com Captopril (10 µg) 1 hora antes + 10 µg OVA + 0.05 mL de Alum, grupo salina (controle
negativo) e grupo carraginina (controle positivo). Nos períodos de (1, 3 e 5 horas) após a primeira
imunização, o efeito hiperalgésico (Dor) foi quantificada utilizando um método de Von frei (CUNHA,
T.M., 2005). A carraginina foi utilizada como controle positivo e salina como controle negativo. * p<0.05
valores considerados estatisticamente significantes quando comparados com o grupo salina.
Imunização com bradicinina induz
produção de anticorpos do padrão Th1
O sangue dos animais imunizados
foram previamente coletados e o soro
obtido para a dosagem de anticorpos IgG
total, Ig G 1 e IgG 2a. Foi observado que
os animais previamente tratados com
captopril e imunizados apresentaram altas
concentrações de anticorpos IgG 2a
antiOVA (perfil Th1 de reposta) quando
comparado com os animais apenas
imunizados e/ou apenas tratados com
captopril (figura-2).
Imunização com bradicinina induz
produção de IL-12
Células do baço de camundongos
previamente imunizados foram incubadas
por 48h com um mitógeno sintético
Concanavalina-A (Con-A) (10µg/mL) e
OVA (20µg/mL) em estufa de CO2 a
37ºC. Os níveis de IL-12 foram então
avaliados a partir do sobrenadante da
cultura por ELISA. Foi observada que as
células do baço de todos os animais
previamente imunizados com BK,
produziram altas concentração de IL-12
na presença de OVA, quando comparado
com o controle meio de cultura de células
(RPMI) (figura-3). Portanto è possível
sugerir que as imunizações com BK
induzem ativação de células dendríticas a
produzirem IL-12, este procedimento
induziu forte polarização da resposta
CD4+ T antiOVA para um perfil
característico de células Th1. Condizente
com este efeito, os animais imunizados
com OVA/BK foram protegidos da
inflamação alérgica (eosinofilia na
pleura), um efeito que seria de outro
modo mediado por linfócitos Th2
(ALIBERTI et al., 2003).
Imunização com
produção de IFN-γ
bradicinina
induz
Novamente, células do baço dos
camundongos previamente imunizados
foram incubadas por 48h com Con-A
(10µg/mL) e OVA (20µg/mL) em estufa
PAVANELLI, Wander Rogério
Interbio v.1 n.2 2007 - ISSN 1981-3775
de CO2 a 37ºC. Os níveis de IFN-γ foram
então avaliados a partir do sobrenadante
da cultura por ELISA. Para abordar
diretamente esta questão, Scharfstein et
al.,(2000) questionaram se BK/LBK
seriam capazes de ativar diretamente
células dendríticas imaturas (iDCs),
promovendo a sua maturação. Com
efeito, BK foi capaz de estimular
aumento de produção de IL-12 e de
35
moléculas co-estimulatórias (CD80/86)
nas células dendríticas imaturas CD11c+
(iDCs) isoladas de baço. Consistente com
o seu presumido papel de sinal de perigo,
a BK induziu a migração de DCs para os
linfonodos drenantes (DLN). E uma vez
ativada por BK (ex. maduras), essas
células foram capazes de apresentar
antígenos para linfócitos T “naive”.
Figura 2 - Produção de anticorpos em camundongos imunizados com BK. Os camundongos foram divididos
em 4 grupos, sendo o grupo (A) - Tratados com Captopril ( 10 µg) 1 hora antes + 1 µg de BK + 10 µg OVA +
0.05 mL Alum, grupo (B) - 1 µg de BK + 10 µg OVA + 0.05 mL de Alum, e grupo (C) - Tratados com
Captopril (10 µg) 1 hora antes + 10 µg OVA + 0.05 mL de Alum, grupo salina (controle negativo). O soro
foi coletado e usado para detectar a produção de IgG total, IgG1 e IgG 2a através de ELISA. Os resultados são
expressos como média±SD. * p<0.05 e ** p<0.05 valores considerados estatisticamente significantes quando
comparado com RPMI.
Nesse trabalho foi observado que as
células do baço dos animais previamente
imunizados com BK (grupo B e C)
produziram altas concentrações de IFN-γ
na presença de OVA, quando comparado
com controle (RPMI) (figura-4). Vale
destacar que a utilização da bradicinina
sintética como adjuvante não foi capaz de
promover a polarização de Th1 em
animais geneticamente deficientes de IL12p40 imunizados com OVA, fato que
implicou a participação do receptor B2
de bradicinina na ativação da resposta
inata,
e
conseqüentemente,
no
mecanismo de instrução/polarização Th1
dependente de IL-12 (HUNTER et al.,
1996). Estes dados preliminares indicam
que imunizações, com OVA combinada a
BK, podem reduzir a concentração do
parasita no tecido cardíaco dos
camundongos infectados, diminuindo a
gravidade da infecção no coração.
PAVANELLI, Wander Rogério
Interbio v.1 n.2 2007 - ISSN 1981-3775
36
Fig. 3- Produção de IL-12 a partir das células do baço de camundongos imunizados com BK. Os
camundongos foram divididos em 3 grupos, sendo o grupo (A) - Tratados com Captopril ( 10 µg) 1 hora
antes + 1 µg de BK + 10 µg OVA + 0.05 mL Alum, grupo (B) - 1 µg de BK + 10 µg OVA + 0.05 mL
de Alum, e grupo (C) - Tratados com Captopril (10 µg) 1 hora antes + 10 µg OVA + 0.05 mL de Alum.
