Aula Prática 13- Técnicas de Imuno-citoquimica e Imuno
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Técnicas de Imuno-Citoquímica e Imuno-Histoquímica Identificação de linfócitos T e B: Marcadores CD4+, CD8+, IgM e IgG Doutoranda: Priscila Diniz Lopes Prof. Hélio José Montassier Disciplina: Imunologia Veterinária Linfócitos T Seleção e maturação de células T TCR αβ se transformam em CD4+ ou CD8+ na medula tímica T CD4+ virgem : MHC de classe IIantígenos exógenos T CD8+ virgem : MHC de classe I – antígenos endógenos Linfócitos B Linfócitos B são ativados pelo antígeno e secretam anticorpos para eliminá-los Em resposta ao CD40 e às citocinas sofre mudança de isótipo da cadeia pesada, levando a produção de anticorpos com cadeias pesadas de diferentes classes Citocinas produzidas pelas céls T auxiliares que são ativadas por patógenos regulam a mudança do isótipo Marcadores Técnica - definição Utilização de Acs para detecção do antígeno distribuído no tecido ou no compartimento de uma célula Histoquímica ◦ Corte de tecido congelado ou parafinado Citoquímica ◦ Esfregaço sanguíneo, aspirados ou suabes Principais fatores Qualidade da marcação: A. Fase pré-analítica (destacando-se fixação do tecido e processamento); B. Recuperação antigênica de epítopos; C. Sensibilidade do sistema de detecção. História Coons, Creech e Jones em 1941 ◦ Conjugaram um anticorpo com um corante fluorescente. Novos compostos marcadores como as enzimas horseradish peroxidase (HRP) em 1966 e fosfatase alcalina em 1978 Aplicações Pré-requisitos Antígeno - Anticorpo Antígeno: molécula que se une de maneira específica a um anticorpo Epítopo: sítios de reconhecimento ou de ligação Imunógeno: molécula que pode desencadear uma reposta ◦ Peptídeos sintéticos ◦ Antígeno purificado Antígeno - Anticorpo Anticorpo: molécula proteica que se liga de maneira específica a uma substância, o antígeno Especificidade e afinidade Soros Reagente da técnica Imunização de animais-alvo Soros policlonais e monoclonais Soros policlonais Vários plasmócitos ◦ Reage com diversos epítopos de um antígeno Coelho, cabra, porco, equino ou ovelha ◦ Facilidade na manutenção ◦ Anticorpos de coelhos precipitam com proteínas de humanos ◦ Pool de anticorpos de diferentes coelhos 10 a 200 µg Intradérmico ou subcutâneo Músculo da pata ou cavidade peritoneal Adjuvante completo ou incompleto de Freund’s Soros monoclonais Produto de um único clone de plasmócitos Uniforme em estrutura, especificidade e afinidade Anticorpos de um clone imunoquimicamente idênticos e reagem com um epítopo específico Ratos Produção de soros monoclonais A. Imunização de um animal B. Colheita de plasmócitos no baço desse animal. C. Fusão desses plasmócitos (curto tempo de vida) com células de mieloma (longo tempo de vida). D. Colocação individual das células resultantes da fusão em cultura de modo a poder recolher-se os anticorpos por elas produzidos. E. Testes para saber suas características. F. Manutenção das culturas (clones) que demonstrem características úteis e destruição das restantes. G. Recolha sistemática dos anticorpos produzidos pelo clone que passam a constituir o soro monoclonal Monoclonais x Policlonais Imunienzimologia É o método de imunohistoquímica que utiliza enzimas como substâncias propiciadoras da visualização do antigênio Métodos Imunohistoquímicos Métodos diretos AC primário possui o marcador Simples, rápido Pouca ampliação de sinal Métodos indiretos Método indireto simples Anticorpo primário Anticorpo secundário possui o marcador Mais sensível que o método direto, maior versatilidade, mais econômico Mais demorado e complexo do que o direto Métodos indiretos Método Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) Anticorpo primário e secundário Complexo Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) Mais sensível, menos