IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE Streptococcus agalactiae

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IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE Streptococcus agalactiae
PROVENIENTES DE TILÁPIAS DO NILO (Oreochromis niloticus) DE
TANQUES REDE NO NORTE DO PARANÁ
Roberta Silva Baldo (Inclusão Social - Fundação Araucária), Lucienne Garcia
Pretto Giordano (Co-Orientadora), Gislayne Fernandes Lemes Trindade Vilas
Boas (Orientadora). Email: [email protected]
Universidade Estadual de Londrina, Departamento de Biologia Geral/CCB
Área: Genética Molecular e de Microorganismos 0.02.02.008
Palavras-chave: Estreptococose; Tilápia do Nilo; PCR.
Resumo
A criação intensiva de tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus) em tanques redes
favorece a proliferação de microorganismos patogênicos, dentre os quais, se
destaca a espécie Streptococcus agalactiae, a qual é responsável por provocar
altas taxas de mortalidade e prejuízos econômicos para piscicultores. Nesse
estudo foi feita a identificação molecular e microbiológica da presença de S.
agalactiae em peixes com e sem sinais clínicos, coletados durante o verão em
cinco estações de piscicultura localizadas no norte do Estado do Paraná.
Introdução
O Brasil possui condições que proporcionam a aquicultura: clima apropriado,
boa disponibilidade de áreas, safras abundantes de grãos (matéria prima para
rações animais) e um considerável potencial hídrico (KUBITZA, 2003).
Segundo Nogueira (2007), dentre as espécies de peixes produzidas no país, a
tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), encontra-se entre as de maior
importância e aceitação pelos consumidores. De acordo com Kubitza (2003),
qualquer desequilíbrio causado por altas densidades de estocagem,
manutenção inapropriada da qualidade da água, má nutrição, aumenta a
suscetibilidade das tilápias à patógenos.
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Dentre os patógenos mais comum encontram-se as bactérias e, mais
frequentemente isoladas, destaca-se Streptococcus agalactiae, a qual produz
sinais clínicos como exoftalmia uni ou bilateral, natação errática, opacidade de
córnea, letargia, ascite e escurecimento da pele (SALVADOR et al, 2005).
Considerando que na região Norte do Estado do Paraná existe uma
grande quantidade de propriedades de criação de tilápia o objetivo desse
trabalho foi fazer o diagnóstico molecular de cepas bacterianas isoladas a partir
de peixes com e sem sinais clínicos, provenientes de cinco propriedades
produtoras de tilápias do Nilo (O. niloticus) no sistema de tanques rede no norte
do Paraná, visando estudar a ocorrência de S. agalactiae durante o verão.
Procedimentos metodológicos
A coleta de peixes foi realizada em cinco propriedades localizadas na região
norte do Paraná nos meses de verão. Em cada coleta foram selecionados
aleatoriamente 10 peixes de cada propriedade, totalizando 50 peixes, com
massa média de 300 g por animal.
Os peixes foram transportados para o Laboratório de Microbiologia
Veterinária e Doenças Infecciosas do Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva (DMVP), da Universidade Estadual de Londrina – UEL.
Foi realizada a retirada asséptica de rim e encéfalo de cada peixe. Os
órgãos foram processados e armazenados em microtubos a -20° C, até o
momento da extração do DNA dos tecidos.
Para o isolamento, foi realizada a colheita asséptica de rim e encéfalo,
os quais foram processados e as amostras semeadas em Agar Columbia com
5% de sangue de ovino. As placas foram incubadas a 30ºC por 48 horas,
sendo observada presença de crescimento de colônias com morfologia típica
de S. agalactiae. Estas foram submetidas à Coloração de Gram, prova da
catalase, esculina, NaCl 6,5% e crescimento em Agar Azul de Metileno. A
identificação do S. agalactiae foi realizada segundo Evans et al. (2002). Para a
identificação bioquímica foi utilizado o sistema Api 20 Strep (BioMerieux,
France) e para a classificação no grupo de Lancefield, foi utilizado o Slidex
strepto kit (BioMerieux, França).
