imunomodulação promovida pelo transplante de células tronco
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Layla Testa Galindo IMUNOMODULAÇÃO PROMOVIDA PELO TRANSPLANTE DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS DERIVADAS DA MEDULA ÓSSEA EM LESÕES NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Ciências. São Paulo 2011 Layla Testa Galindo IMUNOMODULAÇÃO PROMOVIDA PELO TRANSPLANTE DE CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS DERIVADAS DA MEDULA ÓSSEA EM LESÕES NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Ciências pelo programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular. Orientadora: Profª. Drª. Marimélia Porcionatto Co-orientador: Prof. Dr. Niels Olsen S. Câmara São Paulo 2011 Galindo, Layla Testa Imunomodulação promovida pelo transplante de células tronco mesenquimais derivadas de medula óssea em lesões no sistema nervoso central/Layla Testa Galindo--São Paulo, 2011. xiv, 96 f. Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação Biologia Molecular Título em inglês: Immunomodulation promoted by bone marrow derived mesechymal stem cells transplanted in central nervous system injuries 1. Lesão no SNC; 2.Neuroinflamação; 3.Citocinas; 4. Imunomodulação; 5. Células tronco mesenquimais; 6. Células tronco neurais À memória do meu avô Aleno, aos meus pais Carlos e Margarete e à minha irmã Isis, por todo amor, apoio, incentivo e confiança que sempre depositaram em mim e por todas as oportunidades que me proporcionaram. iv Ao Henrique, meu grande amor e amigo, por todo amor carinho, companheirismo, compreensão e apoio. Obrigada por fazer parte da minha vida. v Agradecimentos À minha orientadora Profa. Dra. Marimélia Porcionatto, sou grata pela orientação, pela atenção, amizade, paciência e além de tudo por me dar a chance de aprender cada vez mais. Ao meu co-orientador Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara, pela ajuda e colaboração neste trabalho. À Profa. Dra. Helena Bonciani Nader, pela oportunidade para a realização deste trabalho. À Ana Paula, Carol Ariza, Carol Mônaco, Marcella, Thaís Filippo, Paulo Henrique, Bruno Gui Mi Ko, Renata, Richelli e Carol Meloni, pela grande ajuda, amizade, ensinamentos e risadas que tornaram o dia a dia no laboratório muito mais agradável. À Patricia Semedo, ao Cassiano Oliveira e Gabriela Filoso Barnabé pela ajuda, sem a qual não seria possível completar esse trabalho. Aos amigos e colegas da disciplina de Biologia Molecular da UNIFESP, pelo companheirismo e convivência durante esses anos. Aos demais professores e funcionários da disciplina de Biologia Molecular e do biotério do Infar da UNIFESP, por terem, de alguma forma, contribuído para a realização deste trabalho. Aos meus pais, Carlos e Margarete e à minha irmã Isis pelo constante incentivo, carinho e por sempre acreditarem em mim. À tia Mary, tio Ulisses, Patrícia, Márcia, Priscila, João, à pequena Giovana, Rose, Raquel e à toda minha família pelo incentivo e carinho. Às minhas grandes companheiras Larissa (Mam´s), Larissa (Dutra), e ao companheiro Gustavo (Babito), pela amizade e apoio incondicionais. Às minhas grandes amigas Alice (Desdém), Ana Rachel (Tiazoca), Bianca (Vomets), Danielle (Xan), Lílian (Ofurô), Natália (Disin), pela amizade e reencontros inesquecíveis. À Lídia, velha amiga, por sempre estar a postos quando preciso de uma palavra, um ombro ou um oi. Muito Obrigada. vi Este trabalho foi realizado com apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP/ Processo 2008/07570-9) e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). vii “Quando achamos que temos todas as respostas, vem a vida e muda todas as perguntas.” (Luis Fernando Veríssimo) viii SUMÁRIO 1. 2 3 INTRODUÇÃO ...........................................................................................................1 1.1 Resposta inflamatória no sistema nervoso central e seus mediadores ................1 1.2 Citocinas no SNC ................................................................................................4 1.3 Células tronco mesenquimais secretam fatores ativos em reações inflamatórias 6 1.4 Neurogênese e células tronco neurais endógenas ............................................10 OBJETIVOS .............................................................................................................16 2.1 Geral..................................................................................................................16 2.2 Objetivos específicos .........................................................................................16 MATERIAL E MÉTODOS .........................................................................................18 3.1 Animais..............................................................................................................18 3.2 Obtenção e cultivo das CTMs ............................................................................18 3.3 Diferenciação das CTMs de camundongos........................................................19 3.3.1 Diferenciação adipogênica..........................................................................19 3.3.2 Diferenciação osteogênica..........................................................................20 3.4 Obtenção e cultivo das CTNs ............................................................................21 3.5 Medida da viabilidade celular pela dosagem da atividade de desidrogenase mitocondrial (método do MTT)......................................................................................22 4 3.6 Ensaio de apoptose (TUNEL) ............................................................................22 3.7 Imunofluorescência ............................................................................................23 3.8 Citometria de Fluxo ............................................................................................24 3.9 Produção de lesão no SNC nos animais de experimentação e injeção de CTMs 25 3.10 Análise dos transcritos gênicos..........................................................................26 3.10.1 Extração do RNA dos tecidos dissecados e das células .............................26 3.10.2 Síntese do DNA complementar...................................................................27 3.10.3 PCR em tempo real (qPCR) .......................................................................27 3.11 Análise de citocinas por Multiplex ......................................................................29 3.12 Análise estatística ..............................................................................................30 RESULTADOS .........................................................................................................32 4.1 Isolamento e cultivo de células tronco mesenquimais derivadas de medula óssea de camundongos ..........................................................................................................32 4.2 Ensaios de diferenciação ...................................................................................32 4.3 Isolamento e cultivo de CTNs derivadas da SVZ de camundongos ...................34 4.4 Efeitos das citocinas secretadas por CTMs sobre a sobrevivência, proliferação e diferenciação de CTNs in vitro......................................................................................34 ix 4.4.1 Expressão de citocinas por CTMs de origem adulta ...................................34 4.4.2 Sobrevivência de CTNs ..............................................................................36 4.4.3 Proliferação de CTNs .................................................................................38 4.4.4 Diferenciação de CTNs ...............................................................................40 4.5 Efeito do transplante de CTMs adultas em modelo de lesão traumática no SNC de camundongo ...........................................................................................................42 4.6 Efeito do transplante de CTMs local sobre a resposta inflamatória sistêmica ....47 5 DISCUSSÃO ............................................................................................................51 6 CONCLUSÃO...........................................................................................................58 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .........................................................................60 x Lista de Figuras Figura 1: Neurogênese na zona subventricular. ................................................................... 12 Figura 2: Coordenadas das lesões......................................................................................... 25 Figura 3: CTMs derivadas de medula óssea ......................................................................... 32 Figura 4: Diferenciação adipogênica das CTM ..................................................................... 33 Figura 5: Diferenciação osteogênica das CTMs. .................................................................. 33 Figura 6: CTNs derivadas da SVZ de camundongos ........................................................... 34 Figura 7: Expressão de citocinas por CTMs de origem adulta ............................................ 36 Figura 8: Viabilidade das CTNs cultivadas com meio condicionado por CTMs ................. 37 Figura 9: Ensaio de apoptose das CTNs cultivadas com meio condicionado por CTMs. . 38 Figura 10: Meio condicionado por CTMs estimula proliferação de CTNs in vitro (citometria de fluxo)................................................................................................................... 39 Figura 11: Meio condicionado por CTMs estimula proliferação de CTNs in vitro (imunofluorescência)................................................................................................................. 39 Figura 12: Expressão gênica por CTNs. ................................................................................ 41 Figura 13: Expressão de IL-6 e TNF-α 24 horas após lesão traumática, transplantados ou não com CTMs. ......................................................................................................................... 43 Figura 14: Expressão de IL-10 e IL-4 24 horas após lesão traumática, transplantados ou não com CTMs.. ........................................................................................................................ 45 Figura 15: Expressão de IL-6 e TNF-α 30 dias após lesão traumática, transplantados ou não com CTMs. ......................................................................................................................... 47 Figura 16: Quantificação de citocinas no soro dos animais 24 horas após lesão traumática, transplantados ou não com CTMs. ...................................................................... 48 Figura 17: Quantificação de quimiocinas no soro dos animais 24 horas e 30 dias após lesão traumática, transplantados ou não com CTMs............................................................. 49 xi Lista de Abreviaturas ANOVA Análise de Variância BDNF Brain-Derived Neurotrophic Factor BrdU 5-bromo-2’-deoxiuridina CC Corpo caloso CEP Comitê de Ética em Pesquisa cDNA DNA complementar CTMs Células Tronco Mesenquimais CTNs Células Tronco Neurais CXCL12 Quimiocina CXCR4 Receptor de CXCL12 DAPI 4’-6-Diamidino-2-fenilindol Dcx Doublecortin DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium DMSO Dimetilsulfóxido DNA Ácido desoxirribonucleico dNTP Desoxinucleotídeo trifosfato DV Eixo Dorso-Ventral EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético EGF Epidermal Growth Factor FGF Fibroblast Growth Factor g Gravidade GFAP Glial Acidic Fibrillary Protein HEPES ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N-2-etano-sulfônico HGF Hepatocyte Growth Factor IDO 2, 3 (indolamina 2, 3 deoxigenase), IFNγ Interferon-γ IL-1 Interleucina-1 IL-6 Interleucina-6 LB Lamina Basal LV Lateral ventricle MTT NeuN Brometo de 3,-(4,5-dimetiltiazol-2yl)- 2,5 difeniltetrazolio Neuron-Specific Nuclear Protein NK Células Natural Killer xii NO Óxido nítrico pb pares de bases PBS Tampão Salina Fosfato PCR Reação em Cadeia da Polimerase PFA Paraformoldeído PSA-NCAM Poly-Sialated Neural Cell Adhesion Molecule RMS Rostral Migratory Stream RNA Ácido Ribonucléico RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction SDF-1 Stromal-Derived Factor-1 SFB Soro Fetal Bovino SGZ Subgranular Zone Shh Sonic Hedgehog SNC Sistema Nervoso Central SOX2 SRY bom2, sex determining region Y-2 SVZ Subventricular Zone TAE Tampão Tris-acetato 40mM; EDTA 1mM TCE Traumatismo Crânio Encefálico TGFα Transforming Growth Factor α TGFβ Transforming Growth Factor β TNFα Tumor Necrosis Factor α TUNEL Terminal deoxynucleotidiltransferase (TdT)- mediated dUTP nick and labeling VEGF Vascular Endothelial Growth Factor β-tubulina III Classe III β-tubulina μ Micromêtro xiii Resumo Lesões no sistema nervoso central (SNC) levam a permeabilidade da barreira hematoencefálica, o que permite a entrada de células do sistema imune e a ativação das células da glia, principalmente microglia e astrócitos. Esse processo desencadeia a secreção de mediadores inflamatórios por essas células. As citocinas são as principais moléculas da resposta neuroinflamatória e são críticas para a regulação desta resposta, exercendo uma variedade de ações no SNC. Células tronco mesenquimais (CTMs), que possuem potencial proliferativo e são capazes de originar linhagens celulares distintas e especializadas, também secretam essas moléculas, caracterizando um poder imunomodulador. As CTMs, particularmente as derivadas da medula óssea, promovem o reparo tecidual pela secreção de fatores que aumentam a regeneração do tecido, estimulando proliferação, migração e diferenciação de progenitores endógenos encontrados na maioria dos tecidos, diminuindo a resposta imune e inflamatória e a apoptose. A habilidade de essas células alterarem o microambiente através de sua influência trófica pode contribuir mais significativamente para o reparo do tecido que a transdiferenciação. Nossa hipótese é que as citocinas secretadas pelas CTMs poderiam participar da atração de células tronco neurais endógenas para um local de lesão no SNC, criando um microambiente favorável para essas células. Tendo isso em vista, esta tese teve como objetivo estudar os efeitos dos fatores secretados pelas CTMs sobre células tronco neurais (CTNs) in vitro, e analisar a expressão de citocinas por CTMs in vivo em um modelo de lesão traumática no SNC. Primeiramente, avaliamos os efeitos dos fatores secretados pelas CTMs sobre apoptose, proliferação e diferenciação de CTNs adultas derivadas da zona subventricular e cultivadas como neuroesferas. Para isso, cultivamos as neuroesferas em meio condicionado por CTMs derivadas de medula óssea. Além disso, foram realizadas lesões no córtex motor primário dos animais, seguidas da injeção de CTMs no local da lesão. Nossos resultados indicam que os fatores secretados pelas CTMs não induzem nem previnem a apoptose das CTNs, aumentam a proliferação dessas células e induzem maior expressão do gene GFAP in vitro, o que indicaria uma tendência a diferenciação em astrócitos. Nos experimentos in vivo, nossos resultados mostram que a injeção das CTMs em um modelo de lesão aguda no SNC diminui a expressão de citocinas pró-inflamatórias no tecido lesado, indicando que os fatores solúveis secretados por CTMs podem modular a inflamação no local lesado, o que pode ser interessante para a criação de um microambiente favorável para CTNs endógenas e conseqüentemente para o reparo do tecido lesado. xiv Introdução Introdução 1. INTRODUÇÃO 1.1 Resposta inflamatória no sistema nervoso central e seus mediadores A inflamação foi primeiramente descrita pelo anatomista romano Celsus e caracterizada por calor, rubor, tumor e dor (para revisão, vide (Rock & Kono, 2008). Evolutivamente, a resposta inflamatória tem como função combater parasitas, microorganismos e manter a homeostase tecidual, esta resposta também pode levar a lesões secundárias no tecido e pode estar envolvida com doenças autoimunes e isquemias (Cederberg & Siesjo, 2010). Na maioria dos tecidos, incluindo o sistema nervoso central (SNC), a reação inflamatória é ativada tanto após trauma como após isquemia e pode causar tanto o agravamento como a melhora do tecido danificado, dependendo do tipo de tecido envolvido e do tipo de lesão. Por muitos anos, o SNC foi considerado um local imunologicamente privilegiado, por não ser susceptível nem contribuir para o processo inflamatório causado por lesões ou infecções (Allan & Rothwell, 2003), ou por ter uma resposta imune limitada, diferente dos outros sistemas (Zipp & Aktas, 2006). Hoje, sabe-se que o cérebro é um órgão imunologicamente ativo, conectado diretamente com os sistemas imune e endócrino (Farooqui et al., 2007). O SNC responde a estímulos de inflamação periférica, regula muitos aspectos da resposta inflamatória de fase aguda e possui resposta inflamatória local, o que parece contribuir com a fisiopatologia das doenças cerebrais agudas e crônicas (Lucas et al., 2006). Embora previamente relatada como deletéria para o cérebro lesado, a inflamação no tecido cerebral pode trazer benefícios se for controlada e se ocorrer por um período de tempo definido. Por outro lado, se a reposta inflamatória for sustentada por um longo período de tempo ou se for excessiva, a inflamação passa a ser causa de patologias (Ziebell & Morganti-Kossmann, 2010). Em termos gerais, a neurodegeneração aguda está relacionada com condições clínicas em que neurônios são danificados rapidamente e, geralmente, morrem devido a um dano repentino, como traumas na cabeça, derrames, hemorragia cerebral ou subaracnóidea e isquemia cerebral (Allan & Rothwell, 2001). A neuroinflamação aguda desenvolve-se rapidamente e, geralmente, apresenta quadros de dor (Farooqui et al., 2007). A neuroinflamação aguda pode também ser considerada um mecanismo protetor, porque isola o tecido neural danificado da área não afetada, destrói as células que tenham morrido por conta da lesão inicial e repara a matriz extracelular (Correale & Villa, 2004), resultando em uma resposta adaptativa necessária para o retorno ao estado normal (Guyon et al., 2008). A neuroinflamação crônica difere da aguda por estar abaixo 1 Introdução do limiar da dor. Como resultado, o sistema imune continua a atacar ao nível celular e, quando prolongada ou inapropriada, a inflamação pode ser prejudicial e causar sérios danos ao tecido, levando a uma patologia mais grave (Guyon et al., 2008; Simi et al., 2007). A infiltração de células no cérebro em resposta a infecções, inflamações e lesões agudas é mais fraca e mais demorada que em outros tecidos (Lucas et al., 2006). Porém, quando há o rompimento da barreira hematoencefálica no período agudo da lesão, ocorre influxo de neutrófilos, monócitos e linfócitos circulantes no local lesado, afetando diretamente a sobrevivência e morte neuronais (Morganti-Kossmann et al., 2007). O acúmulo de células do sistema imune no parênquima foi relatado em modelos animais e de pacientes com trauma cerebral (Morganti-Kossmann et al., 2002). Essas células ativadas secretam mediadores como prostaglandinas, radicais livres, fatores do complemento e citocinas pró-inflamatórias que por sua vez induzem a expressão de quimiocinas e moléculas de adesão celular e mobilizam mais células do sistema imune e glia para o local lesado (Werner & Engelhard, 2007). Portanto, após um trauma no cérebro, a resposta inflamatória é caracterizada basicamente por ativação glial, recrutamento de leucócitos, aumento da expressão e secreção de mediadores como citocinas e quimiocinas. Com o tempo, a produção subseqüente de mediadores antiinflamatórios suprime a ativação imune humoral e celular. Além da infiltração de células sangüíneas, a ativação da microglia residente tem uma importância significativa no cérebro