Ruth Milagros Vásquez Delgado Lins
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS – UEA FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS - FMTAM MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS SOROPREVALÊNCIA DO HTLV-I/II EM COMUNIDADES INDÍGENAS DO ESTADO DO AMAZONAS RUTH MILAGROS VÁSQUEZ DELGADO LINS MANAUS 2004 RUTH MILAGROS VASQUEZ DELGADO LINS SOROPREVALÊNCIA DO HTLV-I/II EM COMUNIDADES INDÍGENAS DO ESTADO DO AMAZONAS Dissertação apresentado Programa de Pós Graduação da Universidade do Estado do Amazonas, para obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira Co-orientador: Prof. Dr. Wornei Silva Miranda Braga MANAUS 2004 ii ”... Dê ao mundo o melhor de você, mas isto pode nunca ser o bastante. Dê o melhor assim mesmo.” Madre Teresa de Calcutá iii A MEUS PAIS, Felicindo Vasquez, Pai e amigo In Memorian e Isabel Vasquez, mãe amada cujos ensinamentos jamais me deixaram desistir de meus ideais. AO AFRÂNIO, Por suas constantes demonstrações de carinho que de modo peculiar me incentivaram a concretizar este trabalho. A CELESTE MARIA E RODRIGO, Meus filhos amados, que foram tão amorosos e compreensivos nos momentos de ausência. iv AGRADECIMENTOS A DEUS, por todas as bênçãos, capacitação e perseverança para atingir minhas metas, colocando sempre em meu caminho pessoas que tornam mais leve meu fardo. A Universidade do Estado do Amazonas e a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, pela criação do Curso de Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas. A Superintendência da Zona Franca de Manaus através do convênio 035/2002. Ao meu orientador Prof. Dr. Luiz Carlos de Lima Ferreira, que em meio aos seus numerosos afazeres, sempre se dispôs a me ensinar a fazer pesquisa enfatizando o compromisso com a verdade e o respeito mútuo. Ao Prof. Dr. Wornei Silva Miranda Braga, por gentilmente nos ceder as amostras de soros por ele coletadas nas oito etnias estudadas, juntamente com o banco de dados, contribuindo para o sucesso desta pesquisa. Ao Dr. Marcus Vinícius Guimarães de Lacerda por nos fornecer as amostras de soro, por ele coletadas na etnia Zu hu A há, em 2000. Ao Dr. José de Ribamar Araújo, pela amizade e pelo apoio que sempre me premiou, sendo para mim um grande exemplo de solidariedade e determinação constantes. A Dra. Maria das Graças do Vale Barbosa, Coordenadora do Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas. Ao meu sobrinho Felicien Gonçalves Vásquez, pela assessoria e elaboração dos gráficos que compõem este trabalho, excelente estatístico que é. À cara colega Dra. Kátia Torres (Fundação HEMOAM), pela generosa receptividade quando buscamos sua colaboração e por nos ceder o uso dos aparelhos e alguns testes para a concretização deste trabalho. As colegas do Laboratório de Sorologia (Fundação HEMOAM), nas pessoas de suas funcionárias Dra. Márcia Poinho, Dra. Cristianne Melo, Dra. Lorena Vásquez v e a Técnica de Laboratório Neisiane, pelos valiosos préstimos no desenvolver desta pesquisa. Às queridas amigas Mônica Costa Manso e Ana Ruth Arcanjo, da FMTAM, que inúmeras vezes e sempre com boa vontade, interromperam seus afazeres para contribuir na elaboração deste trabalho. A bibliotecária da FMTAM, Sra. Artemisa Seabra da Silva pelo auxílio na aquisição das referências bibliográficas. Aos caros colegas da primeira turma do Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas, pela amizade de cada um e estímulo constante, desde o início. As amigas Marinalva Rocha e Sirene Brandão, pelos valiosos préstimos no desenvolver deste trabalho e paciência infinita sempre que das mesmas precisamos. vi RESUMO Os vírus humanos linfotrópicos de células T classificados em tipo I (HTLV-I) e tipo II (HTLV-II), são caracterizados como retrovírus do tipo C. O HTLV-I está associado à Leucemia-Linfoma de células T do Adulto (LLTA), a uma doença neurológica a Paraparesia Espástica Tropical - Mielopatia associada ao HTLV (TSPHAM), uveíte associada ao HTLV (HAU) e a anormalidades dermatológicas. A associação do HTLV-II com patologias ainda não está estabelecida. No presente trabalho procurou-se avaliar a soroprevalência do HTLV- I/II em amostras de soro de indígenas pertencentes a as etnias Apurinã, Deni, Jamamadi, Kanamari, Kulina, Mura-Pirahã e Zuhu-A´há, do sul do estado do Amazonas, colhidas para estudos prévios nos anos de 1993 e 2000. Foram incluídos 399 participantes, de ambos os sexos e idades variadas. Todas as amostras foram submetidas ao teste de sorológico de triagem ELISA. Os casos positivos foram submetidos ao método confirmatório Western blot. Dentre as 399 amostras de soro incluídas neste trabalho, três (0,75%) tiveram resultados positivos no ELISA. Estas três amostras foram submetidas ao teste Western blot, com dois resultados negativos e um (0,25%) indeterminado apresentando a banda GD21 sozinha, pertencente à etnia Apurinã localizada no município de Eirunepé. Estes resultados sugerem que a freqüência da infecção pelo HTLV- I/II em populações do sul do estado do Amazonas é nula ou muito baixa, e inferior a observada em populações indígenas do estado do Pará e do restante do território brasileiro. Palavras-chaves: sorológico. HTLV-I/II, HTLV em populações indígenas, Diagnóstico vii ABSTRACT The human T Lynphotropic Virus is classified in type I (HTLV- I) and type II (HTLV-II), they are distinguished like retrovirus of type C. HTLV- I associated to the adult T- cell leukemia- lynphoma (LLTA), to a neurologic diseases, HTLV-I associated myelopathy/ tropical spastic paraparesis (HAM/TSP), uveitis associated with human T- lynphotropic virus type I (HAU) and the dermatologyc infections. The association of HTLV- II with patology still not stablished yet. In this research was studied the serum prevailing of HTLV- I/II in blood samples of indigenous that belongs to the ethnic Apurinã, Deni, Jamamadi, Kanamari, Kulina, Mura-pirahã and Zuhu-A’ há of south Amazon state, catch for studies in the 1993 and 2000. Was include 399 individuals, man, woman of different ages. All the blood samples was submitting to the serological assay ELISA. The positive case was confirmed to western blot test. Between the 399 pieces of serum include in this study, tree (75%) was positive to the ELISA. This tree ones was submitting to western blot test, with two negative results and one (0,25%) indeterminate showing the pattern GD21, that belongs to ethnic Apurinã of Eirunepé. This results suggest that the frequency of the infection by HTLV-I/II in the population of south Amazon state is none or low, and lower than the indigenous population of the Pará state and the rest of the brasilian territory. Key words: HTLV-I/II, HTLV indigenous populations, serological diagnosis. viii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CDC Control Disease Center DNA Ácido Desoxiribonucléico DIH Dermatite Infecciosa Associada ao HTLV-I ELISA Enzyme linked immunosorbent assay FUNAI Fundação Nacional do Índio FHEMOAM Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas FMTIMT Fundação de Medicina Tropical do Amazonas HTLV-I Vírus Linfotrópico de Células T Humanas do tipo I HTLV-II Vírus linfotrópico de Células T Humanas do tipo II IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística LLTA Leucemia-Linfoma de células T do adulto PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ácido Ribonucléico TSP/HAM Paraparesia espástica tropical/Mielopatia associada ao HTLV Wb Western blot ix LISTA DE FIGURAS Figura 01 Representação esquemática das principais estruturas do vírus HTLV ... 04 Figura 02 Fotografia por microscopia eletrônica do vírus HTLV infectando a célula ...................................................................................................... 04 Figura 03 Representação das cinco maiores aglomerações de indivíduos Infectados com HTLV no mundo ............................................................. 06 Figura 04 Prevalência de HTLV I/II reportadas no Brasil de 1989 a 1996 .............. 07 Figura 05 Coleta de sangue e exame físico ........................................................... 22 Figura 06 Placa para realização do teste ELISA, amostras positivas apresentam coloração amarela e amostras negativas coloração rosa ...................... 25 Figura 07 Incubadora automática com contagem de tempo, para placas de ELISA (FHEMOAM) ................................................................................ 25 Figura 08 Lavadora automática para placas de ELISA (FHEMOAM) .................... 26 Figura 09 Western blot: representação das bandas que caracterizam o teste ...... 29 Figura 10 Aparelho automatizado para realização do Western blot 2.4. Laboratório de Sorologia da FHEMOAM ................................................ 30 Figura 11 Distribuição da faixa etária da população indígena das 08 etnias estudadas ............................................................................................... 32 Figura 12 Distribuição dos 324 indígenas que responderam o questionário em relação a ter parceiros ............................................................................ 32 Figura 13 Distribuição geográfica das comunidades indígenas estudadas ............ 35 Figura 14 Resultado do Teste Western blot ........................................................... 36 x LISTA DE TABELAS Tabela 1 Distribuição da freqüência por sexo na população estudada ............ 31 Tabela 2 Distribuição da faixa etária da população indígena das 08 etnias estudadas .......................................................................................... 