Aula Prática 13- Técnicas de Imuno-citoquimica e Imuno

Técnicas de Imuno-Citoquímica
e Imuno-Histoquímica
Identificação de linfócitos T e B:
Marcadores CD4+, CD8+, IgM e
IgG
Doutoranda: Priscila Diniz Lopes
Prof. Hélio José Montassier
Disciplina: Imunologia Veterinária
Linfócitos T
Seleção e maturação de células T
 TCR αβ se transformam em CD4+ ou
CD8+ na medula tímica
 T CD4+ virgem : MHC de classe IIantígenos exógenos
 T CD8+ virgem : MHC de classe I –
antígenos endógenos

Linfócitos B
Linfócitos B são ativados pelo antígeno e
secretam anticorpos para eliminá-los
 Em resposta ao CD40 e às citocinas
sofre mudança de isótipo da cadeia
pesada, levando a produção de
anticorpos com cadeias pesadas de
diferentes classes
 Citocinas produzidas pelas céls T
auxiliares que são ativadas por
patógenos regulam a mudança do
isótipo

Marcadores
Técnica - definição

Utilização de Acs para detecção do
antígeno distribuído no tecido ou no
compartimento de uma célula

Histoquímica
◦ Corte de tecido congelado ou parafinado

Citoquímica
◦ Esfregaço sanguíneo, aspirados ou suabes
Principais fatores

Qualidade da marcação:

A. Fase pré-analítica (destacando-se
fixação do tecido e processamento);

B. Recuperação antigênica de
epítopos;

C. Sensibilidade do sistema de
detecção.
História

Coons, Creech e Jones em 1941
◦ Conjugaram um anticorpo com um corante
fluorescente.

Novos compostos marcadores como as
enzimas horseradish peroxidase (HRP)
em 1966 e fosfatase alcalina em 1978
Aplicações
Pré-requisitos
Antígeno - Anticorpo
Antígeno: molécula que se une de
maneira específica a um anticorpo
 Epítopo: sítios de reconhecimento ou
de ligação
 Imunógeno: molécula que pode
desencadear uma reposta

◦ Peptídeos sintéticos
◦ Antígeno purificado
Antígeno - Anticorpo
Anticorpo: molécula proteica que se
liga de maneira específica a uma
substância, o antígeno
 Especificidade e afinidade

Soros
Reagente da técnica
 Imunização de animais-alvo
 Soros policlonais e monoclonais

Soros policlonais

Vários plasmócitos
◦ Reage com diversos epítopos de um
antígeno

Coelho, cabra, porco, equino ou
ovelha
◦ Facilidade na manutenção
◦ Anticorpos de coelhos precipitam com
proteínas de humanos
◦ Pool de anticorpos de diferentes coelhos
10 a 200 µg
 Intradérmico ou
subcutâneo
 Músculo da pata ou
cavidade peritoneal
 Adjuvante completo
ou incompleto de
Freund’s

Soros monoclonais
Produto de um único clone de
plasmócitos
 Uniforme em estrutura, especificidade e
afinidade
 Anticorpos de um clone imunoquimicamente idênticos e reagem
com um epítopo específico
 Ratos

Produção de soros
monoclonais
A. Imunização de um animal
 B. Colheita de plasmócitos no baço desse animal.
 C. Fusão desses plasmócitos (curto tempo de vida)
com células de mieloma (longo tempo de vida).
 D. Colocação individual das células resultantes da
fusão em cultura de modo a poder recolher-se os
anticorpos por elas produzidos.
 E. Testes para saber suas características.
 F. Manutenção das culturas (clones) que demonstrem
características úteis e destruição das restantes.
 G. Recolha sistemática dos anticorpos produzidos
pelo clone que passam a constituir o soro monoclonal

Monoclonais x Policlonais
Imunienzimologia

É o método de imunohistoquímica que
utiliza enzimas como substâncias
propiciadoras da visualização do
antigênio
Métodos Imunohistoquímicos
Métodos diretos
 AC primário possui o marcador
 Simples, rápido
 Pouca ampliação de sinal

Métodos indiretos
Método indireto simples
 Anticorpo primário
 Anticorpo secundário possui o
marcador
 Mais sensível que o método direto,
maior versatilidade, mais econômico
 Mais demorado e complexo do que o
direto

Métodos indiretos
Método Peroxidase Anti-Peroxidase
(PAP)
 Anticorpo primário e secundário
 Complexo Peroxidase Anti-Peroxidase
(PAP)
 Mais sensível, menos
marcações inespecíficas
 Mais demorado e mais
complexo