lesado (Ziebell & Morganti-Kossmann, 2010). Antes caracterizadas como mero sistema de suporte de neurônios, as células da glia atualmente são reconhecidas como elementos moduladores fundamentais da resposta imune no SNC (Farooqui et al., 2007). A maioria das células do tecido cerebral, incluindo microglia, astrócitos, neurônios e oligodendrócitos, participa da resposta inflamatória no cérebro, mas em geral, a resposta é caracterizada, principalmente, pela ativação da microglia e de astrócitos (Hanisch, 2002). A microglia representa 20% das células da glia (Kreutzberg, 1996). São células fagocíticas da família dos monócitos e macrófagos, respondem rapidamente ao estímulo patogênico como forma de proteger o cérebro e secretam várias moléculas inflamatórias, particularmente, as citocinas, principais efetores na cascata inflamatória (Hanisch, 2002). A principal função da microglia é remover debris de células, processo necessário para atenuar a resposta inflamatória e promover o remodelamento tecidual. Porém a microglia também secreta moléculas neurotóxicas, como glutamato e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, que podem exacerbar a morte neuronal (Kreutzberg, 1996). Os astrócitos participam de uma variedade de processos fisiológicos e fisiopatológicos e, em colaboração com as 2 Introdução células da microglia, monitoram e mantêm a homeostase e o microambiente favorável para a sobrevivência dos neurônios (Kempermann & Neumann, 2003). Os astrócitos presentes na região da lesão desempenham dois papeis diferentes. Por um lado, inibem a regeneração devido à formação de uma cicatriz glial pela secreção de moléculas inibitórias do crescimento axonal (Sofroniew, 2009). Por outro lado, a presença dos astrócitos em torno da lesão provê um ambiente favorável devido à liberação de fatores neurotróficos que promovem o reparo do tecido e a neurogênese. Quando a glia reativa é seletivamente removida em modelo experimental animal, a degeneração secundária é exacerbada (Faulkner et al., 2004). A cicatriz glial tem por função reparar a barreira hematoencefálica, prevenir infiltração de leucócitos e estabelecer uma barreira entre a região da lesão e o resto do SNC, ainda não danificado, impedindo maiores danos. Assim, embora as células da cicatriz glial produzam moléculas inibitórias da regeneração do SNC, a formação da cicatriz glial pode ser encarada como um mecanismo protetor. A maioria dos mediadores inflamatórios tem relativamente pouca ação no tecido nervoso saudável e é expressa em níveis baixos ou em níveis não detectáveis (Lucas et al., 2006). No entanto, estas moléculas inflamatórias são induzidas rapidamente em resposta à lesão no tecido e exercem funções diversas (Rothwell & Luheshi, 2000). As citocinas são os principais mediadores da resposta neuroinflamatória (Simi et al., 2007) e são críticas para a regulação da inflamação, uma vez que desempenham importante papel na resposta celular neural em infecções e lesões no cérebro (Lucas et al., 2006).A inflamação induz rápida expressão de mediadores inflamatórios produzidos e secretados pela microglia e pelos astrócitos, como as citocinas inflamatórias IL-1β e α, IL-3, -6, TNFα (do inglês tumor necrosis factor alpha), TGFβ e α (do inglês transforming growth factor) (Farooqui et al., 2007), quimiocinas e prostaglandinas, que aumentam a expressão de moléculas de adesão e aumentam a permeabilidade da barreira hematoencefálica, o que facilita a invasão de células periféricas e induz a liberação de moléculas potencialmente tóxicas (Lucas et al., 2006; Simi et al., 2007). A incapacidade das fibras nervosas regenerarem leva à morte do corpo celular correspondente. Além disso, fibras não danificadas nas regiões próximas aos axônios lesados são afetadas pelo espalhamento lateral da lesão e sofrem degeneração secundária (Yoles & Schwartz, 1998a). A degeneração secundária parece ser mediada por agentes como glutamato (Yoles & Schwartz, 1998b), radicais livres ou mediadores de toxicidade, alguns dos quais relacionados exclusivamente com lesão axonal do SNC e não com lesão direta aos corpos celulares (Bazan et al., 1995). A maioria da população de neurônios e glia localizados na lesão morrem devido ao rompimento das membranas 3 Introdução celulares ou como conseqüência da isquemia causada pela ruptura vascular. A morte celular maciça na fase secundária ocorre por apoptose e necrose, afetando todas as células nervosas. Estudos investigando alternativas terapêuticas para neuroproteção estão em expansão, tendo como foco principal a intervenção farmacológica, objetivando manipular os processos de lesão secundária e com isso melhorar o prognóstico dos pacientes com traumatismo crânio-encefálico (TCE). Alguns agentes atenuam neurotoxicidade e morte celular secundária em modelos animais de derrame, lesão traumática cerebral e espinal, porém em humanos os testes são inconclusivos (Ziebell & Morganti-Kossmann, 2010). Na última década muitos grupos focaram no desenvolvimento de novas terapias com alvo na inflamação. Foi testado, para modelos de lesão traumática, o uso de canabinóides (Shohami et al., 1997), corticosteróides, interrompido devido à alta mortalidade (Edwards et al., 2005), antiinflamatórios não-esteroidais (Bye et al., 2007), ibuprofeno, benéfico para modelo animal transgênico de Alzheimer, reduzindo a formação das placas β-amilóides associado a redução de mediadores inflamatórios (Townsend & Pratico, 2005), porém não conferiu neuroproteção em lesão traumática e o tratamento crônico conferiu perdas cognitivas em ratos com TCE (Browne et al., 2006). 1.2 Citocinas no SNC As citocinas constituem um grupo diverso de proteínas e, geralmente, são associadas à inflamação, ativação imune e morte ou diferenciação celular. Esse grupo inclui interleucinas (IL), originalmente identificadas como produtos de leucócitos (Allan & Rothwell, 2001); interferons (IFN), sendo que as isoformas alfa e beta promovem a resistência à replicação viral nas células (Akbar et al., 2000) e a isoforma gama, produzida por células do sistema imune, tem ação sobre as células tronco mesenquimais (Krampera et al., 2006); fatores de necrose tumoral (TNF); quimiocinas, caracterizadas como um pequeno grupo de mediadores inflamatórios, secretadas por células da glia e neurônios e conhecidas como proteínas que estimulam a motilidade de leucócitos (Bajetto et al., 2001) também com importância na embriogênese e na homeostase (Ziebell & Morganti-Kossmann, 2010); e, por fim, fatores de crescimento (Allan & Rothwell, 2001). Liberadas por sinalização autócrina ou parácrina, estas proteínas regulam o crescimento, a sobrevivência e a diferenciação de vários tipos celulares (Hanisch, 2002). Muitos de seus receptores têm sido descritos no tecido nervoso e entre eles estão os receptores de TNF-α, IFNγ, IL-1, -2, -3, -4, -6, -10, -12, -15 e -18 e TGFβ (Szelenyi, 2001). 4 Introdução Apesar de possuírem ações diversas, a maioria das citocinas, como outros mediadores inflamatórios, tem pouca ou nenhuma função em tecidos saudáveis, porém são induzidas rapidamente em resposta à lesão tecidual, infecção ou inflamação (Allan & Rothwell, 2001). Considerando as propriedades funcionais das citocinas, pode-se dizer que, quando derivadas de neurônios, estão predominantemente envolvidas com comunicação celular, ativando as demais células neurais, enquanto que quando derivadas da glia, fazem a mediação de crescimento, sobrevivência e reparo neuronais, mas também podem levar a alterações patológicas crônicas associadas com algumas doenças neurodegenerativas (Ziebell & Morganti-Kossmann, 2010). Por isso, este grupo de proteínas tem sido definido como mediador e modulador de diversas formas de neurodegeneração por exercer uma variedade de ações no SNC (Allan & Rothwell, 2001). Citocinas específicas e fatores de crescimento como interleucinas, TNF, NGF (do inglês nerve growth factor) e TGF foram implicados na cascata inflamatória póstraumática. Foram relatadas alterações nas concentrações sistêmicas e intratecais de IL1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF e TGF em pacientes com traumatismo grave e aumento da expressão de RNAm e das concentrações de diversas dessas citocinas foram encontradas no período agudo pós traumático em lesões experimentais em ratos (Lenzlinger et al., 2001) As citocinas geralmente são liberadas alguns minutos após a lesão, pois estão armazenadas intracelularmente como proteínas precursoras que eventualmente podem sofrer modificações e se tornarem moléculas ativas (Morganti-Kossmann et al., 2002). Ainda que de forma exemplificada, podem ser divididas e definidas como mediadores pró-inflamatórios, por exemplo, IL-1, TNF-α e IL-6, que promovem alterações nos neurônios antes que ocorra a morte celular; geralmente são as primeiras a sofrer upregulation após a lesão e induzem a síntese de citocinas antiinflamatórias, como por exemplo IL-10 e TGFβ, que mantêm a homeostase do SNC e garantem a viabilidade celular inibindo respostas inflamatórias (Szelenyi, 2001), neurotrofinas e fatores de crescimento que promovem a sobrevivência neuronal (Du & Dreyfus, 2002). Isso gera um feedback auto-regulatório, restabelecendo a resposta imunológica local (MorgantiKossmann et al., 2002). Estudos do papel das citocinas após uma lesão aguda têm gerado resultados conflitantes, havendo tanto relatos de que sua ação contribuiria para os mecanismos de reparo quanto exacerbaria a fisiopatologia do trauma. As citocinas pró-inflamatórias, assim como o óxido nítrico, os radicais livres e as proteases, todos produzidos pela microglia, possuem efeitos neurotóxicos (Raivich et al., 1999), enquanto que as citocinas 5 Introdução antiinflamatórias e os fatores neurotróficos são responsáveis pela neuroproteção (Allan & Rothwell, 2003). Porém, sobreposições significativas de funções ocorrem entre diferentes citocinas e, portanto, existem redundâncias consideráveis. Devido ao papel dúbio dessas proteínas, pode-se concluir que existem efeitos benéficos como promover diferenciação e sobrevivência neuronais e induzir fatores neurotróficos. Camundongos nocaute para citocinas vão a óbito após TCE experimental e camundongos nocaute para receptores de citocinas apresentam aumento da lesão tecidual após TCE experimental. Altos níveis de citocinas medidos após TCE foram associados com a lesão tecidual, edema, rompimento da barreira hematoencefálica, morte neuronal e déficits neurológicos (MorgantiKossmann et al., 2002). Além disso, o papel de uma citocina em particular pode mudar de acordo com o estágio da lesão, ou seja, se a expressão ocorre logo após a lesão, isto contribui com o andamento da patologia, porém, se a expressão é tardia, colabora com o reparo e recuperação do tecido (Allan & Rothwell, 2003). Por exemplo, o caso da IL-6, uma citocina pleiotrópica, envolvida em diversos processos fisiológicos e patológicos, que pode desempenhar efeito pró ou antiinflamatório, dependendo do microambiente em que se encontra (Kamimura et al., 2003). Outro aspecto interessante é a relação entre a inflamação e a morte neuronal que, apesar das melhoras neurológicas dos pacientes, é um processo progressivo que dura muito tempo após o TCE. Estudos in vitro indicam que as citocinas não causam a morte neuronal diretamente, mas aumentam a expressão de moléculas como Fas e Fas-ligante, que estão associadas a apoptose. Essas e outras moléculas pró e anti apoptóticas foram encontradas no cérebro de humanos e ratos após TCE (Lenzlinger et al., 2002). Em vista disso, pode-se dizer que a conseqüência final, em termos de viabilidade neuronal, da resposta à lesão no SNC dependerá tanto do tipo de citocina expressa como das outras moléculas secretadas pela glia em resposta a estas (Allan & Rothwell, 2003). 1.3 Células tronco mesenquimais secretam fatores ativos em reações inflamatórias Por definição, as células tronco são células indiferenciadas que, ao se dividir, geram células-filhas semelhantes a elas, processo denominado de auto-renovação ou geram células-filhas diferentes, caracterizando uma divisão assimétrica, propriedade importante das células tronco, que define sua multipotencialidade e permite que sejam originados diferentes tipos celulares especializados por divisões sucessivas (Bedada et al., 2006). A classificação das células tronco é feita com base no seu potencial de diferenciação, podendo ser totipotentes, pluripotentes, multipotentes, oligopotentes e 6 Introdução unipotentes (Wagers & Weissman, 2004). Células tronco adultas são responsáveis pela homeostase e integridade do tecido e têm sido descritas em muitos tecidos adultos, como cérebro, coração, pulmões, rins e baço, no entanto, a fonte de células tronco adultas melhor caracterizada é a medula óssea (Salem & Thiemermann, 2010). A medula óssea contém populações celulares heterogêneas, incluindo células tronco hematopoiéticas, macrófagos, eritrócitos, fibroblastos, adipócitos e células endoteliais. A outra porção celular é denominada células tronco não hematopoiéticas, as células tronco mesenquimais (CTMs), que representam 0,001 - 0,01% do total de células da medula óssea (Uccelli et al., 2006). As CTMs foram originalmente isoladas da medula óssea por Friedenstein e colaboradores cerca de 40 anos atrás (Friedenstein et al., 1968) e foram denominadas unidades formadoras de colônias de fibroblastos (CFU-F), o termo mesenquimal surgiu em meados dos anos 90 (Caplan, 1991). Estas células possuem a capacidade de autorenovação e multipotencialidade e podem diferenciar-se em células de linhagem mesodérmica como osso, cartilagem e gordura (Si et al., 2010). Porém, segundo dados da literatura, as CTMs também são capazes de se diferenciar em células musculares (Kurpinski et al., 2010), nervosas (Wislet-Gendebien et al., 2005), hepáticas (Tao et al., 2009), renais (Singaravelu & Padanilam, 2009), pulmonares, do trato gastrointestinal, pele (Krause et al., 2001) e miocárdio (Jackson et al., 2001). Assim como as células tronco hematopoiéticas, a diferenciação das CTMs envolve vários estágios controlados por fatores bioativos encontrados no microambiente local ou fornecidos por cultura de células ex vivo.(Caplan & Dennis, 2006). Não há um marcador específico para CTMs, os critérios utilizados pela International Society for Cellular Therapy (ISCT) são: aderência ao plástico; expressão de CD73, CD90 e CD105; ausência de CD14, CD19, CD31, CD34, CD45 e HLA-DR; capacidade de diferenciação em osteoblastos, condrócitos e adipócitos; e funções imunomodulatórias (Horwitz et al., 2005). Fora a medula óssea, as CTMs são encontradas em quase todos os tecidos e órgãos como o tecido adiposo, periósteo, membrana sinovial, fluido sinovial, músculo, derme, dente de leite, cartilagem articular, sangue de cordão umbilical e tecido perivascular (pericitos) (Bianco et al., 2008; Feng et al., 2010; Phinney & Prockop, 2007). Quando comparadas com outras linhagens de células tronco, como as embrionárias, hematopoiéticas e neurais, as mesenquimais de medula óssea possuem vantagens, como fácil acesso para o isolamento, grande potencial de expansão em cultura, o que permite a manutenção do seu estado indiferenciado por longo período (Meirelles Lda & Nardi, 2009), plasticidade, que permite que respondam a diversos estímulos intra e extracelulares (Bedada et al., 2006), propriedades imunossupressoras e inexistência de 7 Introdução problemas éticos na sua utilização em terapia celular, tornando-as as mais utilizadas entre as células tronco adultas e reforçando sua utilização como uma terapia biológica com várias aplicações clínicas (Salem & Thiemermann, 2010). Muitas evidências indicam que as CTMs possuem potencial imunomodulatório, propriedades antiinflamatórias e efeitos tróficos (Nauta & Fibbe, 2007). Estas características fazem das CTMs boas candidatas para engenharia tecidual, medicina regenerativa e tratamento de doenças autoimune. Estudos têm demonstrado que os efeitos terapêuticos desempenhados pela CTMs são devido ao seu potencial de modular o microambiente local, ativar progenitores endógenos e secretar vários fatores e não devido a sua capacidade de diferenciar em outros tipos celulares (Zhang et al., 2007). Atualmente, os efeitos tróficos das CTMs têm sido reportados em vários modelos de doenças, como queimaduras, infarto do miocárdio, mal de Parkinson, entre outras (Si et al., 2010). Os efeitos desses fatores secretados pelas CTMs podem ser diretos, indiretos ou ambos. Os sinais diretos são desencadeados via sinalização intracelular, enquanto que os indiretos, também denominados tróficos, fazem com que outras células na redondeza também secretem fatores biologicamente ativos (Caplan & Dennis, 2006). Portanto, estas células indiferenciadas podem ter funções distintas, como a transdiferenciação, ou seja, a substituição de células danificadas ou mortas no tecido ou ter efeito parácrino nas células da vizinhança, sem gerar novos fenótipos mesenquimais diferenciados, auxiliando a célula que está em processo de morte e estimulando as células endógenas (Caplan, 2007), sendo esta última a hipótese mais aceita atualmente, ou seja, as CTMs influenciam a regeneração de células ou tecidos pelo efeito dos fatores bioativos por elas secretados (Caplan & Dennis, 2006; McFarlin et al., 2006). O mecanismo de secreção parácrino das CTMs caracteriza seu poder imunomodulatório via supressão da resposta imune, pela inibição da proliferação de células T, B, células natural killer (NK) e células apresentadoras de antígenos. Alguns dos fatores secretados pelas CTMs com propriedades imunomodulatórias são TGF–β, IDO 2, 3 (indolamina 2, 3 deoxigenase), HGF (hepatocyte growth factor), prostaglandina E2, heme-oxigenase e óxido nítrico (NO) (Salem & Thiemermann, 2010). McFarlin e colaboradores (2006) relataram essas funções distintas das CTMs derivadas de medula óssea em feridas realizadas na pele de ratos. Primeiro, esses autores evidenciaram que as CTMs teriam a capacidade de secretar uma variedade de fatores de crescimento e citocinas, constitutivamente ou sob estimulação, que seriam relevantes para o reparo do tecido e regeneração. A produção desses mediadores solúveis seria importante para complementar os fatores de crescimento e citocinas produzidos endogenamente e que regulam processos celulares como quimiotaxia, 8 Introdução proliferação celular, sinalização celular, formação de matriz extracelular e angiogênese. A segunda possibilidade está relacionada com a grande plasticidade e habilidade das CTMs diferenciarem-se em uma variedade de tipos celulares e se integrar ao tecido. As CTMs produzem citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento, como IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, LIF (leukemia inhibitory factor), G-CSF (granulocyte colony stimulating factor), GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor), SCF (stem cell factor), M-CSF (macrophage colony-stimulating factor) e flk-3L (fms like tyrosine kinase-3 ligand). Também expressam receptores de citocinas como IL-1R, IL-3R, IL-4R, IL-6R e IL-7R. Quando induzidas, também expressam altos níveis de quimiocinas leucocitárias, como CXCL9, CXCL10 e CXCL11 (Kode et al., 2009). Majumdar e colaboradores (2000) demonstraram a expressão de genes de citocinas e de fatores de crescimento por CTMs derivadas de medula óssea e investigaram a modulação da expressão de citocinas que ocorre durante a diferenciação osteogênica e de estroma. Estas células expressaram constitutivamente RNAm para IL-6, IL-11, LIF, M-CSF e SCF. Quando estimuladas com IL-1α, as CTMs apresentaram aumento na expressão de IL-6, IL-11 e LIF, e passaram a expressar níveis detectáveis de G-CSF e GM-CSF. Quando cultivadas em meio osteogênico, as células diferenciaram-se em células da linhagem osteogênica e houve diminuição nos níveis de IL-6, IL-11 e LIF, porém a expressão de MCSF e SCF não sofreu alteração e a de G-CSF e GM-CSF permaneceu indetectável. Outros estudos utilizaram CTMs humanas ou de animais em modelos animais para tratar infarto cardíaco (Shake et al., 2002), derrame (Li et al., 2005), regeneração de menisco (Murphy et al., 2003) e secção da medula espinal (Keilhoff et al., 2006). O mecanismo envolvido em todos esses casos parece ser sempre o mesmo: as células tronco secretam fatores bioativos que inibem a cicatrização, inibem a apoptose, estimulam a angiogênese e estimulam a proliferação de células progenitoras intrínsecas do tecido (Caplan, 2007; Caplan & Dennis, 2006). As CTMs também podem migrar para o tecido lesado ou inflamado e lá exercer seu efeito terapêutico. O aumento da concentração de quimiocinas inflamatórias na região lesada é o principal mediador do tráfego de CTMs para a lesão, uma vez que essas células expressam muitos receptores para quimiocinas em sua superfície. A quimiocina CXCL12 e seu receptor CXCR4 é a mais estudada nesse processo (Bhakta et al., 2006). A administração sistêmica de CTMs humanas foi bem sucedida em várias doenças como diabetes (Lee et al., 2006), lesões renais e cerebrais(Chamberlain et al., 2007; Joyce et al., 2010; McTaggart & Atkinson, 2007); osteogenesis imperfecta (Horwitz et al., 2001) e infarto do miocárdio (Brooke et al., 2007). Apesar do sucesso da aplicação das células sistemicamente, poucas células atingem o local lesado (Marino et al., 2008) 9 Introdução sendo que a hipótese mais aceita é que as células fiquem aprisionadas no pulmão (Abdallah & Kassem, 2008). Porém o fato de que poucas células permanecem no local lesado condiz com a hipótese de que não ocorre transdiferenciação e sim, que a atividade trófica exercida por essas células altera o microambiente tecidual, levando à regeneração local (Ohishi & Schipani, 2010). Embora vários estudos mostrem o efeito de citocinas na estimulação de células tronco endógenas derivadas de diversos tecidos, tanto in vitro quanto in vivo (Majumdar et al., 2000; McFarlin et al., 2006; Zhang et al., 2010), pouco se sabe a respeito da expressão e atuação de citocinas expressas por células tronco transplantadas em lesões do SNC. Resultados da literatura mostram que, in vitro, TNF-α induz a proliferação de células tronco neurais via sinalização por NF-κB (Widera et al., 2006). Além de estimular a proliferação, TNF-α aumenta a gliogênese, enquanto IL-6 estimula a neurogênese a partir de CTNs em cultura (Johansson et al., 2008). Outra citocina, IFNγ aumenta, in vitro, a quantidade de neurônios gerados a partir de células tronco neurais derivadas do estriado quando comparado com culturas não tratadas com a citocina (Johansson et al., 2008). 