Inibição de microrganismos bioindicadores em queijo Minas Padrão

Inibição de microrganismos bioindicadores em queijo Minas Padrão
com culturas lácticas adicionadas
1
2
2
Karine de Almeida Marques , Aurélia Dornelas de Oliveira Martins , Bruno Gaudereto Soares ,
Maurílio Lopes Martins2, José Manoel Martins2 e Flávio Bittencourt3
1
Graduanda em Ciência e Tecnologia em Alimentos, IF Sudeste MG – Campus Rio Pomba, 2 Docentes do Departamento de Ciência e
Tecnologia de Alimentos do IF Sudeste MG – Campus Rio Pomba, 3Doscente do Departamento Acadêmico de Matemática, Física e
Estatística do IF Sudeste MG – Campus Rio Pomba, Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia Sudeste de Minas Gerais –
Campus Rio Pomba
Resumo - As bactérias lácticas desempenham importante papel na fermentação contribuindo para uma maior variedade de
alimentos e podem inibir alguns microrganismos indicadores. Avaliou-se o efeito inibidor das culturas adicionadas sobre o
desenvolvimento de microrganismos bioindicadores durante a maturação do queijo Minas Padrão em diferentes tempos de
armazenamento. Os queijos foram fabricados com culturas lácticas de L. acidophilus, L.casei ssp. casei, ABT
(Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum e Streptococcus thermophilus) e tipo “O” (Lactococcus lactis subsp.
lactis e Lactococcus lactis subsp. cremoris), na concentração de 109 UFC/mL e inoculados com Escherichia coli e
Enterobacter aerogenes (106 UFC/mL). Realizou-se contagem dos microrganismos após 0, 10, 20, 30, 45 e 60 dias de
fabricação, em ágar MRS modificado e os microrganismos indicadores conforme a Instrução Normativa nº 62. A cultura de
L. casei ssp casei não foi capaz de reduzir a contagem de E. coli e E. aerogenes a valores inferiores a 102 UFC/g. As culturas
tipo “O”, L. acidophilus e ABT porporcionaram maior redução de E.coli. Apenas nos queijos produzidos com L. casei ssp
casei houve redução de microrganismos viáveis após 10 dias de maturação. Após 60 dias de maturação, os queijos
produzidos com L. acidophilus e ABT apresentaram maior número de microrganismos viáveis. As culturas ABT, L.
acidophillus e tipo 'O” apresentaram melhor potencial de utilização para reduzir as bactérias indesejáveis no produto.
Palavras-chave: probiótico, queijo, antagonismo.
Inhibition of microorganism bioindicators in Minas Padrão cheese
with lactic cultures
Abstract - The lactic bacteria has an important role in fermentation contributing for a greater variety of foods and can inhibit
some indicator microorganisms. This study objective to evaluate the inhibitory effect of the added cultures on the
development of bioindicator microorganisms during ripening of the Minas Padrão cheese at differents storage times. The
cheeses were made with lactic cultures of L. acidophilus, L. casei ssp. casei, ABT (Lactobacillus acidophilus,
Bifidobacterium longum and Streptococcus thermophilus) and type "O" at concentration of 109 CFU/mL and inoculated
with Escherichia coli and Enterobacter aerogenes (106 CFU/mL). After the production was performed count of
microorganisms after 0, 10, 20, 30, 45 and 60 days of manufacture. The lactic acid bacteria count was performed in modified
MRS agar and the indicators microorganisms according Normative Instruction 62. The culture of L. casei ssp. casei was not
able to reduce the count of E. coli and E. aerogenes to values lower than 102 CFU/g. The cultures "O" and L. acidophilus
provided greatest reductions of E.coli. Only in cheese produced with culture of L. casei ssp. casei had reduction in the viable
microorganisms after 10 days of manufacturing. After 60 days of manufacturing, the cheese made with cultures of L.
acidophilus and ABT presented greater number of viable microorganisms. The cultures ABT, L. acidophilus and type "O"
showed best potential of use for to reduce the undesirable bacteria in the product.
