BIOSSÍNTESE DE ÁCIDO INDOL ACÉTICO POR BACTÉRIAS

I CONGRESSO BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA AGROPECUÁRIA,
AGRÍCOLA E AMBIENTAL (CBMAAA)
09 a 12 de maio de 2016 - Centro de Convenções da UNESP,
Câmpus de Jaboticabal, SP
BIOSSÍNTESE
DE
ÁCIDO
INDOL
ACÉTICO
POR
BACTÉRIAS DIAZOTRÓFICAS ASSOCIADAS À Brachiaria
humidicola POR DIFERENTES VIAS METABÓLICAS
INDOLE ACETIC ACID BIOSYNTHESIS BY DIAZOTROPHIC
BACTERIA ASSOCIATED WITH Brachiaria humidicola BY
DIFFERENT METABOLIC PATHWAYS
Everthon Fernandes Figueredo(1)
João Tiago Correia Oliveira(2)
Isaneli Batista dos Santos(3)
Fernando José Freire(4)
Júlia Kuklinsky Sobral(5)
Resumo
Entre os benefícios da interação de bactérias com gramíneas forrageiras, destaca-se a síntese
bacteriana de ácido indol acético (AIA), que atua diretamente no desenvolvimento das raízes
dos vegetais. Nesse contexto, o experimento teve como objetivo quantificar a produção de
AIA por bactérias diazotróficas associadas à Brachiaria humidicola em diferentes vias
metabólicas e avaliar a diversidade genética dos isolados por Box-PCR. Para tanto, 24
colônias isoladas de bactérias foram crescidas em meio líquido TSA 10 % com e sem a adição
de L-triptofano e as concentrações de AIA, obtidas do sobrenadante das culturas
centrifugadas, acrescido do reagente de Salkowiski e quantificado em espectrofotômetro. Já a
variabilidade genética dos isolados foi avaliada pela técnica do BOX-PCR, e os padrões de
bandas gerados, avaliados quanto à diversidade e similaridade genética entre os isolados. A
biossíntese bacteriana de AIA, tanto em via dependente quanto independente de L-triptofano
apresentou concentrações com amplitudes variadas entre 2,09μg.mL-1 a 131,39μg.mL-1 e
0,85μg.mL-1 a 44,14μg.mL-1 respectivamente. As bactérias, também apresentaram alta
variabilidade genética, onde apenas 16,66% dos isolados tiveram similaridade genética
superior a 70%, com diferenças entre os genótipos bacterianos. Portanto, conclui-se que as
bactérias avaliadas são capazes de sintetizar o AIA por duas vias metabólicas diferindo na
expressão da concentração produzida, e que representam grupos bacterianos com alta
variabilidade genética.
Palavras-chave: Auxinas. Diversidade genética. Gramíneas forrageiras.
1
Graduando em Zootecnia pela Universidade Federal Rural de Pernambuco/Unidade Acadêmica de Garanhuns
. Endereço eletrônico: [email protected]
2
Doutorando em Zootecnia pela Universidade Federal Rural de Pernambuco.
3
Doutoranda em Microbiologia Agrícola. Universidade de São Paulo/Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”.
4
Prof. Dr. do Departamento de Agronomia Universidade Federal Rural de Pernambuco.
5
Prof.ª Dr.ª da Universidade Federal Rural de Pernambuco/Unidade Acadêmica de Garanhuns.
Ciência & Tecnologia: FATEC-JB, Jaboticabal (SP), v. 8, Número Especial, 2016. (ISSN 2178-9436).
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Abstract
Among the benefits of the interaction between bacteria and grasses, there is the bacterial
synthesis of indole acetic acid (IAA), which acts directly on the development of the plant
roots. In this context, the experiment aimed to quantify the production of AIA by diazotrophs
associated with Brachiaria humidicola in different metabolic pathways and the genetic
diversity of isolates by PCR-Box. To this, 24 colonies were isolated from bacteria grown on
TSA 10% liquid medium with and without the addition of L-tryptophan and IAA
concentrations obtained from the supernatant of centrifuged culture plus the reagent
Salkowiski and quantified in a spectrophotometer. Already the genetic variability of the
isolates was evaluated by the technique of BOX-PCR, and the patterns generated bands
evaluated for genetic diversity and similarity among the isolates. Bacterial biosynthesis of
IAA, for both dependent and independent pathway of L-tryptophan showed concentrations
varying amplitudes between 2,09μg.mL-1 to 131,39μg.mL-1 and 0,85μg.mL-1 to 44,14μg. ml-1
respectively. The bacteria also showed high genetic variability, where only 16.66% of the
isolates had higher genetic similarity to 70%, with differences between bacterial genotypes.
