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Anais do Conic-Semesp. Volume 1, 2013 - Faculdade Anhanguera de Campinas - Unidade 3. ISSN 2357-8904
TÍTULO: EFEITO BIOLÓGICO ADVERSO DO BACTERICIDA TRICLOSAN SOBRE A OSTRA
ESTUARINA CRASSOSTREA RHIZOPHORAE.
CATEGORIA: CONCLUÍDO
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE
SUBÁREA: ECOLOGIA
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE SANTA CECÍLIA
AUTOR(ES): JÉSSICA TEIXEIRA SILVEIRA, JOÃO EMANOEL DE ALMEIDA
ORIENTADOR(ES): CAMILO DIAS SEABRA PEREIRA
COLABORADOR(ES): FABIO HERMES PUSCEDDU, FERNANDO SANZI CORTEZ
CATEGORIA CONCLUÍDO
Efeito Biológico Adverso do Bactericida Triclosan Sobre a Ostra Estuarina
Crassostrea rhizophorae.
1.
RESUMO
O presente estudo avaliou o efeito citotóxico dos compostos Triclosan em ostras da
espécie Crassostrea rhizophorae, que por serem organismos filtradores favorece a
eficiência das respostas aos ensaios ecotoxicológicos. Para tanto, foi utilizado o
método do Ensaio do Tempo de Retenção do Corante Vermelho Neutro (TRVN). As
concentrações testadas foram baseadas em estudos pretéritos que detectaram a
presença desse fármaco em ecossistemas aquáticos. Os resultados demonstraram a
capacidade do Triclosan em desestabilizar membrana lisossômica após 72 horas de
exposição em concentrações a partir de 120 ng/L de Triclosan. Estes resultados,
além dos dados consultados nas referências disponíveis apresentadas neste estudo,
apontam o risco ecológico desse composto, uma vez que as concentrações de efeito
observado já foram detectadas em matrizes ambientais e efluentes domésticos.
2.
INTRODUÇÃO
Segundo Lemos e Erdtmann (2000), o ambiente aquático, por ser um receptor de
diferentes
tipos
de
descargas
antropogênicas,
vêm
sofrendo
crescentes
contaminações por químicos diversos, que podem, ainda, se associar e formar
outras misturas mais complexas de constituição e ações desconhecidas.
Efluentes urbanos (domésticos e industriais) não possuem atualmente um
tratamento eficaz, eliminando todos os xenobióticos, por isso, após sair das
estações ainda podem conter compostos químicos perigosos e com potenciais
nocivos citotóxicos e genotóxicos à biota exposta (CLAXTON et al., 1998).
Dentre os poluentes encontrados em efluentes domésticos e industriais destacamse os fármacos e produtos de cuidados pessoais. A ocorrência desses compostos
residuais em águas superficiais e subterrâneas, bem como em sedimentos,
demonstra a necessidade de estudos que determinem os efeitos tóxicos dessas
substâncias no ambiente. Os efeitos podem ser observados em qualquer nível da
organização biológica: célula – órgãos - organismo - população - ecossistema (BILA
e DEZOTTI, 2003).
O Triclosan é um agente antibacteriano incorporadas numa ampla variedade de
produtos domésticos e de cuidados pessoais. Devido a pouca eficácia em eliminar
totalmente este químico em estações de tratamento de águas residuais, é um dos
1
CATEGORIA CONCLUÍDO
compostos de águas residuais orgânicos mais vulgarmente detectados para a
frequência e concentração. Além disso, devido à sua propriedade hidrofobica, a TCS
bioacumula em tecidos de organismos aquáticos. Sob estas condições, metil-o
triclosan (éter 2,4,4 '-tricloro-2'-methoxydiphenyl, MTCS) é produto principal da
fotodegradação do TCS, e embora MTCS ser menos encontrado no ambiente, seu
mecanismo de ação é semelhante e pode ocorrer em níveis mensuráveis. (GAUME
et. al., 2012).