Keywords: probiotic, cheese, antagonism.
Introdução
As doenças transmitidas por alimentos consomem
recursos com cuidados de saúde e causam mortalidade e
morbidade em todo o mundo. Entre os sintomas agudos mais
comuns podem ser citados diarreias, vômito, problemas
gastrintestinais, náuseas e, algumas vezes, febre (Mendonça,
2003).
A OMS (Organização Mundial da Saúde) em sua obra já
clássica de 1966, Higiene do leite, apresentava uma lista de
doenças transmissíveis ao homem por intermédio do leite.
Nela incluíam-se viroses, infecções por riquétsias, infecções
bacterianas, protozoonoses e helmintíase. O consumo de
leite não pasteurizado ou queijos elaborados com leite cru é
um risco para a saúde humana. Alguns países não permitem,
de maneira geral, o consumo de leite cru nem de queijos
produzidos com leite não pasteurizado com tempo de
maturação inferior a dois meses (Ordónez, 2005).
De modo geral, o leite produzido no Brasil é obtido em
condições higiênico sanitárias deficientes, predominando
altas contagens de microrganismos aeróbios mesófilos,
psicrotróficos, patógenos e coliformes. No leite há uma
microbiota com grande potencial inibitório e com altas
contagens. As bactérias ácido lácticas, naturalmente
Tecnol. & Ciên. Agropec., João Pessoa, v.7, n.2, p.69-74, jun. 2013
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presentes no leite, são responsáveis por essa inibição; estão
amplamente distribuídas na natureza e são habitantes dos
tratos digestivo, respiratório superior e urogenital inferior
dos animais. O grupo inclui bastonetes e cocos não
esporulados, aeróbios, microaerófilos ou anaeróbios
facultativos. A maioria delas é inativada a temperaturas
superiores a 70 °C (Salminen & Von Wright, 1998).
Essas bactérias desempenham um importante papel na
fermentação contribuindo para uma maior variedade de
alimentos. Além de suas características sensoriais, permitem
uma maior conservação dos alimentos e ainda podem ser
usadas como probiótico (Cebeci & Guarakan, 2003 citado
por Martins et al., 2006).
Existem várias substâncias antimicrobianas que podem
ser produzidas por esses micro-organismos como ácidos
orgânicos (ácido láctico), peróxido de hidrogênio, dióxido
de carbono, diacetil, acetaldeido e substâncias
antimicrobianas de natureza proteica, denominadas
bacteriocinas ou peptídeos bacterianos ou proteínas ativas,
que agem contra outras bactérias Gram-positivas (Naidu et
al., 1999; Close, 2000). As bacteriocinas são peptídeos
complexos ativos, que são sintetizados nos ribossomos da
célula bacteriana e são lançados extracelularmente
apresentando atividade bactericida ou bacteriostática.
Embora as bacteriocinas possam ser produzidas por diversas
bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, as produzidas
pelas BAL tem tido atenção particular nos anos recentes,
devido ao seu potencial de aplicação na indústria de
alimentos como preservativo natural. Cada bacteriocina
possui um espectro de inibição específico (Rodríguez et al.,
2003).
A ação antagonista de espécies de bactérias ácido lácticas
contra microrganismos indesejáveis em alimentos tem sido
descrita em vários trabalhos. Muitas BAL isoladas de leite e
queijos apresentaram poder de inibição frente a patógenos e
deteriorantes, como Staphylococcus spp., Listeria spp.,
Salmonella spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp. e
bactérias do grupo coliforme (Alexandre, 2002).
O uso de microrganismos vivos com o propósito de
manutenção da saúde, além da prevenção ou auxilio no
tratamento de doenças aumentou nos últimos anos. Muitos
desses micro-organismos estão sendo propostos como
suplemento alimentar porque podem afetar beneficamente o
hospedeiro e atuar no equilíbrio da microbiota intestinal
(Atobe, 2003).