1.4 Neurogênese e células tronco neurais endógenas Em 1913, Santiago Ramon y Cajal concluiu que no SNC adulto, as vias neuronais eram fixas e imutáveis. Desde então, a incapacidade do cérebro adulto gerar novos neurônios após o nascimento tornou-se um dogma na neurociência por quase um século. Já nas décadas de 70 e 80, com o surgimento da microscopia eletrônica, estudos demonstraram que a neurogênese ocorre em discretas áreas do cérebro de ratos adultos (Barber, 1982; Kaplan & Hinds, 1977). Finalmente, nos anos 90, a introdução do uso da bromodeoxiuridina (BrdU) para análises de proliferação celular revolucionou as pesquisas sobre a neurogênese no adulto, possibilitando a identificação de regiões proliferativas, inclusive em primatas humanos e não humanos (del Rio & Soriano, 1989). A confirmação de que a neurogênese ocorre no cérebro adulto resultou em importantes implicações para a compreensão do desenvolvimento encefálico e o seu funcionamento, bem como, para o uso de terapias em doenças neurológicas (Vandenbosch et al., 2009). Ficou demonstrado que, assim como na fase embrionária, na fase adulta o cérebro também apresenta células tronco neurais e neuroprogenitores (Basak & Taylor, 2009). A neurogênese no adulto é evolucionariamente conservada em vertebrados, (Kaneko & Sawamoto, 2009) e é caracterizada por gerar novos neurônios a partir de células tronco neurais localizadas em regiões restritas, que migram para seu destino final, 10 Introdução onde exercem sua função (Kojima et al., 2010). No cérebro do roedor adulto, células tronco neurais (CTNs) estão concentradas na zona subventricular (subventricular zone, SVZ) da parede do ventrículo lateral e na zona subgranular (subgranular zone, SGZ) no giro denteado do hipocampo (Alvarez-Buylla & Lim, 2004). Há quatro tipos celulares na SVZ: as células ependimais (1), que contornam a superfície do ventrículo lateral, são ciliadas e expressam vários fatores que sustentam a proliferação e diferenciação das CTNs; as células astrócitos-like (2), verdadeiras células tronco neurais, GFAP (glial fibrilary acidic protein) positivas, que tem potencial de auto-renovação, apresentam taxa de proliferação lenta e dão origem às células amplificadoras transitórias (3), que proliferam rapidamente, são GFAP negativas e originam neurônios imaturos, os neuroblastos (4), células migratórias, Dcx (doublecortin) positivas, que migram para seu lugar definitivo no SNC (Kaneko & Sawamoto, 2009; Nam et al., 2007) (figura 1a e b). A vasculatura também é muito importante no nicho neurogênico por levar hormônios e fatores de crescimento que modulam a neurogênese (Shen et al., 2008). Os processos biológicos que compõem a neurogênese podem ser divididos em três: proliferação, migração e diferenciação, sendo que cada processo ocorre em um local determinado que possui um conjunto próprio de relações celulares e interações moleculares. A proliferação ocorre ao longo das paredes laterais dos ventrículos laterais (Alvarez-Buylla & Lim, 2004). A migração, ou seja, a decisão do destino das CTNs da SVZ é determinada por interações moleculares de células progenitoras neurais vizinhas, os astrócitos e, provavelmente, também por células endoteliais e é sinalizada via epinefrina, notch, Wnt, Sonic hedgehog (Shh) entre outros (Conover et al., 2000; Riquelme et al., 2008). A migração é um passo essencial na neurogênese do cérebro adulto (Okano & Sawamoto, 2008). Por toda a vida adulta, células geradas na SVZ atravessam uma longa distância tangencialmente, em corrente, pela corrente migratória rostral (RMS, rostral migratory stream) para o bulbo olfatório, onde as células se diferenciam em interneurônios e se integram à circuitaria neuronal olfatória (Alvarez-Buylla & Lim, 2004) (figura 1c). Células no giro denteado nascem localmente na base da SGZ e migram uma curta distância para integrar o giro denteado nas funções de aprendizagem e memória (Kaneko & Sawamoto, 2009). 11 Introdução Figura 1: Neurogênese na zona subventricular. (A) representação de secção coronal do encéfalo adulto, localização e estrutura da SVZ. A SVZ está localizada na parede do ventrículo lateral e é constituída de quatro tipos celulares: células ependimais (roxo), astrócitos-like (azul), células amplificadoras transitórias (verde), neuroblastos (vermelho). Vaso sangüíneo (rosa). (B) produção de neurônios na SVZ: astrócitos-like, células tronco neurais, com potencial de autorenovação (azul) dão origem às células amplificadoras transitórias (verde) que por sua vez originam os neuroblastos (vermelho). (C) migração de neuroblastos pela corrente migratória rostral (RMS, rostral migratory stream) para o bulbo olfatório. OB (bulbo olfatório). Figura modificada de Kaneko et al., 2009 A migração dos neuroblastos durante o período de desenvolvimento do SNC é caracterizada como migração gliofílica (Lois et al., 1996; Wichterle et al., 1997), ou seja, os neurobastos utilizam a glia radial como suporte para a migração. Vários fatores realizam a mediação desse processo no córtex cerebral, como Rho GTPases, semaforinas-neuropilinas, neuregulinas, PSA-NCAM (Polysialic acid-neural cell adhesion molecule) e proteoglicanos de condroitim sulfato (Gerhardt et al., 2004; Gu et al., 2009; Kriegstein & Noctor, 2004). Na corrente migratória rostral, os neuroblastos sofrem modificações no citoesqueleto, mediadas por Cdk5 (ciclina dependente de kinase 5) (Hirota et al., 2007), possuem um processo anterior e um posterior, formam agregados de células alongadas, classificadas como “corrente” e, dessa forma, deslizam uns sobre os outros, o que caracteriza uma migração homofílica, além disso, são envoltos por astrócitos, havendo a formação de um tubo glial em direção ao bulbo olfatório (figura 1c). A molécula de adesão PSA-NCAM e β1-integrina expressas na superfície dos neuroblastos (Murase & Horwitz, 2002), metaloproteinases de matriz produzidas pelos neuroblastos e moléculas de matriz extracelular incluindo tenascina-C, proteoglicanos e 12 Introdução lamininas estão envolvidas na migração de neuroblastos pela corrente migratória rostral. Estas células também são guiadas por outras moléculas, como netrina1 (Murase & Horwitz, 2002), prokineticina 2 (Ng et al., 2005), GDNF (glial cell-line derived neurotrophic factor) e BDNF (brain-derived neurotrophic factor), que atraem as células para o bulbo olfatório. Lesões alteram a fisiologia cerebral causando alterações inclusive no padrão normal da neurogênese no cérebro adulto. Após uma lesão no SNC, ocorre estimulação da proliferação celular na SVZ, migração em corrente dos progenitores neuronais para a área lesada e redução da migração das células da SVZ para o bulbo olfatório (Ohab & Carmichael, 2008). O reconhecimento de sinais atrativos provenientes da lesão pelas CTNs e a migração dessas células para o local lesado devem contribuir para o processo de regeneração neuronal do SNC (Armstrong & Barker, 2001). Basicamente, o processo inflamatório age na área neurogênica do cérebro, altera o microambiente das CTNs e influencia em seu destino. Os processos envolvidos na neurogênese no adulto, ou seja, proliferação, migração e diferenciação são alteradas pelos mediadores inflamatórios. Uma resposta imune descontrolada prejudica a sobrevivência e proliferação dos progenitores neurais e bloqueia o processo de reparo. Contudo, a ativação controlada da microglia e de algumas moléculas inflamatórias são pró-neurogênicas e com isso, ajudam a promover a recuperação (Das & Basu, 2008). Sabe-se que durante a formação da corrente de migração, as células mudam ativamente suas direções de movimento estendendo e retraindo seu processo anterior, o que sugere que os neuroblastos interagem ativamente com o microambiente para alcançar a área lesada por múltiplas rotas migratórias (Zhang et al., 2009). No entanto, muitos mecanismos ainda são desconhecidos. Da mesma forma que nem todos os fatores que atraem as células da SVZ para a região de lesão são conhecidos (Zhang et al., 2004), os mecanismos pelos quais a lesão recruta essas células e os sinais que estimulam a proliferação e a diferenciação das células precursoras neurais na SVZ após uma lesão também permanecem desconhecidos (Ohab & Carmichael, 2008). O que se sabe, é que a lesão aumenta a expressão, na SVZ, de genes que fazem parte de funções comuns na sinalização e regulação da transcrição da angiogênese e neurogênese, como por exemplo, NCAM, tenascina, FGF, EGF, vimentina, Notch, Olig1, Sox3 (Liu et al., 2007). Um fator que limita o processo neurogênico após um processo lesivo no cérebro é a baixa taxa de sobrevivência dos progenitores neurais que chegam à lesão devido ao ambiente hostil que encontram, ambiente gerado pelos mediadores inflamatórios secretados pelas células do sistema imune que infiltram no cérebro e pelos elementos 13 Introdução secretados pelas células da glia. Alguns estudos evidenciam que a ativação aguda das cascatas pró-inflamatórias locais ou sistêmicas tem efeito negativo na neurogênese no adulto (Molina-Holgado & Molina-Holgado, 2010). Dados indicam que a proliferação de CTNs foi significativamente reduzida quando essas células foram cultivadas com meio condicionado por microglia ativada e isso não aconteceu quando o meio foi condicionado por microglia não ativada (Rock et al., 2004). Acredita-se que este efeito pode ter sido mediado por citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias como IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-18, MCP-1 e espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Porém outros estudos sugerem que a microglia ativada nem sempre é prejudicial para a neurogênese, na verdade, sob certas condições elas podem ser benéficas (Ekdahl et al., 2009). Citocinas antiinflamatórias como IL-4, IFN-γ, TGF-β1 e a pró-inflamatória TNF-α, quando agindo em seu receptor TNFR2, podem promover diferenciação neuronal, e pró-inflamatórias como IL-1, IL-6, e TNF-α agindo no receptor TNFR1, tendem a diminuir esse processo (Mathieu et al., 2010; Widera et al., 2006). Com base nessas informações, nossa hipótese é que, além dos efeitos anti e próinflamatórios desencadeados pela secreção de citocinas pelas CTMs, essas citocinas poderiam proporcionar um ambiente favorável à sobrevivência, proliferação e diferenciação desses progenitores no local lesado. 14 Objetivos Objetivos 2 2.1 OBJETIVOS Geral Estudar a ação parácrina de citocinas secretadas por CTMs derivadas de medula óssea de camundongos adultos sobre a proliferação, sobrevivência e diferenciação de CTNs e a imunomodulação por CTMs. 2.2 Objetivos específicos 1. Análise in vitro da expressão de citocinas por CTMs, não diferenciadas, derivadas de medula óssea de camundongos adultos. 2. Estudo dos efeitos das citocinas secretadas por CTMs sobre a proliferação, sobrevivência e diferenciação de CTNs in vitro. 3. Análise da imunomodulação por CTMs adultas in vivo, transplantadas em modelo de lesão traumática no SNC de camundongo adulto. 16 Material e Métodos Material e Métodos 3 3.1 MATERIAL E MÉTODOS Animais Neste estudo, foram utilizados camundongos C57BL/6 machos provenientes do Laboratório de Experimentação Animal do INFAR (Instituto Nacional de Farmacologia) e do CEDEME (Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais para Medicina e Biologia), ambos da Universidade Federal de São Paulo. Os animais foram mantidos no biotério do INFAR, sob regime de claro/escuro de 12h/12h (claro: 7h00 – 19h00), sendo a temperatura ambiente mantida constante entre 22 ± 2 ºC, ração e água ad libidum. Todos os experimentos com os animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (número de protocolo CEP 1367/08). 3.2 Obtenção e cultivo das CTMs As CTMs foram obtidas da medula óssea de camundongos C57BL/6 machos jovens (6 semanas de idade). Os animais foram eutanasiados em câmara de CO2. Os fêmures foram extraídos e limpos cuidadosamente com um bisturi estéril para a retirada de cartilagem e músculos e colocados em placa de Petri com DMEM baixa glicose (1 g/l) (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, GibcoBRL, San Francisco, CA, EUA). Dentro do fluxo laminar vertical, com o auxílio de uma tesoura, as epífises foram cortadas e desprezadas. Uma seringa contendo DMEM baixa glicose [ bicarbonato de sódio 3,7 g/l e HEPES 3,7 g/l (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, EUA), NaCl 4,7 mg, pH 7,5], foi inserida em uma das extremidades do osso e pressionada, recolhendo o líquido contendo a medula em uma placa de Petri. A medula óssea foi desagregada com a seringa (aspirações e despejos sucessivos), sendo que os volumes dos fêmures de cada animal não foram misturados. O material de cada medula óssea foi transferido para um tubo Falcon de 15 ml e a solução centrifugada por 5 minutos a 400 xg à temperatura ambiente. O sobrenadante foi desprezado, as células foram ressuspendidas em 3,5 ml de meio de cultura completo, contendo DMEM baixa glicose suplementado com Soro Fetal Bovino (SFB) 10 % (Cultilab, Campinas, SP, Brasil), glutamina 1 % (Sigma) e penicilina/estreptomicina 1 % (GibcoBRL) e plaqueadas em placa de cultura de 6 poços (Corning Incorporated, New York, NY, EUA), sendo que o volume total de células da medula óssea extraída de cada fêmur foi colocada em um poço. As células foram mantidas em estufa a 37 ºC, com controle de umidade (maior que 95 %) e 5 % de CO2. 18 Material e Métodos Após 72 horas do plaqueamento, o meio de cultura foi aspirado juntamente com as células não aderentes e trocado por meio fresco. As CTMs permanecem aderidas ao plástico. O meio de cultura foi então trocado todos os dias e, atingindo aproximadamente 80 % de confluência, as células foram subcultivadas na proporção 1:2. Após o subcultivo, a cada 3 ou 4 dias o meio foi trocado. Para o subcultivo, o meio foi aspirado, as células lavadas com PBS-EDTA 0,03 % pH 7,4 1 X e acrescentado tripsina 0,1 % (Cultilab). As células foram incubadas a 37 ºC por 10 minutos e, em seguida, a tripsina foi inativada pela adição de DMEM baixa glicose suplementado com SFB 10 %. O material foi transferido para um tubo Falcon de 15 ml e centrifugado a 400 xg por 5 minutos. Após a centrifugação, o sobrenadante foi aspirado e as células ressuspendidas em meio completo e plaqueadas. O congelamento das CTMs foi feito com solução de congelamento consistindo de SFB 90 % e DMSO 10 % (dimetilsulfóxido, MP Biomedicals, São Paulo, SP, Brasil). As células foram incubadas com tripsina, centrifugadas a 400 xg por 5 minutos e congeladas em proporção de 1:1 de solução de congelamento e meio de cultura. Foi feito um congelamento gradual das células, primeiramente colocadas a -20 ºC, em seguida a 80 ºC e por fim, em nitrogênio líquido. Para a obtenção do meio de cultura condicionado pelas CTMs, culturas de células confluentes (subcultivo 5º-10º) foram cultivadas em DMEM baixa glicose, suplementado com SFB 0,5 %, por 96 horas. Após esse tempo, o meio de cultura foi centrifugado a 400 xg por 5 minutos, o sobrenadante coletado e congelado imediatamente, sendo mantido a -80 ºC até o uso. 3.3 Diferenciação das CTMs de camundongos Com relação aos ensaios de diferenciação para a caracterização das CTMs, foi empregado o teste de plasticidade para diferenciação adipogênica e osteogênica. 3.3.1 Diferenciação adipogênica A diferenciação adipogênica foi induzida na 6ª passagem. As CTMs foram cultivadas em uma densidade de 6x10 4 células/poço em placa de 24 poços (Corning) com meio de cultura completo até atingirem a confluência. Nesse ponto, o meio de cultura foi trocado por meio de cultura de indução de adipogênese que consiste em DMEM baixa glicose suplementado com 1 μM de dexametasona (Sigma) em etanol, 100 μM de indometacina (Sigma) em etanol, 10 μg/ml de insulina, 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina 19 Material e Métodos (IBMX, Sigma) em DMSO e SFB 5 %, por três dias. Em seguida, o meio de indução de adipogênese foi trocado por meio de manutenção, constituído de DMEM baixa glicose suplementado com insulina 10 μg/ml e SFB 5 %. Essa estimulação foi repetida duas vezes, num total de 18 dias de tratamento. As células controle foram cultivadas em DMEM baixa glicose suplementado com SFB 5 %. Coloração: A diferenciação adipogênica foi observada por microscopia após coloração por Oil Red O e hematoxilina de Harris. Para a coloração, o meio de cultura foi aspirado e as células foram lavadas 2 vezes com PBS 1X. Em seguida, as células foram fixadas com paraformaldeído (PFA) (Synth, São Paulo, Brasil) 4 % por 1 hora a temperatura ambiente. Após a fixação, as células foram lavadas 3 vezes com PBS 1X, 5 minutos cada e 1 vez com isopropanol (Merck, Darmstadt, Alemanha) 60 %. Em seguida, as células foram incubadas com solução Oil Red O 3 mg/ml por 1 hora a temperatura ambiente. Após esse período as células foram lavadas novamente com PBS 1X e coradas com hematoxilina de Harris por 5 minutos. As células foram mantidas em água para não secarem até as fotos serem feitas. 