Ferramentas biotecnológicas para o estudo funcional de genes
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Ferramentas biotecnológicas para o estudo funcional de genes Márcia Margis-Pinheiro Laboratório de Genética Vegetal Departamento de Genética Universidade Federal do Rio Grande do Sul http://www.ufrgs.br/RNAi/NGFP.htm Ferramentas biotecnológicas para o estudo funcional de genes Análises in silico Análise de promotores Avaliação da expressão gênica Superexpressão e silenciamento de genes Estudo da localização subcelular dos produtos gênicos Modificação Genética de Plantas: aplicações • Melhoramento genético •Biorreatores • Estudo funcional de genes Modificação Genética de Plantas: aplicações • Melhoramento genético •Biorreatores • Estudo funcional de genes PESQUISA BÁSICA Porque precisamos estudar a função dos genes? 1) Obstáculo para a manutenção e estabilidade da produção agrícola: susceptibilidade das plantas aos estresses ambientais (bióticos e abióticos); 2) Manipulação de características nutricionais: depende do conhecimento das vias que governam a síntese e o catabolismo dos metabólitos produzidos pela planta. Desafio... Identificar novos genes alvos para desenvolver estratégias eficientes para manipulação genética de plantas mais resistentes ao estresses ambientais ou que apresentem características novas e de interesse biotecnológico. Determinação de função de genes em plantas 1) Estudos de seqüenciamento e homologia 2) Estudo de expressão: - Quantificação dos níveis do produto gênico - Estudos de promotores (*) 3) Estudos de ganho de função - Superexpressão (*) - Expressão ectópica (*) 4) Estudos de perda de função (Gene knockout) - Alelos que ocorrem naturalmente - Mutações induzidas de deleções - Produção de mutantes insercionais (*) - Silenciamento gênico (*) (*) Estratégias que dependem da produção de plantas transgênicas Estudos de seqüenciamento e homologia Identificação de genes a partir do sequenciamento do DNA e atribuição de funções. O papel da Bioinformática: 1- Encontrar o gene; 2- Fazer predição (promotores, seqüência codificante, etc) 3- Classificar funcionalmente os genes Exemplo: Seqüenciamento do genoma da soja: ● ~46,000 genes que codificam proteínas. ● É preciso entender a função de um grande número de genes. ● Muitas das seqüências gênicas preditas precisam ser confirmadas experimentalmente ANOTAÇÃO DE SEQUÊNCIAS GÊNICAS http://www.phytozome.net/ http://www.phytozome.net/ Plantas transgênicas e o estudo da expressão gênica Regulação da expressão gênica: Regulação transcricional - Fatores de transcrição - Elementos-cis Plantas transgênicas e o estudo da expressão gênica ● Através do estudo de promotores é possível identificar a presença de elementos de regulação em cis essenciais para a expressão do gene. ● Esses estudos poderão revelar promotores de padrão de expressão específicos, os quais poderão ser úteis para a expressão controlada de genes de interesse em plantas transgênicas. ● Estudo de promotores • Isolamento da região promotora do gene • ~2 kb antes do códon de iniciação; • Amplificação do DNA genômico com primers específicos; • Clonagem no vetor pGEM-Teasy → pHGWFS7,0 pHGWFS7,0 KARIMI et. al., 2005 3'O CS Produção de vetores para o estudo do promotores GUS Lima et al, 2002 Padrão de expressão do gene P4 em Plantas Transgênicas de Tabaco Lima et al, 2002 Padrão de expressão do gene P4 em Plantas Transgênicas de Tabaco cultivadas a 28 ○ C (painéis superiores) e à 42○ C (painéis inferiores) Lima et al, 2002 Superexpressão 1) Produção de plantas transgênicas expressando níveis alterados do produto do gene em estudo. 