Therefore, it was concluded that tested bacteria are able to synthesize the IAA using two
pathways, differ in the concentration produced, and represent bacterial groups with high
genetic variability.
Keywords: Auxin. Genetical diversity. Foragers grasses.
1 Introdução
As gramíneas forrageiras do gênero Brachiaria representam um importante recurso
para a produção pecuária brasileira, devido à sua capacidade de se adaptar a diferentes
condições de solo e clima (SILVA et al., 2010). No entanto, a baixa disponibilidade de
nutrientes no solo em áreas de cultivo de pastagem com a finalidade de produzir alimento para
a produção pecuária, tem afetado a qualidade e o desenvolvimento das gramíneas devido à
retirada constante de nutrientes do solo exportados pelas plantas e a falta de reposição por
adubação. Esses fatores tendem a condicionar a degradação das plantas forrageiras
diminuindo sua produtividade (EUCLIDES et al., 2015). Neste
contexto,
os
potenciais
benefícios das interações plantas/bactérias têm sido explorados para uso em pastagens, devido
à capacidade dos micro-organismos de promover o desenvolvimento dos vegetais, através de
mecanismos bioquímicos como a fixação biológica de nitrogênio, solubilização de fosfato,
inibição de fitopatógenos e da produção de fitormônios como as auxinas, giberelinas e
citocininas. (KEYEIO, et. al. 2011). Entre as auxinas, o ácido indol acético (AIA) é o mais
produzido pelas bactérias, sendo o mais ativo e melhor caracterizado (ALI et al., 2010).
O AIA é capaz de proporcionar tanto respostas rápidas ao desenvolvimento das plantas
como a elongação celular, quanto lentas, como a diferenciação e divisão das células,
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interferindo no aumento das raízes e na quantidade de pelos radiculares, podendo ainda atuar
no tropismo e dominância apical dos vegetais (SUKUMAR et al., 2013).
Diversos grupos genéticos de bactérias já foram descritos quanto à utilização de
diferentes vias bioquímicas para biossíntese bacteriana de AIA, entretanto, a que utiliza o
aminoácido L-triptofano como precursor, é a mais comumente caracterizada (PATTEN &
GLICK, 1996, DOBBELAERE et al., 2003). No entanto, essas bactérias também podem
produzir esse fitormônio em uma segunda via metabólica, por meio da assimilação de outros
precursores não totalmente definidos, mais que estão presentes no ambiente natural ou no
cultivo in vitro (NAVEED et al., 2015).
Tendo em vista que as bactérias produtoras de ácido indol acético apresentam
potencial de aplicação como reforço para eficácia da promoção do crescimento vegetal, sendo
um fator que pode contribuir para o aumento e melhoria da produtividade pecuária, o presente
experimento teve por objetivo avaliar produção de AIA in vitro, por bactérias diazotróficas
associadas à Brachiaria humidicola, em diferentes vias metabólicas, quantificar o ácido indol
acético sintetizado, e verificar a diversidade genética entre os isolados bacterianos pela
técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction) BOX.
2 Material e Métodos
As linhagens diazotróficas utilizadas para avaliação da produção de Ácido indol acético
foram isoladas da raiz e da rizosfera de Brachiaria humidicola cultivadas na fazenda Pau
Ferro (S 09º06’53” e W 36º21’29”) no município das Correntes, Pernambuco, Brasil. Foram
selecionados 24 isolados de bactérias (UAGB 101 a UAGB 124), tendo sido repicadas por
esgotamento e purificação em placas de Petri contendo meio de cultura sólido TSA 10%
(Trypcase Soy Agar), para obtenção de colônias isoladas.