3.3.2 Diferenciação osteogênica A diferenciação osteogênica foi induzida na 6ª passagem das células. As CTMs foram cultivadas em uma densidade de 6x10 4 células/poço em placa de 24 poços (Corning) com meio de cultura completo até atingirem a confluência. A partir daí as CTMs foram incubadas com meio de cultura contendo dexametasona 0,1 μM, sódio βglicerofosfato 10 mM e acido ascórbico 0,2 mM (Sigma). O meio foi trocado a cada três dias e as células mantidas em cultura por 24 dias. O nível da diferenciação osteogênica foi analisado por microscopia pela coloração Alizarin Red (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e hematoxilina de Harris. Coloração: Para a coloração, o meio de diferenciação foi aspirado cuidadosamente e as células foram fixadas com etanol 70 % gelado por 1 hora a temperatura ambiente. Após fixadas, as células foram lavadas 2 vezes, 5-10 minutos cada, com água destilada e em seguida incubadas com solução de Alizarin Red a temperatura ambiente por 30 minutos. Após esse período a solução foi removida e as células lavadas 4 vezes com água destilada. Ao final da última lavagem a água foi mantida para as células não secarem. 20 Material e Métodos 3.4 Obtenção e cultivo das CTNs As CTNs foram obtidas da SVZ de camundongos C57BL/6 machos jovens (6 semanas de idade). Os animais utilizados foram eutanasiados por deslocamento cervical. Os encéfalos dos camundongos foram depositados em uma placa de Petri contendo DMEM alta glicose (4,5 g/l) (GibcoBRL). A dissecção foi feita sob uma lupa e o material obtido foi transferido para um tubo de centrifugação contendo 1 ml de DMEM alta glicose. Após a sedimentação o excesso de meio foi removido e as células incubadas com 1 ml de tripsina 0,1 %, EDTA 10 mM, pH 6.3 por 3 minutos a 37 °C para a obtenção de células isoladas. A seguir a tripsina foi inativada pela adição de meio de cultura contendo SFB 10%, o material foi homogeneizado e centrifugado a 400 xg por 5 minutos. O sobrenadante foi removido e foi adicionado meio de cultura suplementado, cuja composição está descrita a seguir. O tecido foi dissociado pela passagem dos fragmentos por uma ponteira de 1.000 µl seguida pela passagem por ponteira de 200 µl, até obter-se uma suspensão de células isoladas. A suspensão obtida foi filtrada em filtro de 40 µm (BD, San Jose, CA, EUA), quantificadas e a viabilidade avaliada por coloração com Trypan Blue (GibcoBRL). As células foram plaqueadas na densidade de 2,4x107 células/garrafa de cultura de 75 cm2 previamente tratada com Poly-Hema (Poli [2hidroxietil metacrilato], Sigma) para evitar a adesão das células à placa e promover a formação das neuroesferas. A composição do meio de cultura para as células tronco neurais é DMEM alta glicose 70 %, F12 30 % (GibcoBRL), penicilina/estreptomicina 1 % (GibcoBRL), suplemento B27 2 % (GibcoBRL), EGF 20 ng/ml (Sigma), FGF-2 20 ng/ml (R&D, Minneapolis, MN, EUA) e heparina 5 µg/ml (Sigma). A formação das neuroesferas leva, em geral, de 14 a 21 dias para ocorrer e, durante esse período, o meio de cultura foi trocado a cada 4 ou 5 dias. Para isso, as células foram centrifugadas a 400 xg por 5 minutos e metade do meio de cultura de cada placa foi trocado, sendo substituído por meio de cultura fresco. As neuroesferas formadas foram mantidas em estufa a 37 ºC, com controle de umidade (maior que 95 %) e 5 % de CO2. Depois de formadas, as neuroesferas foram cultivadas nas condições listadas a seguir por 2 dias para verificar a viabilidade celular e 4 dias para verificar a sobrevivência e diferenciação. a.) Meio de cultivo completo com os fatores de crescimento (EGF e FGF2) e suplemento B27 (controle); b.) Meio condicionado por CTMs; 21 Material e Métodos O suplemento B27 é utilizado no cultivo de células tronco neurais por conter fator de sobrevivência. Na condição de cultivo de neurosferas em meio condicionado por CTMs a quantidade de glicose foi ajustada, uma vez que as CTMs são cultivadas em DMEM baixa glicose. 3.5 Medida da viabilidade celular pela dosagem da atividade de desidrogenase mitocondrial (método do MTT) As neuroesferas cultivadas por 48 horas nas condições descritas no item 3.4 foram mantidas em estufa a 37 °C, 5 % CO2 e umidade maior que 95 %. Ao término deste período, as células foram centrifugadas a 400 xg por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e foram adicionados 270 μl de meio de cultura e 30 μl de solução aquosa de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólio) (Sigma) (5 mg/l) por poço deixando-se incubar durante 3 horas a 37 °C. Após esse período a solução de MTT foi retirada e então foram adicionados 180 μl de DMSO (MP Biomedicals) em cada poço. A placa foi agitada por 15 minutos e o conteúdo foi transferido para uma placa de 96 poços, seguindo-se a leitura da absorbância a 540 nm em leitor ELISA (Labsystems Multiskan MS, Helsinki, Finlândia). 3.6 Ensaio de apoptose (TUNEL) A reação de TUNEL (Terminal deoxynucloetidiltranferase (TdT)–mediated dUTP nick and labeling) para detecção de células apoptóticas foi realizada de acordo com as instruções no fabricante do ApopTag in situ Apoptosis Kit Detection (CHEMICOM, Temecula, CA, EUA). Resumidamente, as neurosferas cultivadas nas condições descritas no item 3.4 foram plaqueadas em lamínulas de vidro revestidas com poli-L-lisina e laminina e mantidas em estufa a 37 ºC, 5 % CO2, umidade maior que 95 %, por 4 dias. Após esse período, as neuroesferas foram fixadas com uma solução de etanol e ácido acético (2:1), gelada, por 5 minutos à -20 °C, seguido de 2 lavagens, 5 minutos cada, com PBS 0,1 M, pH 7. A seguir, foi colocado o tampão de equilíbrio diretamente nas neuroesferas, durante 20 segundos, a temperatura ambiente e a solução da enzima TdT foi aplicada. As neuroesferas foram incubadas em câmara úmida a 37 °C por 1 hora. Em seguida, foi utilizado o tampão para parada da reação e lavagem, por 10 minutos, a temperatura ambiente. Depois de lavadas 3 vezes com PBS, as neuroesferas foram incubadas com anti-digoxigenina por 30 minutos em câmara escura a temperatura ambiente. Finalmente, as neuroesferas foram lavadas com PBS (4 vezes, 2 minutos 22 Material e Métodos cada) e incubadas com DAPI (Molecular Probes, Carlsbad, CA, EUA) 100 ng/ml em PBS por 1 hora a temperatura ambiente, no escuro e lavadas novamente 3 vezes com PBS. As lâminas foram montadas com Fluormont G (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, Hertfordshire, Inglaterra). As células foram fotografadas em microscópio confocal Zeiss LSM510 (Zeiss, Oberkochen, Baden-Wurttemberg, Alemanha). 3.7 Imunofluorescência As neurosferas cultivadas nas diferentes condições descritas no item 3.4, foram centrifugadas 400 xg por 5 minutos e o sobrenadante descartado. A seguir, as células foram fixadas em PFA 4 % por 40 minutos no gelo e imersas em solução de sacarose 10 % em PBS por 2h a 4 °C, solução de sacarose 20 % em PBS por 2h a 4 °C e, finalmente solução de sacarose 30 % em PBS por 16h-18h, a 4 ºC. As neuroesferas foram congeladas em isopentano (Sigma) usando gelo seco e embebidas em Tissue Tek (Electron Microscopy Sciences). As neuroesferas foram seccionadas no criostato em cortes de 12 μm de espessura e montadas em lâminas silanizadas (Superfrost, Fisher Scientific, Philadelphia, PA, EUA) para realização de imunofluorescência. As lâminas com os cortes foram mantidas a -20 °C até a realização das reações de imunofluorescência. Para a imunofluorescência, as lâminas com os cortes de neuroesferas foram lavadas 3 vezes, 5 minutos cada, com PBS 0,1 M pH 7,4 e incubadas com Triton X100 0,1 % em PBS à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, as neuroesferas foram incubadas com HCl 2 M em PBS durante 1 hora a 37 °C.Ao término desta última incubação, as neuroesferas foram lavadas novamente 2 vezes com PBS 0,1 M pH 7,4 e bloqueadas com SFB 10 % e Triton X-100 0,1 % por 1 hora também a temperatura ambiente. Foi adicionado o anticorpos primários (anti-GFAP de camundongo, produzido em galinha, Millipore, Tremecula, EUA) diluído 1:300 em uma solução de bloqueio (SFB 10 %, Triton X-100 0,1 % em PBS 1X) e o anticorpo primário anti-BrdU conjugado com Alexa594(Invitrogen) diluído 1:100 (em SFB 10 %, Triton X-100 0,1 % em PBS 1X)por 16h18h horas a 4 ºC. Após esse período, as neuroesferas foram lavadas 2 vezes, 5 minutos cada, com PBS e, em seguida, incubadas com anticorpos secundários (anti-IgG de galinha conjugado com Alexa488 ou anti-IgG de camundongo conjugado com Alexa 546, Invitrogen) diluídos 1:300 na solução de bloqueio. Os núcleos foram corados com DAPI (Molecular Probes) 100 ng/ml em PBS 0,1 M pH 7,4 por 1 hora à temperatura ambiente. Novamente as neuroesferas foram lavadas 3 vezes, 5 minutos cada, com PBS e as lâminas foram montadas com Fluormont G (Electron Microscopy Sciences). As lâminas foram 23 Material e Métodos analisadas por microscopia de fluorescência utilizando o microscópio Eclipse E600 (Nikon, Melville, NY, EUA). As imagens foram capturadas pela câmera digital Evolution MP Color (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, EUA) utilizando-se o programa QcapturePro (QImaging, Surrey, BC, Canada). 3.8 Citometria de Fluxo CTNs obtidas de camundongos C57BL/6 e mantidas como neuroesferas como descrito no item 3.4, foram mantidas em DMEM 70 %, F12 30 %, penicilina/estreptomicina 1 %, suplemento B27 2 %, EGF 20 ng/ml, FGF-2 20 ng/ml e heparina 5 µg/ml (meio controle) e em meio condicionado por CTMs por 4 dias. Vinte e quatro horas antes do início das análises, as neuroesferas foram incubadas com BrdU (Accurate Chemical & Scientific Corporation) 0,2 μM. As neurosferas foram centrifugadas a 400 xg por 5 minutos e dissociadas utilizando tripsina 0,1 % a 37 °C por 5 minutos. As células dissociadas foram centrifugadas a 400 xg por 5 minutos e fixadas em 0,5 ml de solução de PFA 1 % em PBS 0,1 M pH 7,4 por 20 minutos no gelo. Em seguida, as células foram centrifugadas a 400 xg por 5 minutos. O pellet celular foi lavado com 0,5 ml de PBS e centrifugado novamente a 400 xg por 5 minutos e o sobrenadante descartado. Após isso, as células foram incubadas com HCl 2 M em PBS durante 1 hora a 37 °C e centrifugadas a 400 xg por 5 minutos, lavadas com 0,5 ml de PBS e centrifugadas novamente a 400 xg por 5 minutos. As células foram incubadas a temperatura ambiente, com anticorpo primário específico para marcador de proliferação celular: anti-BrdU (Accurate Chemical & Scientific Corporation) diluído 1:300 em solução de bloqueio (SFB 10% em PBS). Após 1h as células foram lavadas com PBS e incubadas com o anticorpo secundário anti-IgG de rato conjugado com Alexa488 diluído 1:300 em SFB 10 % em PBS. Após 40 minutos as células foram novamente lavadas e ressuspendidas em 500 μl PBS 0,1 M pH 7,4. A leitura e as análises foram realizadas em citômetro de fluxo (BD FACSCaliburTM System, BD Biosciences) empregando o aplicativo Windows Multiple Document Interface Flow Cytometry Aplication (WinMDI Version 2.9, The Scripps Research Institute, San Diego, CA, EUA), com aquisição de 10.000 eventos tendo como parâmetro FL2 em escala logarítmica que detecta a fluorescência verde. Os controles negativos foram realizados na ausência de anticorpos primários. 24 Material e Métodos 3.9 Produção de lesão no SNC nos animais de experimentação e injeção de CTMs As lesões foram produzidas no córtex motor primário do hemisfério esquerdo do SNC de camundongos C57BL/6 machos adultos (3 meses de idade). Para a realização da lesão criogênica, os camundongos foram anestesiados com xilasina (32,8 mg/kg)/ketamina (66,4 mg/kg), posicionados em grade esteriotáxica e submetidos ao protocolo descrito por Chiba e colaboradores (2004), já utilizado rotineiramente no laboratório (Coulson-Thomas et al., 2008). Resumidamente, uma agulha de metal, resfriada com nitrogênio líquido, foi introduzida no cérebro dos animais quatro vezes, por 30 segundos, nas coordenadas estereotáxicas correspondentes ao córtex motor primário [ântero-posterior: +0.198 mm; médio-lateral: +0.175 mm; dorso-ventral: -0.15 mm; (Paxinos & Franklin, 2001)] (figura 2a). Os animais foram submetidos a um protocolo de tratamento de lesão aguda (24 horas) e crônica (30 dias). CTMs (1x105 células/3 μl), entre os subcultivos 5 e 10, foram injetadas imediatamente após a realização da lesão, utilizando a mesma anestesia e o mesmo acesso. Os controles consistiram de animais que tiveram o córtex motor lesado, mas não receberam o transplante de CTMs e animais sem lesão. Após 24 horas ou 30 dias da lesão e da injeção das células, os animais foram eutanasiados sob anestesia com injeção intraperitoneal de tiopental de sódio (Tiopentax, Cristália, São Paulo, Brasil) para coleta do encéfalo (Figura 2b). Os córtices motores primários ipsilateral, contralateral e o cerebelo foram dissecados e o RNA total extraído para análise da expressão das citocinas por PCR quantitativa. Também foi colhido o sangue dos animais por punção cardíaca, para análise de citocinas no soro. O sangue foi incubado a 37 °C por 30 minutos e centrifugado a 1.700 xg por 20 minutos para separar o soro da porção vermelha do sangue. O soro foi imediatamente congelado e mantido a – 80°C. Figura 2: Coordenadas das lesões: As lesões foram realizadas no córtex motor primário nas coordenadas estereotáxicas: ântero-posterior: +0.198 mm; médio-lateral: +0.175 mm; dorsoventral: -0.15 mm (A, desenho extraído de Paxinos e Franklin, 2001). Em B observamos um encéfalo de camundongo adulto com lesão no córtex motor primário esquerdo (seta). 25 Material e Métodos 3.10 Análise dos transcritos gênicos 3.10.1 Extração do RNA dos tecidos dissecados e das células Após 24 horas ou 30 dias da lesão no córtex motor e da injeção das CTMs, os animais foram eutanasiados, o cérebro foi retirado da calota craniana de forma asséptica, os córtices motores ipsilateral, contralateral e o cerebelo dissecados, imediatamente congelados e mantidos à -80 °C até o processamento. As CTNs mantidas como neuroesferas conforme descrito no item 3.4, foram mantidas por 4 dias em DMEM 70 %, F12 30 %, penicilina/estreptomicina 1 %,suplemento B27 2 %, EGF 20 ng/ml, FGF-2 20 ng/ml e heparina 5 µg/ml (meio controle) e em meio condicionado por CTMs. Após este período, as células foram submetidas ao protocolo de extração de RNA. As CTMs (subcultivo 5-10) também foram submetidas à extração de RNA para a análise de citocinas expressas constitutivamente por essas células. A extração do RNA foi realizada utilizando TRIzol® Reagent (Invitrogen, San Diego, CA, EUA) seguindo o protocolo do fabricante. Brevemente, os tecidos foram homogeneizados em 1 ml de TRIzol® e incubados por 10 minutos à temperatura ambiente. Foram adicionados 200 μl de clorofórmio (Merck), agitado e a mistura incubada por 2 a 3 minutos à temperatura ambiente sendo, posteriormente, centrifugada a 12.000 xg (centrífuga modelo 5410 Eppendorf, Hamburg, Alemanha) de 2 °C a 8 °C por 15 minutos. Após a centrifugação, a mistura separa-se em uma fase mais densa de coloração rosa (fenol-clorofórmio) no fundo do tubo contendo as proteínas, uma interface branca (DNA precipitado) e uma fase sobrenadante aquosa (incolor) onde está contido o RNA solúvel. Esta parte então foi transferida para outro tubo de microcentrífuga e foi precipitado adicionando-se 500 μl de isopropanol (Merck). As amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 10 minutos e centrifugadas a 12.000 xg, de 2 °C a 8 °C por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e o pellet de RNA foi lavado com etanol 75 % [etanol (Merck); H2O livre de RNAse]. A solução foi agitada e centrifugada a 7.500 xg de 2 °C a 8 °C por 10 minutos. Ao final desse processo, o pellet contendo RNA foi seco ao ar, ressuspendido em 22 μl de H2O livre de RNAse e armazenado à -80°C. Segundo o protocolo do fabricante, quando o tecido tem peso abaixo de 15 mg, deve-se utilizar aproximadamente 700 μl de TRIzol® Reagent. Após vários testes, o volume ideal encontrado para um bom rendimento da extração do RNA dos córtices motores foi de 500 μl, portanto para a extração do RNA desses tecidos foi utilizada a metade da quantidade dos reagentes descritos acima, sendo que para o cerebelo manteve-se 1 ml de TRIzol®. 26 Material e Métodos Uma alíquota de 2 μl foi usada para quantificação do RNA utilizando-se o espectrofotômetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, EUA). Após a quantificação, as amostras de RNA foram submetidas à eletroforese em gel de agarose em TBE 0,5X (Tris-borato-EDTA – tris-borato 45 mM e EDTA1 mM, pH 8,3) para análise das unidades conservadas do rRNA, 18S e 28S, que indicam a integridade do RNA. No gel de agarose foram aplicados 2 μg de RNA juntamente com 1 μl de loading dye (LGC, Teddington, Middlesex, Reino Unido). A corrida foi feita a 5V/cm por 1 hora e 30 minutos. 3.10.2 Síntese do DNA complementar Após a quantificação, 2 μg do RNA total foram utilizados para a síntese da fita de DNA complementar. A este RNA foram adicionados 0,5 mM de Oligo(dT)15 Primer (Promega, Madison, WI, EUA), e H2O livre de RNase até completar volume de 5 μl. Essa mistura foi incubada por 5 minutos a 70°C seguido por 5 minutos a 4°C. Após esse período de incubação, foram adicionados às amostras 0,5 μl de RNasin® Ribonuclease Inhibitor (Promega), 1,0 μl de desoxinucleotídeo trifosfato 10 mM (dNTP Promega), 1,0 μl de ImProm-II Reverse Transcription System (Promega), 4,0 μl do tampão da enzima, 2,4 μl de MgCl2 25 mM e 6,1 μl de H2O livre de RNase. As condições de amplificação utilizadas em termociclador (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha) foram: 25 °C por 5 minutos, 42 °C por 60 minutos, 70 °C por 15 minutos. Após a síntese, o cDNA as amostras foram armazenadas a -20 °C. Para verificar a eficiência da RT-PCR, foi realizada uma reação de PCR para amplificação do gene endógeno HPRT, sendo as condições da reação: 12,8 μl de H2O DNase free, 0,04 mM de cada primer (forward 5’ CTCATGGACTGATTATGGACAGGAC 3’ e reverse 5’ GCAGGTCAGCAAAGAACTTATAGCC 3’), 0,5 mM de dNTP (Promega), GoTaq (Promega) 2,5 μl do tampão da enzima, 3 mM final de MgCl2 e 1 μl de cDNA. As condições de amplificação utilizando-se termociclador Eppendorf foram: 92 °C por 2 minutos, seguido de 35 ciclos de 94 °C por 1 minuto, 55 °C por 1 minuto, 72 °C por 1 minuto, finalizando com 1 ciclo a 72 °C por 5 minutos. As amostras foram analisadas por eletroforese em gel de agarose 1,5 % em tampão TAE 1X (tris-acetato-EDTA – trisacetato 0,04 M e EDTA 0,001 M). No gel de agarose foram aplicados 4 μl do produto de PCR juntamente com 1 μl de loading dye (LGC). A corrida foi feita a 100 V por 30 minutos. 