2) Em seguida, o fenótipo dessas plantas pode ser analisado e correlacionado com os níveis de expressão do transgene. A superexpressão do gene é possível graças à utilização de promoteres fortes, em geral o promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), que em dicotiledôneas é expresso de maneira constitutiva. Silenciamento gênico Produção de plantas transgênicas expressando RNAi Silenciamento gênico mediado por RNA Waterhouse and Helliwell, 2003 Plantas transgênicas silenciadas – Tecnologia RNAi Chs_hairpin Chalcona sintase Moléculas de dsRNAs silenciada Hairpin - hp Bastam 18 a 26 nt ! Exemplos de Plantas Transgênicas com tecnologia RNAi : Batata resistente ao PVY ou PLRV Mamão resistente ao PRSV Soja menos alergênica – protease 30-kda Algodão com maior teor de ácido oléico Nt ASR silenced plants are sensitive to drought Ra01 (2007) (2007) (2008) (2009) Mortel et al., 2007 Expressão diferencial de genes que codificam para fatores de transcrição WRKY em resposta à Ferrugem Asiática Genes selecionados: GmWRKY20 GmWRKY Gm WRKY27 GmWRKY Gm WRKY46 GmWRKY Gm WRKY57 METODOLOGIA Identificação, isolamento e clonagem dos genes de interesse Construção de vetores para transformação vegetal (superexpressão e silenciamento por RNAi) Caracterização dos níveis de expressão gênica (qRT(qRT-PCR) sob diversas condições Transformação de soja e análises moleculares, bioquímicas e fenotípicas das plantas obtidas. Infecção pelo patógeno causador da Ferrugem Asiática • Coleta de amostras: Embrapa Soja (Londrina /PR), abril/2009 – Cultivar Embrapa–48 (Susceptível) x PI 561356 (Resistente) – Folhas controle x folhas inoculadas – Triplicatas biológicas – Variação temporal (horas após a inoculação): 1h 12h 24h 48h 96h 192h Superexpressão Silenciamento Construção dos cassetes gênicos Construção dos cassetes gênicos Confirmação da integração do transgene Técnica: PCR WRKY 57 - Superexpressão Embriões L 600 bp + + 1 2 3 4 5 Plantas 6 7 1 2 3 WT Confirmação da integração do transgene Técnica: PCR WRKY 27 – Silenciamento Plantas L 270 bp + 1 2 WT Confirmação da integração do transgene Técnica: expressão de GFP Expressão GFP observada um mês após a transformação em embriões resistentes à higromicina (B,C); (B,C); e em raízes (D) e tricomas foliares (F) de plantas aclimatadas. aclimatadas. Tecidos selvagens (WT) são mostrados em A, D e E. Aumento: Aumento: 40 40x x. Microscópio de fluorescência Olympus® (filtro BP, excitação – 488nm 488nm / emissão – 505505-530 nm). nm). Plantas obtidas Tabela 1. Número de linhagens transgênicas estabelecidas Gene Cultivar Bombardeamento Superex. WRKY 20 WRKY 27 WRKY 57 Silenciam. IAS-5 Superex. 5 Bragg 4 BRSMG 68 Vencedora 2 IAS-5 Bombardeam./ Agrobacterium 1 1 Confirmação do silenciamento do gene WRKY 27 Técnica: RT-qPCR Fig.1 Níveis de expressão (RTqPCR) do gene GmWRKY27 em plantas não transformadas e plantas da linhagem GmWRKY27-RNAi (Teste t de Student, p<0.05). WT WRKY 27 RNAi Bioensaio: Desenvolvimento de P. pachyrhizi em folhas destacadas 12 dias após a inoculação. Lesões WT Pústulas WRKY 27 RNAi Fig.2 A) Número de lesões e pústulas em plantas não transformadas e plantas da linhagem GmWRKY27-RNAi (Teste t de Student, p<0.05). (B) Lesões Tan e pústulas em folha de planta não transformada. (C) Lesões Tan e pústulas em folha de planta da linhagem GmWRKY27-RNAi. Localização subcelular do produto gênico Fusão traducional do gene em estudo com o gene da proteína GFP. RB p35S Fusão T35S NptII Transformação genética de células ou plantas. Análise no microscópio confocal. LB Exemplo:Localização subcelular da proteína codificada pelo gene OsAPx1 Localização subcelular da proteína codificada pelo gene OsAPx6 OsAPx6:GFP RB p35S OsAPx6 GFP T35S NptII LB Localização subcelular das proteínas OsAPX em protoplastos de plantas de arroz RB pUbi GFP Transgenic calli ASR5 lies in nucleus, cytosol and chloroplasts Protoplasts ASR5 T35S Hpt LB CONCLUSÃO A manipulação genética de plantas oferece inúmeras possibilidades de estratégias para o estudo da função e da regulação da expressão gênica.
