Efeitos de extratos de Cenchrus echinatus (Capim

Efeitos de extratos de Cenchrus echinatus (Capim-carrapicho) em culturas de Sclerotinia
sclerotiorum
Mariany Braz de Souza (PIBIC/CNPq), Maicon Andreus Godoi de Souza, Leopoldo Sussumu
Matsumoto, Christiane Luciana da Costa (Orientadora)
e-mail: [email protected].
Universidade Estadual do Norte do Paraná/Campus Luiz Meneghel
Ciências Biológicas, Microbiologia
Palavras-chave: Sclerotinia sclerotiorum, Cenchrus echinatus, Antifúngico.
Resumo
Sclerotinia sclerotiorum é o fungo considerado um dos patógenos fúngicos mais importantes no
mundo sendo o agente que causa a doença conhecida como mofo branco, que atinge entre outras
culturas, a soja. A espécie Cenchrus echinatus, popularmente conhecida por capim-carrapicho, é
uma gramínea que possui alta capacidade de infestação em áreas de cultivo no Brasil. Muitos
trabalhos foram desenvolvidos com o objetivo de testar a atividade fungicida ou fungistática de
extratos vegetais com atividade antioxidante, em espécies fitopatogênicas. Desta forma, o objetivo
deste trabalho foi investigar o efeito de extratos de C. echinatus em culturas de S. sclerotiorum. O
isolado de S. sclerotiorum foi obtido a partir da cultura de soja. Foram obtidos extratos etílicos nas
seguintes proporções: 2% v/v de raiz, 3% v/v de folhas+caules e 5% de inflorescências. Para
estimativas do crescimento em meio sólido foi obtido o Índice de Velocidade de Crescimento
Micelial (IVCM), e em meio líquido, a biomassa seca. A técnica do microcultivo em lâminas foi
utilizada para testar os efeitos dos extratos na morfologia do fungo-teste. Todos os experimentos
foram realizados em cinco repetições e as estimativas produziram médias que foram comparadas
entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. As estimativas de IVCM e de
biomassa seca demonstraram que os extratos de C. echinatus não provocaram atividade fungitóxica
em culturas de S. sclerotiorum. No entanto, as propriedades anti-oxidantes de C. echinatus, torna
esta espécie um bom alvo de estudos para testes de fungitoxicidade sobre outros patógenos.
Introdução
Sclerotinia sclerotiorum é um fungo polífago, tendo como hospedeiros plantas de 75 famílias,
278 gêneros e 408 espécies. Entre eles, destacam-se soja, girassol, canola, ervilha, feijão, alfafa,
fumo, tomate e batata. Este fungo é considerado um dos patógenos fúngicos mais importantes no
mundo e está distribuído em todas as regiões produtoras, sejam elas temperadas, subtropicais ou
tropicais. O fungo S. sclerotiorum é o agente que causa a doença conhecida como mofo branco ou
podridão branca, característica por exibir lesões encharcadas nos órgãos afetados, de coloração
parda e consistência mole, com micélio branco, de aspecto cotonoso, cobrindo porções dos tecidos
(LEITE, 2005).
A espécie Cenchrus echinatus, popularmente conhecida por capim-carrapicho, é uma
gramínea anual herbácea, originária da América tropical, muito comum nas áreas agrícolas do
Estado de São Paulo e estados limítrofes, bem como, na região nordeste. Sua reprodução é
exclusivamente por sementes, cujo pericarpo é liso de coloração castanho alaranjado e com o
embrião dorso-basal quase preto. Cada invólucro pode conter de um a seis cariopses, das quais
apenas a maior é mais vigorosa. Possui alta capacidade de infestação devido ao seu tipo de
infrutescência que facilmente adere-se ao pêlo de animais e diversos tipos de superfície, sendo
bastante disseminado e altamente competitiva com outras culturas anuais. C. echinatus é uma
importante infestante em áreas de cultivo de milho, sorgo e milheto no Brasil (DAN, 2011).
