título do resumo

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DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO/MOLECULAR E ESTUDOS DE
PATOGENICIDADE DE STREPTOCOCCUS AGALACTIAE EM PEIXES.
Gabriel Augustho dos Santos Ferreira1; Ulisses de Pádua Pereira2;
[email protected]
1 Bolsista de Iniciação Científica CNPq, discente do Curso de Medicina
Veterinária.
2 Orientador, Docente do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva,
Coordenador do Laboratório de Bacteriologia em Peixes da UEL (LABBEP), CCA-UEL.
Área e sub-área do conhecimento: Medicina Veterinária Preventiva,
Doenças Infecciosas de animais.
Palavras-chave: aquicultura, diagnóstico microbiológico, bacteriologia.
Resumo
A piscicultura mundial vem apresentando elevadas taxas de expansão
nas últimas décadas e por este fato veio a ser um dos mais promissores ramos
da agropecuária dentro do contexto da produção de proteína de origem animal
e no Brasil não foi diferente. O cultivo de tilápias se destaca por liderar o
ranque das espécies mais produzidas, possuindo grande importância
econômica, entretanto, falhas no manejo auxiliam na manutenção e rápida
disseminação de patógenos. A estreptococose em peixes é uma doença
comum em várias partes do mundo podendo infectar diversas espécies de
peixes de água doce e marinhos. Esta doença apresenta mortalidade elevada,
principalmente em peixes cultivados em tanques-rede, quando há manejo
inadequado ou elevação da temperatura da água. O presente trabalho teve
como objetivo realizar o diagnóstico microbiológico e molecular em peixes
acometidos por este patógeno e comprovar a virulência do Streptococcus
agalactiae por infeção experimental. Foram coletados 55 peixes que
apresentavam sinais clínicos, oriundos de sete propriedades e transportados
ao Laboratório de Bacteriologia em Peixes (LABBEP) para posterior
processamento, isolamento, analises bacteriológicas, identificação por métodos
moleculares e posteriormente a reprodução da infecção por via intraperitoneal.
As cepas isoladas foram identificadas como pertencentes ao grupo B de
Lancefield e confirmadas por reação de PCR com primers espécie específicos
para Streptococcus agalactiae. Todas as amostras sequenciadas agruparam
com amostras já isoladas por outras equipes no país, em um cluster de
amostras do sorotipo Ib, o mais comum em tilápias no Brasil. Todas as
amostras foram resistentes a estreptomicina no antibiograma, e foram
1
sensíveis a todos os outros antimicrobianos testados. Na infecção
experimental, a taxa de mortalidade foi de 100% dos animais infectados o que
comprovou a virulência do patógeno.
Introdução e objetivo
Nas últimas duas décadas, houve um aumento na produção e no
consumo mundial de peixe (FELDHUSEN, 2000). Segundo a Secretaria de
Aquicultura e Pesca, SEAP (2006), a produção vem crescendo rapidamente no
mundo, contribuindo de forma cada vez mais efetiva com o suprimento mundial
de pescado. Assim, observa-se um crescente interesse dos pesquisadores e
criadores, no que se refere aos prejuízos causados por mortalidade e
problemas na produção piscícola (SCHALCH, 2011). As bactérias apresentam
grande importância na piscicultura intensiva, uma vez que podem ocasionar
impacto econômico considerável devido às doenças com elevadas taxas de
morbidade e mortalidade.
A estreptococose em peixes é uma doença comum em várias
partes do mundo podendo infectar diversas espécies de peixes de água doce e
marinhos. Esta doença apresenta mortalidade elevada, principalmente em
peixes cultivados em tanques-rede quando há manejo inadequado,
ocasionando estresse físico e fisiológico, deterioração da qualidade da água,
nutrição deficiente, elevação da temperatura da água, infestação por parasitas
e excessivas estocagens (FIGUEIREDO et al., 2008). O diagnóstico das
afecções microbiológicas é importante na busca da identificação de quais são
as bactérias, ou outro agente patogênico, causador de lesões graves que
geralmente evoluem para o óbito. O conhecimento da distribuição sazonal dos
microrganismos causadores de enfermidades, assim como, da complexa
relação entre fatores ambientais, hospedeiros e patógenos são importantes
para realizar a profilaxia adequada, através de programas preventivos de
controle destas enfermidades (SCHALCH; MORAES, 2005).
O diagnóstico precoce por microbiologia e por técnicas
moleculares em conjunto com o perfil de sensibilidade aos agentes
antibacterianos é de fundamental importância para a eficácia do tratamento
bem como para monitorar o aparecimento de linhagens mais resistentes
(GASTALHO et al., 2014). Adicionalmente, análises filogenéticas também
auxiliam nisso, uma vez que o aparecimento de linhagens geneticamente
distintas das frequentemente isoladas na região também pode indicar
diferenças na virulência e no perfil de resistência aos antibacterianos
(PEREIRA et al., 2013).