A ecotoxicologia é a ciência que estuda os efeitos de compostos naturais ou
sintéticas sobre toda a biota e sobre ecossistemas terrestres ou aquáticos, que
constituem a biosfera, incluindo assim a interação das substâncias com o meio nos
quais os organismos vivem num contexto integrado (CAIRNS & NIEDERLEHNER,
1995).
Dentre os diversos ensaios ecotoxicológicos realizados com bivalves, destaca-se o
Ensaio do Tempo de Retenção do Corante Vermelho Neutro (TRVN). A avaliação da
integridade da membrana lisossômica, através do TRVN foi considerada a mais
confiável e recomendada técnica de biomarcadores para avaliação da qualidade da
água, de acordo com os resultados de um programa internacional de monitoramento
ambiental (UNEP, 1997).
Esse método baseia-se no fato de moluscos de expostos a poluentes
apresentarem um menor tempo de retenção do corante vermelho neutro pelos
compartimentos lisossômicos devido à redução da integridade e estabilidade da
membrana lisossomal (NASCIMENTO et. al., 2002).
3.
(i)
OBJETIVOS
Avaliar a citotoxidade do bactericida Triclosan em ostras Crassostrea
rhizophorae empregando-se o Ensaio do Tempo de Retenção do Corante Vermelho
Neutro (TRVN); (ii) avaliar a capacidade do Triclosan causar efeitos tóxicos em
concentrações ambientalmente relevantes; (iii) gerar subsídios para futuras
avaliações de risco ambiental desse composto e sua regulação pela legislação
pertinente.
4.
METODOLOGIA E DESENVOLVIMENTO
4.1. COLETA E MANUTENÇÃO DOS ORGANISMOS
As ostras da espécie Crassostrea rhizophorae (GUILDING, 1828) foram adquiridas
em uma fazenda de cultivo localizado em Cananéia - SP. Os organismos foram
2
CATEGORIA CONCLUÍDO
acondicionados em uma caixa térmica e transportados para o laboratório. No
laboratório, os organismos foram aclimatados em tanques contendo água do mar
filtrada por 03 dias, com aeração e temperatura de 25ºC até o momento da
realização dos ensaios.
4.2. TRICLOSAN
O Triclosan (TCS–2.4.4.– tricloro–2 hidroxi difenil éter) é um composto bactericida
muito utilizado em formulações de creme dental, creme facial, xampu, sabonetes,
desodorantes, e em diversos tipos de materiais como embalagens de gêneros
alimentícios, adesivos, brinquedos, polietileno, sapatos, selantes, tintas, colchão,
roupas, cortinas de chuveiro, pisos, toldos e rejuntes (USEPA, 2008).
Encontra-se na molécula do biocida um grupo fenol e átomos de cloro substituídos.
Possui massa molecular de 289,54 g/mol, é pouco solúvel em águas (12 mg/L a 20
ºC), exceto quando há pH alcalino. O composto apresenta maior solubilidade em
solventes orgânicos. Apresenta estabilidade térmica elevada, o que permite sua
incorporação em vários materiais plásticos (SCHWEIZER, 2001).
É um composto não ionizável em pH neutro (pKa de 8,1) e relativamente não
volátil, com uma pressão de vapor de 4×10-6 mmHg (ORVOS et. al., 2002). Possui
um coeficiente de partição octanol-água relativamente alto (log Kow de 5,4), o que
sugere que esse composto possa ser absorvido em sedimentos de ambientes
aquáticos (SINGER et. al., 2002) por sólidos, material particulado e sedimento, além
de poder bioacumular em tecidos orgânicos gerando efeitos tóxicos ao ecossistema
envolvente (MELO et. al., 2000).
O Triclosan age inibindo enzimas específicas da membrana celular, além de
colaborar para sua desorganização. Atinge tanto bactérias Gram-positivas como
Gram-negativas, fungos e alguns vírus (TORRES et. al., 2003). Quando
biodisponível no ambiente acaba por atingir organismos com sítios ativos
semelhantes.