Muitos trabalhos foram desenvolvidos com o objetivo de testar a atividade fungicida ou
fungistática de extratos vegetais, em espécies fitopatogênicas ou de armazenamento. Alguns dos
extratos de plantas, como óleos essenciais, condimentos e diferentes compostos isolados de plantas,
tem sido registrados como inibidores efetivos do crescimento, esporulação e produção de
micotoxinas em fungos filamentosos. O modo de ação da maioria dos inibidores não está
completamente elucidada, mas muitos possuem atividade antioxidante. (RODRIGUEZ-AMAYA;
SABINO, 2002; KLICH, 2007). Extratos de yacon (SILVA et al., 2002), nim (RAZZAGHI et al.,
2005), folha de louro (ATANDA et al, 2007) e muitos outros condimentos (HITOKOTO et al.,
1980) podem ser citados como exemplos. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi investigar o
efeito de extratos de C. echinatus em culturas de S. sclerotiorum, por meio da avaliação do
crescimento micelial e da morfologia.
Material e métodos
O fungo Sclerotinia sclerotiorum
O isolado de S. sclerotiorum foi gentilmente obtido do banco de fungos fitopatogênicos do
Laboratório de Fitopatologia da UENP campus Luiz Meneghel (LM). Foi obtido a partir da cultura
de soja, mantido em meio Batata Dextrose Ágar (BDA) a 20oC ± 2. Os escleródios obtidos a partir
da cultura inicial foram inoculados em placas de Petri contendo meio BDA e incubados a 20oC ± 2
o
C por quatro dias, até a formação do micélio branco algodonoso.
Obtenção dos extratos de Cenchrus echinatus
As plantas da espécie C. echinatus foram coletadas no campus da UENP/LM. Foram
separadas as seguintes partes: 1) Folhas e caules;
2) Inflorescências; 4) Raízes. As plantas foram lavadas com água e secas em estufa a
aproximadamente 40oC. O agente extrator utilizado foi o álcool etílico a 70%. O extrato etílico foi
obtido por meio do método da maceração das frações secas da planta, utilizando gral e pistilo, onde
a operação é realizada de maneira repetitiva por um período de 30 minutos. O material macerado foi
colocado em imersão na substância extratora em Erlenmeyer durante 7 dias, de modo a se obter
extratos de 2% v/v de raiz, 3% v/v de folhas+caules e 5% de inflorescências. Após este período, o
material foi filtrado em gazes estéreis e aquecidas em manta até a evaporação total do extrator.
Cada um dos extratos foi incorporado ao meio BDA ainda líquido e aquecido de modo a formar um
conjunto homogêneo. Os meios contendo os três tipos de extratos (meios-testes) foram
autoclavados a 121oC, 1 atm, durante 15 minutos. Em seguida, foram vertidos em placas de Petri.
Considerou-se os meios-controles aqueles que continham o meio BDA na ausência dos extratos.
Avaliação do potencial anti-fúngico de Cenchrus echinatus em culturas sólidas de S. sclerotiorum
Para avaliação do potencial antifúngico, discos de micélio (aproximadamente 1 cm de
diâmetro) de cultura de S. sclerotiorum foram transferidos para os centros das placas de Petri
contendo os meios-controle e testes (cinco repetições para o controle e cinco para cada um dos
testes). As placas foram incubadas a 20oC ± 2 oC durante cinco dias. A partir do segundo dia de
incubação foram medidos dois diâmetros transversos da colônia, afim de se verificar o Índice de
Velocidade de Crescimento Micelial – IVCM (OLIVEIRA, 1991), obtido pela fórmula: IVCM= Σ
(D-Da)/N. Sendo: IVCM= índice de velocidade de crescimento micelial; D= diâmetro atual da
colônia; Da= diâmetro da colônia do dia anterior N= número de dias após a inoculação. Obteve-se a
média do IVCM obtida em cada um dos testes e no controle. As médias foram comparadas entre si
pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
Avaliação do potencial anti-fúngico de Cenchrus echinatus em culturas líquidas estáticas de S.
sclerotiorum
Para avaliação do potencial anti-fúngico de C. echinatus em culturas líquidas de S.
sclerotiorum, os meios Batata Dextrose foram acrescidos dos extratos da planta de forma
semelhante ao que foi empregado nos meios sólidos. Os meios foram acondicionados em tubos de
ensaio, semeados com um disco de 0,5 cm2 de micélio de S. sclerotiorum e incubados a 20oC ± 2 oC
durante cinco dias em condições estáticas. Ao final do período de incubação, os micélios foram
retirados do meio líquido e secos em estufa por um período de sete dias a 40 oC e pesados para
estimativo seco. Os experimentos foram realizados em cinco repetições. As médias das repetições
de cada tratamento dados foram comparadas entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de
probabilidade.