Realizar o diagnóstico microbiológico e molecular de Streptococcus
agalactiae isolados de peixes e analisar filogeneticamente os isolados
comparando com sequências de bactérias depositadas no Genbank.
2
Adicionalmente, avaliar o perfil de sensibilidade (por antibiograma) de amostras
isoladas frente aos antimicrobianos mais utilizados na piscicultura e comprovar
sua virulência em desafio experimental.
Procedimentos metodológicos
Foram coletados um total de 55 peixes (5-20 peixes) de 7 propriedades
diferentes da bacia do rio Paranapanema que tiveram elevada mortalidade e
com sinais clínicos variáveis (exoftalmia, apatia, hiporexia, escurecimento de
pele e/ou natação errática). Os peixes foram transportados até o Laboratório de
Bacteriologia em Peixes (LABBEP) do Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva da Universidade Estadual de Londrina. Posteriormente, foi realizada
a coleta assepticamente de baço, olhos, cérebro, fígado, abcessos caudais e
rim cranial, e outras amostras provenientes de órgãos ou tecidos que
apresentaram lesões macroscópicas e conteúdos anormais para realização das
análises microbiológicas.
Os swabs dos órgãos coletados foram semeados em caldo BHI e
ágar nutriente enriquecido com 5% de sangue ovino desfibrinado e cultivados
em estufa à 28ºC por até 72 horas. Onde houve o crescimento de colônias
bacterianas puras, foram observadas características morfológicas: morfologia
de colônia e células bacterianas, coloração de Gram, catalase, oxidase,
crescimento em caldo BHI com 6,5% de NaCl, teste de CAMP e hemólise. Nos
casos de bactérias cocos Gram positivos com testes de catalase e oxidase
negativos, foi realizado o teste de esculina. Também foi utilizado o KIT Slidex
Strepto, a fim de identificar a qual grupo de Lancefield pertencem os isolados,
além de análises por biologia molecular (reação de PCR utilizando os primers
espécie específicos para S. agalactiae, Sdi 61 e Sdi 252, e amplificação e
posterior sequenciamento do gene 16S rRNA codificador da subunidade 16S
ribossomal).
Para análise do perfil de sensibilidade aos antibióticos seguiramse as normas do CLSI de 2012 (Clinical and Laboratory Standards Institute)
considerando as especificidades dos testes para animais aquáticos reportados
também pelo CLSI em 2006 (Methods for Antimicrobial Disk Susceptibility
Testing of Bacteria Isolated from Aquatica Animals). As bactérias já
identificadas e cultivadas em meio de cultura foram diluídas em solução salina
até atingir a escala 0,5 de MacFarland e em sequência semeadas em ágar
Mueller Hinton enriquecido com 5% de sangue ovino desfibrinado, com adição
de discos contendo concentrações conhecidas de antibióticos (estreptomicina
10 µg, amoxacilina 10 µg, cloranfenicol 30 µg, tetraciclina 30 µg, enrofloxacina
10 µg, penicilina 10 µg e florfenicol 30 µg) no meio de cultura.
Para a extração do DNA as bactérias isoladas foram cultivadas
por 24 a 48 horas a 28ºC em meio de cultura líquido (caldo BHI).
3
Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 8.000 g por 10 minutos,
descartado o sobrenadante, e realizado o método de extração conforme
Pereira et al. (2013). O precipitado bacteriano foi lavado com solução 1 mL
Tris/EDTA/NaCl [10 mM Tris/HCl (pH 7.0), 10 mMEDTA (pH 8.0), and 300 mM
NaCl] e centrifugado novamente nas mesmas condições, realizando-se
novamente o processo de centrifugação, descartando novamente o
sobrenadante e se ressuspensão do pellet em 1 mL TE/lisozima [25 mM
Tris/HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0), 10 mM NaCl, e 10 mg lisozima/mL].
As amostras foram incubadas a 37ºC por 60 minutos, em seguida adicionaramse 30 µl de 30% N-lauroyl-sarcosine sódico (Sarcosyl) a cada amostra,
vortexado e incubado por 20 minutos a 65ºC, seguiu-se por incubação a 4ºC
por cinco minutos. O DNA foi purificado utilizando fenol/clorofórmio/álcool
isoamílico (25:24:1) e precipitado com etanol e posteriormente utilizado para
PCR. A identificação das espécies das bactérias foi realizada a partir das
análises in silico utilizando o software BLAST do NCBI ou por análises de
alinhamento e filogenia realizadas pelos programas Bioedit e Mega5.