31 Tabela 3 Distribuição da freqüência da população indígena das 08 etnias estudadas .......................................................................................... 33 Tabela 4 Distribuição da Média de idade da população indígena estuda em relação às etnias ................................................................................ 33 Tabela 5 Distribuição das aldeias indígenas nas 08 etnias estudadas ............ 34 xi SUMÁRIO INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 01 1. VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS (HTLV) .................................. 01 1.1 HISTÓRICO .................................................................................................... 01 1.2 CARACTERÍSTICAS DO AGENTE ETIOLÓGICO .......................................... 01 1.3 EPIDEMIOLOGIA ............................................................................................ 05 1.4 PREVALÊNCIA DO HTLV-I EM COMUNIDADES INDÍGENAS ...................... 07 1.5 TRANSMISSÃO .............................................................................................. 09 1.6 PATOGENIA ................................................................................................... 10 1.7 DOENÇAS ASSOCIADAS À INFECÇÃO PELO VÍRUS HTLV-I ..................... 1.7.1 DOENÇAS HEMATOLÓGICAS ............................................................. 1.7.1.1 Leucemia-Linfoma de Células T do Adulto (LLTA) .................... 1.7.2 DOENÇAS NEUROLÓGICAS ............................................................... 1.7.2.1 Mielopatia Associada ao HTLV-I – Paraparesia Espástica Tropical (TSP/HAM) ................................................................. 1.7.3 UVEÍTE ASSOCIADA AO HTLV (HAU) ................................................. 1.7.4 MANIFESTAÇÕES DERMATOLÓGICAS ............................................. 11 11 11 12 1.8 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL ................................................................... 1.8.1 REAÇÕES DE TRIAGEM ...................................................................... 1.8.2 REAÇÕES CONFIRMATÓRIAS OU SUPLEMENTARES ..................... 1.8.3 REAÇÕES MOLECULARES ................................................................. 15 16 16 17 12 13 14 2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 18 2.1 GERAL ............................................................................................................ 18 2.2 ESPECÍFICOS ................................................................................................ 18 3. METODOLOGIA ......................................................................................................... 19 3.1 MODELO DE ESTUDO ................................................................................... 19 3.2 UNIVERSO DE ESTUDO ................................................................................ 19 3.2.1 POPULAÇÃO DE REFERÊNCIA ........................................................... 19 3.2.2 POPULAÇÃO DE ESTUDO ................................................................... 19 3.3 PROCEDIMENTOS ......................................................................................... 3.3.1 SELEÇÃO DOS INDIVÍDUOS A SEREM INCLUÍDOS NO ESTUDO ... 3.3.2 INSTRUMENTOS .................................................................................. 3.3.3 COLETA DAS AMOSTRAS ................................................................... 3.3.4 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS ................................................. 20 20 20 21 21 3.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO ............................................................................ 22 3.5 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO ........................................................................... 22 xii 3.6 REALIZAÇÃO DAS SOROLOGIAS ................................................................. 3.6.1 DESCRIÇÃO DO MÉTODO ELISA ....................................................... 3.6.1.1 Componentes do Kit .............................................................. 3.6.1.2 Procedimento do Ensaio ....................................................... 3.6.1.3 Cálculo dos Resultados ......................................................... 3.6.1.4 Interpretação dos Resultados ................................................ 3.6.2 DESCRIÇÃO DO MÉTODO WESTERN BLOT ..................................... 3.6.2.1 Componentes do Kit .............................................................. 3.6.2.2 Procedimentos de Ensaio Kit HTLV blot 2.4 ....................... 3.6.2.3 Interpretação dos Resultados ................................................ 22 22 23 23 24 24 26 26 27 28 3.7 METODOLOGIA ESTATÍSTICA ...................................................................... 30 4. RESULTADOS ........................................................................................................... 31 4.1 ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO ......................................................................... 4.1.1 SEXO E FAIXA ETÁRIA ........................................................................ 4.1.2 PARTICIPANTES COM PARCEIROS ................................................... 4.1.3 ETNIAS ESTUDADAS ........................................................................... 4.1.4 MÉDIA DE IDADE EM RELAÇÃO A ETNIA .......................................... 4.1.5 ALDEIAS ESTUDADAS ......................................................................... 4.1.5 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DA POPULAÇÃO ESTUDADA ........... 4.1.7 TESTES SOROLÓGICOS ..................................................................... 4.1.7.1 Elisa .......................................................................................... 4.1.7.2 Western Blot ………………………………………………............ 31 31 32 33 33 34 35 36 36 36 5. DISCUSSÃO ……………………………………………………………………………….. 37 6. CONCLUSÃO ............................................................................................................. 42 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................... 43 8. OBRAS CONSULTADAS ........................................................................................... 50 9. ANEXOS ..................................................................................................................... 52 INTRODUÇÃO 1. VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANAS (HTLV) 1.1 HISTÓRICO Os retrovírus foram inicialmente descritos em 1908 quando Elerman e Bang afirmaram que um agente biológico era capaz de causar transformações malignas, fato este observado quando ao injetar infiltrado celular obtido de tecido leucêmico de pássaros em galinhas, conseguiram produzir leucemia nas mesmas. Posteriormente, Rous em 1911, relatou que esses vírus apresentavam capacidade de causar sarcoma em pintos, ficando então conhecido como sarcoma de Rous. A certeza da transmissão horizontal dos referidos retrovírus deu-se em 1964, quando Jarret et al., conseguiram isolá-los de células leucêmicas de gatos. Independentemente, Temin et al. (1970), comunicaram o descobrimento da enzima denominada transcriptase reversa, em vírus tumorais RNA. A importância desse descobrimento reside no fato de que novas pesquisas tiveram êxito ao se conhecer melhor o mecanismo de replicação viral, após a entrada do vírus na célula, a transcriptase reversa copia o genoma do vírus para DNA (acido desoxirribonucléico), que é integrado no genoma da célula do hospedeiro, formando o provírus que por sua vez é usado como modelo para a síntese do RNA viral que será incorporado nas novas partículas virais em formação. Reportado posteriormente na literatura por Gallo et al., (1970), denominado atualmente como vírus linfotrópico de células T humanas tipo I, conhecido pela sigla em inglês HTLV-I (Human T-linfotropic virus-I), pertencente à família Retroviridae e representante da sub-família Oncovirinae. Em 1976, Morgan et al., desenvolveram técnicas para o cultivo de células T através do fator de crescimento para células do tipo T, hoje conhecido como interleucina- 2, sendo possível detectar pequenas quantidades do vírus permitindo a caracterização da família Retroviridae. A partir desses achados seguiu-se uma longa busca por retrovírus humanos, o primeiro a ser isolado em 1980 por Poiesz et al., a partir de uma linhagem de células linfoblastóides, obtida de um paciente com linfoma cutâneo de células T, nos Estados Unidos (EUA), sendo denominado retrovírus tipo C. 2 No Japão outro retrovírus foi isolado em 1977 de um paciente com diagnóstico de leucemia-linfoma de células T do adulto (LLTA), por Takatsuki et al., anos depois demonstrou-se que o HTLV-I e o vírus da leucêmia-linfoma de células T assemelhavam-se e apresentavam a mesma sequência de nucleotídeos, sendo comum a sua associação etiológica, comprovada mediante a presença de anticorpos para o HTLV-I em pacientes com LLTA. Foi observada grande homologia na seqüência entre diferentes subtipos de HTLV-I isolados, mesmo quando detectados em regiões geográficas diferentes. São subtipos do HTLV-I: o cosmopolita (Japão, Caribe, norte da África, e América do Sul), o africano (Zaire) e o melanésio, considerado o mais divergente de todos (SOARES et al., 2001). Após o isolamento do HTLV-I, um segundo retrovírus, o vírus humano linfotrópico de células T tipo II (HTLV-II), foi isolado das células de um paciente com o diagnóstico de leucêmia de células pilosas, mas sua associação com condições patológicas, ainda não está suficientemente esclarecida. (KALAYNARAMAN et al., 1982). Métodos de cultivo in vitro e a caracterização biológica e molecular desses vírus evidenciaram dois agentes relacionados, porém distintos, que passaram a ser denominados HTLV-I e HTLV-II, com tropismo para linfócitos T, CD4+ e CD8+. Existem quatro subtipos moleculares do HTLV-II, formando quatro grupos filogenéticos separados HTLV-IIa, HTLV-IIb, HTLV-IIc e HTLV-IId. Não existem evidências associando qualquer dos subtipos com propriedades patogênicas no hospedeiro humano infectado (SOARES et al., 2001). O subtipo HTLV-IIc é o mais freqüentemente encontrado no Brasil (ISHAK et al., 2003). 