Probióticos são bactérias vivas contidas nos alimentos, e,
após ingestão exercem efeitos benéficos ao hospedeiro. Os
micro-organismos mais comuns encontrados nos alimentos
com probiótico são Lactobacilos e Bifidobactérias (Cebeci
& Guarakan, 2003 citado por Martins et al., 2006).
Muitas estirpes de bactérias têm sido comercialmente
usadas, sendo os gêneros de Lactobacillus, Bacillus,
Bifidobacterium e Streptococcus as mais comuns (Close,
2000). Membros do gênero Lactococcus e Lactobacillus são
mais usualmente utilizados por serem considerados GRAS
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Tecnol. & Ciên. Agropec., João Pessoa, v.7, n.2, p.69-74, jun. 2013
(Generally Recognized as Safe), já Streptococcus,
Enterococcus e outros gêneros de bactérias láticas contém
algumas espécies patogênicas que atuam como oportunistas
(Salminen et al., 1998).
O estudo do efeito de probiótico sobre a inibição de
patógeno é de grande relevância, e a utilização de bactérias
lácticas como bioconservadores mostra-se uma alternativa
na conservação de produtos (Chioda et al., 2007).
Algumas culturas mixtas probioticas, por exemplo
culturas de ABT (que contêm o Lactobacillus acidophillus,
Bifidobacterium e Streptococcus thermophilus) foram
desenvolvidas para trazer os sabores preferidos nos produtos
em que são usadas. A introdução de culturas para o
inoculação direto da cuba do queijo permitiu que os
produtores da cultura lançasse misturas novas da cultura,
termofilicas (principalmente S. thermophilus) e mesofilicas
consistir. Adicionalmente, Lactobacillus spp. e de
Bifidobacterium spp. foram empregados com sucesso como
adjunções na produção de queijo (Buriti et al., 2007). Diante
do exposto, o presente estudo teve por objetivo avaliar o
efeito inibidor das culturas adicionadas sobre o
desenvolvimento de microrganismos bioindicadores ao
longo da maturação do queijo Minas Padrão e verificar a
viabilidade dessas culturas durante a vida de prateleira do
produto.
Material e Métodos
O experimento foi conduzido no laboratório de
Bromatologia e Novos Produtos do Instituto Federal de
Educação, Ciência e Tecnologia do Sudeste de Minas Gerais
– Campus Rio Pomba (IF Sudeste MG – Campus Rio
Pomba), no período de fevereiro a novembro de 2010.
A fabricação dos queijos foi realizada em três repetições,
partindo-se da mesma base. Para cada repetição, as análises
microbiológicas foram realizadas em duplicata.
As culturas lácticas de L. acidophilus, L.casei ssp casei,
cultura ABT (Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium
longum e Streptococcus thermophilus) e cultura tipo “O”
(Lactococcus lactis sp. Lactis e Lactococcus lactis
subsp.cremoris) foram obtidas do estoque de culturas do IF
Sudeste MG – Campus Rio Pomba.
Para a ativação das culturas um inoculo de 0,1 mL foi
adicionado em 10 mL de leite desnatado reconstituído a
12%, previamente esterilizado (100 ºC/40 minutos) e
incubados por 35 ºC/18h. A ativação foi realizada por três
vezes consecutivas. Após a terceira ativação foi feito o
plaqueamento em meio de cultura Man, Rogosa and Sharpe MRS (Merck) acrescido de 0,004% de púrpura de
bromocresol (Himedia) e 0,5% de carbonato de cálcio
(Merck). As placas foram incubadas em jarra de anaerobiose
a 35 ºC/18h. Após o período de incubação uma colônia
isolada de cada cultura foi inoculada em caldo Infusão de
Cérebro e Coração (BHI) (Merck) e incubada a 35 ºC/18h.
Foram realizadas coloração de Gram das colônias a fim de se
verificar pureza.