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Para a extração do DNA foram macerados, 25 mg de rim e 25 mg de
encéfalo de cada peixe, Em seguida, as amostras foram submetidas à extração
de DNA por fenol, clorofórmio e com lise enzimática por Proteinase K,
totalizando 150 amostras, as quais foram submetidas à amplificação por PCR
para identificação molecular de S. agalactiae, conforme descrito por
SCARPASSA (2014).
Resultados e Discussão
Tabela 1 - Peixes positivos para S. agalactiae por isolamento e
amplificação com e sem sinais clínicos de doença bacteriana nas cinco
propriedades estudadas no verão:
Fonte: Roberta, 2016.
Legenda: A, B, C, D, E: Propriedades de criação intensiva de tilápias do Nilo; TSS/CS: Total de peixes sem/com sinal clínico; A - SS/CS: Amplificação em peixes sem/com
sinal clínico; I - SS/CS: Isolamento em peixes sem/com sinal clínico; N - AI: Peixes negativos
(sem amplificação e isolamento).
Dos 50 peixes avaliados, 34 foram considerados positivos pela técnica de
amplificação, se pelo menos um dos órgãos coletados apresentou amplificação
de S. agalactiae.
Pelo isolamento, dos 50 peixes avaliados, um foi considerado positivo,
pois em pelo menos um dos órgãos foi positivo pela técnica de isolamento.
Os dados sugerem que a própria tilápia do Nilo (O. niloticus), pode
manter populações viáveis de S. agalactiae em peixes assintomáticos. Na
ocorrência de condições adversas esses animais podem se tornar fonte de
infecção para outros animais não infectados por essa bactéria.
Conclusões
3
A PCR (Polymerase Chain Reaction) permitiu detectar a presença bacteriana
em mais amostras que pelo isolamento.
Também foi possível observar a presença de S. agalactiae em todas as
propriedades estudadas e em peixes com e sem sinais clínicos.
Peixes assintomáticos podem ser reservatórios de S. agalactiae,
favorecendo a ocorrência de surtos de infecção por essa espécie em criações
intensivas.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq, CAPES e a Fundação Araucária pela
concessão de bolsas e apoio financeiro.
Referências
EVANS, J.J.; KLESIUS, P.H.; GILBERT, P.M. Characterization of bhemolytic
group B Streptococcus agalactiae in culture sea bream ( Sparus auratus) (L.),
and wild mullet (Liza klunzingeri), in Kuwait. Journal of Fish Diseases , v. 25,
n. 3, p. 505-513, 2002.
KUBITZA, F. Qualidade da água no cultivo de peixes e camarões. Panorama
da Aquicultura. 1 ed. Jundiaí, v. 10 nº 60. 2003. 41 p. 2003.
MARTINEZ, G.; HAREL, J.; GOTTSCHALK, M. Specific detection by PCR of
Streptococcus agalactiae in milk. Canadian Journal of Veterinary Research,
v. 65, n. 1, p. 6872, 2001.
NOGUEIRA, A. Criação de tilápias em tanques rede; Salvador: Sebrae
Bahia. 23p. 2007.
SALVADOR, R.; MULLER, E. E.; FREITAS, J. C.; LEONHADT, J. H.; PRETTO
GIORDANO, L. G.; DIAS, J. A. Isolation and characterization of
Streptococcus spp. group B in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) reared
in hapas nets and earth nurseries in the northern region of Parana State,
Brazil . Ciência Rural, Santa Maria, v. 35, p. 1374-1378. 2005.
4
SCARPASSA, J. A.; Detecção molecular e isolamento de Streptococcus
agalactiae em tilápia do nilo (Oreochromis niloticus) com e sem sinais
clínicos de doença bacteriana. 2010. Dissertação (Mestrado em Genética e
Biologia Molecular) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina. 2014.
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