1.2 CARACTERÍSTICAS DO AGENTE ETIOLÓGICO O HTLV-I é constituido de um genoma de ácido ribonucléico (RNA), de fita dupla (contendo 9 quilobases), que se replica por meio de um DNA complementar, através de uma enzima viral denominada transcriptase reversa, mecanismo este que lhe confere capacidade para induzir infecção e doenças latentes crônicas durante toda a vida, este vírus apresenta particularmente tropismo celular por células T CD4+. (TANGY et al., 1996; SEGURADO et al., 2000 ). A estrutura da partícula viral (Fig.1) e o ciclo replicativo do HTLV-I, são comuns aos demais retrovírus, apresenta genes regulatórios e funcionais localizados 3 no pró-vírus ( gag,pol,env,px,tax e rex), que codificam peptídeos que se expressam nas células infectadas, onde anticorpos do hospedeiro contra tais peptídeos, constituem a base do teste sorológico imunoenzimático de triagem ELISA (CDCCenter for Disease Control, 1993). O genoma proviral é constituído de: • env - codifica as glicoproteínas externas do envelope (a precursora gp61-68 e sua derivada gp46) e a proteína transmembrana (gp21); • pol - codifica as enzimas transcriptase reversa (p99), RNase, endonuclease e protease; • gag - codifica as proteínas do core viral (a precursora p52 e suas derivadas p15, p19 e p24); • tax - codifica a proteína p40tax, transativadora do segmento LTR viral e de genes da célula eucariótica infectada; • rex - codifica a proteína p27rex, reguladora pós – transcricional da síntese de proteínas estruturais do vírus; • segmento LTR - presente nas extremidades do genoma proviral, contém as regiões reguladoras da transcrição viral; • genes de função ainda pouco conhecidas, rof e tof. Os genes acima enumerados provocam resposta humoral específica do hospedeiro infectado, que leva à produção de anticorpos voltados a diferentes constituintes antigênicos virais, os quais podem ser pesquisados por meio de técnicas de diagnóstico sorológico (PROIETTI et al., 2001). Após a entrada do vírus na célula (Fig. 4), seu genoma é copiado para DNA (ácido desoxirribonucléico) pela enzima transcriptase reversa, e é integrado no genoma celular, formando o provírus. A síntese do RNA viral é feita por enzimas celulares, usando o pro-vírus integrado como modelo. O RNA é então processado para formar as proteínas virais e também o RNA que será introduzido nas novas partículas virais em formação (SOARES, et al., 2001). 4 Figura 1. Representação esquemática das principais estruturas do vírus HTLV Fonte: Adaptado de Gallo (1986) Figura 2. Fotografia por microscopia eletrônica do vírus HTLV infectando a célula. Fonte: <http://www.htlv.com> 5 1.3 EPIDEMIOLOGIA Os agrupamentos geográficos (Fig. 3) foram inicialmente documentados no sul do Japão, anticorpos contra o HTLV-I tem sido detectados em 1 a 2 milhões de pessoas e mais de 700 casos de LLTA, são diagnosticados a cada ano, mais da metade dos casos são do distrito de Kyushu (8%). O HTLV-I é endêmico em ilhas situadas no sudeste do Japão, onde cerca de 20% da população adulta é soropositiva (YAMAGUCHI et al., 1994). Muitas infecções em residentes do Norte do Japão são oriundas de migrantes das regiões do Sul do Japão e de diversas ilhas do Caribe, em negros de Trinidad e Tobago (BARTHOLOMEW et al., 1990), em Barbados e 5% e na Jamaica (WATTEL et al., 1985). O HTLV está presente na América Central e do Sul e em regiões da África, (DELAPORTE et al., 1988). Na Melanésia há uma soroprevalência elevada, destacando-se a região de Papua-Nova Guiné, no Médio Oriente, no Ártico e ilhas do oceano Índico e do Pacífico Sul (YANAGIHARA et al., 1990). No Brasil, o HTLV foi detectado em todas as regiões estudadas (Fig.2), testes de triagem de doadores de sangue e estudos conduzidos em populações indígenas, usuários de drogas intravenosas e gestantes, constituem as principais fontes de informação sobre essas viroses em nosso país, que possui o maior número absoluto de indivíduos soropositivos para HTLV-I, dentre todos os países aproximadamente 2,5 milhões de pessoas, para uma população de cerca de 150 milhões de habitantes, destacando-se maior prevalência nos estados da Bahia, Pernambuco e Pará (PROIETTI, et al., 2002). Durante o ano de 1995, 35 amostras soropositivas de doadores de sangue do Centro de Hematologia e Hemoterapia do Pará, foram testadas pelos métodos de ELISA e Western blot, resultando em 10 (28,6%) amostras positivas para o HTLV-I e 2 (5,7%) positivas para o HTLV-II, estas através da PCR foram classificadas como HTLV- IIa e três (8,6%) foram indeterminadas (ISHAK et al., 1998). A prevalência do HTLV-I, aumenta com a idade, na infância a soropositividade para o HTLV-I é muito baixa e aumenta a partir da adolescência e início da idade adulta, nas mulheres observa-se um aumento acentuado que continua após os 40 anos de idade em relação aos homens que normalmente atinge um platô após os 40 anos (PROIETTI, 2002). As explicações mais prováveis para essa situação, são que a infecção latente poderia sofrer reativação ao longo da vida, aumento progressivo no título de 6 anticorpos em pessoas infectadas a mais tempo, que a transmissão sexual seja mais eficiente do homem para a mulher e que as transfusões sanguíneas são mais freqüentes em mulheres. (BLAYNEY et al., 1983). Principalmente em pessoas com ancestrais de regiões endêmicas, ou mesmo imigrantes dessas regiões que apresentam taxas elevadas de soropositividade, como por exemplo os nascidos em Okinawa que migraram para o Hawaii e Brasil, segundo Veronesi et al., (1995) e para o Peru segundo Gotuzzo et al., (1994) e aqueles nascidos no Caribe que migraram para os EUA (BLATTNER et al., 1982). ÁFRICA BRASIL CARIBE JAPÃO MELANÉSIA Figura 3. Representação das cinco maiores aglomerações de indivíduos Infectados com HTLV no mundo 7 Figura 4. Prevalência de HTLV I/II reportadas no Brasil de 1989 a 1996 Fonte: PROIETTI et al., 2002 1.4 PREVALÊNCIA DO HTLV-I EM COMUNIDADES INDÍGENAS No Brasil vivem cerca de 345 mil índios, distribuídos entre 215 sociedades indígenas, que perfazem cerca de 0,2% da população brasileira, este dado refere-se a indígenas que vivem em aldeias. Havendo uma estimativa de 100 a 190 mil que 8 vivem fora de terras indígenas, inclusive em áreas urbanas. No Estado do Amazonas estima-se que haja 83.966 indígenas, segundo informes da FUNAI (Fundação Nacional do Índio). Sabe-se que 53 grupos ainda não foram contactados e alguns grupos estão requerendo o reconhecimento de sua condição indígena junto ao órgão Federal indigenista, segundo IBGE, 2004. Conforme o “estatuto” do índio (Lei 6001, de 19.12.1973), um grupo de pessoas pode ser considerado indígena ou não se estas pessoas se considerarem indígenas ou se assim forem consideradas pela população que as cerca ( FUNAI, 2004). O HTLV-I/II é endêmico em áreas geográficas distintas, sendo os níveis de infecção do HTLV-II comum em populações indígenas das Américas Central e do Sul, inclusive do Brasil (ISHAK et al., 2003). A infecção pelo HTLV-II, considerada menos patogênica, é endêmica em diversas comunidades indígenas da Amazônia, com soroprevalência distinta em relação às regiões descritas em alguns trabalhos que envolvem o Estado do Pará, onde apresenta maior prevalência (ISHAK et al., 1995; MALONEY et al., 1992; VALLINOTO et al., 2002). Segundo pesquisa realizada por Maloney et al., (1992), através de testes sorológicos e moleculares, a distribuição da soroprevalência entre 13 tribos da America Central e do Sul (Brasil, Venezuela, Costa Rica e Guiana) foi nula em 10/13 das etnias estudadas em índios americanos no período entre 1966 a 1984. Em estudo retrospectivo realizado no Estado do Pará, Nakauchi et al., (1990), analisaram 137 amostras de soros de índios das comunidades Tiriyo e Mekranoite, sendo positivas pelo método ELISA 39% e 20% respectivamente, um caso foi positivo para HTLV-I, confirmado através da técnica de western blot. Em Belém no estado do Pará foi detectada a presença do HTLV-II a na etnia Kayapo, Munduruku, Arara do Laranjal e Tyrio. Na etnia Kayapo a soroprevalência tende a aumentar com a idade com evidências moleculares da transmissão vertical do HTLV-IIa (ISHAK et al., 1995). Testes sorológicos e moleculares realizados em amostras de sangue de indígenas da aldeia Kararao (Kayapo), forneceram evidências da transmissão intrafamilial e vertical do HTLV-IIc, detectou-se reatividade específica em 3/26 indivíduos, dos quais duas amostras eram de uma mãe e de seu filho, provavelmente a amamentação seria um mecanismo de transmissão que em grande 9 parte é responsável pela endemicidade do HTLV nessas populações (ISHAK et al., 2001). Em 591 amostras de soro coletadas nos anos de 1985 e 1988 de indígenas de quatro etnias da região amazônica, foi encontrada soroprevalência na taxa de 0,0% para o HTLV-I, 28 amostras foram positivas para o HTLV-II (4,7%) e cinco para o HTLVI/II (0,8%) (GABBAI et al., 1993). A infecção pelo HTLV-II é considerada endêmica em outras populações indígenas da América do norte, central e do sul, em pesquisa realizada por Fujiyoshi et al, 1999, foi encontrada as seguintes prevalências para o HTLV-I, em indígenas de várias etnias e paises: Aymara (Peru) 1,6%, Aymara (Bolívia) 5,3%, Quechua (Bolívia) 4,5%, Puna (Argentina) 2,3% e Atacama 4,1%. Resultados encontrados para o HTLV-II: Kayapó (Brasil) 57,9%, Chaco (Paraguay) 16,4%, Alacaf (Paraguay) 34,8% e Yahgan (Chile). Na Colômbia 29-92 (31,5%) em índios Guahibo. Na Venezuela índios Yaruro e Guahibo 61% HTLV-IIb. Na Argentina, 0,45% a 2,78% HTLV-I e 2,78% a 21,9% HTLV-II em populações indígenas (GASTALDELLO et al., 2004). A variação nas taxas de prevalência em regiões diferentes pode ser devida a desigualdades no tamanho das amostras e metodologia empregada, bem como ser conseqüente a diferença de etnias nas populações estudadas (PROIETTI et al., 2000). 