As colônias crescidas foram transferidas para meio liquido TSA 10 % (Triptic Soy
Agar), e incubadas em mesa agitadora (120 rpm) a uma temperatura de 280C, na ausência de
luz por um período de 24h. Em seguida, transferiu-se 10μL da cultura para tubos de ensaio
contendo meio TSA 10% liquido com e sem a adição do aminoácido L-triptofano a uma
concentração de 5mM, sendo novamente incubadas, em triplicata, por 24h em ambiente
escuro. Após esse período, 2mL do meio de cultura, apresentando crescimento bacteriano,
foram extraídos e transferidos para centrifugação (12.000g) em microtubos, sendo
posteriormente retirada uma alíquota de 1,4mL do sobrenadante do centrifugado, que foi
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transferido novamente, para microtubos contendo 0,6mL do reagente de Salkowski (2% de
FeCl3 0,5M em 35% de ácido perclórico). As amostras acrescidas com o reagente foram
incubadas a 280C por 30 minutos em ambiente ausente de luz para reação dos compostos
indólicos do sobrenadante com os sais férricos presentes no reagente ocasionando o
desenvolvimento de coloração rósea com variações de tonalidade de acordo com as
concentrações de AIA.
A intensidade da cor apresentada na reação dos compostos indólicos com o reagente de
Salkowsky foi quantificada em espectrofotômetro a um comprimento de onda de 530 nm e as
concentrações de AIA estimadas a partir de uma curva padrão previamente estabelecida com
quantidades conhecidas de ácido indol acético 0, 25; 50; 100; 150; 200 e 300 μg mL-1 em
meio de cultura não inoculado, com e sem a adição de L-triptofano 5mM.
Para avaliação da diversidade genética dos isolados, o DNA gnômico das bactérias foi
extraído com Kit de extração DNA Purification (Fermentas). A reação do PCR foi realizada
com primer BOX AR1 (5’-CTACGGCAAGGCGACGCTACG-3’), em volume final de
25µL por reação, contendo 0,5 a 0,10 ng de DNA molde; 1mM de cada dNTP’s, 1x de
DMSO (dimetilsofoxamida); 1x do tampão da enzima Taq Buffer, 3,5 mM de MgCl2 e 0,08U
da enzima Taq DNA polimerase. A reação de amplificação foi realizada em termociclador
com programação de desnaturação inicial a 95ºC por 2 min, 35 ciclos de desnaturação a 94ºC
por 2 min, 92ºC por 30 segundos, anelamento a 50ºC por 1 min seguido de extensão final a
65ºC por 10 min. Após a amplificação, a reação foi avaliada por eletroforese em gel de
agarose (1,5% p/v) e tampão 1x TAE (40 mM de Tris-acetato; 1mM de EDTA) e corado com
Blue green loading dye (LCG Bio) em seguida o gel foi fotodocumentado em câmara de luz
ultra-violeta para avaliação dos perfis dos amplicons.
As médias dos dados de produção de AIA foram avaliadas no software estatístico
SISVAR 5.3® utilizando-se a ferramenta (ANOVA), aplicando-se o teste de Scott-Knott
(p≥0,05). Os perfis de bandas gerados pela técnica de BOX-PCR foram transformados em
planilha binária para obtenção de dendrograma de similaridade utilizando-se coeficiente de
Jaccard agrupado pelo algoritmo UPGMA (Unweighted Pair- Group Method with
Arithmetical Average), utilizando-se o software PAST® (Paleontological Statistic) versão
3.11. (HAMMER et al., 2001).
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3 Resultados e Discussão
Os Isolados bacterianos avaliados em meio liquido acrescido de L-triptofano,
expressaram concentrações de AIA variando entre 2,09μg.mL-1 biossintetizados pela
linhagem UAGB 110 e 131,39μg.mL-1 pela linhagem UAGB 104, ambas endofíticas de raiz
apresentando diferenças estatísticas significativas quando avaliadas pelo testes de Scot-Knott
(p≥0.05) (Figura 1). De acordo com NAVEED et al., (2015), o L-triptofano, pode promover
um aumento na produtividade de Ácido indol acético pelas bactérias, uma vez que sua
presença no meio de cultivo provoca um efeito estimulatório nas vias de ativação fisiológica,
responsáveis pela assimilação desse aminoácido usado como precursor para biossíntese
bacteriana de AIA.