4.3.
PREPARO DAS SOLUÇÕES-TESTE
Para realização de cada experimento, foi preparada uma solução mãe de 0,01g
de Triclosan solubilizado em 10 mL do solvente DMSO e avolumadas para um litro
de água do mar com salinidade de 25 ppm, a partir dela foram feitas soluções-testes
em diretamente em cada aquário de 20 litros. As concentrações pré-liminares
testadas foram determinadas a partir de estudos pretéritos de toxicidade crônica do
Triclosan (AGUERRA et. al., 2003; ORVOS et. al, 2002; CORTEZ, et. al. 2012).
4.4. ENSAIO DO TEMPO DE RETENÇÃO DO CORANTE VERMELHO NEUTRO
3
CATEGORIA CONCLUÍDO
O Ensaio do Tempo de Retenção do Corante Vermelho Neutro avaliou os efeitos
tóxicos do Triclosan sobre a integridade/estabilidade da membrana lisossômica da
ostra C. rhizophorae de acordo com o método descrito por Lowe et. al. (1995).
Esse método detecta alterações das membranas lisossômicas, podendo indicar
respostas celulares a diferentes contaminantes. No caso das ostras, sabe-se que o
principal responsável pelo seqüestro e acumulação de metais tóxicos e xenobióticos
orgânicos é o lisossomo, e também tem um papel chave no processo de
detoxificação e posterior excreção desses compostos (MOORE, 1985; VIARENGO
et. al., 1987).
Para avaliação dos efeitos citotóxicos do Triclosan, os organismos (n = 10) foram
expostos a três diferentes concentrações do composto, além do controle de água. O
tempo de exposição foi de 72 horas, à 25ºC (± 2ºC), com aeração constante e com
ausência parcial de luz.
Após o período de 72 horas de exposição dos organismos, foram retirados 0,5 ml
da hemolinfa do músculo adutor posterior de cada ostra, com uma seringa
hipodérmica contendo 0,5 ml de solução fisiológica (com pH 7,36 e salinidade
ajustada para 20). Os materiais coletados foram transferidos para tubos de
microcentrífuga com capacidade de 2 mL. Em seguida foram pipetados 40 μl de
cada solução de hemolinfa sobre lâminas tratadas previamente com poly-L-lisina
(1:10), e incubadas em câmara escura e úmida por 15 minutos. Após este período,
40 μl de solução de vermelho neutro foram adicionados à hemolinfa presente em
cada lâmina, e o conjunto foi incubado por mais 15 minutos. As lâminas foram
observadas com auxílio de microscópio (400x) em intervalos de 15 minutos.
O tempo de retenção do vermelho neutro pelos lisossomos foi obtido pela
estimativa da proporção de células que tiverem o corante liberado para o citosol e/ou
anormalidades no tamanho, cor dos lisossomos e formato das células.
Hemócitos saudáveis são grandes e apresentam forma irregular e, uma vez
expostos ao vermelho neutro, seus lisossomos podem ser vistos como pequenos
pontos rosados aglomerados. O núcleo pode ser visto como uma esfera incolor
assim como o citosol. Hemócitos estressados tendem a ser esféricos e menores
contendo lisossomos maiores e escuros e o citosol pode aparecer tingido de rosa
pela liberação do corante contido nos lisossomos (KING, 2000), como mostram as
Figuras 01. e 02.