As culturas de E. Coli e Enterobacter aerogenes são
referendadas e foram obtidas nos laboratórios de
Microbiologia do Departamento de Ciência e Tecnologia de
Alimentos da Universidade Federal de Viçosa e trazidas sob
refrigeração, em março de 2011, ao laboratório de
Microbiologia do IF Sudeste MG – Campus Rio Pomba. As
culturas foram isoladas em meios seletivos e analisadas
quanto a sua morfologia (coloração de Gram).
Para a produção de cada queijo foi utilizado
aproximadamente cinco litros de leite. Previamente à
coagulação do leite foi inoculado aproximadamente 106
9
UFC/mL de microrganismo indicador e 10 UFC/mL de
cultura láctica. A fabricação do queijo Minas Padrão foi
realizada de acordo com Furtado & Neto (1994).
Foram produzidos queijos com as seguintes combinações
de culturas de microrganismos indicadores cultura láctica:
- Cultura láctica de Lactobacillus casei ssp casei e E. coli;
- Cultura láctica de Lactobacillus casei ssp casei e E.
aerogenes;
- Cultura láctica de Lactobacillus acidophillus e E. coli;
- Cultura láctica de Lactobacillus acidophillus e E.
aerogenes;
- Cultura láctica ABT e E. coli;
- Cultura láctica tipo “O” e E. aerogenes;
- Cultura láctica tipo “O” e E. coli;
- Cultura tipo “O”.
Após a fabricação, as amostras foram prensadas e os
queijos (6 peças de aproximadamente 80 g) foram
armazenados sem embalar a temperatura de 10 °C, e após 10,
20, 30, 45 e 60 dias de armazenamento cada amostra foi
avaliada quanto a contagem microbiológica.
Após 0, 10, 20, 30, 45 e 60 dias de fabricação foi realizada
contagem de microrganismos indicadores e das bactérias
láticas.
Para a contagem das bactérias láticas, foram pesados
assepticamente 25 g de queijo, diluído em 225 mL de 0,1% de
água peptonada (Hexis) e homogeneizado em estomacher
por dois minutos. Após as devidas diluições em água
peptonada (0,1 %), o material foi plaqueado em duplicata em
seguida foi vertido ágar MRS acrescido de 0,004% de
púrpura de bromocresol e 0,5% de carbonato de cálcio e
incubados a 36 °C por 48 horas em atmosfera microaerófila.
Para obtenção da atmosfera microaerófila a superfície das
placas foram recobertas com uma sobrecamada do mesmo
meio e incubadas em jarra de anaerobiose. Colônias típicas
de cada placa das duplicatas foi avaliadas quanto a
morfologia e coloração de Gram.
A contagem de coliformes termotolerantes foi realizada
de acordo com Instrução Normativa nº 62 (BRASIL, 2003) e
a confirmação de E. coli e E. aerogenes foi realizada
utilizando-se o este IMVic.
Os dados foram avaliados utilizando-se os valores
médios das três repetições.
Resultados e Discussão
Os resultados da contagem de microrganismos
indicadores dos queijos produzidos nos diferentes tempos de
armazenamento estão apresentados na Tabela 1.
Até os 60 dias de armazenamento L. casei ssp. casei
reduziu menos que um ciclo log a contagem de E. aerogenes
e E. coli quando comparado com as outras culturas lácticas.
Apenas a cultura de L. casei ssp. casei foi incapaz de
reduzir a contagem de E. coli e E. aerogenes a valores
2
inferiores a 10 UFC/g, tendo a contagem destes microorganismos aumentado nos primeiros 20 dias de
armazenamento e apresentado uma pequena redução após 20
dias, mas permanecendo com uma contagem ao final da
5
maturação superior a 10 UFC/g.