1.5 TRANSMISSÃO Os mecanismos de transmissão reconhecidos para o HTLV-I, incluem a transmissão vertical, de mãe infectada para o filho, via transplacentária, durante o parto e através de linfócitos infectados presentes no leite materno, que pode representar até 15% de todas as infecções, crianças amamentadas artificialmente apresentaram uma taxa de soroconversão de 1% a 2%, enquanto que as com aleitamento materno apresentaram 20%, a transmissão intra-uterina ou transvaginal também pode ocorrer (TAKAHASHI et al., 1991). Resultados de testes Western blots seriados de crianças soroconvertidas nascidas de mães positivas para o HTLV-I mostram um padrão de presença de anticorpos maternos nos primeiros meses, geralmente desaparecendo todas as bandas por volta dos seis meses de idade, com surgimento subseqüente de novas bandas desta vez em associação com infecção nativa. Para algumas crianças foi 10 cessada a amamentação vários meses antes da soroconversão, porém infecção latente por HTLV-I não foi detectada por meio da técnica da PCR (HIRATA et al., 1992). A transmissão horizontal, ocorre através da transfusão de hemocomponentes celulares Manns et al., (1991) ou do uso comum de objetos contaminados com sangue, ou ainda por relacionamento sexual ( MURPHY et al.,1989). Em área endêmica, indivíduos soropositivos para HTLV-I, estão agrupados em famílias, o que reflete o predomínio de transmissão da mãe para o filho e também por contato sexual. Todas as pesquisas afirmam persistência da infecção por toda a vida (SOARES et al., 2001). Em estudos realizados no Japão, observou-se que a transmissão homem mulher (61%, em 10 anos) era mais comum do que mulher - homem (menor que 1 %), detectou-se a presença do HTLV-I em células mononucleares no sêmen (NIKANO et al., 1984). Devido às conseqüências, potencialmente graves da infecção por HTLV-I, o CDC - Centers of Disease Control and Prevention, recomenda às pessoas infectadas, informarem a soropositividade a seu médico, não doarem sangue e hemoderivados, sêmem ou orgãos, não compartilharem agulhas e seringas, não amamentar ou inativar o leite materno através da pasteurização ou fervura e usar preservativos para evitar a transmissão sexual. A coincidência de outra doença sexualmente transmissível com manifestação genital ulcerativa, amplia o risco de transmissão do HTLV-I (MURPHY et al.,1989). No Brasil, o comportamento epidemiológico dessa retrovirose demonstra evidências de transmissão sexual e vertical do HTLVI-II, em nativos procedentes de comunidades indígenas da Amazônia Brasileira, assim como em filhos amamentados por mães soropositivas para HTLVI-II ( ISHAK et al., 1995). 1.6 PATOGENIA A infecção inicia-se quando ocorre a interação das glicoproteínas do envelope viral com receptores localizados na membrana plasmática das células-alvo. No entanto, não se identificaram as moléculas envolvidas nessa interação, sabe-se que após a introdução do material genético viral no citoplasma da célula, ocorre a transcrição reversa do RNA viral, por meio de enzimas virais essenciais denominadas transcriptase reversa e integrase, originando a molécula de DNA viral complementar de dupla fita, que após migração para o núcleo da célula, integra-se 11 ao genoma da mesma, passando a DNA proviral, que torna-se estável fazendo a sua replicação, durante o ciclo celular (SOARES et al., 2001). 1.7 DOENÇAS ASSOCIADAS A INFECCAO PELO VÍRUS HTLV-I 1.7.1 DOENÇAS HEMATOLÓGICAS 1.7.1.1 Leucemia-Linfoma de Células T do Adulto (LLTA) A leucemia-linfoma de células T do adulto (LLTA), foi descrita por Takatsuki et al., em 1977, sendo característica sua associação etiológica com o HTLV-I confirmada pela demonstração da integração monoclonal de DNA proviral nas células leucêmicas, confirmando que a leucemia surge da transformação malígna realizada pelo vírus e seus produtos protéicos, como por exemplo a proteína tax, embora ocorra geralmente no adulto, conforme inicialmente descrito no Japão ( TAKATSUKI et al., 1985). No Caribe observou-se acometimento de indivíduos mais jovens, casos de LLTA foram descritos em pessoas de nove a 23 anos por Bittencourt, et al., (1998). Este fato reflete a importância de co-fatores ambientais distintos, os quais são responsáveis pelo desenvolvimento de LLTA, nos indivíduos portadores de HTLV-I, de várias regiões geográficas, como no Brasil onde foram diagnosticados casos de LLTA em diversas regiões estudadas (POMBO DE OLIVEIRA et al., 1990). O papel etiológico do HTLV-I, nesta patologia foi demonstrado através das seguintes evidências: presença de LLTA em região endêmica para o HTLV-I, pacientes com LLTA apresentam anticorpos para HTLV-I e a integração monoclonal do DNA proviral nas células leucêmicas dos pacientes, confirma que a LLTA surgiu da transformação maligna de uma célula previamente infectada com HTLV-I (PROIETTI et al., 2002). As formas clínicas desta doença são classificadas em quatro grupos: forma aguda, crônica, linfomatosa e smoldering, um estágio intermediário entre o portador sadio e o doente com monoclonalidade, esta forma pode evoluir para as formas crônica ou aguda variando entre 10 a 15 anos. As lesões de pele crônica resistentes a tratamento tem sido um dos sinais clínicos iniciais da LLTA, normalmente sem apresentar linfocitose e com alguns linfócitos atípicos, podendo desapercebida por vários anos (LEVINE et al., 2002; WAGNER et al., 1998). passar 12 Os linfócitos apresentam acentuado pleomorfismo celular, de tamanho médio com núcleos polilobulados, as células leucêmicas se assemelham às células de Sèzary, apresentando núcleos denteados, é possível que essas células ativadas liberem citocinas e que estas modifiquem as características patológicas dos pacientes com a doença (YAMAGUCHI , 1994). Os achados predominantes ao exame físico, no ínicio da doença, são adenomegalia (60%), hepatomegalia (26%), esplenomegalia (22%) e lesões cutâneas (39%). A hipercalcemia é freqüentemente associada à LLTA (YAMAGUCHI, 1994). A forma crônica da LLTA têm um curso clínico muitas vezes assintomático até ocorrer a progressão da doença para a forma aguda, onde se apresenta agressiva, com prognóstico reservado que não responde bem ao tratamento usado nos linfomas de alto grau de malignidade. Nos casos com lesões de pele, a fotoquimioterapia extracorpórea tem sido usada com algum benefício para a regressão das lesões, porém não evita a transformação em forma aguda posteriormente (PROIETTI et al., 2002). O tempo de sobrevida em pacientes com LLTA em formas aguda e linfomatosa varia de duas semanas a mais de um ano. Causas de morte incluem pneumonia por Pneumocystis carinii, hipercalcemia, meningite criptocócica, herpes zoster disseminado e coagulação intravascular disseminada (YAMAGUCHI, 1994). 1.7.2 DOENÇAS NEUROLÓGICAS 1.7.2.1 Mielopatia Associada ao HTLV-I - Paraparesia Espástica Tropical (TSP/HAM) O quadro clínico é de início insidioso e de caráter lentamente progressivo, com diminuição gradual da força muscular dos membros inferiores, associada a queixas sensitivas leves do tipo parestesia de membros inferiores. Com a progressão da doença podem surgir, urgência miccional, incontinência ou retenção urinária, constipação intestinal e, em adultos, diminuição da libido e da potência sexual (TAKAYANAGUI, 1996). A idade média para o aparecimento dos sintomas, ocorre predominantemente na faixa etária entre 35 e 49 anos e, atualmente existem relatos de acometimento em indíviduos cada vez mais jovens, inclusive abaixo de 10 anos de idade. O exame 13 neurológico em crianças soropositivas para HTLV-I, pode mostrar sinais iniciais, mesmo que elas não apresentem queixas neurológicas, o que pode demonstrar um futuro desenvolvimento de TSP/HAM (GESSAIN et al., 1985; SEGURADO, 2001). Os sinais de envolvimento do trato piramidal são as principais alterações semiológicas: paraparesia crural com espasticidade, exacerbação dos reflexos profundos, clônus, sinal de Babinski e outros sinais de liberação piramidal. Observase freqüentemente a presença de hiper-reflexia profunda, também nos membros superiores, associada ao sinal de Hoffman (TAKAYANAGUI,1996). Embora o envolvimento medular seja a característica mais marcante, ocasionalmente são observados envolvimentos de outras áreas do sistema nervoso como: tremor de intenção, ataxia cerebelar, hipoacusia, atrofia óptica, ptose palpebral e lesão do nervo facial, entre outros. A evolução é normalmente lenta e progressiva, com duração de muitos anos. Em torno de dez anos após a instalação da doença, aproximadamente um terço dos pacientes estão paraplégicos e confinados ao leito. O conhecimento ainda impreciso dos mecanismos fisiopatológicos, impede uma terapêutica comprovadamente eficaz (GESSAIN et al., 1992). 