4
CATEGORIA CONCLUÍDO
Figura 01. Células saudáveis
Figura 02. Células estressadas
ANÁLISE DOS DADOS
Para a contagem das células foi utilizada uma tabela onde, para mais que 50%
das células observadas sem sinais de stress, usou-se o sinal + (positivo) para o
animal examinado. O “end-point” foi determinado quando 50% ou mais das células
exibiram anomalias estruturais ou vazamento do corante para o citosol, e o sinal –
(negativo) foi marcado na tabela (KING, 2000). O estado de integridade da
membrana lisossômica pode ser refletido pelo tempo necessário para que ocorra o
extravasamento do corante vermelho neutro para o citosol, o tempo de retenção
médio para cada concentração é calculado pelo tempo em minutos de cada animal
analisado. Os dados obtidos foram analisados através de análise de variância
(ANOVA) e complementados pelos testes Post-hoc de Newman – Kells e Dunnets,
para verificar diferenças significativas (p < 0.05 e p > 0.001) entre os tempos médios
de retenção do corante vermelho neutro nos organismos do grupo controle e dos
organismos expostos às diferentes concentrações dos compostos.
5.
RESULTADOS
No ensaio pré-liminar o Triclosan apresentou citotoxicidade nas concentrações de
120 ng.L-1 e 1200 ng.L-1, após 72 horas de exposição. Na realização dos estudos
definitivos as concentrações testadas foram com de menor gradiente e valores mais
próximos. Pode se observar que o efeito persistiu na concentração de 120 ng.L -1,
porém sem manifestar alterações significativas em relação ao controle na
concentração de 100 ng.L-1 (Figura 03).
Figura 03. Resultado dos ensaios preliminar e definitivos de citotoxicidade do bactericida Triclosan.
*
representa diferença significativa do controle (Test T – p<0,05).
A ocorrência de fármacos e produtos de higiene e cuidados pessoais
(micropoluentes) em matrizes ambientais (água superficial, água de abastecimento e
5
CATEGORIA CONCLUÍDO
sedimentos) e em efluentes de estações de tratamento de esgotos vem sendo
comprovada nas últimas décadas. Em diferentes países, estes compostos têm sido
encontrados no ambiente aquático em concentrações que variam de pg/L a µg/L
(TERNES et al., 1999; AGUERA et al., 2003; YU et al., 2006; ELLIS, 2006;
LARSSON et al., 2007; NISHI et al., 2008; KUSTER et al., 2008;).
Visando à proteção da biota aquática, torna-se desejável progredir da identificação
e quantificação da presença desses contaminantes para uma avaliação de sua
biodisponibilidade e seus efeitos. Diversos estudos vêm alertando a ocorrências do
bactericida Triclosan nos ecossistemas aquáticos (Cortez et al. 2011).
Estudo realizado por HEATH et al. (2001) demonstra a capacidade do composto de
inibir a síntese de ácidos graxos, além de poder interagir com os fosfolipídios da
membrana e prejudicar a função mitocondrial (CANESI et al., 2007) de forma a
desestabilizar membranas lisossômicas.
A redução da integridade da membrana lisossomal implica em estresse fisiológico,
já que o lisossomo para diversos organismos (principalmente bivalves) está
diretamente relacionado à imunorreatividade, desempenhando um papel central na
degradação de materiais fagocitados. Alterações em sua membrana podem resultar
em redução do crescimento e do potencial reprodutivo de bivalves (MOORE e
VIARENGO, 1987), além de degeneração dos tecidos por processos autofágicos.
Desse modo este trabalho demonstra que, em situações controladas de laboratório,
o Triclosan foi capaz de desestabilizar a membrana lisossômica de ostras a partir da
concentração de 120 ng/L.
No estudo realizado por CORTEZ (2012) os danos a membrana lisossômica
sofridas pelo Triclosan, empregando o ensaios de citotoxicidade com mexilhões
Perna perna, foram encontradas nas concentrações de 120 ng/L com 48 horas de
exposição, e 12 ng/L com exposição de 72 horas.
COOGAN et al. (2007) em seu estudo indica que o Triclosan pode bioacumular em
organismos marinhos de diferentes níveis tróficos Determinaram através do peso
fresco de algas do gênero Cladophora sp, coletadas em uma ETE do norte do Texas
– USA, fatores de bioacumulação que variaram de 900 a 2100150 ng/g, e a
concentração de Triclosan nas Algas variou de 100 a 150 ng/g.