Figura 1- Médias da produção de AIA por bactérias diazotóficas associadas a Brachiaria humidicola em meio
de cultura acrescido com L-Triptofano. Medias seguidas por letras iguais não diferiram estatisticamente
pelo teste de Scott-Knot (P>0.05).
Resultados similares foram obtidos por Fernandes-Junior et al. (2015) que avaliando a
produção de AIA por bactérias associadas a gramínea Tripogon spicatus, obtiveram
quantificações do fitormônio variando entre 5,8μg.mL-1 e 82μg.mL-1, de ácido indol acético
sintetizado em meio de cultura líquido acrescido de L-triptofano, onde atribui as maiores
concentrações de AIA a bactérias diazotróficas putativas. Contudo, as quantidades máximas
de AIA obtidas no presente experimento foram significativamente maiores que as relatadas
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por esse autor e seus colaboradores revelando a necessidade de maior exploração desse grupo
de bactérias.
Já Masciarelli et al., (2013) relatam que síntese de AIA por bactérias diazotróficas do
gênero Azospirillum, associada a inúmeras espécies de gramíneas, está ligada a apenas uma
via metabólica dependente de L-triptofano, não tendo identificado em seus experimentos
biossíntese de AIA na ausência do aminoácido, constatando o uso de apenas uma via de
biossíntese L-triptofano dependente por essas bactérias. No entanto, no presente experimento,
além de biossintetizarem AIA na presença desse aminoácido, todas as bactérias diazotróficas
avaliadas também foram capazes de sintetizar o AIA por via metabólica independente do Ltriptofano sendo um indicativo que essas bactérias possam não pertencer ao referido gênero.
O AIA bacteriano acumulado no sobrenadante das culturas na ausência do aminoácido
L-triptofano também apresentou variabilidade de concentrações entre 0,85 μg.mL-1 e 44,14
μg.mL-1 (Figura 2). Sendo o quantitativo mínimo e o máximo biossintetizado pelos Isolados
UAGB 102 e UAGB 112 respectivamente.
Figura 2 – Produção média de ácido indol acético (AIA) por bactérias diazotróficas isoladas de Brachiaria
humidicola, em meio de cultivo ausente de L-Triptofano. Medias seguidas por letras com números
iguais não apresentam diferenças estatísticas pelo teste de Scott-Knott (P>0.05).
Avaliando a eficiência de bactérias diazotróficas de sintetizarem auxinas com e sem a
adição de L-triptofano in vitro, Cecagno et al., (2014), evidenciaram que esses microorganismos possuem em seu genoma diferentes mecanismos ligados a expressão de genes que
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são ativados em meio a substratos formadores de auxinas, tendo relatado uma grande
versatilidade dessas bactérias em sintetizar fitormônios por outras vias metabólicas na
ausência de L-triptofano, pela ação de enzimas como nitrilases e flavina-oxigenase, o que
explica a biossiossíntese de compostos indólicos na ausência do aminoácido.
Machado et al., (2013), verificando a biossíntese de AIA por bactérias diazotróficas
promotoras de crescimento em plantas em meio de cultura com e sem a presença de Ltriptofano observaram que 90% das bactérias que produziram AIA na presença do aminoácido
também foram capazes de produzir o ácido indol acético em sua ausência quantificando entre
3,2 μg.mL-1 a 4,0 μg.mL-1. Contudo, ainda que as concentrações de AIA quantificadas tenham
sido inferiores às obtidas no meio com L-triptofano, ressaltam que essas bactérias, quando
inoculadas, foram capazes de promover e desenvolvimento radicular de gramíneas forrageiras
como Panicum maximum e Paspalum saurae. Esses resultados são similares aos obtidos nesse
experimento, porém as concentrações de AIA em via L-triptofano independente foram
superiores às relatadas, bem como o percentual de isolados capazes de biossintetizar AIA
independente de L-triptofano, onde o total foi de 100%.