1.7.3 UVEÍTE ASSOCIADA AO HTLV (HAU) Termo genérico que se refere à inflamação, tanto do trato uveal quanto de outras partes do bulbo ocular, como a retina, o nervo óptico, o corpo vítreo, a córnea e a esclera podendo ocasionar a perda total da visão ( PINHEIRO et al., 1996). Os sinais clínicos e sintomas da uveíte são: dor ocular, fotofobia, embaçamento visual e hiperemia ocular. O curso clínico pode ser lentamente progressivo e persistir por longos períodos, quando não tratadas. Respondem bem ao tratamento com corticosteróides tópicos ou sistêmicos e podem apresentar recorrências se a terapia for interrompida. Estudos clínicos, soroepidemiológicos e virológicos relatam uma uveíte endógena como outra patologia associada ao HTLV-I, conhecida como HAU (uveíte associada ao HTLV-I), que pode ocorrer em portadores de doença neurológica (TSP/HAM) ou mesmo, se apresentar em portadores do vírus HTLV-I, sem comprometimento sistêmico. A HAU afeta principalmente pacientes do sexo masculino, faixa etária dos 20 aos 49 anos, e no sexo feminino ocorrem dois picos: um dos 20 aos 29 anos e outro dos 50 aos 59 anos. Embora a idade de 14 aparecimento da HAU seja geralmente após 16 anos de idade, observou-se recentemente a presença de HAU em cinco crianças de três, oito, 10 e 14 anos de idade, com quadro clínico similar ao dos adultos (PROIETTI et al., 2002). Não se sabe ao certo se a uveíte é causada diretamente pela presença do vírus no globo ocular ou se o HTLV-I seria um mediador no desencadeamento de reação autoimune. A segunda hipótese parece ser mais provável, baseada nas seguintes informações: Linfócitos T CD4 – positivos infectados com o vírus HTLV-I, produzem uma infinidade de linfocinas mediadas pela interleucina-2; a uveíte responde bem à terapia com corticosteróides, que são imunossupressores; há uma certa proporção de pacientes com hipertireoidismo associado; linfócitos infectados com o vírus foram detectados pela PCR (reação em cadeia da polimerase) na câmara anterior de olhos com uveíte (YAMAMOTO et al., 1998). O HTLV-I, na forma de provírus (genoma viral integrado no DNA celular) pode ser detectado no humor aquoso, obtido por punção ocular de portadores de HAU sugerindo que células infectadas pelo HTLV-I têm papel ativo na uveíte (MOCHIZUKI et al., 1992). 1.7.4 MANIFESTAÇÕES DERMATOLÓGICAS Manifestações cutâneas são comuns na infecção por HTLV-I e nas doenças associadas ao vírus, como infiltrados linfomatosos na LLTA, que se manifestam como pápulas persistentes e generalizadas, nódulos e placas que podem evoluir com ulceração, pode haver ainda xeroderma e ictiose associadas à MAH-PET e à dermatite infecciosa (DI), cuja transmissão parece ser materno infantil via leite materno. Há outras lesões descritas como dermatomiosite, escabiose crostosa , rash psoriasiforme e dermatite seborréica, existem também relatos de associação de micose fungóide com HTLV (ZUCKER et al., 1999) A dermatite infecciosa (DIH), foi descrita pela primeira vez na Jamaica, em 1966 e associada à infecção pelo HTLV-I em 1990, essa associação foi confirmada com a presença do genoma viral em culturas de biópsia de pele (LA GRENADE, 1996). Apresenta quadro clínico de dermatite exsudativa severa, com crostas no couro cabeludo, pescoço, orelhas, região retroauricular, inguinal e axilar. Observa-se cultura positiva para Staphylococcus aureus e Streptococcus -hemolítico em material da pele e narinas, respondendo bem à antibioticoterapia apropriada, pode 15 haver progressão para doenças mais graves associadas ao HTLV-I, como LLTA (PROIETTI et al., 2002). A DIH inicia-se após os 18 meses de idade, as lesöes säo eritematodescamantes e freqüentemente crostosas, localizando-se com mais freqüência no couro cabeludo, regiöes retroauriculares, cervical, peribucal, inguinocrural e perinasal. Podem ser vistas também fístulas, pápulas foliculares e fissuras reatroauriculares. As crinaças apresentam prurido que pode variar de leve a moderado, secreção nasal crônica e blefaroconjuntivite. O diagnóstico diferencial pode ser feito com dermatites atópica e seborréica do ponto de vista clínico. Considerando-se a elevada freqüência de DIH em Salvador, Bahia, sugere-se que seja feita de rotina a sorologia para HTLV-I, em crianças que apresentarem quadro dermatológico com czema (BITTENCOURT et al., 2001). 1.8 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL A realização do diagnóstico laboratorial da infecção pelo HTLV (Anexo C), pode ser realizado através dos seguintes testes: 1) Triagem sorológica 2) Confirmação sorológica por meio do teste Western blot para HTLVI e II 3) Confirmação da infecção pelo HTLV I e II, através da realização da PCR Todos os conjuntos de diagnóstico sorológico utilizados deverão estar obrigatoriamente registrados no Ministério da Saúde (PROIETTI et al., 2000). O diagnóstico inicial da infecção pelo vírus HTLV-I, é realizado por meio de testes sorológicos diversos que têm base na detecção de anticorpos, no soro do indivíduo, os quais são gerados a partir de uma resposta imunológica direcionada contra antígenos virais codificados por genes estruturais reguladores (PROIETTI et al., 2002). 16 1.8.1 Reações de Triagem As reações de triagem, não diferenciam o HTLV-I do HTLV-II, devido às reações cruzadas de anticorpos, sendo, portanto, referidas como testes para HTLV-I e II. As seqüências dos genomas do HTLV-I e II têm similaridade de aproximadamente 65%, resultando em produtos protéicos relacionados, no entanto, eles contêm alguns antígenos diferentes, o que permite distinguí-los nas reações confirmatórias. A técnica mais comumente empregada para a triagem, é a reação de ELISA ou EIA (enzyme linked immunosorbent assay ou enzyme immunoassay), na qual os antígenos específicos são adsorvidos a uma placa de poliestireno e incubados com os soros em teste, sendo a reação definida como positiva através da intensidade colorímetrica medida em densidade óptica (DO) a partir de um corte definido ou cut- off. Resultados inconclusivos necessitam investigação complementar. Após sofrer várias modificações, os testes atualmente contêm apenas proteínas recombinantes e peptídeos sintéticos, proporcionando maior sensibilidade (%) e especificidade, os testes ELISA considerados apropriados são os das marcas: Organon Teknica, Murex, Abbott e Ortho (VRIELINK et al.,1999). Os testes de aglutinação de partículas de látex ou de gelatina sensibilizadas com antígenos virais inativados, também são utilizados como reações de triagem. 1.8.2 Reações Confirmatórias ou Suplementares A confirmação diagnóstica da infecção pelo HTLV pode ser realizada a partir de diferentes métodos sorológicos, dos quais o mais utilizado é o Western blot (Wb), detectando a presença de anticorpos para diferentes antígenos virais, separados eletroforeticamente, segundo seu peso molecular e carga elétrica, aderidos a um suporte sólido de nitrocelulose, os anticorpos são identificados pela visualização de bandas correspondentes aos diferentes antígenos virais. O teste da IFI (Imunofluorescência Indireta) não é comercializado apresentando resultados subjetivos, o que limita sua utilização. Outros são o RIBA (recombinant immunoblot assay) o RIPA-PAGE (radioimunoprecipitação em gel de poliacrilamid). 17 1.8.3 Reações Moleculares O diagnóstico molecular é realizado com a PCR - reação em cadeia da polimerase, capaz de detectar um único fragmento de DNA e copiar sua seqüência de ácidos nucléicos, amplificando até um milhão de vezes a sequência viral inicial. O provírus detectado nas células infectadas é capaz de esclarecer estados sorológicos indeterminados, além de ser utilizado para identificar claramente se a infecção ocorre pelo tipo I ou pelo tipo II do HTLV. A identificação através da PCR das infecções por HTLV-I, baseia-se na escolha dos iniciadores complementares às extremidades da região do genoma a ser amplificada, a qual deve ser uma região altamente conservada e espécie-específica. A PCR deve ser considerada atualmente como um ensaio confirmatório adicional e como uma técnica de pesquisa (PROIETTI et al., 2002). 18 2 OBJETIVOS 2.1 GERAL Estimar a soroprevalência da infecção pelo HTLV I/II, em oito comunidades indígenas do Estado do Amazonas. 2.2 ESPECÍFICOS Descrever o perfil da soroprevalência do HTLV-I, em indivíduos de oito comunidades indígenas do Amazonas; Caracterizar os fatores sócio-demográficos da população de estudo associando: sexo, faixa etária e etnia. 19 3 METODOLOGIA 3.1 MODELO DE ESTUDO Trata-se de um estudo retrospectivo (estudo de casos prevalentes), em comunidades indígenas do estado do Amazonas, que avaliará a taxa de prevalência do HTLV I/II, em relação a diferentes variáveis epidemiológicas. 3.2 UNIVERSO DE ESTUDO 3.2.1 POPULAÇÃO DE REFERÊNCIA O estudo se desenvolveu na Amazônia ocidental, entre populações indígenas dos vales dos rios Juruá, Purús e Madeira, principais afluentes da margem direita do rio Amazonas, tendo como base os municípios de Lábrea, Pauini, Eirunepé, Envira e Nova Olinda do Norte (Fig. 13). A região apresenta clima tropical úmido, com elevados índices pluviométricos anuais, que se encontram exacerbados entre os meses de Dezembro a Julho, e uma estação menos chuvosa entre os meses de Agosto e Novembro. A economia local está centralizada na produção de látex, juta, madeira, pesca, agricultura de subexistência e exploração de madeiras nobres. 