Até 30 dias de armazenamento, as culturas que tiveram
maior valor numérico na redução dos microrganismos
indicadores foram a cultura tipo O e L. Acidophilus frente a
E. Coli com 3,3 e 4,5 reduções decimais respectivamente. A
inibição de E. coli por L. acidophilus verificada no atual
experimento também foi comprovada por Alves (2010),
Saad (2005), chioda et al. (2007), Pereira & Gómez (2007) e
Alegro (2003).
Alves (2010), avaliando o comportamento de E. coli em
queijo Minas Frescal elaborado com utilização de L.
acidophillus observou que no trigésimo dia de armazenagem
houve redução de três ciclos logarítimos de E. coli no queijo.
Saad (2005), no estudo da melhoria da qualidade de queijo
Minas Frescal por bactérias probióticas constatou que o uso
de L. acidophilus reduziu a contagem de bactérias
contaminantes de queijo Minas Frescal, comparando aos
queijos que usam a cultura tipo “O”. Segundo a autora, este
resultado pode ser atribuído à produção de compostos
inibidores como as bacteriocinas, proteínas que inibem a
multiplicação de micro-organismos principalmente os
patogênicos. Lengua et al. (2010) ao avaliarem a atividade
antagônica de diferentes cepas de lactobacilos isolados de
produtos comerciais na Colômbia observaram que as cepas
avaliadas inibiam E. coli.
Chioda et al. (2007), avaliaram o grau de atividade
antagônica de L. Acidophillus e constataram que as cinco
estirpes de L. acidoplhillus empregadas no estudo foram
eficientes no controle de E. coli. Pereira & Gómez (2007)
que estudaram a atividade antimicrobiana de L. acidophilus
contra micro-organismos patogênicos veiculados por
alimentos verificaram que L. acidophilus apresentou
atividade inibidora frente a S. aureus e E. coli.
Alegro (2003), no desenvolvimento de queijo Minas
Frescal probiótico com L. acidophilus e Bifidobacterium
lactis isolados e em co-culturas, verificou que em queijos
produzidos com L. acidophilus e Bifidobacterium lactis,
houve inibição do desenvolvimento de E.coli, a qual não foi
detectada em nenhum dos queijos após 60 dias de maturação.
A inibição de E. coli pela cultura ABT é explicada pelo fato
desta cultura mista conter Bifidobacterium longum e
Lactobacillus acidophilus.
Tecnol. & Ciên. Agropec., João Pessoa, v.7, n.2, p.69-74, jun. 2013
71
Tabela 1. Contagem de microrganismos indicadores em queijo Minas Padrão nos diferentes tempos de armazenamento.
Médias de três repetições.
Cultura láctica
L. acidophilus
L. casei ssp. casei
L. acidophilus
L. casei ssp. casei
ABT
Tipo O
Tipo O
Tipo O
Micro-organismo
indicador
E. coli
E. aerogenes
E. aerogenes
E. coli
E. coli
E. aerogenes
E. coli
-
0
3,8 x 106
3,3 x 106
2,5 x 106
2,9 x 106
2,2 x 106
1,1 x 106
1,8 x 106
<1,0 x 101
Contagem de micro-organismo indicador UFC/g
Tempo de armazenamento (dias)
10
20
30
45
60
5
4
2
1
4,2 x 10
3,2 x 10
1,2 x 10
<1,0 x 10
<1,0 x 101
6,1 x 106 3,9 x 106
1,5 x 106
8.9 x 105
6,8 x 105
5
4
4
3
6,2 x 10
6,7 x 10
1,8 x 10
6,5 x 10
1,3 x 102
7,3 x 106 4,2 x 106
2,4 x 106
9,3 x 105
7,8 x 105
2,8 x 105 4,1 x 104
7,3 x 103
2,1 x 102
1,4 x 101 est.
6,7 x 105 9,0 x 104
1,7 x 104 1,3 x 101 est. 1,1 x 101 est.