Uma grande versatilidade na biossíntese de AIA pelos isolados bacterianos avaliados
neste experimento pôde ser observada, onde a bactéria UAGB 110, embora possuindo a
capacidade de sintetizar o fitormônio em duas vias metabólicas, L-triptofano dependente e
independente, obteve as menores concentrações de AIA quantificadas nas duas vias entre
todas as bactérias avaliadas. Já o isolado UAGB 108 apresentou elevada produção de AIA
apenas em meio acrescido de L-triptofano com baixa produção na ausência do aminoácido.
Outros isolados que se destacaram na produção do fitormônio em meio acrescido de Ltriptofano (UAGB 104, UAGB 109, UAGB 112, UAGB 113, UABG 115), também foram os
que mais produziram o ácido indol acético em sua ausência, embora em menores quantidades,
assim, verificando, que a quantidade de AIA produzido pelas bactérias avaliadas, depende
principalmente da eficiência dos mecanismos utilizados para esse propósito e em função da
via metabólica expressa para biossíntese do fitormônio.
A avaliação da variabilidade genética das bactérias revelou uma grande diversidade
entre os isolados, de acordo os perfis das bandas gerados pela técnica do BOX-PCR, com a
formação de seis grupos (cluster’s) de acordo com o coeficiente de similaridade de Jaccard.,
onde 16,66% das bactérias obtiveram similaridade superior a 70%, estando agrupadas nos
cluster I e II, e 25% foram completamente similares, agrupadas nos cluster’s II, IV e V
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(Figura 3). Quando correlacionados os grupos gerados, com a biossíntese de ácido indol
acético por via dependente e independente de L-triptofano observou-se também variabilidade
nas concentrações expressas entre os isolados dentro dos grupos formados. Contudo, nas
bactérias agrupadas com 100% de similaridade, essa diferença na biossíntese de AIA não foi
observada.
Isolados bacterianos de cana-de-açúcar avaliados por Lira-Cadete et al., (2012),
também apresentam alta variabilidade genética quando avaliadas pela técnica do BOX-PCR,
com similaridade máxima entre os isolados de 83%. Contudo, a seletividade utilizada naquele
trabalho foi à capacidade de solubilização de fosfato expressa pelas bactérias, o que difere
deste, onde a seletividade foi a biossíntese de AIA.
Figura 3 – Dendrograma gerado a partir do agrupamento da matriz de similaridade genética dos 24 isolados
bacterianos associados à raiz e a rizosfera de B. humidicola, através do algoritmo UPGMA
(Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Average). Os números nos nós do dendrograma
indicam o valor da porcentagem de vezes que o grupo ocorreu no mesmo nó durante o Bootstrap de
1000 repetições.
Similaridade
Similaridade
Similarity
0,96
0,84
0,72
0,60
0,48
0,36
0,24
0,12
0,00
39
50
6
99
1
24
84
100
6
79
24
2
0
11
22
98
2
0
38
93
18
0
29
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
UAGB
112
118
108
110
111
113
109
114
120
107
115
117
116
104
105
106
124
119
121
122
123
101
102
103
Cluster I
Cluster II
Cluster III
Cluster IV
Cluster V
Cluster VI
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Similarmente aos resultados obtidos no presente experimento, VIDEIRA, et al.,
(2012), observaram grande variabilidade genética entre bactérias isoladas de Pennisetum
purpureum. Contudo, com grande formação de grupos com graus de similaridade genética na
faixa de 70%, esses isolados, embora no mesmo agrupamento, também apresentaram grande
variabilidade na biossíntese de AIA via L-triptofano dependente.
4 Conclusões
As Bactérias diazotróficas isoladas de Brachiaria humidicola são capazes de sintetizar o
ácido indol acético in vitro por duas vias metabólicas diferentes, L-triptofano dependente e
independente.
As concentrações de AIA sintetizado variaram conforme a via metabólica utilizada
pelas bactérias para a biossíntese do fotormônio, sendo as maiores concentrações expressas
em via metabólica L-triptofano dependente.
As bactérias avaliadas apresentam alta variabilidade genética, apresentando também,
diferenças nas concentrações de AIA biossintetizado entre os isolados agrupados nos mesmos
Cluster’s.
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Ciência & Tecnologia: FATEC-JB, Jaboticabal (SP), v. 8, Número Especial, 2016. (ISSN 2178-9436).