3.2.2 POPULAÇÃO DE ESTUDO Indígenas pertencentes a oito comunidades do estado do Amazonas, totalizando 399 amostras de soros provenientes das seguintes etnias e respectivos locais de procedência: Apurinã Kanamari Deni Jamamadi Kulina Mura-Pirahã Paumari Zuhu-A´há Lábrea e Pauini Eirunepé Tapauá Lábrea Envira e Eirunepé Nova Olinda do Norte Lábrea Lábrea 20 No município de Lábrea os Zuhu-A´há, uma aldeia considerada fechada, segundo informação verbal cedida pelo Dr. Marcus Lacerda, responsável pela coleta de amostras de soro dos indígenas dessa etnia para estudos prévios epidemiológicos. As demais aldeias visitadas aparentavam comunidades ribeirinhas, com uma área livre central, circundada por habitações, normalmente próximas de um igarapé, algumas com escolas, posto médico e igreja onde conviviam com missionários de outros países. Estas comunidades em regra estão localizadas em regiões no meio da floresta de difícil acesso fluvial e terrestre, à exceção das aldeias do Cacau, da etnia Kulina, e de Nova Esperança dos Apurinã, que são considerados bairros afastados das cidades de Envira e Lábrea. 3.3 PROCEDIMENTOS 3.3.1 SELEÇÃO DOS INDIVÍDUOS A SEREM INCLUÍDOS NO ESTUDO O número de indivíduos avaliados ficou condicionado ao número de aldeias visitadas e ao número de pessoas presentes no momento da visita. Nas aldeias pequenas, todos eram avaliados e nas maiores onde foi realizado sorteio, a grande maioria dos sorteados estavam no momento da entrevista e concordavam em participar. Nas aldeias maiores, se procedia a seleção de 50% da população por amostragem aleatória simples, sorteados do censo familiar de cada aldeia. Em aldeias pequenas a investigação se realizava com praticamente todos os indivíduos presentes, sendo deixados de fora somente os que estavam ausentes em alguma atividade na floresta. 3.3.2 INSTRUMENTOS Como instrumentos de investigação foi utilizado o censo familiar de cada aldeia, elaborado pelo programa de saúde indígena, de onde podiam ser coletadas informações como: sexo, idade, além de um questionário individual (anexo 1). 21 3.3.3 COLETA DAS AMOSTRAS As amostras de soro estavam separadas em alíquotas e armazenadas na soroteca da gerência de virologia da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTIMT), as mesmas foram coletadas por BRAGA, et al., 1993 nas comunidades indígenas, determinadas por autoridades competentes da FUNAI, pois no momento da coleta havia transporte disponível somente para essas localidades. As informações referentes aos indivíduos participantes foram obtidas por meio de inquérito, através de questionário padronizado, desenvolvido para esta finalidade. Posteriormente as amostras de soro foram utilizadas por FERREIRA et al., 2002, sendo encontrado em determinadas aldeias 100% de positividade para o Helicobacter pylori , através do método de ELISA. Foi solicitado um consentimento verbal dos dirigentes das comunidades e chefes de família após apresentação do projeto, explicando os objetivos antecipadamente. O projeto foi apresentado aos dirigentes do programa de saúde indígena da Fundação Nacional de Saúde e também as entidades governamentais e não-governamentais que trabalhavam em conjunto com a Fundação Nacional de Saúde. 3.3.4 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS 1- Colheram-se 10ml de sangue de cada indíviduo, por punção venosa a vácuo; 2- Mantiveram-se os tubos à temperatura ambiente, até formação de coágulo; 3- Centrifugaram-se as amostras a 2000 rpm, por 5 minutos, para obtenção do soro, o qual foi separado em alíquotas e acondicionados em tubos criogênicos com capacidade de 1,5ml cada um, em duplicidade, devidamente identificados com um código para cada participante; 4- As amostras foram armazenadas a –20 oC; 5- Todas as amostras foram coletadas pela mesma pessoa e imediatamente acondicionadas em gelo e transportadas para realização da centrifugação. 22 Figura 5. Coleta de sangue e exame físico. 3.4 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO Alíquotas de soros de populações das 8 etnias armazenadas no Laboratório de Virologia da FMTIMT. 3.5 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO Soros que se apresentaram hemolisados, lipêmicos ou ictéricos. 3.6 REALIZAÇÃO DAS SOROLOGIAS Todos os testes foram realizados no Laboratório de Sorologia da Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (FHEMOAM). 3.6.1 DESCRIÇÃO DO MÉTODO ELISA Foi utilizado o KIT ABBOTT MUREX HTLV-I + II Código: GE81-8E22 04 Lote: H814010, Validade: 30.09.04. Enzimaimunoensaio qualitativo para a detecção de anticorpos contra o vírus T – linfotrópico humano, tipos I e II (HTLV - I e HTLV - II) em soro ou plasma humano. O MUREX HTLV-I + II sanduíche”, baseado em é um ensaio de ELISA seqüencial tipo “antígeno proteínas transmembrânicas do HTLV-I e HTLV-II. recombinantes derivadas de proteínas 23 Os antígenos são selecionados para otimizar a especificidade e sensibilidade de ambos e são usados no formato selecionado para permitir a detecção de anticorpos do tipo IgA, IgG e IgM. 3.6.1.1 COMPONENTES DO KIT Placa revestida com antígenos do HTLV-I e II Diluente de Amostra: Um frasco contendo 36ml de tampão e detergentes. Contém conservantes Bronidox a 0,05%. Conjugado: Um frasco contendo antígenos do HTLV conjugados com peroxidase de rábano e liofilizado. Diluente do Conjugado: Um frasco contendo uma solução vermelha consistindo por tampão, proteína bovina e detergente. Contém conservante Bronidox a 0,05%. Controle Positivo anti-HTLV; Um frasco com 1,5 ml de sorohumano inativado contendo anticorpos contra o HTLV, negativo para antígeno de superfície da Hepatite B (HbsAg) e negativo para anticorpos contra o vírus da imunodeficiência humana tipos I e II (HIV 1 e HIV 2) e HVC, diluído em tampão contendoo proteína bovina. Contém conservante Bronidox a 0,05%. Controle Negativo: Um frasco com 2,5 ml de soro humano normal, não reativo para HbsAg e anticorpos contra HIV 1, HIV 2, HCV,HTLV I e II, diluídos em um tampão com proteína bovina. Contém conservante Bronidox a 0,05%. 3.6.1.2 PROCEDIMENTO DO ENSAIO 1) Reconstituir e misturar o Conjugado, preparar a solução de Substrato e a solução de Lavagem. 2) Adicionar 50µl de diluente da amostra em cada cavidade da placa. 3) Adicionar 50µl de cada Amostra de soro em cada cavidade da placa. 4) Adicionar 50ul de cada Controle, em três cavidades da placa. 5) Cobrir as cavidades com a tampa e incubar por 30 minutos a 37o C em condições de umidade. 6) Lavar a placa, em lavadora automatizada. 7) Adicionar 100ul de Solução de Substrato em cada cavidade. 8) Cobrir as cavidades e incubar por 30 minutos a 37oC. 24 9) Observar uma coloração púrpura nas amostras reativas. 10) Adicionar 50ul de Solução de Parada (ácido Sulfúrico 0,5M a 2M) em cada cavidade. 11) Após 15 minutos ler a absorbância em 450nm. 3.6.1.3 CÁLCULO DOS RESULTADOS Controle Negativo: Calcular a absorbância média dos controles negativos, que deverá ser menor que 0,2. Valor de Cut-off: Calcular o valor de cut-off adicionando-se 0,2 à média das replicatas do controle negativo. Controle Positivo: A absorbância do controle Positivo deve ser acima da absorbância média do controle negativo. 3.6.1.4 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS Resultados Negativos: Amostras que apresentarem uma absorbância menor que o valor do Cut-off, são consideradas negativas no MUREX HTLV I+II. Resultados Positivos: Amostras que apresentarem uma absorbância igual ou maior que o valor do Cut-off, são consideradas inicialmente reativas no ensaio. 25 Figura 6. Placa para realização do teste ELISA, amostras positivas apresentam coloração amarela e amostras negativas coloração rosa. Figura 7. Incubadora automática com contagem de tempo, para placas de ELISA (FHEMOAM) 26 Figura 8. Lavadora automática para placas de ELISA (FHEMOAM) 3.6.2 DESCRIÇÃO DO MÉTODO WESTERN BLOT Enzimaimunoensaio qualitativo Kit ABBOTT MUREX HTLV Blot 2.4, Lote: AK3022, Validade: 01.11.04, para detecção in vitro de anticorpos para HTLV-I e HTLV-II em soro ou plasma humano, como um teste suplementar mais específico para amostras reativas em procedimentos de triagem como o ELISA. As tiras de nitrocelulose são incorporadas com proteínas virais do HTLV derivadas de partículas virais rompidas nativas e inativadas e proteínas desenvolvidas geneticamente. 3.6.2.1 COMPONENTES DO KIT 1) TIRAS DE NITROCELULOSE – Incorporada com lisado viral de HTLV I e antígeno recombinante do envelope; 2) CONTROLE-NÃO REATIVO – Soro humano normal inativado. Não reativo para anti-HCV, anti-HIV 1 e 2, anti-HTLV I - II e HbsAg. Contém azida sódica e timerosal como conservantes; 27 3) CONTROLE REATIVO FORTE I – Soro humano inativado com alto título de anticorpos para HTLV-I; 4) CONTROLE REATIVO FORTE II – Soro humano inativado com alto título de anticorpos para HTLV-II; 5) TAMPÃO ESTOQUE LIOFILIZADO – Deve ser reconstituído em água grau reagente; 6) TAMPÃO DE LAVAGEM CONCENTRADO (20 X) - Tampão Tris com Tween 20 e contém timerosal como conservante; 7) CONJUGADO – Anti-IgG – humana (cabra) conjugada com fosfatase alcalina; 8) SUBSTRATO – Solução de 5-bromo-4-cloro-3-indolfosfato (BCIP) e Tetrazólico Nitroazul (NBT); 9) PÓ DE REVELÇÃO – Leite em pó desnatado; 10) BANDEJA DE INCUBAÇÃO – Com 9 canaletas cada 11) Pinça 3.6.2.2 PROCEDIMENTOS DE ENSAIO KIT HTLV Blot 2.4 1) Colocar as tiras em cada canaleta, com o lado numerado para cima, incluir as tiras para os controles reativo forte e controle não-reativo; 2) Adicionar 2 ml de Tampão de Lavagem diluído a cada canaleta; 3) Incubar as Tiras por pelo menos 5 minutos em temperatura ambiente em uma plataforma de agitação. Remover o Tampão por aspiração; 4) Adicionar 2ml de Tampão de Revelação a cada canaleta seguido de 20ul de soro teste às canaletas apropriadas; 5) Cobrir a bandeja com a cobertura fornecida e incubar por 1 hora em temperatura ambiente na plataforma de agitação; 6) Descobrir cuidadosamente a bandeja para evitar o extravasamento ou a mistura das amostras. Aspirar as misturas das canaletas; 7) Lavar cada tira 3 vezes com 2 ml de Tampão de Lavagem diluído, deixando que as tiras fiquem embebidas durante 5 minutos na plataforma de agitação entre cada lavagem; 8) Adicionar 2 ml de Solução de Trabalho do Conjugado a cada canaleta. Cobrir a bandeja e incubar por 1 hora em temperatura ambiente na plataforma de agitação; 28 9) Aspirar o conjugado das canaletas. Lavar as tiras como no passo 7; 10) Adicionar 2 ml de Solução de Substrato a cada canaleta. Cobrir a bandeja e incubar por 15 minutos na plataforma de agitação; 11) Aspirar o Substrato e enxaguar as tiras várias vezes com água grau reagente para interromper a reação; 12) Remover as tiras com auxílio de pinça, e colocar para secar em papel toalha; 13) Observar as bandas e classificar os resultados. 