3.10.3 PCR em tempo real (qPCR) Utilizando RNA extraído de CTNs, fizemos as análises para os seguintes transcritos gênicos: GFAP, nestina, GAP43, SOX2 e os genes endógenos GAPDH e 27 Material e Métodos βactina (tabela 1). A reação de qPCR foi realizada utilizando Brilliant® II SYBR® Green QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) em termociclador Stratagene Mx3000P QPCR System (Stratagene). Para cada reação, 400ng de cDNA foram adicionados a 10 μl de SYBR®-Green, 1 μl do primer sense (0,5μM, concentração final), 1 μl do primer anti-sense (0,5 μM, concentração final), 0,3 μl de DyeROX (diluído 1:500) e água livre de RNAses para completar um volume final de 20 μl. Todas as reações foram realizadas em triplicata. O ciclo das reações consistiu de: ativação a 95 ºC por 10 minutos e 40 ciclos de 95 ºC por 15 segundos, 60 ºC por 1minuto e 72 ºC por 1 minuto. Tabela 1: seqüência dos primers utilizados para as CTNs gene gfap nestina gap43 sox2 βactina gapdh sense antisense sense antisense sense antisense sense antisense sense antisense sense antisense seqüência do primer 5’–CTCAGTACGAGGCAGTGGCC–3’ 5’–CGGGAAGCAACGTCTGTGA–3’ 5’– AGCAACTGGCACACCTCAAG–3’ 5’–GGTGTCTGCAAGCGAAAGTTC–3’ 5’-AAGGAGGAGCCTAAACAAGCCGAT-3’ 5’-TAGGTTTGGCTTCGTCTACAGCGT-3’ 5’–ATCCCATCCAAATTAACGCA–3’ 5’–GAAGCGCCTAACGTACCACT–3’ 5’-CGATGCCCTGAGGCTCTTT-3’ 5’-TGGATGCCACAGGATTCCA-3’ 5’-AAGAAGGTGGTGAAGCAGGCATCT-3’ 5’-ACCCTGTTGCTGTAGCCGTATTCA-3’ tamanho do produto (pb) 132 146 200 206 200 200 Utilizando RNA de CTMs, analisamos os transcritos gênicos das citocinas IL-6, TNF-α, IL-10 e IL-4 (tabela 2). Os endógenos utilizados também foram GAPDH e βactina. Tabela 2: seqüência dos primers utilizados para as CTMs. gene IL-6 seqüência do primer sense tamanho do produto (pb) 5´-CACAAAGCCAGAGTCCTTCAGAGA-3´ 228 antisense 5´-CTAGGTTTGCCGAGTAGATCT-3´ TNF-α sense 5´-ATGAGCACAGAAAGCATGATC-3´ 273 antisense 5´-TAGAGGCTTGTCACTCGAATT-3´ IL-10 sense 5´-TCCCCTGTGAAAATAAGAGCA-3´ 100 antisense 5´-TGGCCTTGTAGACACCTTGG-3´ IL-4 sense 5´-ACAGGAGAAGGGACGCCATG-3´ 222 antisense 5´-GCAGCTTATCGATGAATCCA-3´ Para amplificar os transcritos gênicos específicos para cada citocina e para o controle endógeno nos tecidos dissecados, utilizou-se o sistema TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As citocinas analisadas foram IL-4 28 Material e Métodos (Mm00445259_m1), IL-10 (Mm00439614_m1), IL-6 (Mm00446190_m1), TNF-α (Mm00443258_m1) e o controle endógeno HPRT (Mm00446968_m1). Cada reação foi realizada em triplicata em reações com volume final de 10 μl. Adicionou-se 5 μl de Mix TaqMan, 0,5 μl de primer, 1 μl de cDNA completando com água até 10 μl. A reação foi realizada em aparelho ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystem). A partir das curvas de amplificação geradas foi determinado o número de ciclos que passam um limiar Ct (Cycle Threshold), no qual todas as amostras podem ser comparadas. Com esses valores, foi empregado o método de quantificação relativo em tempo real, no qual os resultados obtidos com a análise dos genes de interesse foram comparados com o gene endógeno HPRT. Dessa maneira, níveis arbitrários de mRNA foram expressos como uma diferença de “n” vezes em relação ao calibrador (grupo controle). A expressão relativa dos genes foi calculada utilizando o método 2 –ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001) onde: 1. Ct: indica o número do ciclo no qual a quantidade do gene alvo amplificado alcança um limiar fixo; quanto menor o valor numérico de Ct, mais rapidamente foi atingido o número de cópias estabelecido; 2. ΔCt: normalização com um gene de expressão constitutiva; é obtido pela diferença entre o Ct do gene alvo e o Ct do gene endógeno para cada amostra; 3. ΔΔCt: média do ΔCt do grupo controle - ΔCt de cada gene para cada amostra. 3.11 Análise de citocinas por Multiplex O soro dos animais que foi coletado no dia da eutanásia e o meio condicionado por CTMs foram congelados a -80oC até o momento da análise. O painel de citocinas avaliadas foi Mouse Th1/Th2 (Bio Rad, Hercules, CA, EUA), que contém anticorpos para quantificar as citocinas CXCL1 (KC), CXCL5 (LIX), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10), CXCL12 (MIP-2; SDF-1), CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-1 ), CCL5 (RANTES), CCL11 (eotaxin), G-CSF, GM-CSF, INFγ, IL-1 , IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, LIF, TNF-α e VEGF. O ensaio foi desenvolvido de acordo com o protocolo do fabricante. Brevemente, 50 µL do soro e do meio condicionado foram usados. O filtro da placa de 96 poços foi lavado com Bioplex Assay Buffer (Bio-Rad). Em seguida, foram adicionados os beads conjugados com anticorpos anti-citocinas, lavados a seguir com Bioplex Wash Buffer, sendo posteriormente adicionadas as amostras a serem testadas, soro dos animais e meio condicionado por CTMs. Após incubação de 2 horas, a placa foi novamente lavada com o Bioplex Wash Buffer, sendo então adicionado a cada poço o 29 Material e Métodos anticorpo biotinilado de detecção para um epítopo diferente da citocina, formando então um sanduíche de anticorpos, incubado por 1hora. Após esse período, novas lavagens com o Bioplex Wash Buffer foram realizadas sendo então adicionado estreptavidina conjugada com peroxidase, que se liga ao anticorpo biotinilado, por 30 minutos. Novas lavagens foram realizadas com Bioplex Wash Buffer e os beads foram ressuspensos com Bioplex AssayBuffer e analisados no Bioplex Suspension Array System/ Luminex (BioRad) utilizando o Software Bio-Plex Manager, versão 4.0 (Bio-Rad). Os resultados obtidos são referentes a, no mínimo, 100 beads por citocina. Houve a realização de uma curva padrão das citocinas analisadas, que varia de 10,000 to 3,2 pg/mL. 3.12 Análise estatística A significância estatística dos resultados foi determinada utilizando-se o método ANOVA e teste de Tukey. Os resultados apresentados são a média ± erro padrão, sendo considerados estatisticamente diferentes se p<0.05. 30 Resultados Resultados 4 4.1 RESULTADOS Isolamento e cultivo de células tronco mesenquimais derivadas de medula óssea de camundongos As CTMs foram extraídas da medula óssea do fêmur de camundongos machos jovens (6 semanas de idade). As células foram plaqueadas e separadas dos outros tipos celulares presentes na medula por aderência ao plástico e foram cultivadas até a passagem 10, quando foram congeladas (figura 3). Figura 3: CTMs derivadas de medula óssea do fêmur de camundongos machos de 6 semanas, na 5ª passagem. Barra de escala=100µm. 4.2 Ensaios de diferenciação Para a caracterização das CTMs, as células foram induzidas a diferenciar em outros tipos celulares, como adipócitos e osteócitos. As células foram incubadas com meio de indução de diferenciação em adipócitos e osteócitos. A verificação da diferenciação foi realizada por coloração por Oil Red O, para visualizar vesículas adiposas presentes nas células (figura 4) ou com Alizarin Red, que possibilita a visualização de depósitos de cálcio (figura 5). 32 Resultados Figura 4: Diferenciação adipogênica das CTM. (A) CTMs induzidas a diferenciar em adipócitos. A seta indica vesículas de gordura no interior das CTMs. As células foram mantidas em meio de cultura suplementado com insulina, dexametasona, IBMX e indometacina, por 18-21 dias e coradas com Oil Red O/hematoxilina. (B) Controle, CTMs mantidas em cultura por 18-21 dias, com meio de cultura controle, coradas com hematoxilina. Barra de escala = 100 μm. Figura 5: Diferenciação osteogênica das CTMs. (A) CTMs induzidas a diferenciar em osteócitos, as setas indicam acúmulo de cálcio. As células foram mantidas em meio de cultura suplementado com dexametasona, ácido ascórbico e β-glicerofosfato, por 24 dias e coradas com Alizarin Red. (B) Controle, CTMs mantidas em cultura por 24 dias, em meio de cultura controle. Barra de escala = 100 μm. 33 Resultados 4.3 Isolamento e cultivo de CTNs derivadas da SVZ de camundongos As CTNs foram obtidas da SVZ de camundongos machos jovens (6 semanas de idade). As células foram cultivadas em suspensão para promover a formação de neuroesferas e não ocorrer diferenciação (Figura 6). A formação das esferas leva, em geral, de 14 a 21 dias e, depois de formadas devem ser utilizadas em curto prazo, pois entram em senescência. Figura 6: CTNs derivadas da SVZ de camundongos machos de 6 semanas de idade cultivadas como neuroesfera.Barra de escala = 25 μm. 4.4 4.4.1 Efeitos das citocinas secretadas por CTMs sobre a sobrevivência, proliferação e diferenciação de CTNs in vitro Expressão de citocinas por CTMs derivadas de medula óssea Primeiramente, utilizando a metodologia de Multiplex, fizemos a análise do meio condicionado por CTMs e observamos que essas células secretam uma variedade de quimiocinas, citocinas e fatores de crescimento mesmo sem receber estímulo (tabela 3). 34 Resultados Tabela 3: Quimiocinas, citocinas e fatores de crescimento detectados no meio de cultura condicionado por CTMs. Quimiocinas MCP1 (CCL2) MIP1a (CCL3) MIP1b (CCL4) Rantes (CCL5) KC (CXCL1) LIX (CXCL5) IP10 (CXCL10) LIF MIG (CXCL9) Citocinas pró-inflamatórias IL-6 IL17 TNF-α INFg Citocinas antiinflamatórias IL-4 IL-5 IL-10 Fatores de crescimento G-CSF VEGF Concentração (pg/ml) 687,0-1719,4 93,2-2998,6 208,0-5172,1 6,8-2339,0 573,0-1920,0 0,0-840,3 74,2-496,2 3,1-8306,0 0,0-55,5 0,0 0,9-1,8 0,0-0,2 0,6-5,2 1,9-2,4 1,3-1,8 0,0-12,1 2,5-3,0 1060,1-3389,1 Como nosso objetivo foi avaliar a resposta inflamatória in vivo e tendo acompanhado dados da literatura sobre inflamação no SNC, optamos pelas citocinas próinflamatórias IL-6 e TNF-α e as antiinflamatórias IL-10 e IL-4. Para verificar se havia expressão do RNAm dessas quatro citocinas, utilizamos CTMs no subcultivo 5. O RNA foi extraído e foi realizada PCR para as quatro citocinas selecionadas (figura 7), seguida de eletroforese em gel de agarose. Podemos observar que as CTMs têm expressão constitutiva de IL-6 e TNF-α, baixa expressão de IL-10 e nenhuma expressão de IL-4. Apesar de não termos encontrado IL-6 no meio condicionado, observamos que essas células expressam o RNAm para a molécula. A falta de detecção de RNAm de IL-4 pode ter sido devido ao não funcionamento da reação, uma vez que foi possível detectar IL-4 no meio de cultura condicionado pelas CTMs. 35 Resultados Figura 7: Expressão de citocinas por CTMs derivadas de medula óssea . CTMs no subcultivo 5 foram submetidas à extração de RNA, seguida de RT-PCR e PCR para as citocinas IL-10, IL-6, TNF- α, e IL-4, além dos genes endógenos β-actina e GAPDH. As CTMs expressam constitutivamente RNAm para IL-6, TNF-α e IL-10, mas não foi detectado RNAm para IL-4. Experimento realizado em triplicata. 4.4.2 Sobrevivência de CTNs 4.4.2.1 Viabilidade das CTNs cultivadas com meio condicionado por CTMs Para testar a possível atividade das citocinas solúveis no meio condicionado por CTMs como fatores de sobrevivência das CTNs, as neuroesferas foram mantidas em 2 condições de cultivo distintas: com meio completo, ou seja, com os fatores de crescimento EGF, FGF-2 e suplemento B27; ou com o meio condicionado por CTMs, por um período de 48 horas. Ao término desse período de incubação, a quantidade de células viáveis foi avaliada pela medida da atividade de desidrogenase mitocondrial (ensaio de MTT). Este método avalia a atividade metabólica das células quantificando a redução metabólica do MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólio) por desidrogenases associadas ao NADPH e ao NADH, resultando na produção de cristais de formazano, de cor violeta, no interior das células. A intensidade da cor é medida em espectrofotômetro, e pode ser correlacionada com a quantidade de células que estavam vivas ao término do experimento. Como indicado na figura 8, podemos observar que não houve alteração na viabilidade das CTNs após 48 horas de incubação, tanto em condições ideais de cultivo, ou seja, com meio completo suplementado (EGF, FGF-2 e B27), como com o meio 36 Resultados condicionado por CTMs, sugerindo que os fatores solúveis secretados pelas CTMs seriam suficientes para a manutenção da viabilidade celular das CTNs. 0.35 Abs (540 nm) 0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 Controle Meio condicionado Figura 8: Viabilidade das CTNs cultivadas com meio condicionado por CTMs. As CTNs cultivadas como neuroesferas foram cultivadas em meio completo (controle) e com meio condicionado por CTMs. Após 48 horas de incubação nessas condições foi realizado o ensaio de MTT e a análise feita em espectrofotômetro. As barras indicam as médias de triplicatas experimentais ± desvio padrão. Fatores secretados por CTMs no meio condicionado permitem a manutenção da viabilidade das CTNs. 4.4.2.2 Avaliação da apoptose das CTNs cultivadas com meio condicionado por CTMs Com o objetivo de avaliar os efeitos parácrinos das citocinas secretadas por CTMs sobre a morte celular das CTNs cultivadas como neuroesferas, utilizamos o ensaio de apoptose TUNEL (Terminal deoxynucloetidiltranferase (TdT)–mediated dUTP nick and labeling). Este método é utilizado para detectar DNA fragmentado, resultante da cascata de apoptose. A técnica é baseada na catálise, pela enzima TdT, da adição de dUTP fluorescente nos terminais 3’-hidroxil dos fragmentos de DNA. Após a formação das neuroesferas, estas foram plaqueadas em lamínulas previamente tratadas com poli-L-lisina e laminina por um período de 4 dias. As neurosferas foram mantidas em meio completo ou em meio condicionado por CTMs. Após a realização da reação de TUNEL, as neuroesferas foram analisadas por escaneamento a laser de forma descendente em microscópio confocal. Na figura 9 podemos observar que as células presentes nas neuroesferas cultivadas com o meio condicionado apresentam taxa de apoptose semelhante à das neuroesferas cultivadas em seu meio suplementado. Esses dados complementam os 37 Resultados resultados obtidos por MTT, que sugerem que CTMs secretam fatores de sobrevivência para CTNs. Figura 9: Ensaio de apoptose das CTNs cultivadas como neuroesferas com meio condicionado por CTMs. As neuroesferas foram cultivadas em meio completo (controle, painel A) ou com meio condicionado por CTMs (painel B). As células foram mantidas nessas condições por 4 dias e, após esse período, foi realizado o ensaio de TUNEL para a identificação de células apoptóticas (verde). Os núcleos foram corados com DAPI (azul). 4.4.3 Proliferação de CTNs 4.4.3.1 O meio condicionado por CTMs induz a proliferação das CTNs Para avaliar o efeito dos fatores solúveis secretados por CTMs sobre a proliferação de CTNs foi utilizada a incorporação de BrdU, com análise realizada por duas metodologias diferentes, citometria de fluxo e imunofluorescência em cortes das neurosferas. Após a formação das neuroesferas, estas foram incubadas com meio completo ou com meio condicionado por CTMs por 4 dias. Vinte e quatro horas antes da análise, acrescentou-se BrdU (0,2µM) nas placas de cultura. Os resultados da citometria de fluxo indicam que 27% das células incorporaram BrdU quando as neuroesferas foram cultivadas em meio completo, enquanto que para as neurosferas cultivadas em meio condicionado foi de 37% (figura 10). Resultado semelhante foi observado quando a análise foi realizada por imunofluorecência (figura 11). Esses dados mostram que os fatores solúveis secretados por CTMs promovem a proliferação de CTNs in vitro, sugerindo que o mesmo efeito poderia ocorrer in vivo. 38 Resultados % células BrdU+ 40 *** 30 20 10 0 Controle Meio condicionado Figura 10: Meio condicionado por CTMs estimula proliferação de CTNs in vitro (citometria de fluxo). As neuroesferas derivadas da SVZ de camundongos de 6 semanas de idade foram cultivadas por 4 dias em seu meio completo (controle) e em meio condicionado por CTMs. 24 horas antes da análise, as neuroesferas foram incubadas com BrdU. As células que incorporaram BrdU foram reconhecidas por anticorpo primário anti-BrdU, seguido de marcação com anticorpo secundário fluorescente. O gráfico mostra a porcentagem de células BrdU+ para cada condição. Os controles negativos tinham ausência de anticorpo primário. (***p<0,0001). Figura 11: Meio condicionado por CTMs estimula proliferação de CTNs in vitro (imunofluorescência). Imunofluorescência para GFAP (verde, marcador de células da glia) e BrdU (vermelho). Os núcleos foram corados com DAPI. As neuroesferas foram cultivadas em meio completo (controle, painel A) e em meio condicionado por CTMs (painel B) por 4 dias. Foram feitas criossecções de 12 µm de espessura. Objetiva de 40X. Barra de escala=20 µm. 39 Resultados 4.4.4 Diferenciação de CTNs 4.4.4.1 Expressão de genes neuronais e gliais por CTNs em resposta aos fatores solúveis secretados por CTMs Após investigarmos o efeito dos fatores solúveis secretados por CTMs sobre a sobrevivência, morte e proliferação das CTNs in vitro, avaliamos se esses fatores poderiam causar alterações na expressão gênica das CTNs. Os genes escolhidos foram: GFAP, nestina, GAP43 e SOX2. A proteína GFAP é um componente dos filamentos intermediários presentes em astrócitos, nestina também é uma proteína de filamento intermediário, porém utilizado como marcador de células imaturas, GAP43 é um marcador de cone de crescimento axonal e SOX2 é um fator de transcrição envolvido na manutenção da pluripotência de CTNs e na diferenciação neuronal durante a neurogênese. Após extração do RNA das CTNs cultivadas como neuroesferas em meio completo (controle) ou em meio condicionado por CTMs por quatro dias, a expressão dos genes selecionados foi avaliada quantitativamente, por qPCR. A análise foi feita a partir da normalização da expressão por dois genes endógenos, GAPDH e β-actina. Os resultados apresentados são a média de triplicatas experimentais. Observamos que nas neuroesferas cultivadas com meio condicionado por CTMs houve aumento da expressão de GFAP (p<0,0001) ao passo que houve diminuição da expressão de nestina (p<0,05) (figura 12A e B), porém não houve alteração na expressão de GAP43 e SOX2 (figura 12 C e D). 40 *** 40 30 3 2 1 0 Controle Meio condicionado Ct 50 70 RNAm de GFAP/ actina (2 - - ) Ct 60 RNAm de GFAP/GAPDH (2 A ) Resultados 60 *** 50 40 3 2 1 0 Controle Meio condicionado 0.75 0.50 * 0.25 0.00 RNAm de SOX2/GAPDH (2 0.75 0.50 * 0.25 0.00 Controle Meio Condicionado 1.25 - 0.50 0.25 0.00 Meio Condicionado 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 Controle Meio Condicionado ) Controle RNAm de GAP43/ actina (2 0.75 Ct ) RNAm de GAP43/GAPDH (2 1.00 1.5 - 1.25 - Ct D 1.00 ) Ct 1.25 - Ct ) Meio Condicionado RNAm de Nestina/ actina (2 1.00 Controle C 1.25 - Ct ) 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 Controle Meio condicionado RNAm de SOX2/ actina (2 RNAm de Nestina/GAPDH (2 - Ct ) B 1.0 0.5 0.0 Controle Meio Condicionado Figura 12: Expressão de GFAP (A), nestina (B), GAP43 (C) e SOX2 (D) por CTNs. Análise por qPCR da expressão de GFAP, nestina, GAP43 e SOX2 por CTNs cultivadas como neuroesferas. Os fatores secretados por CTMs promoveram aumento da expressão de GFAP e diminuição da expressão de nestina. Os valores são médias aritméticas do ΔΔCT ± erro padrão, normalizados pela expressão de GAPDH e βactina e calculados por ΔΔCt, em relação ao controle.*p<0,05, ***p<0,0001 (teste de tukey). 41 Resultados 4.5 Efeito do transplante de CTMs adultas em modelo de lesão traumática no SNC de camundongo Após avaliação da ação dos fatores solúveis secretados por CTMs sobre a sobrevivência, proliferação e diferenciação de CTNs cultivadas como neuroesferas e, sabendo do papel imunomodulador das CTMs, verificamos se estas células causariam modificações na expressão de citocinas inflamatórias em modelo de lesão traumática aguda no cérebro de camundongos adultos. Para isso, foram quantificadas as citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α e as antiinflamatórias IL-4 e IL-10, do tecido cerebral de animais transplantados ou não com CTMs. Como descrito em Material e Métodos, o cerebelo e os córtices motores ipsilateral e contralateral dos animais foram dissecados após lesão criogênica no córtex motor esquerdo, com e sem injeção de CTMs no local da lesão. O RNA total foi extraído e a expressão gênica dos genes alvo foi avaliada por qPCR. O córtex motor contralateral e o cerebelo foram utilizados como controle. Nos animais submetidos à lesão que não receberam CTMs observamos maior expressão da citocina pró-inflamatória IL-6 no córtex motor ipsilateral, tanto em relação ao controle (p<0,001), como em relação aos animais tratados com CTMs, nos quais houve diminuição da expressão desta citocina (p<0,05).Porém nos animais tratados com CTMs, a redução de IL-6 não foi suficiente para chegar aos níveis observados para animais controle (p<0,001), embora tenham sido mais baixos do que para os animais não tratados com CTMs (p<0,05). Não houve alteração na expressão de IL-6 no córtex motor contralateral e cerebelo (figura 13), indicando que a modulação do processo inflamatório foi local e não generalizada para todo o encéfalo. Para a citocina TNF-α, houve uma tendência à diminuição da expressão no córtex motor ipsilateral com o tratamento com CTMs quando comparado com os animais sem tratamento (figura 13) e não houve alteração na expressão de TNF-α no córtex motor contralateral e no cerebelo. 