marcações inespecíficas Mais demorado e mais complexo Métodos indiretos Método APAAP (Alkaline phosphatase anti Alkaline phosphatase) Método semelhante ao PAP, mas que utiliza como marcador a fosfatase alcalina em vez da peroxidase Imunocitoquimica (eritrócitos) Métodos de avidina-biotina Detecta pequenas quantidade de antígenos Alta sensibilidade (1 molécula de anticorpo se liga a 150 moléculas de biotina )– diminui o “fundo” Técnica mais rápida Alta versatilidade Métodos de avidina-biotina Avidina-biotina se baseiam em 4 princípios gerais: A. A extraordinária afinidade existente entre a avidina e a biotina que se ligam formando um complexo praticamente indissociável B. A possibilidade existente de ligação entre a biotina e outras moléculas, como enzimas e anticorpos (anticorpos biotinilados) C. Possibilidade de se marcar a avidina com uma variedade de substâncias como enzimas, metais pesados ou fluorocromos D. Possibilidade de utilização da avidina como ponte entre duas moléculas biotini-ladas (e.g. um anticorpo e uma enzima) Métodos de avidina-biotina Técnica streptABC Anticorpo primário Anticorpo secundário biotinilado Aplicação do complexo streptavidinabiotina (marcado com substância propiciadora da visualização normalmente HRP). Métodos de avidina-biotina Técnica LSAB Anticorpo primário Anticorpo secundário biotinilado Aplicação da streptavidina marcada com substância propiciadora da visualização (normalmente HRP). Métodos de polímero Técnica mais sensível e permite detectar a quantidade mínima do antígeno Não utiliza estreptoavidina e biotina Simples e rápida execução Reprodutibilidade Facilidade da padronização Métodos de polímero Polímero de esqueleto interno Esqueleto central que estão acoplados anticorpos secundários (20) e moléculas propiciadoras da visualização (100 moléculas) (Ex: HRP) Molécula utilizada para a formação do esqueleto é dextrano (polissacarídeo hidrofílico) Métodos de polímero Polímero de esqueleto interno direto Esqueleto de dextrano Anticorpo primário e HRP acoplados Extremamente rápido e fácil, diminuindo fatores de erros Pouco poder de amplificação e relativamente dispendioso e existem poucos anticorpos primários comercializados desta forma Métodos de polímero Polímero de esqueleto interno indireto Anticorpo primário Anticorpos secundários e HPR acoplados ao polímero Fácil e rápido, diminui erros, amplificador de sinais Relativamente dispendioso Aspecto prático dos reagentes Cuidado com material e reagentes Diluição do anticorpo Testar diluições diferentes Pipetagem Tempo e temperatura de incubação Higiene e segurança do laboratório Preparação de amostras Fixação Preservação Estabilização Proteção Preparação de amostras Formaldeído Econômico, mais utilizado, penetra nos tecidos ◦ Pontes de metileno entre os aminoácidos de várias proteínas ◦ “Máscarar” antígenos ◦ Algumas alterações estruturais nas biomoléculas, principalmente nas proteínas ◦ Recuperação antigênica ◦ O tempo de espera entre colheita de material e fixação, pH, temperatura, tamanho dos fragmentos a fixar (10*10*3 mm), duração da Preparação de amostras Fixação para cortes de criostato > preservação dos tecidos Fixadores: álcool, acetona Microtomia Cortes finos, sem pregas ou estrias Não desbastar os cortes entre HE e IHQ Recuperação antigênica Cortes parafinados Digestão enzimática proteolítica Recuperação antigênica de origem térmica por alta temperatura ◦ Forno de micro-ondas, autoclave, panela de pressão, banho de água quente e vapor quente Inibição de partículas endógenas Peroxidase endógena Baço, Rins, Fígado, Medula óssea e em áreas de necrose ◦ Bloqueada por um excesso de substrato ( H2O2) que leva à saturação da atividade enzimática Fosfatase alcalina Rim, fígado e osso Figura 112 - CD3 (negro) e CD20 (castanho) em gânglio linfático Figura 92 - Receptores de Estrogênio