Para verificar a virulência do S. agalactiae foi realizada uma
infecção experimental deste patógeno via intraperitoneal. Adquiriu-se juvenis
de produtores de alevinos do estado do Paraná e antes do início do
experimento foram acondicionados em aquários de 60 L (em uma densidade
de 15 peixes por aquário) com renovação contínua de água (0,5 L/h), 12h de
luz diária e alimentados três vezes ao dia com ração de 32%PB por 10 dias
para ambientação. Os animais foram divididos em grupos de 10 peixes cada,
delineado da seguinte forma: grupo controle negativo, grupo infectado com
baixa dosagem bacteriana (1 x 104 UFC/peixe) e grupo infectado com elevada
dosagem bacteriana (1 x 108 UFC/peixe). Após infecção experimental, os
animais foram observados 4 vezes ao dia para avaliação de sinais clínicos e
para processamento microbiológico logo após a ocorrência de óbitos.
Resultados e discussão
Do total de amostras coletadas, foram isoladas 39 cepas de rim, cérebro
e olho. As colônias encontradas foram puntiformes, com bordos regulares, não
hemolíticas, catalase negativas, oxidase negativas, apresentaram ausência de
crescimento em caldo BHI suplementado com 6,5% de NaCl, esculina
negativos e foram negativas no teste de CAMP. No teste de sensibilidade,
todas as cepas foram resistentes à estreptomicina, entretanto, todas foram
sensíveis aos outros antimicrobianos testados. Os isolados foram identificados
como pertencentes ao grupo B de Lancefild pelo Kit Slidex Strepto e,
posteriormente confirmado pela reação de PCR utilizando os primers espécie
específicos para Streptococcus agalactiae. Adicionalmente, a relação
filogenética foi analisada pelas sequencias obtidas no sequenciamento do gene
4
16S rRNA sugerindo que as amostras pertencem ao sorotipo Ib, o qual é o
mais frequente no país (PEREIRA, et al., 2013).
Após a infecção experimental foi observado no primeiro dia pósinfecção anorexia, escurecimento de pele e natação errática no grupo que
recebeu maior dosagem bacteriana. Já no grupo que recebeu menor dosagem
bacteriana, no terceiro dia pós-infecção hiporexia e escurecimento de pele.
Mortalidade começou a ocorrer no segundo e quinto dia pós-infecção nos
grupos de maior dosagem do patógeno e menor dosagem, respectivamente.
No fim do experimento in vivo, todos os animais evoluíram ao óbito e a
presença de S. agalactiae foi confirmada por cultura bacteriana.
Adicionalmente, no grupo controle negativo não houve mortalidade e todos os
animais foram negativos na cultura bacteriana.
Conclusão
Os métodos de diagnósticos microbiológicos e moleculares quando
utilizados conjuntamente proporcionam maior rapidez, praticidade e
confiabilidade no diagnóstico de S. agalactiae em peixes. Foi demonstrado que
este patógeno está presente nas pisciculturas da bacia do rio Paranapanema e
com relação filogenética das bactérias isoladas similar aos resultados obtidos
em outras regiões do país e do mundo. Adicionalmente, foi comprovada a
virulência deste patógeno, com mortalidade de 100% dos animais. Por fim, o
monitoramento do perfil de sensibilidade aos agentes antibacterianos deve ser
realizado de forma periódica, uma vez que a resistência a estreptomicina está
amplamente disseminada nas linhagens isoladas na região.
Referências
FELDHUSEN, F. The role of seafood in bacterial foodborne
diseases. Microbes and Infections, v.2, p. 1651–1660, 2000.
FIGUEIREDO, H. C. P. & LEAL, C. A. G. Tecnologias aplicadas em
sanidade de peixes. Revista Brasileira de Zootecnia, v.37, p.8-14, 2008.
GASTALHO, S.; SILVA, G. J.; RAMOS, F. Uso de antibióticos em
aquacultura e resistência bacteriana: Impacto em saúde pública. Acta
Farmacêutica Portuguesa, v. 3, p. 29–45, 2014.
PEREIRA, U. P.; MIAN, G. F.; OLIVEIRA, I C M; et al. Genotyping of
Streptococcus agalactiae strains isolated from fish, human and cattle and
their virulence potential in Nile tilapia. Veterinary Microbiology, v. 140, n. 1–
2, p. 186-192, 2010.
SCHALCH, S. H. C. & MORAES, F. R. Distribuição sazonal de
parasitos branquiais em diferentes espécies de peixes em pesque-pague
5
do município de Guariba - SP, Brasil. Revista Brasileira de Parasitologia
Veterinária, v.14, n.4, p. 141-146, 2005.
SCHALCH, S. H. C. Impactos causados por parasitoses em peixes
criados na região noroeste paulista do Estado de São Paulo. Pesquisa &
Tecnologia, v.8, n.38. 6 p. 2011.
SEAP, Secretaria de Aqüicultura e Pesca. O diagnóstico da pesca
extrativa
no
Brasil,
2006.
Disponível
em:
<
http://www.presidencia.gov.br/estrutura_presidencia/seap/pesca/> Acesso em:
23 set. 2016
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