42 Resultados A B Córtex motor ipsilateral ** 125 100 75 50 25 4 * 125 Expressão Relativa TNF Expressão Relativa IL6 Córtex motor ipsilateral ** 3 2 1 0 Controle Lesão 75 3 2 1 0 CTMs Controle Lesão Expressão Relativa TNF 15 0.75 0.50 0.25 0.00 Controle Lesão CTMs Córtex motor contralateral 1.25 1.00 *** 100 Córtex motor contralateral Expressão Relativa IL6 *** ** * 10 5 0 CTMs Controle Lesão CTMs Cerebelo Cerebelo 2 Expressão Relativa TNF Expressão Relativa IL6 1.5 1.0 0.5 0.0 Controle Lesão CTMs 1 0 Controle Lesão CTMs Figura 13: Expressão de IL-6 e TNF-α nos córtices motores ipsilateral, contralateral e cerebelo de camundongos 24 horas após lesão traumática, transplantados ou não com CTMs. Vinte e quatro horas após a lesão, os animais foram eutanasiados e os tecidos de interesse coletados para a extração do RNAm e obtenção do cDNA. A expressão das citocinas de caráter inflamatório IL-6 (A) e TNF-α (B) foi analisada por qPCR. Os valores são médias aritméticas do ΔΔCT ± erro padrão, normalizados pela expressão de HPRT e calculados por ΔΔCt, em relação ao controle. As análises estatísticas realizadas foram ANOVA e teste de Tukey. *p<0,05, **p<0,001, ***p<0,0001. Na análise da expressão de citocinas antiinflamatórias, IL-10 e IL-4, observamos aumento de IL-10 nos animais com lesão não tratada em relação aos animais controle (p<0,001) e, surpreendentemente, o transplante de CTMs causou diminuição dos níveis 43 Resultados da citocina (p<0,01), sem diferença entre os animais tratados e controles (figura 14). Como as CTMs têm capacidade imunomoduladora, esperávamos que houvesse um aumento de IL-10 no sítio da lesão com o tratamento com as CTMs, porém podemos sugerir que a diminuição de IL-10 pode ter sido favorável, uma vez que não houve diferença do grupo tratado em relação ao grupo de animais saudáveis, controle. Não houve alteração na expressão de IL-4 em todos os tecidos analisados em todos os grupos. 44 Resultados A Córtex motor ipsilateral 8 Expressão Relativa IL4 Expressão Relativa IL10 150 125 100 75 50 B Córtex motor ipsilateral ** *** 10 0 2 CTMs Controle Córtex motor contralateral 2.5 Expressão Relativa IL4 Expressão Relativa IL10 Lesão 3 2 1 0 Lesão CTM Córtex motor contralateral 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Controle Lesão Controle CTMs Cerebelo 1.5 1.0 0.5 0.0 Lesão CTM Cerebelo 3 Expressão Relativa IL4 2.0 Expressão relativa IL10 4 0 Controle 4 6 2 1 0 Controle Lesão CTMs Controle Lesão CTM Figura 14: Expressão de IL-10 e IL-4 nos córtices motores ipsilateral, contralateral e cerebelo de camundongos 24 horas após lesão traumática, transplantados ou não com CTMs. Vinte e quatro horas após a lesão, os animais foram eutanasiados e os tecidos de interesse coletados para a extração do RNAm e obtenção do cDNA. A expressão de citocinas de caráter antiinflamatório IL-10 (A) e IL-4 (B) foi analisada por qPCR. Os valores são médias aritméticas do ΔΔCT ± erro padrão, normalizados pela expressão de HPRT e calculados por ΔΔCt, em relação ao controle. As análises estatísticas realizadas foram ANOVA e teste de Tukey e. **p<0,01, ***p<0,001. 45 Resultados Quando os animais foram mantidos por 30 dias após a lesão e injeção de CTMs, não observamos expressão das citocinas antiinflamatórias IL-10 e IL-4 em nenhum dos grupos experimentais. Diferentemente do modelo agudo, as alterações nas citocinas próinflamatórias foram, em geral, discretas. Houve um aumento da citocina IL-6 no córtex motor ispilateral com injeção de CTMs em relação ao grupo submetido somente a lesão (p<0,001). O mesmo foi observado no cerebelo. No córtex motor contralateral houve diminuição de IL-6 nos grupos submetidos à lesão e lesão com injeção de CTMs em relação ao grupo controle (p<0,01) (figura 15 A). Para TNF-α, no córtex motor ipsilateral observamos efeito semelhante ao observado na fase aguda do modelo, havendo uma tendência a diminuição dessa citocina quando comparamos o grupo submetido somente a lesão com o grupo que recebeu CTMs e o mesmo foi observado no cerebelo. Em contrapartida, observamos um ligeiro aumento de TNF-α no córtex motor contralateral nos animais que receberam CTMs (figura 15 B). 46 Resultados A B Córtex motor ipsilateral Córtex motor ipsilateral 25 ** 2.0 Expressão Relativa TNF Expressão Relativa IL6 2.5 *** 1.5 1.0 0.5 0.0 Controle Lesão 1.0 0.5 ** ** Lesão CTM 0.0 Expressão Relativa TNF Expressão Relativa IL6 *** 1 0 Lesão Lesão CTM CTM Córtex motor contralateral 8 * ** 6 4 2 0 Lesão CTM Cerebelo 10 2 Controle 0 Controle Cerebelo * 1 10 Expressão Relativa TNF Expressão Relativa IL6 1.5 3 5 Controle Córtex motor contralateral Controle 15 CTM 2.0 ** ** 8 ** 6 4 2 0 Controle Lesão CTM Figura 15: Expressão de IL-6 e TNF-α nos córtices motores ipsilateral, contralateral e cerebelo de camundongos 30 dias após lesão traumática, transplantados ou não com CTMs. 30 dias após a lesão, os animais foram eutanasiados e os tecidos de interesse coletados para a extração do RNAm e obtenção do cDNA. A expressão das citocinas de caráter inflamatório IL-6 (A) e TNF-α (B) foi analisada por qPCR. Os valores são médias aritméticas do ΔΔCT ± erro padrão, normalizados pela expressão de HPRT e calculados por ΔΔCt, em relação ao controle. As análises estatísticas realizadas foram ANOVA e teste de Tukey e. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. 4.6 Efeito do transplante de CTMs local sobre a resposta inflamatória sistêmica Após a lesão e a injeção de CTMs foi colhido sangue dos animais tanto na fase aguda como na fase crônica do modelo, no momento da eutanásia. O soro obtido foi utilizado para avaliarmos se poderia haver influência sistêmica da resposta inflamatória 47 Resultados ocorrida no SNC e se a injeção de CTMs poderia modular a expressão de moléculas inflamatórias sistemicamente. Foi utilizada a metodologia de Multiplex para avaliar os níveis de diversas citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento no soro dos animais. Como observamos nas figuras 16 e 17, não foi encontrado um padrão de aumento ou diminuição de moléculas inflamatórias nos diferentes grupos de animais. Porém podemos observar que nos animais que sofreram lesão aguda ocorre uma variação maior nos níveis de mediadores da inflamação. Dados da literatura são contraditórios nesta questão. Helmy e colaboradores (2010) descreveram alterações nos níveis dos mesmos mediadores inflamatórios que avaliamos em humanos após TCE, mas essas alterações ocorreram localmente. Os autores afirmam que há uma correlação fraca entre a inflamação sistêmica e a central. Contrariamente, outros autores já relataram correlação entre os níveis de citocinas envolvidas na resposta inflamatória ao TCE tanto central quanto sistemicamente (Csuka et al., 1999). *** *** 1450 *** *** pg/ml 12500 2500 1100 650 350 50 20 750 20 controle lesão CTMs *** *** *** *** *** *** *** *** 10 10 0 0 IL-1 IL-5 IL-6 IL-17 TNF- IL-4 IL-10 Figura 16: Quantificação de citocinas no soro dos animais 24 horas após lesão traumática, transplantados ou não com CTMs. Vinte e quatro horas após a lesão o sangue dos animais foi colhido por punção cardíaca e a composição de citocinas foi avaliada pela metodologia de Multiplex. (A) citocinas pró-inflamatórias e (B) citocinas antiinflamatórias (controle n=3, lesão sem transplante n=6, transplante de CTMs n=4). ***p<0,001. 48 Resultados controle lesão A 5000 CTMs 3000 * *** *** pg/ml 1000 600 350 100 90 * 60 30 0 * * * * * * CCL2 CCL3 CCL5 CCL11 CXCL1 CXCL2 CXCL5 CXCL9 CXCL10 G-CSF GM-CSF B 5000 * * pg/ml 3000 * 1000 150 * ** ** 100 50 0 CCL2 CCL3 CCL5 CCL11 CXCL1 CXCL2 CXCL5 CXCL9 CXCL10 G-CSF GM-CSF Figura 17Quantificação de quimiocinas no soro dos animais 24 horas e 30 dias após lesão traumática, transplantados ou não com CTMs. Vinte e quatro horas (A) e trinta dias (B) após a lesão o sangue dos animais foi colhido por punção cardíaca e a composição de quimiocinas foi avaliada pela metodologia de Multiplex. (controle n=3, lesão sem transplante n=6, transplante de CTMs n=4). *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001. 49 Discussão Discussão 5 DISCUSSÃO O SNC foi considerado por muitas décadas como local de privilégio imunológico e inflamatório. A presença da barreira hematoencefálica embasou esse conceito, uma vez que sua impermeabilidade impede a passagem de componentes celulares e moleculares das respostas imune e inflamatórias durante condições fisiológicas normais. No entanto, atualmente é evidente que em condições inflamatórias ou não inflamatórias, células do sistema imune e mediadores inflamatórios podem ultrapassar a barreira hematoencefálica. Em um quadro de lesão, além das células do sistema imunológico que invadem o cérebro, a microglia e os astrócitos também têm capacidade de expressar mediadores inflamatórios e secretar citocinas, quimiocinas e prostagladinas. Acredita-se que o início da resposta inflamatória no cérebro se dá pela secreção de citocinas próinflamatórias como IL-1α e β, TNF-α, interferon-γ e IL-6 que levam por sua vez a upregulation de moléculas de adesão, liberação de quimiocinas e ativação de mais células inflamatórias. Por outro lado, outro grupo de citocinas como IL-4, IL-10, IL-13 e TGF-β causam diminuição da intensidade das reações inflamatórias e citotóxicas e por isso são denominadas citocinas antiinflamatórias (Cederberg & Siesjo, 2010). A resposta inflamatória exacerbada e persistente pode levar à neurodegeneração crônica e causar degeneração secundária. Um dos maiores desafios encontrados para a regeneração do SNC é a lesão secundária decorrente do insulto inicial e a consequente formação da cicatriz glial Em lesões medulares traumáticas, por exemplo, a fase de lesão secundária pode ser descrita com uma sequência complexa de eventos celulares. Nesta fase, como resposta do sistema imune ao insulto, ocorre morte celular maciça, necrose secundária e/ou apoptose, danos oxidativos, excitotoxicidade e danos axonais (Ronaghi et al., 2010). Em uma lesão no SNC, as células do sistema imune secretam moléculas neurotóxicas, como citocinas inflamatórias e espécies reativas de oxigênio e moléculas neuroprotetoras, caracterizando um papel dúbio duplo do processo inflamatório, ou seja, efeitos agudos deletérios e efeitos benéficos em longo prazo, que contribuem para a neuroproteção e reparo (Kerschensteiner et al., 2010). Porém, o resultado do processo inflamatório agudo traz graves consequências para o paciente, portanto é necessário encontrar uma forma de fazer a modulação desse processo na tentativa de diminuí-lo. Muitos estudos têm utilizado drogas antiinflamatórias, que geralmente são utilizados na clínica no início do TCE (Bye et al., 2007; Edwards et al., 2005; Shohami et al., 1997; Townsend & Pratico, 2005), porém sem sucesso. CTMs têm sido alvos para muitos estudos devido seu papel imunomodulador. São células multipotentes e com capacidade de auto-renovação, o que elevou o interesse de 51 Discussão sua utilização para combater lesões teciduais e envelhecimento (Hoogduijn et al., 2010), porém atualmente muitos estudos sugerem que os efeitos regenerativos que as CTMs exercem sobre um tecido não são devido à transdiferenciação e substituição das células lesadas ou mortas, e sim devido à secreção de fatores que estimulam as células progenitoras locais. Na questão da imunomodulação atualmente é aceito que o efeito imunossupressor causado pelas CTMs é mediado por fatores solúveis (Phinney & Prockop, 2007). Muitos grupos evidenciaram esse fato em diversos tipos de tecidos. Semedo e colaboradores (2009) demonstraram que fatores secretados por CTMs modulam a inflamação após lesão renal aguda, diminuindo a expressão das citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6 e TNF-α, e aumentando as citocinas antiinflamatórias IL-4 e IL-10. Nguyen e colaboradores (2010) verificaram que fatores secretados por CTMs elevaram o reparo cardíaco e a contratilidade em miocárdio isquêmico. Nemeth e colaboradores (2010) relataram que CTMs propiciaram o reequilíbrio do sistema imune em modelo de asma. No SNC, Karussis e colaboradores (2010) relataram que o transplante de CTMs em pacientes com esclerose múltipla e esclerose lateral amiotrófica é viável e induz efeitos imunomodulatórios imediatos. Li e colaboradores (2010) relataram que o transplante de CTMs inibiu a atividade exagerada da astroglia e proporcionou um ambiente favorável para progenitores endógenos em cérebro isquêmico de Macaca fascicularis. Ao analisarmos o meio condicionado por CTMs, pela metodologia de Multiplex, observamos que há a secreção de diversos fatores solúveis, entre citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento, que são produzidos pelas células e secretados para o meio, sem nenhum estímulo (tabela 3). A partir daí selecionamos as quatro citocinas que foram utilizadas em nossos experimentos, as pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α e as antiinflamatórias IL-10 e IL-4. Apesar de não termos detectado IL-6 no meio de cultura, selecionamos esta citocina por sua relevância na resposta inflamatória. Confirmamos que as CTMs expressam IL-6 por PCR, porém não encontramos RNAm para IL-4 (figura 7), o que pode ter sido devido a algum problema metodológico. Neste trabalho, optamos por um modelo experimental de lesão traumática no córtex motor, que apresenta duas fases, uma aguda, 24 horas após a lesão e uma fase crônica, 30 dias após a lesão. O córtex motor recebe informações somatossensoriais processadas pelo tálamo e pelo córtex somatossensorial primário e instruções motoras das áreas de planejamento motor (Todorov, 2000). Lesões no córtex motor e/ou no trato córtico-espinal ocasionam hemiplegia ou hemiparesia no hemicorpo contralateral, evidenciada pela dificuldade ou incapacidade de recrutamento das respectivas unidades motoras. 52 Discussão Nossos resultados mostram que 24 horas após a lesão do córtex motor, ocorre um aumento significativo nas citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α no local, porém quando injetamos CTMs derivadas de medula óssea no mesmo local, observamos a diminuição dessas citocinas (figura 13). No córtex motor contralateral e cerebelo não verificamos alterações. Também observamos que a citocina antiinflamatória IL-10 teve a expressão aumentada no local da lesão e diminuiu após a administração de CTMs (figura 14A). Acreditamos que devido à modulação da inflamação pelas CTMs, todas as moléculas inflamatórias envolvidas tiveram sua expressão reduzida, o que explicaria o fato de que tanto as citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α como a antiinflamatória IL-10 tiveram diminuição de expressão após a administração de CTMs. IL-10 é uma citocina antiinflamatória com efeitos imunossupressores, inibe citocinas pró-inflamatórias, impede a diminuição da expressão da proteína anti-apoptótica Bcl2 em tecido cerebral isquemiado e limita a lesão excitotóxica (Liu et al., 2009; Morganti-Kossmann et al., 2007). A expressão da citocina IL-4 foi baixa ou praticamente nula em todos os tecidos de todos os grupos experimentais (figura 14B), o que pode indicar mais uma vez que talvez tenha ocorrido um problema de técnica, já que relatos da literatura indicam que há expressão dessa citocina em cérebro lesado. Na fase crônica do modelo, 30 dias após a lesão e administração de CTMs pudemos observar alterações na expressão das citocinas. IL-6 é uma citocina pleiotrópica, envolvida em diversos processos fisiológicos e patológicos, e com funções diversas no SNC, mas que pode desempenhar efeito pró ou antiinflamatório, dependendo do microambiente em que se encontra (Kamimura et al., 2003). Esta proteína é secretada principalmente pela microglia e astrócitos, seu papel neuroprotetor é caracterizado pela inibição de TNF-α, estimulação de NGF e promoção da revascularização, entre outros efeitos. Suas características inflamatórias vêm da indução de quimiocinas, moléculas de adesão e participação na formação da cicatriz glial (Morganti-Kossmann et al., 2007). Observamos que decorridos os 30 dias, houve aumento da expressão de IL-6 no local da lesão onde houve injeção de CTMs (figura 15A), contrário ao observado na fase aguda do modelo (figura 13A). Esse dado confirma a imunomodulação promovida pelas CTMs, pois em um ambiente altamente aversivo e inflamatório num período agudo de lesão, onde IL-6 é prejudicial, as CTMs induzem a diminuição dessa citocina, enquanto que decorrido algum tempo, essas células induzem aumento da expressão de IL-6 que passaria a ter um papel benéfico na regeneração do tecido. TNF-α também é uma citocina pró-inflamatória expressa em altas concentrações em condições patológicas no cérebro, e é expressa em baixos níveis em condições 53 Discussão normais no SNC (Ziebell & Morganti-Kossmann, 2010). Esta proteína apresenta duas isoformas, uma solúvel e uma transmembrânica e, quando liberada, pode exercer sua função pela ativação de dois receptores distintos, TNFR1 e TNFR2 (Mathieu et al., 2010). TNF-α é caracterizado como pró-inflamatório por induzir morte neuronal, pois em altas concentrações causa apoptose neuronal por uma via mediada por caspase-8 (Liu et al., 2009). A produção de TNF-α aumenta após isquemia in vivo e a diminuição da expressão de seus receptores pode reduzir a morte neuronal (Liu et al., 2009). Assim como IL-6, TNF-α tem ação pleiotrópica no cérebro isquêmico. Altas concentrações são lesivas para o tecido, porém também pode proteger o cérebro em certas circunstâncias. Essas diferentes ações podem ser explicadas pelas isoformas e pela interação com os dois receptores (Mathieu et al., 2010). A maioria dos efeitos mediados por TNF-α é via TNFR1, que tem o domínio relacionado à morte celular e tem expressão aumentada no cérebro isquêmico, porém quando TNF-α interage com TNFR2 tem efeito neuroprotetor, funções antiinflamatórias e anti-apoptóticas (Hallenbeck, 2002). Iosif e colaboradores (2006) demonstraram também que quando TNF-α age via TNFR1 ocorre diminuição da neurogênese no hipocampo e via TNFR2 aumenta a sobrevivência de neurônios recém formados. Veroni e colaboradores (2010) relataram que a ativação de TNFR2 na microglia promove indução de vias antiinflamatórias, ativando IL-10. Nós observamos neste trabalho que tanto 24 horas (figura 13B) como 30 dias (figura 15B) após a lesão e transplante de CTMs, a expressão de TNF-α foi menor no grupo transplantado em relação ao grupo lesado, porém permaneceu com níveis de expressão mais alto que o encontrado em animais sem lesão. Este dado pode indicar, segundo explicitado anteriormente, que esta citocina pode ter um efeito pró-inflamatório agudo, porém um efeito antiinflamatório crônico, colaborando com a neurogênese. Não observamos expressão de IL-10 e IL-4 nos animais avaliados na fase crônica do modelo. As alterações que foram observadas no córtex contralateral e cerebelo 30 dias após a lesão e injeção das CTMs (figura 15) podem ser devido à degeneração secundária causada pela lesão inicial no córtex motor, fazendo com que ocorresse uma diminuição do suporte trófico para os neurônios nesses locais e causando resposta inflamatória e possível morte neuronal. Além dessas modificações nos padrões de expressão das citocinas inflamatórias no local da lesão no SNC, a injeção de CTMs também influenciou a expressão de citocinas sistemicamente. Pudemos observar que houve alteração de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento no soro dos animais (figuras 16 e 17). Outros autores também relataram essa influencia sistêmica que uma lesão no SNC pode causar (Csuka et al., 1999; Hergenroeder et al., 2010). 