Efeitos dos extratos de C. echinatus na morfologia de S. sclerotiorum
Para analisar os efeitos de C. echinatus na morfologia de S. sclerotiorum, foi empregada a
técnica do microcultivo em lâminas (LACAZ et al, 1998) contendo meio sólido com as mesmas
condições dos tratamentos dos métodos descritos anteriormente. Todos os cultivos foram feitos em
cinco réplicas (lâminas). Após a obtenção dos microcultivos, as lâminas foram coradas com azul de
algodão e analisadas em microscopia de luz. Ao analisar a morfologia do micélio foram
especialmente observadas a existência das seguintes características: 1) Ramificação anormal do
micélio diferente da ramificação normal e dicotômica, 2) Atenuação da parede celular das hifas; 3)
Aumento ou diminuição no tamanho das hifas; 4) Vacuolização evidente do micélio.
Resultados e Discussão
Os cálculos de IVCM e as medidas de biomassa obtidas por meio do peso seco (Tabela 1)
demonstraram que os extratos de C. echinatus não provocaram redução no IVCM e na biomassa do
fungo S. sclerotiorum. Desta forma, os resultados apresentados neste trabalho não demonstraram
um potencial anti-fúngico para a planta C. echinatus.
Muitos autores testaram a atividade anti-fúngica de extratos vegetais, em espécies
fitopatogênicas ou de armazenamento. Alguns dos extratos de plantas, como óleos essenciais,
condimentos e diferentes compostos isolados de plantas, tem sido registrados como inibidores
efetivos do crescimento, esporulação e produção de micotoxinas em fungos filamentosos.
A propriedade antioxidante de um extrato vegetal pode o tornar um potencial alvo para
testes de atividade anti-fúngica. Sabe-se que C. echinatus apresenta atividade anti-oxidante
(SILVA, 2008), por isso foi selecionado para os testes realizados neste trabalho. Porém, como os
resultados anteriores demonstraram, não houve inibição do crescimento micelial em culturas de S.
sclerotiorum.
Tabela 1. Efeitos de extratos de C. echinatus no IVCM e no peso seco de S. sclerotiorum.
Tratamentos
IVCM#
Peso
seco
da
(cm/dia)
colônia##(g)
Controle
1,25±0 a
0,038±0,002 ab
Raíz
1,11±0,09 a
0,038±0,004 ab
Inflorescência
1,0±0 a
0,047±0,001 a
Caule + Folha
1,23±0,07 a
0,033±0,275 b
#
Obtido em cultura sólida. ##Obtido em cultura líquida. Médias ± Desvio padrão. Os números
seguidos das mesmas letras numa mesma coluna não diferem entre si pelo Teste de Tukey ao nível
de probabilidade de 5%.
A análise da morfologia das culturas de S. sclerotiorum por meio da técnica do microcultivo e
observação em microscopia de luz, não demonstrou nenhuma das alterações morfológicas descritas
anteriormente. As características morfológicas dos micélios-testes foram as mesmas exibidas pelo
micélio-controle. Fato este que corrobora os dados anteriores, e reforça o resultado de que a planta
C. echinatus não exibe propriedade anti-fúngica em cultura de S. sclerotiorum.
Conclusões
De acordo com os resultados obtidos, nota-se que os extratos de C. echinatus não apresentaram
fungitoxicidade sobre S. sclerotiorum. Demais estudos podem ser realizados com o intuito de testar
os efeitos de C. echinatus em outras espécies de fungos. As propriedades anti-oxidantes de C.
echinatus, torna esta espécie um bom alvo de estudos para testes de fungitoxicidade.
Agradecimentos
À UENP e à Fundação Araucária.
Referências
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