2,9 x 105 1,2 x 103
9,8 x 102
<1,0 x 101
<1,0 x 101
<1,0 x 101 <1,0 x 101 <1,0 x 101
<1,0 x 101
<1,0 x 101
est. = estimado
Os resultados da contagem de bactérias lácticas, em
UFC/g, dos queijos inoculados com diferentes microorganismos indicadores em seis tempos de armazenamento
estão apresentados na Tabela 2. Quanto ao número de
microrganismos viáveis, todas as culturas lácticas avaliadas
6
apresentaram contagens acima 10 UFC/g até os 60 dias de
armazenamento do produto.
Após 60 dias de maturação, os queijos produzidos com as
culturas de L. acidophilus e cultura ABT apresentaram
contagem de micro-organismos viáveis superior a 107
UFC/g. Resultados compatíveis ao reportado por Alves
(2010), que observou durante 30 dias de armazenagem de
queijo Minas Frescal produzido com a cultura de L.
acidophillus um aumento na contagem de L. acidophillus ao
longo do tempo.
Resultado semelhante foi verificado por Buriti et al.
(2005), que realizaram a contagem de L. acidophillus em
queijo Minas Frescal durante 21 dias de estocagem e
observaram que estes micro-organismos se mantiveram em
níveis constantes durante o armazenamento. Viegas (2008),
trabalhando com leites fermentados probióticos produzidos
a partir de bactérias ácido-lácticas e adicionados de
concentrado proteico de soro lácteo, concluíram que para
garantir os efeitos probióticos, o produto deve conter, no
6
momento do consumo, no mínimo 10 UFC/g de bactérias
probióticas. Desta forma, os queijos produzidos com todas as
culturas probióticas avaliadas, provavelmente, podem ser
considerados como um produto probiótico. No entanto,
queijos produzidos com culturas de L. casei apresentaram
maiores valores numéricos dos microrganismos indicadores
avaliados.
Tabela 2. Contagem de bactérias lácticas em queijo Minas Padrão inoculado com diferentes microrganismos indicadores.
Médias de três repetições.
Cultura láctica
utilizada
L. casei ssp. casei
ABT
Tipo O
L. acidophilus
L. casei ssp. casei
L. acidophilus
Tipo O
Tipo O
72
Micro-organismo
indicador
E. coli
E. coli
E. coli
E. coli
E. aerogenes
E. aerogenes
E. aerogenes
0
1,1 x 109
1,8 x 108
2,6 x 108
1,6 x 109
2,2 x 109
3,8 x 109
7,6 x 108
2,5 x 108
Contagem de bactérias lácticas UFC/g
Tempo (dias)
10
20
30
45
7,9 x 108
4,5 x 109
5,0 x 109
2,4 x 109
4,5 x 108
5,3 x 109
9,2 x 108
7,7 x 109
Tecnol. & Ciên. Agropec., João Pessoa, v.7, n.2, p.69-74, jun. 2013
1,5 x 108
1,4 x 109
2,6 x 108
9,0 x 108
1,3 x 108
6,8 x 108
6,9 x 107
4,1 x 107
7,7 x 107
7,6 x 108
1,7 x 107
7,9 x 107
8,4 x 107
4,2 x 107
5,6 x 106
4,6 x 106
9,1 x 106
2,2 x 108
1,1 x 107
6,6 x 107
5,7 x 107
3,2 x 107
3,2 x 106
2,2 x 106
60
5,1 x106
8,3 x 107
8,6 x 106
3,2 x 107
7,1 x 106
1,5 x 107
1,3 x 106
1,1 x 106
Conclusões
1. As culturas ABT, L. acidophillus e tipo 'O”
apresentaram melhor potencial de utilização para reduzir as
bactérias indesejáveis no produto.
2. As culturas ABT e L. Acidophillus apresentaram
resultados favoráveis, com contagem após 60 dias de
6
armazenamento superior 10 UFC/g.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao suporte financeiro oferecido
pelo CNPq pela bolsa de iniciação científica concedida a
primeira autora e ao IF Sudeste MG – Campus Rio Pomba
pela oportunidade oferecida e suporte para o
desenvolvimento deste projeto.
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