Métodos indiretos
Método APAAP (Alkaline phosphatase
anti Alkaline phosphatase)
 Método semelhante ao PAP, mas que
utiliza como marcador a fosfatase
alcalina em vez da peroxidase
 Imunocitoquimica (eritrócitos)

Métodos de avidina-biotina
Detecta pequenas quantidade de
antígenos
 Alta sensibilidade (1 molécula de
anticorpo se liga a 150 moléculas de
biotina )– diminui o “fundo”
 Técnica mais rápida
 Alta versatilidade

Métodos de avidina-biotina





Avidina-biotina se baseiam em 4 princípios
gerais:
A. A extraordinária afinidade existente entre a
avidina e a biotina que se ligam formando um
complexo praticamente indissociável
B. A possibilidade existente de ligação entre a
biotina e outras moléculas, como enzimas e
anticorpos (anticorpos biotinilados)
C. Possibilidade de se marcar a avidina com
uma variedade de substâncias como enzimas,
metais pesados ou fluorocromos
D. Possibilidade de utilização da avidina como
ponte entre duas moléculas biotini-ladas (e.g.
um anticorpo e uma enzima)
Métodos de avidina-biotina
Técnica streptABC
 Anticorpo primário
 Anticorpo secundário biotinilado
 Aplicação do complexo streptavidinabiotina (marcado com substância
propiciadora da visualização normalmente HRP).

Métodos de avidina-biotina
Técnica LSAB
 Anticorpo primário
 Anticorpo secundário biotinilado
 Aplicação da streptavidina marcada
com substância propiciadora da
visualização (normalmente HRP).

Métodos de polímero
Técnica mais sensível e permite
detectar a quantidade mínima do
antígeno
 Não utiliza estreptoavidina e biotina
 Simples e rápida execução
 Reprodutibilidade
 Facilidade da padronização

Métodos de polímero
Polímero de esqueleto interno
 Esqueleto central que estão acoplados
anticorpos secundários (20) e moléculas
propiciadoras da visualização (100
moléculas) (Ex: HRP)
 Molécula utilizada para a formação do
esqueleto é dextrano (polissacarídeo
hidrofílico)

Métodos de polímero
Polímero de esqueleto interno direto
 Esqueleto de dextrano
 Anticorpo primário e HRP acoplados
 Extremamente rápido e fácil, diminuindo
fatores de erros
 Pouco poder de amplificação e
relativamente dispendioso e existem
poucos anticorpos primários
comercializados desta forma

Métodos de polímero
Polímero de esqueleto interno indireto
 Anticorpo primário
 Anticorpos secundários e HPR
acoplados ao polímero
 Fácil e rápido, diminui erros,
amplificador de sinais
 Relativamente dispendioso

Aspecto prático dos
reagentes
Cuidado com material e reagentes
 Diluição do anticorpo
 Testar diluições diferentes
 Pipetagem
 Tempo e temperatura de incubação
 Higiene e segurança do laboratório

Preparação de amostras
Fixação
 Preservação
 Estabilização
 Proteção

Preparação de amostras
Formaldeído
 Econômico, mais utilizado, penetra nos
tecidos

◦ Pontes de metileno entre os aminoácidos de
várias proteínas
◦ “Máscarar” antígenos
◦ Algumas alterações estruturais nas
biomoléculas, principalmente nas proteínas
◦ Recuperação antigênica
◦ O tempo de espera entre colheita de material
e fixação, pH, temperatura, tamanho dos
fragmentos a fixar (10*10*3 mm), duração da
Preparação de amostras
Fixação para cortes de criostato
 > preservação dos tecidos
 Fixadores: álcool, acetona

Microtomia
Cortes finos, sem pregas ou estrias
 Não desbastar os cortes entre HE e
IHQ

Recuperação antigênica
Cortes parafinados
 Digestão enzimática proteolítica
 Recuperação antigênica de origem
térmica por alta temperatura

◦ Forno de micro-ondas, autoclave, panela
de pressão, banho de água quente e vapor
quente
Inibição de partículas
endógenas
Peroxidase endógena
 Baço, Rins, Fígado, Medula óssea e
em áreas de necrose

◦ Bloqueada por um excesso de substrato (
H2O2) que leva à saturação da atividade
enzimática
Fosfatase alcalina
 Rim, fígado e osso

Figura 112 - CD3 (negro) e CD20
(castanho) em gânglio linfático
Figura 92 - Receptores de
Estrogênio