54 Discussão Conforme exposto anteriormente, a resposta do organismo à lesão no SNC envolve ativação glial, recrutamento de leucócitos, aumento na expressão e secreção de mediadores inflamatórios como as citocinas e quimiocinas (Ziebell & Morganti-Kossmann, 2010). Estudos recentes têm implicado vários sinais moleculares na regulação da migração das CTNs em cérebro com lesão incluindo fatores angiogênicos, quimiocinas, citocinas e componentes da matriz extracelular (Kojima et al., 2010). No entanto, os mecanismos subjacentes à migração das CTNs nos cérebros lesionados permanecem desconhecidos. Uma das características da neurogênese em adultos é que novos neurônios são gerados pelas CTNs situadas em regiões específicas que, em seguida, migram para o seu destino final onde exercerão suas funções. Portanto a migração é um passo importante para a neurogênese no cérebro adulto (Okano & Sawamoto, 2008). O aumento de quimiocinas no local da lesão atrai células tronco endógenas da SVZ, região neurogênica em adultos, onde as células tronco se dividem gerando os precursores neurais. No cérebro de roedores normais esses precursores migram tangencialmente pela corrente migratória rostral e se diferenciam em interneurônios no bulbo olfatório, porém no cérebro lesionado, os precursores neuronais recém gerados migram em direção à área de lesão (Martino & Pluchino, 2006). A lesão induz aumento na proliferação das células presentes na SVZ e a migração dos precursores neuronais para o local lesado (Parent et al., 2002). No entanto, nem todas as células que chegam ao local da lesão são capazes de sobreviver devido ao ambiente hostil que encontram. Um dos nossos objetivos foi investigar a ação do meio condicionado por CTMs sobre CTNs cultivadas como neuroesferas, com intuito de verificar se a capacidade imunomodulatória conferida às CTMs pela secreção de fatores tróficos poderia causar alguma alteração na sobrevivência, proliferação e diferenciação de CTNs in vitro. Em um ambiente in vivo, essas moléculas secretadas por CTMs poderiam proporcionar um ambiente mais favorável para a sobrevivência das CTNs e com isso permitir que as células que chegam ao local da lesão, sobrevivam e recuperem o tecido lesado. Ao cultivarmos CTNs como neuroesferas com o meio condicionado por CTMs, pudemos observar que não houve alteração na sobrevivência dessas células (figura 8) e nem aumento da morte celular (figura 9), o que indica que os fatores secretados por CTMs não são nocivos às CTNs. Por incorporação de BrdU, observamos que houve aumento significativo na proliferação das CTNs quando cultivadas com o meio condicionado por CTMs (figuras 10 e 11), ou seja, os fatores solúveis estimulam a proliferação dessas células. A presença de TNF-α no meio condicionado pode ter influenciado nesse resultado, uma vez que essa citocina agindo no receptor TNFR2 das 55 Discussão CTNs e também via sinalização de IKK/NF-kappaB, induz neurogênese in vitro e in vivo (Iosif et al., 2006; Rubio-Araiz et al., 2008; Widera et al., 2006; Wu et al., 2000). Para averiguar se os fatores solúveis presentes no meio condicionado por CTMs também poderiam influenciar na diferenciação de CTNs, após o cultivo das neuroesferas com meio condicionado a expressão de genes relacionados com a diferenciação das linhagens neurais foi avaliada por qPCR. Observamos que houve aumento da expressão de GFAP pelas CTNs, gene expresso por astrócitos maduros. Este dado pode ser observado tanto por análise quantitativa da expressão gênica como por imunofluorescência, onde observamos maior quantidade de células GFAP positivas (figuras 11 e 12). Sabe-se que IL-6 tem efeito antineurogênico in vivo, porém Barkho e colaboradores (2006) mostraram que IL-6 secretado por astrócitos de regiões neurogênicas do hipocampo induziu a diferenciação de CTNs in vitro. Os autores observaram que tanto IL-1β quanto IL-6 aumentou a atividade do promotor do gene GFAP nas CTNs, mas apenas IL-6 causou aumento na porcentagem de células GFAP positivas. Também observamos diminuição da expressão de nestina, marcador de células neuronais imaturas. Não houve alteração de expressão de SOX2, fator de transcrição necessário para a manutenção do estado de pluripotência das CTNs no adulto (Pevny & Nicolis, 2010). A expressão constitutiva de SOX2 inibe a diferenciação neuronal, como não houve diferenças na expressão de SOX2 nas CTNs cultivadas com o meio condicionado em relação ao controle, esse fato pode explicar a diminuição da expressão de nestina, ou seja, a expressão de SOX2 impediu que as células neurais diferenciassem para neurônios. Também não houve alteração na expressão de GAP43, proteína neuronal, expressa em cones axonais em crescimento (figura 12) (Kusik et al., 2010). Este conjunto de resultados sugere que os fatores solúveis secretados por CTMs estimulam a diferenciação de CTNs em células da glia (astrócitos) sem alterar a diferenciação neuronal. Com base em nossos resultados, tanto in vitro como in vivo, apresentamos a ação de fatores solúveis secretados por CTMs sobre CTNs e sobre a imunomodulação na resposta inflamatória em uma lesão traumática no cérebro. A participação das CTMs na resposta inflamatória pode gerar um ambiente favorável à recuperação tecidual, diminuindo os efeitos lesivos da inflamação intensa e gerando um ambiente favorável para a sobrevivência e diferenciação de células tronco endógenas. Porém, muitos aspectos dos mecanismos pelos quais as CTMs realizam a imunomodulação ainda não estão completamente esclarecidos. 56 Conclusão Conclusão 6 CONCLUSÃO Os resultados apresentados nesta Tese mostram que as CTMs expressam e secretam fatores solúveis que podem agir sobre CTNs derivadas da SVZ estimulando a proliferação in vitro. Além disso, os fatores modulam a expressão gênica das CTNs, com aumento na expressão de GFAP, gene relacionado com astrócitos maduros, o que indicaria que esses fatores podem induzir a diferenciação de CTNs preferencialmente em células da glia (astrócitos). Além disso, as CTMs foram capazes de promover imunomodulação da resposta inflamatória em modelo de lesão traumática no SNC de camundongo, diminuindo a expressão das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α na fase aguda. 58 Referências Bibliográficas 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABDALLAH, B. M. and KASSEM, M. (2008). Human mesenchymal stem cells: from basic biology to clinical applications. Gene Ther, 15, 109-116. AKBAR, A. N., LORD, J. M. and SALMON, M. (2000). IFN-alpha and IFN-beta: a link between immune memory and chronic inflammation. Immunol Today, 21, 337-342. ALLAN, S. M. and ROTHWELL, N. J. (2001). Cytokines and acute neurodegeneration. Nat Rev Neurosci, 2, 734-744. ALLAN, S. M. and ROTHWELL, N. J. (2003). Inflammation in central nervous system injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 358, 1669-1677. ALVAREZ-BUYLLA, A. and LIM, D. A. (2004). For the long run: maintaining germinal niches in the adult brain. Neuron, 41, 683-686. ARMSTRONG, R. J. and BARKER, R. A. (2001). 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Furthermore, mesenchymal stem cells (MSC) which have proliferative potential and are able to originate different and specialized cell lineages, also secrete these molecules, characterizing its immunomodulatory function. MSC, particularly those derived from bone marrow, promote tissue repair by secreting factors that enhance tissue regeneration stimulating proliferation, migration and differentiation of endogenous stem-like progenitors found in most tissues, decreasing inflammatory and immune reactions and apoptosis. The ability of such cells to alter tissue microenvironment through its trophic influence may contribute more significantly than their capacity for transdifferentiation in effecting tissue repair.Our hypothesis is that MSC secreted cytokines could take part in the attraction of endogenous neural stem cells (NSC) to an injury site in the CNS, providing a favorable microenvironment for these cells. Our aim was to study the effects of factors secreted by MSC on NSC in vitro and to analyse the MSC cytokines expression in vivo in a model of CNS traumatic injury. We first evaluated the effects of MSC secreted factors on apoptosis, proliferation and differentiation of adult NSC derived from the subventricular zone and cultured as neurospheres. Neurospheres were cultured in MSC conditioned medium (MSC-CM), which was obtained from bone marrow-derived MSC cultures. Besides a traumatic injury was performed at the primary motor cortex of mice and MSCs were injected at the injury site. Our results show that MSC secreted factors do not induce or prevent NSC apoptosis, increase NSC proliferation and induce bigger expression of GFAP gene in vitro, this could indicate a tendency of differentiation to astrocytes. In vivo experiments show that MSC injection at an acute model of injury diminishes pro-inflamatory cytokines in the injured tissue, suggesting that MSC secreted factors may modulate the inflammation at the injury site, which may be interest to the development favorable microenvironment for endogenous NSC and consequently repair of the injured tissue. 68 Anexos Formação Acadêmica 2004 – 2007: Graduação em Ciências Biológicas - Modalidade Médica. Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho - UNESP Botucatu, Brasil Título: Análise do Padrão de Metilação dos Genes RASSF1 e RARB em Carcinomas Mamários Orientador: Dra Cláudia Aparecida Rainho Bolsista da: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo Atividades Complemetares Eventos/ Trabalhos Apresentados em Congressos e Simpósios GALINDO, L. T., Filippo T.R.M, Semedo P., Câmara N.O.S., Porcionatto M.A. Paracrine effects of bone marrow mesenchymal stem cells on neural stem cells survival and proliferation. In: V Congresso Brasileiro de Células-tronco e Terapia Celular, 2010. GALINDO, L. T., Filippo T.R.M, Semedo P., Câmara N.O.S., Porcionatto M.A. Soluble factors secreted by mesenchymal stem cells induce neural stem cells proliferation in vitro. In: Perspectives of Stem Cells: 1st Meeting on Stem Cell Research, 2010. GALINDO, L. T., Filippo T.R.M, Semedo P., Câmara N.O.S., Porcionatto M.A. Fatores secretados por células-tronco mesenquimais previnem a apoptose de células-tronco neurais. In: IV Simpósio de Células-tronco, Terapia Celular e Gênica da Unifesp, 2010 GALINDO, L. T., Filippo T.R.M, Semedo P., Câmara N.O.S., Porcionatto M.A. Study of paracrine effects of bone marrow mesenchymal stem cells on neural stem cells. In: IV Simpósio Internacional de Terapias Avançadas e Células-Tronco, 2009. 3º Simpósio Multidisciplinar sobre Células Tronco da Unifesp, 2008. (Ouvinte) Organização de eventos PAPEM: Programa de Atualização de Professores do Ensino Médio. Realizado de 20 a 24 de julho de 2009, Unifesp – São Paulo 12o Encontro Nacional de Biomedicina Realizado de 29 a 31 de outubro de 2009, Botucatu – São Paulo. Membro da Comissão de Apoio Artigo Publicado Galindo L.T, Filippo T.R.M, Semedo P., Ariza C.B, Moreira C.M, Câmara N.O.S., Porcionatto M.A. Mesenchymal stem cell therapy modulates the inflammatory response in experimental traumatic brain injury. Neurology Research International. 2011. Artigo Submetido Filippo T.R.M, Barnabe G.F, Ariza C.B, Galindo L.T, Moreira C.M., Mello L.E., Juliano M.A., Juliano L., Porcionatto M.A.. Towards regeneration: chemotaxis of SVZ neural stem cells-derived neuroblasts stimulated byCXCL12 N-terminal peptides after experimental brain injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 2011. Parecer do Comitê de Ética Institucional Hindawi Publishing Corporation Neurology Research International Volume 2011, Article ID 564089, 9 pages doi:10.1155/2011/564089 Research Article Mesenchymal Stem Cell Therapy Modulates the Inflammatory Response in Experimental Traumatic Brain Injury Layla T. Galindo,1 Thais R. M. Filippo,1 Patricia Semedo,2 Carolina B. Ariza,1 Caroline M. Moreira,1 Niels O. S. Camara,2 and Marimelia A. Porcionatto1 1 Departamento de Bioquı́mica, Universidade Federal de São Paulo, Rua Três de Maio 100, 04044-020 São Paulo, SP, Brazil de Imunologia, Universidade de São Paulo, 05508-000 São Paulo, SP, Brazil 2 Departamento Correspondence should be addressed to Marimelia A. Porcionatto, [email protected] Received 14 January 2011; Revised 20 March 2011; Accepted 31 March 2011 Academic Editor: K. J. Becker Copyright © 2011 Layla T. Galindo et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Therapy with mesenchymal stem cells (MSCs) has showed to be promising due to its immunomodulatory function. Traumatic brain injury (TBI) triggers immune response and release of inflammatory mediators, mainly cytokines, by glial cells creating a hostile microenvironment for endogenous neural stem cells (NSCs). We investigated the effects of factors secreted by MSCs on NSC in vitro and analyzed cytokines expression in vitro in a TBI model. Our in vitro results show that MSC-secreted factors increase NSC proliferation and induce higher expression of GFAP, indicating a tendency toward differentiation into astrocytes. In vivo experiments showed that MSC injection at an acute model of brain injury diminishes a broad profile of cytokines in the tissue, suggesting that MSC-secreted factors may modulate the inflammation at the injury site, which may be of interest to the development of a favorable microenvironment for endogenous NSC and consequently to repair the injured tissue. 1. Background For many years, the central nervous system (CNS) was considered an immunologically privileged site, due to its particular and limited immune response, different from other systems [1]. It is now clear that CNS is connected to the immune and endocrine systems and has a local inflammatory response, which can contribute to the pathophysiology of acute and chronic brain diseases [2, 3]. Acute neurodegenerative conditions such as traumatic brain injury (TBI) are characterized by severe neuronal loss [4]. TBI breaks the impermeability of the blood brain barrier, which allows the invasion of immune cells and activation of glial cells, mainly microglia and astrocytes, key cells for the immune response within CNS, triggering the secretion of inflammatory mediators by those cells [5, 6]. Inflammatory molecules are important in healthy nervous tissue and their expression is promptly upregulated when an injury occurs [3]. Cytokines are the main molecules in neuroinflammatory response and are critical for its regulation, exerting a variety of activities [7, 8]. Microglia and astrocytes release several cytokines, such as IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF-α, and TGF-β, chemokines, and prostaglandins, which increase the blood brain barrier permeability and facilitate the invasion of peripheral immune cells, inducing the secretion of toxic molecules [3, 7]. In the adult brain, chemoattractants, including the chemokine CXCL12 produced at the injury site induce neuroblasts originated by neural stem cells (NSC) at neurogenic niches, such as the subventricular zone (SVZ), to migrate towards the injury in order to regenerate the nervous tissue [9–11]. Although neuroblasts leave the neurogenic niche arrive at the injury site, only a few survive due to the injury inflammatory microenvironment that is thought to be unfavorable to neuroblast survival and differentiation into mature neurons [12]. The limited CNS capacity of regeneration and the complex environment created by TBI, starting at the acute phase, followed by a secondary phase that continues for weeks after the primary insult [13] lead researchers to try to find potential therapies using neuroprotective and anti-inflammatory drugs [14–18]. 2 Cell-based therapy using adult-derived mesenchymal stem cells (MSC) have been tested in several disease models [19–24]. It is well accepted that transplantation of MSC, particularly those derived from bone marrow, promotes tissue repair via secreted soluble factors that enhance tissue regeneration, stimulate proliferation, migration, and differentiation of endogenous stem-like progenitors found in most tissues, as well as by decreasing inflammatory and immune reactions and apoptosis [25, 26]. The ability of such cells to modify tissue microenvironment through its trophic influence may contribute more significantly than their capacity for transdifferentiation in effecting tissue repair. In order to better understand the paracrine effects of MSC transplanted into an experimental brain injury site on local cytokine production we have used a TBI model in mice, transplanted bone marrow-derived MSC into the lesion, and analyzed the production of cytokines. We also investigated the effects of soluble factors secreted by MSC on neural stem cells survival, proliferation, and differentiation in vitro. Our results show a decrease in the production of inflammatory cytokines 24 hours after MSC transplantation. We also show that soluble factors secreted by MSC increase proliferation and modulate gene expression of neural stem cells in vitro, increasing the expression of GFAP, a marker of glial cells. 2. Material and Methods 2.1. Animals. Adult (6-week-old for MSC and NSC isolation, 12-week-old for TBI model) C57BL/6 male mice were used in this study. The animals were maintained under standard conditions (light/dark cycle 12 h/12 h, constant room temperature at 22 ± 2◦ C, food, and water ad libitum). All the experimental procedures were conducted according to international regulation and were approved by the Committee for Ethics in Research of Universidade Federal de São Paulo (approval no. 1367/08). 2.2. Isolation, Expansion, and Characterization of MSC. After euthanasia in CO2 chamber, bone marrow was obtained from femur of adult mice. The femora were removed, cleaned, and placed in DMEM low glucose (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, GibcoBRL, San Francisco, USA). Inside the laminar flow, the epiphyses were cut and bone marrow was flushed by DMEM into a culture dish using a syringe. The volume obtained from each femur was treated separately. Bone marrow was suspended and centrifuged for 5 minutes at 400 × g. The supernatant was discarded and the cell pellet derived from each femur was suspended in DMEM low glucose containing 10% fetal bovine serum (FBS, Cultilab, Campinas, SP, Brazil), 1% glutamine (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), and 1% penicillin/streptomycin (GibcoBRL) and cultured in six-well culture dishes (Corning Incorporated, NY, USA) at a volume of 3.5 mL/well. Cultures were kept in a humidified 5% CO2 incubator at 37◦ C for 72 hours, when nonadherent cells were removed by changing the medium. Culture medium was changed every 3 days until adherent cells (MSC) reached 70–80% confluence, then Neurology Research International cells were washed with 0.03% PBS/EDTA, detached with 0.1% trypsin (Cultilab), and replated in a 1 : 2 split ratio. Differentiation potential was checked by culturing the MSC under favorable conditions for adipogenic and osteogenic differentiation, as previously described [27]. To obtain the MSC conditioned medium (MSC-CM), confluent cultures (passages 5–10) were kept in DMEM low glucose containing 0.5% FBS for 96 hours. After this period, conditioned medium was centrifuged for 5 minutes at 400 × g, the supernatant was collected, immediately frozen and kept at −80◦ C until its use. 2.3. Isolation of Adult NSC and Neurosphere Formation. Adult NSC were obtained from adult C57BL/6 male mice SVZ. After euthanasia by cervical dislocation, brain was removed, the SVZ dissected under a microscope, and the cells maintained in DMEM high glucose (GibcoBRL). After sedimentation, supernatant was discarded, and cells were dissociated by incubation with 0.1% trypsin/EDTA during 5 minutes at 37◦ C. FBS was added to stop trypsin action, cells were centrifuged for 5 minutes at 400 × g, and supernatant was removed. Isolated cells were then suspended in DMEM/F12 7 : 3 (v/v) (GibcoBRL), supplemented with 2% B27 (GibcoBRL), 20 ng/mL EGF (Sigma), 20 ng/mL FGF2 (R&D, Minneapolis, MN, USA), 1% penicillin/streptomycin (GibcoBRL), and 5 μg/mL heparin (Sigma). After mechanical dissociation, cells were plated on a polyHEMA (Sigma) precoated 75 cm2 flask at a density of 2.4 × 107 cells/flask or on a 24-well plate at a density of 2 × 106 cells/well. Neurosphere formation takes up to 14–21 days to occur, and during that time culture medium was changed every 4-5 days by centrifugation for 5 minutes at 400 × g. Half volume of the medium was replaced by fresh medium. Neurospheres were cultured with or without MSC-CM for 2 days to evaluate NSC viability and for 4 days to evaluate NSC survival and differentiation. 