3.6.2.3 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS A banda do soro controle serve para checar a adição de soro no ensaio. Ausência desta banda indica que nenhum soro teste, conjugado ou substrato foi dispensado na tira teste ou então ocorreram outros erros operacionais. Padrão I Interpretação 1 Nenhuma reatividade com as proteínas do HTLV Soro negativo 2 Reatividade com GAG (p19 com ou sem p24) e 2 ENV (GD21 e rgp46-I) HTLV I Soro positivo 3 Reatividade com GAG (p24 com ou sem p19) e 2 ENV (GD21 e rgp46-II) HTLV II Soro positivo 4 Reatividade com GAG (p19 e p24) e ENV (GD21) HTLV positivo 5 Bandas específicas do HTLV detectadas, mas não relacionadas às do HTLV I, HTLV II ou HTLV soropositivo Indeterminada 29 rgp46-I rgp46-II p53 gp46 p36 p26 P28 p24 p21 P19 GD21 Figura 9. Western blot : representação das bandas que caracterizam o teste. 30 Figura 10. Aparelho automatizado para realização do Western blot 2.4. (Laboratório de Sorologia da FHEMOAM) 3.7 METODOLOGIA ESTATÍSTICA Os dados foram registrados em um banco de dados e a análise estatística foi realizada através de Estatísticas Descritivas (Tabelas e Gráficos), utilizando-se o Programa Epi-Info 6. 31 4 RESULTADOS 4.1 ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO 4.1.1 SEXO E FAIXA ETÁRIA Houve predomínio do sexo masculino, em número de 203 (50,9%), sobre o feminino, com 196 (49,1) na população indígena estudada (tabela 1). Quanto à faixa etária, observou-se que a população das oito etnias estudadas tinham predominantemente entre 8 a 15 anos (28,3%) como mostra a tabela 2 e figura 11. Tabela 1 Distribuição da freqüência por sexo na população estudada Sexo Freq. % Feminino Masculino 196 203 49,1 50,9 Total 399 100,0 Tabela 2 Distribuição da faixa etária da população indígena das 08 etnias estudadas Faixa Etária Freq. % Acum(%) ≤7 81 20,3 20,3 8 a 15 113 28,3 48,6 16 a 23 56 14,0 62,6 24 a 31 58 14,5 77,1 32 a 39 28 7,0 84,1 40 a 47 14 3,5 87,6 48 a 55 16 4,0 91,6 56 a 63 14 3,5 95,1 64 a 71 11 2,8 97,9 72 a 87 8 2,1 100,0 Total 399 100,0 - Média= 22,3 anos; DP=18,5anos; Mediana=16 anos; Mín. 1; Max. 87 anos 32 113 120 100 81 80 56 60 58 40 28 14 20 16 14 11 8 0 <=7 8 a 15 16 a 23 24 a 31 32 a 39 40 a 47 48 a 55 56 a 63 64 a 71 72 a 87 Figura 11. Distribuição da faixa etária da população indígena das 08 etnias estudadas 4.1.2 PARTICIPANTES COM PARCEIROS Dentre os indivíduos pertencentes às etnias que responderam o questionário, em relação a ter parceiros a maioria afirmou que não tinham 175 (54%) sendo considerados solteiros e 149 (46%) confirmaram ter parceiros (Figura 10). Figura 12. Distribuição dos 324 indígenas que responderam o questionário em relação a ter parceiros 33 4.1.3 ETNIAS ESTUDADAS Em um total de 399 indígenas, 104 (26,1%) eram da etnia Apurinã. A segunda etnia com o maior número de indivíduos participantes foi a Paumari (23,6%), conforme a tabela 3. Tabela 3 Distribuição da freqüência da população indígena das 08 etnias estudadas Aldeia Freq % Apurinã 104 26,1 Paumari 94 23,6 Kanamari 55 13,8 Jamamadi 53 13,3 Kulina 41 10,3 Zuhu-A´há 28 7,0 Deni 18 4,5 Mura-Pirahã 6 1,5 Total 399 100.0 4.1.4 MÉDIA DE IDADE EM RELAÇÃO À ETNIA A média de idade das sete etnias estudadas foi 19,8 anos, com exceção da etnia Zuhu-A´há cuja média de idade foi de 58,2 anos. Podemos observar que não houve diferença estatisticamente significante ao nível de 5%, entre a média de idade e as etnias (Tabela 4). Tabela 4 Distribuição da Média de idade da população indígena estuda em relação às etnias. Etnia Freq Média DP Mediana Apurinã 104 19,6 16,5 13,0 Kanamari 55 22,5 16,0 20,0 Deni 18 18,9 17,1 12,0 Jamamadi 53 16,8 16,2 10,0 Kulina 41 21,4 14,4 20,0 Mura-Pirahã 6 21,3 16,2 22,5 Paumari 94 18,5 14,3 15,5 Zuhu-A´há 28 58,2 16,5 64,0 p-valor = 0,5903. 34 4.1.5 ALDEIAS ESTUDADAS Pode ser observado através da tabela 5, que o predomínio de indivíduos estudados eram pertencentes a aldeia Mamuri (14,8%). Tabela 5 Distribuição das aldeias indígenas nas 08 etnias estudadas Aldeia N % Mamuri Nova Vista Estirão São Francisco Crispim Cacau Japiim Zuhu-A´há Ponta Fina Iminaha Sapatini Cidadezinha Ponta Kumaru Rio Maici Nova Esperança Macapá Palhau Aquiri Bananal Labrea Lusitânia Visagem 55 49 37 36 33 30 29 28 17 14 13 9 7 6 6 5 4 3 2 2 2 2 2 14,8 13,2 10,0 9,7 8,9 8,1 7,8 7,0 4,6 3,8 3,5 2,4 1,9 1,6 1,6 1,3 1,1 0,8 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Apurina 1 0,3 Bela Rosa Bom Futuro Lago do Recurso Maraha Marrecao Rio Sepati São Clemente 1 1 1 1 1 1 1 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 399 100,0 Total 35 4.1.6 DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DA POPULAÇÃO ESTUDADA As etnias pesquisadas eram predominantemente da região sul do Estado do Amazonas, localizadas nos municípios de Envira, Eirunepé, Lábrea, Tapauá e no município de Nova Olinda do Norte (Figura 13). N NOVA OLINDA DO NORTE TAPAUÁ MuraPirahã ENVIRA PAUINI LÁBREA EURINEPÉ Kulina Kanamari Apurinã Jamamadi Paumari Deni Zuhu-A´há Figura 13. Distribuição geográfica das comunidades indígenas estudadas 36 4.1.7.TESTES SOROLÓGICOS 4.1.7.1 ELISA Das 399 amostras de soro analisadas na população indígena estudada, 3 (0,75%) foram reativas no método de triagem ELISA. 4.1.7.2 WESTERN BLOT Para confirmar os resultados, foi realizado o teste Western blot, duas amostras foram negativas para HTLV I/II e uma (3,9% ) apresentou padrão indeterrminado, com a presença da banda GD21 (Figura 14). Figura 14. Resultado do Teste Western blot 37 5 DISCUSSÃO Amostras de soros de oito etnias indígenas localizadas no sul do estado do Amazonas foram examinadas através de métodos sorológicos de triagem e confirmatório, com o objetivo de caracterizar a infecção pelo HTLV-I/II. Esta infecção é endêmica em várias partes do mundo, caracteriza-se por agrupamentos de indivíduos em áreas geográficas definidas, com uma variação espacial na taxa de soroprevalência. Endêmica no Japão, Caribe, África, América do Sul e ilhas da Melanésia (SOARES et al., 2001). Estima-se que 15 a 20 milhões de pessoas estão infectadas pelo HTLV-I no mundo. No Brasil, ele está presente em todos os estados onde foi pesquisado, apresentando prevalências variadas, aproximadamente 2,5 milhões de pessoas infectadas pelo vírus HTLV-I, evidenciando o Brasil como o país com o maior número de casos ( PROIETTI et. al. 2002). O HTLV-I está associado a Síndromes lifoproliferativas, leucemia/linfoma de células T do adulto (ATL), a paraparesia espástica tropical/Mielopatia associada ao HTLV (TSP/HAM), doenças dermatológicas, uveítes associadas ao HTLV (HAU), entre outras patologias (MANNS et al., 1999; YAMAGUCHI, 1994; BARMAK et al., 2003). A infecção tem período de latência prolongado, até algumas décadas ou por toda a vida do indivíduo (BARMAK et al., 2003). A transfusão de sangue é uma das principais vias de transmissão (MACEDO et al., 2004). A infecção pelo HTLV-II que parece ser menos patogênica, é endêmica em diversas comunidades indígenas da Amazônia, e áreas urbanas, em Belém no estado do Pará (ISHAK et al., 1998), com evidências moleculares da transmissão do HTLV-IIc de mãe para filho na aldeia Kararao, na região amazônica brasileira. (ISHAK et. al. 2001). Fujiyoshi et al., (1999) estudando a distribuição característica dos portadores do HTLV-I e II entre grupos étnicos nativos da América do Sul, sugere a divisão em dois grupos étnicos principais: os agrupamentos de HTLV-I nas zonas montanhosas dos Andes e os focos de HTLV-II das planícies da América do Sul. Estudos relativos à prevalência do HTLV-I/II no estado do Amazonas são muito escassos na literatura. Grande parte dos trabalhos sobre a epidemiologia do HTLV- 38 I/II consistem em estudos de soroprevalência em doadores de sangue, com ambas as cidades de Florianópolis e Manaus apresentando o menor índice de 0,08% e as cidades de Belém 1,61% e Salvador com prevalência de 1,35% a 1,80%, as cidades com maior taxa (PROIETTI et al., 2002). No presente estudo, das 399 amostras de soro analisadas na população indígena estudada, 3 (0,75%) foram reativas no método de triagem pelo ELISA para detecção de anticorpos contra o virus T – linfotrópico humano, tipos I e II. Para confirmar os resultados, foi realizado o teste Western blot, duas amostras foram negativas para HTLV-I/II e uma (0,25%) apresentou padrão indeterminado, com a presença da banda GD21. As duas amostras positivas através do teste de ELISA, consideradas posteriormente negativas pelo método confirmatório Western blot, foram baixas (0,5%), comparadas com o trabalho de Britto et al, (1998) que encontraram 2,25% de resultados falso positivos. A causa de resultados falso positivos elevados podem estar associados à malária em regiões consideradas endêmicas, segundo Levine et al., (1988) e aos procedimentos sucessivos de congelamento e descongelamento e armazenamento das amostras por períodos prolongados, levando à aderência inespecífica de imunoglobulinas à fase sólida, durante a realização do teste ELISA. Outra possível causa pode ser devido a reações cruzadas com os anticorpos contra os antígenos do sistema de histocompatibilidade (HLA), sendo que os lisados virais podem conter antígenos HLA da célula usada para propagar o vírus (BRITTO et al., 1998). O padrão indeterminado, com a presença da banda GD21, encontrada no presente trabalho, tem sido acompanhado de várias interpretações: os estudos de soroprevalência para o HTLV-I realizado por Lu et al., (2003), em 2.578,238 doadores de sangue na cidade de Taiwan, demonstraram que 1793 (0,06%) das amostras foram positivas para o HTLV-I, 605 (0,023%) foram indeterminadas, apresentando a banda GD21 sozinha em 59,6% dos resultados indeterminados, sugere o autor que a maioria das reações inespecíficas do ELISA foram provavelmente precipitadas pela glicopreteina GD21 do envelope viral. Segundo Manns et al., (1991) a distribuição do HTLV em populações indígenas da América do Sul demonstra que a presença da banda GD21 pode tratar-se de uma soroconversão precoce, sendo necessário futuras investigações laboratoriais. 