Foram descritos efeitos citotóxicos agudo em células do sistema imunológico
(hemócitos) e em células de função respiratória (células de emalhar) do gastropode
abalone exposto ao biocida (GAUME et.al., 2012). A IC50 foi avaliada a 6 uM, tanto
para as células de hemócitos e das guelras, após uma incubação de 24 h com o
6
CATEGORIA CONCLUÍDO
composto. Além disso, pode ser observado ainda nesse estudo efeitos na morfologia
e na densidade de hemócitos, e uma diminuição do metabolismo destas células
quando foram expostos a 8 mM de
Triclosan. O Metil-Triclosan (produto da
degradação do Triclosan) apresentou uma citotoxicidade significativa após
exposição de 24 h de incubação de hemócitos expostas a 4 uM, comprovando que o
MTCS pode ser considerado igualmente tóxico em menores concentrações.
Lin et. al., (2010) observaram que o Triclosan gerou efeitos nocivos em celomócitos
de Eisenia fetida em níveis bioquímicos e genéticos. Observou-se que o Triclosan
altera as atividades de enzimas antioxidantes dos organismos, de acordo com
concentração e tempo de exposição. O composto age potencializando as atividades
de CAT e GST durante um curto tempo de exposição superando dados obtidos pelo
controle, seguido de uma queda na taxa de atividade. Enquanto que em tempo de
exposição prolongado a resposta enzimática foi de queda na atividade para níveis
bem inferiores àquelas encontradas no controle. sta hipótese é confirmada pelos
dados obtidos por Canesi et. al. (2007) já indicavam em seus estudos que o
Triclosan inibiu a atividade da catalase de CAT em hemócitos de M. galloprovincialis.
Lin et. al., (2010) também observaram com a realização do teste do cometa, que o
Triclosan impactou geneticamente E. fetida, tendo como lócus de efeito os
filamentos de DNA; enquanto que um estudo realizado por Ciniglia et. al., (2005)
implicou que o composto inibiu o crescimento vegetativo de microalga Closterium
ehrenbergii a 0,5 mg/L. Os efeitos sobre a reprodução indicam que o número
zigospórios foi significativamente reduzido após aplicação de 0,937 mg/L. O ensaio
do cometa mostrou que o tratamentos com Triclosan conduziu a um dano do DNA
na concentração de
0,25 mg/L causando efeitos genotóxicos significativos. Em
concentrações mais elevadas apontou danos irreversíveis aos filamentos de DNA.
Estes estudos pretéritos, aliados aos resultados obtidos no presente estudo,
demonstram os riscos ecológicos deste composto no ambiente aquático, já que a
maioria destas concentrações são inferiores a aquelas detectadas no ambiente.
6.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O Triclosan causou citotoxicidade em ostras da espécie Crassostrea rhizophorae a
partir da concentração de 120 ng/L em condições controladas de laboratório,
demonstrando a capacidade de desestabilizar membranas lisossômicas de espécies
não-alvo, e gerar estresse fisiológico.
7
CATEGORIA CONCLUÍDO
Nosso estudo demonstra a necessidade de uma futura regulação do descarte de
Triclosan no ambiente aquático a partir da identificação de concentrações seguras
que diminuam o risco ecológico.
Nossos resultados também demonstram que estudos ecotoxicológicos empregando
biomarcadores e orientados pelo modo de ação dos fármacos proporcionam
informações relevantes para avaliação de efeitos adversos, uma vez que
contemplam os órgãos alvos e os efeitos biológicos precoces (“early warning”), o
que
possibilita
uma
melhor
avaliação
da
toxicidade
em
concentrações
ambientalmente relevantes. Além disso, a utilização de biomarcadores pode
embasar avaliações de risco ambiental e tomadas de decisões mais protetivas, a
partir da investigação de efeito em níveis inferiores de organização biológica
(bioquímico, celular) e previsão de efeitos em níveis superiores (população e
comunidade).
7.
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