2.4. MTT Assay. The MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-yl)2,5diphenyltetrazolium bromide, Sigma) assay was performed to evaluate NSC viability cultured for 48 hours in MSC-CM. At the end of this period, neurospheres were centrifuged for 5 minutes at 400 × g, supernatant was discarded, and 270 μL of culture medium and 30 μL of MTT solution (5 mg/L) were added to each well and incubated for 3 hours at 37◦ C. After this period, MTT solution was aspirated and the formazan reaction products were dissolved by the addition of 180 μl of dimethyl sulfoxide (DMSO, MP Biomedicals, Solon, Ohio, USA) to each well. The plate was shaken for 15 minutes, the content was transferred to a 96-well plate, and the optical density was read at 540 nm on an ELISA plate reader (Labsystems Multiskan MS, Helsinki, Finland). 2.5. Proliferation Assay. In vitro adult NSC proliferation was measured by flow cytometry (FACSCalibur System, BD Biosciences, San Jose, CA, USA, using the software Windows Multiple Document Interface Flow Cytometry Application, WinMDI Version 2.9, The Scripps Research Institute, San Diego, CA, USA), after BrdU incorporation. Adult NSC Neurology Research International were cultured as neurospheres and maintained for 4 days in MSC-CM or in control medium (DMEM/F12 7 : 3 v/v, supplemented with 2% B27, 20 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF2, 1% penicillin/streptomycin, and 5 μg/mL heparin) at 37◦ C. BrdU was added during the last 24 hours before analysis. Neurospheres were dissociated with 0.1% trypsin for 5 minutes at 37◦ C, fixed by 1% paraformaldehyde (PFA) in 0.1 M PBS, incubated in 2 M HCl for 1 hour at 37◦ C, washed with 0.1 M PBS, blocked, and permeabilized with 10% FBS and 0.1% TritonX-100 in 0.1 M PBS. Cells were incubated with anti-BrdU (rat IgG 1 : 300, Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, USA) for 1 hour and washed with 0.1M PBS. Cells were then incubated with secondary antibody (Alexa Fluor488-conjugated goat antirat IgG, 1 : 300, Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA) for 40 minutes. 2.6. Injury to Mice Primary Motor Cortex and MSC Transplantation. Adult C57BL/6 male mice were submitted to surgery under anesthesia with intraperitoneal administration of xilasine (32 mg/kg)/ketamine chloridrate (66 mg/kg) (Dopalen, Vetbrands, São Paulo, Brazil). Traumatic injury to mice motor cortex was performed according to previously described protocol [28, 29]. Briefly, a metal needle was chilled using isopentane on dry ice and was inserted 4 times, during 30 seconds each, into the motor cortex (stereotaxic coordinates from bregma: AP +0.198 mm; ML +0.175 mm; DV −0.15 mm [30]). MSC (1 × 105 cells in 3 μL) were injected at the injury site using a Hamilton syringe under the same stereotaxic coordinates and the same anesthesia, immediately after the injury. Control consisted of animals without injury and animals that were submitted to the injury but did not receive MSC (injury, no treatment). Brain tissue was collected 24 hours (acute injury) or 30 days (chronic injury) after MSC injection. Mice were anesthetized by i.p. injection of sodium thiopental (Tiopentax, Cristália, São Paulo, Brazil), brain was removed from skull, the motor cortex was dissected and total RNA was extracted by Trizol Reagent (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Animal’s blood was collected by cardiac puncture, centrifuged to separate the serum, which was immediately frozen in dry ice and kept at −80◦ C until use. 2.7. qPCR. Total RNA was isolated from dissected motor cortex or neurospheres using Trizol Reagent (Life Technologies), and RNA concentration was determined using NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, MA, USA). Reverse transcriptase reactions were performed with ImProm-II Reverse Transcription System (Promega, Madison, WI, USA) using 2 μg of total RNA. Brain tissue samples qPCR was performed using ABI PRISM 7500 Sequence Detector, using Sequence Detection Software 1.9 for analysis (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), using TaqMan probes (Applied Biosystems) for HPRT (Mm00446968 m1; endogenous control gene), IL-4 (Mm00445259 m1), IL-6 (Mm00446190 m1), IL-10 (Mm00439614 m1), and TNFα (Mm00443258 m1) according to the manufacturer’s recommendations. Values are 3 expressed relatively to control RNA obtained from motor cortex from mice that were not submitted to surgery. Neurosphere samples qPCR was performed using Brilliant II SYBR Green QPCR Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA, EUA) using Mx3000P QPCR System using MxPro qPCR Software for analysis (Stratagene). Primers sequences were GAPDH (endogenous control gene; sense 5 -AAGAAGGTGGTGAAGCAGGCATCT-3; antisense 5 ACCCTGTTGCTGTAGCCGTATTCA-3 ), GFAP (sense 5 -CTCAGTACGAGGCAGTGGCC-3 ; antisense 5 -CGGGAAGCAACGTCTGTGA-3 ), nestin (sense 5 -AGCAACTGGCACACCTCAAG-3 ; antisense 5 -GGTGTCTGCAAGCGAAAGTTC-3 ), GAP-43 (sense 5 -AAGGAGGAGCCTAAACAAGCCGAT-3 ; antisense 5 -TAGGTTTGGCTTCGTCTACAGCGT-3 ), and SOX2 (sense 5 -ATCCCATCCAAATTAACGCA-3 ; antisense 5 -GAAGCGCCTAACGTACCACT-3 ). Values are expressed relatively to RNA from neurospheres cultured in regular medium (control). The quantification of the target genes was normalized by an endogenous control gene (HPRT for brain tissue samples and GAPDH for neurosphere samples). The threshold cycle (Ct) for the target gene and the Ct for the internal control were determined for each sample, run in triplicates. The relative expression of mRNA was calculated by 2−ΔΔCt method [31]. 2.8. Bio-Plex. In order to analyze alterations in cytokines expression in mice serum after TBI, a Bio-Plex assay was performed. Custom Bio-Rad (Bio-Rad laboratories, Hercules, CA, USA). Bio-Plex cytokine analysis kits were used together with the Bio-Plex system array reader according to the manufacturer’s directions. The following cytokines were quantified: CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-1β), CCL5 (RANTES), eotaxin (CCL11), CXCL1 (KC), CXCL2 (MIP-2), CXCL5 (LIX), CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP10), G-CSF, GM-CSF, INF-γ, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, LIF, TNF-α, and VEGF. Samples were run in triplicate for each assay. The assay was read on the Bio-Plex suspension array system, and the data were analyzed using Bio-Plex Manager software version 4.0. Standard curves ranged from 10,000 to 3,2 pg/mL. 2.9. Statistical Analysis. Data are expressed as mean ± SEM. Differences between groups were evaluated by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s posttest by the use of GraphPad Prism software version 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Statistical significance was set at P < .05. 3. Results 3.1. MSC Transplantation Modulates Cytokines Expression after Acute Brain Injury. Acute TBI results in upregulation of anti- and proinflammatory cytokines expression 24 hours after the injury (Figure 1(a)). Thirty days after injury, the expression levels of IL-10 and IL-4 are undetected whereas the expression of TNF-α persists significantly higher 4 Neurology Research International ∗∗ ∗ ∗∗∗ Relative expression Relative expression 150 ∗∗ 25 ∗∗∗ ∗∗ 50 5 15 5 3 ∗∗ ∗∗∗ 2 1 0 0 IL-6 TNF-α IL-10 IL-4 IL-6 TNF-α Control Control Injury no treatment Injury no treatment MSC treated MSC treated (a) IL-10 IL-4 (b) Figure 1: Relative expression of IL-6, TNF-α, IL-10, and IL-4 in acute and chronic models of motor cortex injury. (a) 24 hours and (b) 30 days after injury and MSC injection, RNA was extracted from motor cortex of control, injury without treatment and MSC treated mice. qPCR was performed to quantify the expression of inflammatory cytokines and relative expression was calculated in relation to HPRT. Data are expressed as mean of 2−ΔΔCt ± SEM (control n = 3, injury no treatment n = 6, MSC treated n = 4). ∗ P < .05, ∗∗ P < .001, ∗∗∗ P < .0001. than in undamaged tissue and IL-6 expression decreases (Figure 1(b)). Our results show that immunomodulation by MSC transplantation in the TBI acute model is indicated by downregulation of IL-6, and IL-10 mRNA levels (Figure 1(a)). Thirty days after injury and injection of MSC, we observed increased expression of IL-6 (Figure 1(b)). 3.2. Transplanted MSC also Modulate Serum Levels of Cytokines. TBI induces an inflammatory reaction by the release of proinflammatory cytokines IL-1β, IL-6, and IL8 that can be detected in the serum of patients that have suffered severe TBI [32, 33]. There is very limited information about serum levels of cytokines in TBI model we used, especially regarding the levels of the pro-inflammatory interleukins seen in patients. Similar to what is observed for humans, the serum level of four pro-inflammatory cytokines, IL-1β, IL-6, IL-17, and TNF-α was increased by the injury (Figure 2(a)). We also observed increased levels of two anti-inflammatory cytokines, IL-4 and IL-10 (Figure 2(b)). Interestingly, MSC transplantation into the injury site decreased the serum levels of all cytokines in the acute phase of the model (Figure 2). We expanded the investigation of the levels of cytokines to several chemokines, because of their important role in the modulation of the activity of immune cells, as well as of stem cells, especially regarding mobilization of stem cells from tissue-specific stem cell niches [34, 35]. We observed a variety of responses to injury and to MSC transplantation in the acute (24 hours) and chronic (30 days) phases. CCL5, CXCL9, and CXCL10 serum levels did not change in response to injury or to MSC transplantation after injury, in both acute and chronic phases (Figure 3). CCL2, CCL3, CCL11, CXCL1, and G-CSF serum levels increased 24 hours after injury in nontreated animals (Figure 3(a)) whereas only CCL2 and CCL11 returned to control levels after 30 days, even without MSC transplantation (Figure 3(b)). GM-CSF level was lower 24 hours after injury when compared to serum levels from control animals (Figure 3(a)), and was undetected after 30 days (Figure 3(b)). MSC transplantation decreased serum levels of CCL2, CCL11, CXCL1, CXCL5, CXCL9, CXCL2, and GM-CSF to normal, or even below normal values, 24 hours after injury. On the other hand, analysis of serum of animals that received MSCs 30 days after injury and transplantation showed that the levels of CCL2, CCL11, and CXCL1 were higher than the levels found in normal animals serum (Figure 3). 3.3. MSC-Conditioned Medium Stimulates Proliferation of Neural Stem Cells and Modulates Gene Expression In Vitro. Many reports describe that soluble factors secreted at brain injury sites, including chemokines and cytokines, induce neural stem cells to migrate towards the injury site [36–38]. A recent study from our laboratory (unpublished data) showed that peptides analogous to the chemokine CXCL12, known to chemoattract cells that express the receptor CXCR4 such as lymphocytes, progenitor cells, hematopoietic, neural, and embryonic cells [39], stimulated chemotaxis of neuroblasts towards a cortex injury site, and modulated gene expression in vivo. Nevertheless, the hostile environment created by the inflammatory mediators secreted by glial and immune cells that infiltrate the injured brain reduces the survival of the migrating neuroblasts. The in vivo effects of MSC immunomodulation that we observed in the TBI model lead us to ask whether MSC secrete factors that could modulate neural stem cells survival, proliferation, and differentiation. In vitro treatment of neural stem cells derived from adult mice SVZ, cultured as neurospheres, with MSC-conditioned medium (MSC-CM) resulted in increased proliferation (Figure 4(a)) without affecting survival of the cells (Figure 4(b)). Neurology Research International 5 ∗∗∗ ∗∗∗ ∗∗∗ ∗∗∗ 1450 12500 2500 1100 350 ∗∗∗ ∗∗∗ ∗∗∗ ∗∗∗ 50 20 (pg/mL) (pg/mL) 650 750 20 ∗∗∗ ∗∗∗ ∗∗∗ ∗∗∗ 10 10 0 0 IL-1β IL-5 IL-6 IL-17 TNF-α IL-4 IL-10 Control Control Injury of treatment Injury of treatment MSC treatment MSC treatment (a) (b) Figure 2: Cytokine profile in serum in TBI acute phase. Serum from mice submitted to the TBI protocol was used to investigate for cytokines content. Mice were transplanted (MSC treated) or not (injury not treated) with MSC immediately after the injury and blood was collected after 24 hours. (a) Pro-inflammatory cytokines and (b) anti-inflammatory cytokines (control n = 3, injury no treatment n = 6, MSC treated n = 4). ∗∗∗ P < .001, ∗∗ P < .01. Soluble factors present in MSC-CM changed neural stem cell gene expression, inducing upregulation of GFAP, a marker of astrocytes intermediate filaments, and downregulation of nestin, a marker of immature cells (Figure 5). The expression levels of GAP43, an axonal growth marker, and SOX2, a neural stemness marker, did not change (Figure 5). 4. Discussion Recently, the immunomodulatory properties of MSC have been investigated in a number of pathological situations. Despite MSC multipotency and self-renewing characteristics, studies suggest that the tissue regenerative potential exerted by these cells are not due to transdifferentiation and substitution of dead cells, but is due to the secretion of soluble factors which stimulate local progenitor cells to survive, proliferate, and differentiate [40, 41]. Several studies have demonstrated this effect in different pathologies, such as acute kidney injury [42], chronic renal failure [43], renal fibrosis [44], myocardium infarction [45], asthma [46], multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis [47], and brain ischemia [48]. In the present study, we used a murine TBI model performed in the motor cortex of mice. Our results show that 24 hours after the injury there is a significant increase in the expression of the proinflammatory cytokines IL-6, and TNF-α in the injury site (Figure 1). The increase in pro- and anti-inflammatory mediators, such as IL-6, and IL-10, have been described in cerebrospinal fluid as well as in serum of patients with severe TBI [49]. In the model we used, MSC transplantation significantly decreased the expression of IL-6, and similar results were observed regarding the anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-4, both locally and in serum (Figures 1 and 2). IL-6 is a pleiotropic cytokine, involved in several pathological situations and can play pro- or anti-inflammatory effects depending on the microenvironment [50]. Our results show that there was an increase in IL-6 expression at the injury site and also in serum (Figure 2). IL-6 is secreted mainly by microglia and astrocytes, and its neuroprotector role is characterized by TNF-α inhibition and NGF stimulation. IL-6 also promotes tissue revascularization and tissue scar formation [4]. Our results show increased IL-6 levels 30 days after injury and MSC transplantation, contrary to its decrease in the acute phase of the injury (24 hours after injury). These results suggest the immunomodulatory property of MSC in the TBI model where in a hostile environment in the acute period, when IL-6 is deleterious to the tissue, MSC downregulates IL-6, while after a few days, MSC upregulates IL-6, in a period when this chemokine would become beneficial to a possible tissue regeneration. Besides the alterations in cytokines expressions in the site of injury, MSC transplantation also influenced the levels of chemokines systemically, both in the acute (24 hours) 6 Neurology Research International 5000 (pg/mL) 3000 ∗ ∗∗∗ ∗∗∗ 1000 600 350 100 90 60 30 0 ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ CCL2 CCL3 CCL5 CCL11 CXCL1 CXCL2 CXCL5 CXCL9 CXCL10 G-CSF GM-CSF (a) ∗ ∗ 5000 (pg/mL) 3000 ∗ 1000 ∗ 150 ∗∗ ∗∗ 100 50 0 CCL2 CCL3 CCL5 CCL11 CXCL1 CXCL2 CXCL5 CXCL9 CXCL10 G-CSF GM-CSF Control Injury no treatment MSC treated (b) Figure 3: Chemokine profile in serum in TBI acute and chronic phase. Serum from mice submitted to the TBI protocol was used to investigate for cytokines content. Mice were transplanted (MSC treated) or not (injury not treated) with MSC immediately after the injury and blood was collected after 24 hours (acute phase) (a) or 30 days (chronic phase) (b). (control n = 3, injury no treatment n = 6, MSC treated n = 4). ∗ P < .005, ∗∗∗ P < .001. and chronic (30 days) phases of TBI (Figure 3). It has been described that administration of IL-1β to the brain induces hepatic CXC and CCL chemokine synthesis, which correlates to elevation of circulating leukocytes in the blood [51]. CNS injury involves glial activation, leukocytes recruitment, increase in the expression, and secretion of inflammatory mediators as cytokines, and chemokines [6]. Recent studies have described molecular signals regulating NSC migration in the injured brain, including angiogenic factors, chemokines, cytokines and extracellular matrix components [52]. Brain injury induces proliferation of NSC in the SVZ and migration of neuroblasts from the SVZ towards the site of the insult [53]. Nevertheless few neuroblasts arrive at the injury site and survive to the injury microenvironment [12]. Our aim was to verify if the immunomodulatory properties observed in the in vivo experiments by the secretion of soluble factors by MSC could have any direct effect on NSC survival, proliferation, and/or differentiation. In our experiments, exposing NSC to soluble factors present in MSC-CM did not influence NSC apoptosis (data not shown) and survival, but increased proliferation, indicating that the factors secreted by MSC may contribute to enhancing the number of NSC without affecting survival (Figure 4). On the other hand, MSC-CM soluble factors modulated NSC gene expression, upregulating GFAP expression, downregulation of nestin, and no alterations in GAP43 and SOX2 expression (Figure 5). SOX2 is a transcription factor expressed by NSC present in neurogenic niches and maintains pluripotency or stemness state [54]. Constitutive expression of SOX2 inhibits neuronal differentiation, so this could explain nestin downregulation. 5. Conclusion In this study we observed that MSC are able to modulate the inflammatory response in an acute TBI model by changing the expression of pro- and anti-inflammatory cytokines, along with modulation of serum levels of several chemokines. In addition, MSC secreted soluble factors are capable of stimulating proliferation of NSC in vitro, as well as increasing the expression of GFAP, a gene related to mature astrocytes, indicating that factors expressed by MSC could induce differentiation of NSC in vivo. Altogether these results indicate that there are still open possibilities of new regeneration therapies to treat nervous tissue injuries, highlighting Neurology Research International 7 ∗∗∗ 40 0.35 0.3 0.25 Abs (540 nm) BrdU + cells (%) 30 20 0.2 0.15 0.1 10 0.05 0 0 Control Control MSC-CM (a) MSC-CM (b) Figure 4: MSC secreted factors stimulate adult NSC proliferation. (a) Survival of NSC measured by MTT assay. (b) Proliferation of NSC measured by BrdU incorporation using flow cytometry. Data are mean ± SEM of two independent experiments performed in triplicates. ∗∗∗ P < .001. 60 to T. R. M. Filippo, C. B. Ariza, L. T. Galindo, C. M. Moreira); and CNPq (Research Fellowship and Research Grant (573909/2008-3) to M. A. Porcionatto). ∗∗∗ Relative expression 50 40 Conflict of Interests 30 3 The authors declare that they have no conflicts of interest. 2 ∗ References 1 0 GFAP Nestin GAP43 SOX2 Control MSC-CM Figure 5: MSC secreted factors upregulate GFAP expression by adult NSC. RNA was extracted from neurospheres cultured in control medium or MSC-CM, and qPCR was performed to evaluate the expression of GFAP, nestin, GAP43, and SOX2. Relative expression was calculated in relation to GAPDH. Data expressed as mean of 2−ΔΔCt ± SEM of triplicates. ∗ P < .05, ∗∗∗ P < .0001. the importance of immunomodulatory properties of MSC and its potential to allow NSC survival and proliferation. Funding This paper was supported by FAPESP (Research Grant to M. A. Porcionatto (2008/07570-9); Grad Student’s Fellowships [1] S. M. Allan and N. J. Rothwell, “Inflammation in central nervous system injury,” Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, vol. 358, no. 1438, pp. 1669–1677, 2003. [2] A. A. 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