39 A presença de reatividade para a proteína do envelope viral GD21 sozinha, pode ser indício de fase precoce de produção de anticorpos durante a soroconversão (LAL RB, 1996). No entanto resultados indeterminados podem representar soropositividade inespecífica (BRITTO et al., 1998). A nula ou baixa prevalência nas etnias estudadas no presente trabalho poderá ser imputado em decorrência de muitas das comunidades estudadas serem consideradas fechadas ou de contato esporádico com a civilização, hipótese esta também compartilhada por Maloney et al., (1992) e Ishak et al., (1995). Considerando-se que a população pesquisada neste estudo apresentou faixa etária com média de 19,8 anos de idade, é possível que alguns indivíduos não foram identificados como soropositivos para o HTLV-I/II, em decorrência da amostra apresentar uma faixa etária baixa haja vista que a soropositividade do vírus HTLVI/II se eleva com a idade, aumentando a partir da fase da adolescência e início da fase adulta. Nas mulheres a prevalência é mais acentuada e continua após os 40 anos de idade, nos homens é considerada menor e atinge um platô após os 40 anos de idade. A hipótese mais provável para explicar esse fato seria de que a transmissão sexual do vírus HTLV-I/II seja mais efetiva do homem para a mulher e também o fato de que as transfusões sangüíneas ocorrem com maior freqüência em indivíduos do sexo femenino (PROIETTI et al., 2002). Esta hipótese se contrapõe aos nossos achados e reforça a soroprevalência nula, ao ser identificado a taxa de 0,0% na etnia Zuhu-A´há cuja média de idade foi de 58,2 anos. Através do presente estudo nota-se diferenças substanciaIs quanto a prevalência do HTLV I/II em comunidades indígenas do sul do estado do Amazonas com aqueles descritos no estado do Pará por Ishak et al., ( 2003). Maloney et al., (1992) estudando a distribuição da soroprevalencia entre 13 tribos da America Central e do Sul (Brasil, Venezuela, Costa Rica e Guiana) semelhantemente como no nosso estudo, encontrou prevalência nula em 10/13 das etnias estudadas em índios sul americanos no período entre 1966 a 1984. Incluindo a etnia Kanamari 0/34, também pesquisada em nosso estudo demonstrando prevalência igualmente nula 0/55. Em estudo retrospectivo realizado no Estado do Pará, Nakauchi et al., (1990), analisaram 137 amostras de soros de índios das comunidades Tiriyo e Mekranoite, sendo positivas pelo método ELISA 39% e 20% respectivamente, um caso foi positivo para HTLV-I, confirmado através da técnica de western blot. 40 Em estudo semelhante ao nosso realizado por Gabbai, et al., (1993), em 591 amostras de soro coletadas nos anos de 1985 e 1988 e conservadas a –20oC, de indígenas de quatro etnias da região amazônica, foi encontrada soroprevalência na taxa de 0,0% para o HTLV-I, 28 amostras foram positivas para o HTLV-II (4,7%) e cinco para o HTLVI/II (0,8%). O vírus linfotrópico de células T, tipo I /II, apresenta soroprevalência distinta em relação às regiões descritas em alguns trabalhos que envolvem o estado do Pará, apresentando maior prevalência nessa região para o HTLV-II (ISHAK et al., 1995; MALONEY et al., 1992; VALLINOTO et al., 2002). É provável que o vírus linfotrópico de células T humanas tenha vindo para o Brasil via tráfico de escravos africanos, via imigração japonesa no início do século ou combinação das vias anteriores. Estudos da variação genômica de cepas do HTLV certamente contribuirão para esclarecer essas hipóteses (SCHULZ et al., 1991). A infecção pelo HTLV-II é considerada endêmica em outras populações indígenas da América do norte, central e do sul, em pesquisa realizada por Fujiyoshi et al, 1999, foi encontrada as seguintes prevalências para o HTLV-I, em indígenas de várias etnias e paises: Aymara (Peru) 1,6%, Aymara (Bolívia) 5,3%, Quechua (Bolívia) 4,5%, Puna (Argentina) 2,3% e Atacama 4,1%. Resultados encontrados para o HTLV-II: Kayapó (Brasil) 57,9%, Chaco (Paraguay) 16,4%, Alacaf (Paraguay) 34,8% e Yahgan (Chile). Na Colômbia 29-92 (31,5%) em índios Guahibo. Na Venezuela índios Yaruro e Guahibo 61% HTLV-IIb. Na Argentina, 0,45% a 2,78% HTLV-I e 2,78% a 21,9% HTLV-II em populações indígenas (Gastaldello et al., 2004). A freqüência nula ou muito baixa do HTLV I/II, o que é desejável, em populações indígenas do sul do estado do Amazonas deve despertar nas autoridades relacionadas com saúde publica a preocupação de envidar esforços no sentido de evitar a disseminação deste agente infeccioso para as comunidades indígenas. O processo de colonização levou à extinção de muitas sociedades indígenas que viviam no Amazonas, território dominado, seja pela ação das armas seja pelo contágio de doenças trazidas dos países europeus para as quais os índios não tinham anticorpos ou uma imunidade natural, tal como ocorreu com a tuberculose com os índios do Rio Negro, mas recentemente o vírus da gripe com a população indígena dos Zuhu-A´há aqui estudada ou ainda, pela aplicação de políticas visando 41 a assimilação pelos índios à nova sociedade implantada, com forte influencia européia. Embora não se saiba exatamente quantas sociedades indígenas existissem no Brasil à época da chegada dos europeus, há estimativas sobre o número de habitantes nativos naquele tempo que variam de 1 a 10 milhões de indivíduos, para uma população atual de 345.000 índios (<http://www.funai.gov>). Estes números nos dão uma idéia da imensa quantidade de pessoas e sociedades indígenas inteiras exterminadas ao longo destes mais de 500 anos, como resultado de um processo de colonização baseado no uso da força, por meio das guerras e da política de assimilação, e da transmissão de doenças infecto-contagiosas. Urge portanto, a tomada de medidas profiláticas, da educação sanitária para que estas populações não atinjam a prevalência alarmante de 57% de infectados como aquelas prevalentes nos índios Kayapós pelo HTLV-II (ISHAK et al., 2003). Em conclusão, os nossos dados sugerem que a freqüência da infecção pelo HTLV-I/II em populações indígenas do sul do estado do Amazonas é nula ou muito baixa, e inferior a observada em populações indígenas do estado do Pará e do restante do território brasileiro. 42 CONCLUSÃO 1. A soroprevalência da infecção pelo HTLVIII em populações indígenas do sul do estado do Amazonas é nula ou muito baixa. 2. O presente estudo fornece evidências de que o HTLV- I foi introduzido recentemente na Amazônia, por apresentarem inclusive as etnias fechadas, 0% de prevalência, na época da coleta. 3. Deve-se estabelecer uma política em termos de saúde pública para que haja manutenção da baixa prevalência do vírus no estado do Amazonas através de medidas profiláticas e educação sanitária. 43 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BARMAK, K; HARHAJ, E.; GRANT, C., et al. Human T cell leukemia virus type I – induced disease: pathways to cancer and neurodegeneration. Virology, 308:1-12, 2003. BARTHOLOMEW, C.; CLEGHORN, F.; BLATTNER, W.A. The clinical spectrum of HTLV-I infection in Trinidad and Tobago. In:BLATTNER, W.A.(ed). Human Retrovirology: HTLV. New York, Raven Press, p.237-44, 1990. BITTENCOURT, A. J. Transmissão vertical do virus linfotrópico para a célula T humana tipos I e II (HTLV- I/II). J Bras Ginecol, 108:187-4, 1998. BITTENCOURT, A.; OLIVEIRA, M. F. Dermatite infecciosa associada ao HTLV-I. 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Amostras estas, coletadas anteriormente a vigência da Resolução CNS 196-96, de 10 de outubro de 1996, portanto de acordo com o exposto, o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido não se aplica. RISCOS ASSOCIADOS AO ESTUDO Não haverá risco, haja vista tratar-se de material já coletado. BENEFÍCIOS De posse dos resultados, medidas preventivas futuras poderão ser adotadas para os grupos de procedência das amostras. CONFIDÊNCIA E AVALIAÇÃO DOS REGISTROS Os registros ou resultados dos testes relacionados ao estudo são exclusivos dos representantes da FMT-IMT-AM, assegurando a confidencialidade do sujeito da pesquisa, sendo garantido em conformidade com as normas e leis legais regulatórias de proteção nacionais ou internacionais. ANEXO B - QUESTIONÁRIO DE INVESTIGAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA EM POPULAÇÕES INDÍGENAS Número de identificação I- IDENTIFICAÇÃO 1-Nome 2-Sexo [ ] masculino 3-Idade [ ] feminino Anos 4-Etnia 5- Tem parceiro ? [ ]sim [ ] não 7-Tempo que vive neste local 8-Razões para mudança III- OBSERVAÇÕES Data da entrevista ANEXO C- Fotografia Etnia Kulina Figura 16. Etnia Kulina ANEXO D- Fluxograma do Diagnóstico Laboratorial