As células do baço dos camundongos foram incubadas por 4 dias com RPMI (meio de cultura), Con-A
(10µg/mL) e OVA (20µg/mL). Em seguida o sobrenadante foi obtido e analisado por Elisa o nível de IL12. Os resultados são expressos como média±SD. * p<0.05 valores considerados estatisticamente
significantes quando comparado com RPMI.
Fig. 4- Produção de IFN-γ a partir das células do baço de camundongos imunizados com BK. Os
camundongos foram divididos em 3 grupos, sendo o grupo (A) - Tratados com Captopril ( 10 µg) 1 hora
antes + 1 µg de BK + 10 µg OVA + 0.05 mL Alum, grupo (B) - 1 µg de BK + 10 µg OVA + 0.05 mL
de Alum, e grupo (C) - Tratados com Captopril (10 µg) 1 hora antes + 10 µg OVA + 0.05 mL de Alum.
As células do baço dos camundongos foram incubadas por 4 dias com RPMI (meio de cultura), Con-A
(10µg/mL) e OVA (20µg/mL). Em seguida o sobrenadante foi obtido e os níveis de IL-12 quantificados
por Elisa. Os resultados são expresso como média±SD. * p<0.05 e ** p<0.01 valores considerados
estatisticamente significantes quando comparado com RPMI.
PAVANELLI, Wander Rogério
Interbio v.1 n.2 2007 - ISSN 1981-3775
Esse resultado foi comprovado num
processo de imunização com OVA
combinada a BK, onde tal procedimento
induziu forte polarização da resposta
CD4+T antiOVA para um perfil
característico de células Th1, com
produção de citocinas como IL-12 e IFNγ. Portanto o conhecimento do papel da
BK, citocinas (IFN-γ e IL-12) na
imunopatogênese das Doenças de
Chagas, certamente foi útil não apenas
para o entendimento dos mecanismos que
podem levar a resistência à doença ou ao
dano tecidual, mas também colaborar no
desenvolvimento
de
estratégias
terapêuticas, incluindo a utilização de
vacinas e de imunoterapia.
Referências Bibliográficas
ALIBERTI, J., et al. Bradykinin induces IL-12
production by dendritic cells: a danger signal that
drives Th1 polarization. J. Immunol. v. 1;170, n.
11. p. 5349-53, 2003.
CUNHA, T.M., et al. A cascade of cytokines
mediates
mechanical
inflammatory
hypernociception in mice. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United
States of America, United States, v. 102, n. 5, p.
1755-1760, 2005.
37
LIMA, A.P, et al. Heparan sulfate modulates
kininrelease by Trypanosoma cruzi thorough the
activity of cruzipain. J Biol Chem,.v. 277,
p.5875-5881, 2002.
ROCHA E SILVA, M.; BERALDO, W.T;
ROSENFELD, G. Bradykinin, a hypotensive and
smooth muscle stimulating factor released from
plasma globulin by snake venoms and by trypsin.
Am J Physiol; v.156, p.261-73, 1949.
SHARFSTEIN, J. et al. Host cell invasion by
Trypanosoma cruzi is potenetiated by activation
of bradikinin B2 receptors, J. Exp Med. ,v. 192,
p. 1289-1299. 2000
TODOROV A.L., et al. Trypanosoma cruzi
induces edematogenic responses in mice and
invades cardiomyocytes and endothelial cells in
vitro by activating distinct kinin receptor subtypes
(B1/B2). The FASEB Journal. V. 20, 2002.
TODOROV A.G, et al. Trypanosoma cruzi
induces edematogenic responses in mice and
invades cardiomyocytes and endothelial cells in
vitro by activating distinct kinin receptor (B1/B2)
subtypes FASEB J.;v. 17, n. 1, p. 73-5, jan 2003.
TORRICO F., et al. Endogenous IFN-gamma is
required for resistance to acute Trypanosoma
cruzi infection in mice, J. Immunol. v.146 p.
3626–3632, 1991.
DEL NERY.E., et al. Kininogenase activity by
the major cysteinyl proteinase (cruzipain) from
Trypanosoma cruzi. L. J. Biol. Chem., v.272, p.
25713–25718, 1997.
GUO, Y.L,; COLMAN, R,W. Two faces of highmolecular-weight
kininogen
(HK)
in
angiogenesis: bradykinin turns it on and cleaved
HK (HKa) turns it off. J. Thromb Haemost. Feb
23, 2005.
HUNTER, C.A..; SLIFER, T.; ARAUJO, F.G.,
Interleukin-12mediated
resistance
to
Trypanosoma cruzi is dependent on tumor
necrosis factor alpha and gamma interferon,
Infect. Immun., v. 64, p.2381–2386, 1996.
LEEB-LUNDBERG, L.M., et al. International
union of pharmacology. XLV. Classification of
the kinin receptor family: from molecular
mechanisms to pathophysiological consequences.
Pharmacol Rev. Mar; v. 57, n. 1, p. 27-77, 2005
PAVANELLI, Wander Rogério