DEGRAÇÃO DO FIBRINOGÊNIO POR METALOPROTEASE

METALOPROTEASE DEPENDENTE DE ZINCO PRESENTE NO VENENO
DA VESPA Polybia occidentalis.
Pâmela Cristina Mertz (IC-voluntária - Unicentro), Larissa Pires Kikuti (ICvoluntária - Unicentro), Alessandra Zatt Schardosin (IC-voluntária - Unicentro).
Marta Chagas Monteiro (Orientadora – Dep. de Farmácia/Unicentro).
e-mail: [email protected]
Palavras-chave: metaloprotease, Polybia occidentalis, fibrinogênio.
Resumo
Os venenos de animais e insetos vêm sendo investigados para a determinação
de seus componentes ativos e para o entendimento da influência dos mesmos
nos processos homeostáticos. Nossos estudos indicam que o veneno da vespa
Polybia occidentalis, tem em sua composição uma metaloprotease, que atua na
cascata de coagulação, degradando o fibrinogênio, o que contribui para a ação
anticoagulante do veneno. Sendo que a ação dessa metaloprotease pode ser
inibida por EDTA, EGTA e íons Ca2+ e potencializada por íons Zn2+, o que
demonstra sua dependência a esse íon.
Introdução
Estudos já realizados com o veneno de animais e insetos peçonhentos como
aranhas, cobras e serpentes demonstraram que os principais componentes do
veneno que possuem atividade fibrinolítica são as metaloproteases 1,2,3,4. O
veneno de vespas e abelhas é constituído por uma mistura de vários
componentes bioquímicos e farmacologicamente ativos, como pequenos
peptídeos (mastoparan e peptídeo quimiotático), aminas vasoativas (histamina,
serotonina, dopamina e norepinefrina) e uma série de proteínas de alto peso
molecular, tais como: antígeno 5, fosfolipase (PL) A (PLA1 e PLA2) e B,
fosfatase ácida, proteases, hialuronidase e nucleotidases 5. Diante desse
grande número de componentes ativos presentes no veneno de himenópteros,
é de grande interesse da área biotecnológica, o estudo de atividades biológicas
desencadeadas por esses componentes, visando à produção de novos
fármacos6. Em nossos estudos através de ensaios de coagulação foi possível
observar que o veneno da Polybia occidentalis possui componentes com
atividade anticoagulante. Além disso, nossos dados mostraram que o veneno
possivelmente possui uma metaloprotease capaz de clivar a cadeia beta do
fibrinogênio de maneira dose dependente. As metaloproteases apresentam
efeito sobre componentes da coagulação, digerindo proteínas envolvidas no
processo da cascata de coagulação do sangue, como o fibrinogênio, fibrina e o
fator Von Willebrand. Tais proteases podem ser α ou β fibrinogenases,
degradando a cadeia α ou a cadeia β do fibrinogênio, ou ambas 7,8. Diante
disto, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito dos metais na atividade
fibrinogenolítica do veneno.
Materiais e métodos
Preparação da amostra.
As vespas foram capturadas de regiões de mata no Parque das Araucárias, em
Guarapuava-PR e levadas ao laboratório onde foram armazenadas a
-20ºC. Posteriormente, as glândulas foram removidas com o auxílio de pinças
e microscópio. As glândulas intactas foram colocadas em 500μL de solução
salina 0,09% em tubos de plástico, agitadas em Vortex, centrifugadas e
liofilizadas.
Teste de dosagem de fibrinogênio in vitro
Nos experimentos foram utilizados o Kit Wiener Lab, cujas amostras de 200 μL
de plasma foram diluídas com 1800 μL do tampão Imidazol foram préaquecidos por 2 minutos em banho-maria a 370C. Em seguida, 200µL do
plasma diluído foi incubado por aproximadamente 1 minuto com as seguintes
substâncias: veneno (4.4 μg) na presença ou ausência de EDTA, EGTA, Ca 2+
(CaCl2) ou Zn2+ (ZnSO4). Finalmente, 100 μL de trombina foi adicionada às
amostras pré-incubadas e o tempo de formação de coágulo foi cronometrado
em segundos. Os experimentos foram realizados em triplicata, considerando a
média dos tempos observados. O cálculo da concentração de fibrinogênio foi
feito a partir da curva padrão contida no Kit.
Concentração de fibrinogênio
(mg/dL)
400
300
#
#
#
#
*# * #
*#
200
*
100
0
Plasma
*#
*#
EDT A EGT A Ca +2 Zn +2
EDT A EGT A Ca +2 Zn +2
Venom
*P 0.05 comparado ao plasma (controle -)
#
P 0.001 comparado ao veneno (4.4g)
Resultados e Discussão
Verificou-se que o veneno diminuiu a concentração do fibrinogênio presente no
plasma humano. As adições de EDTA (um inibidor da coagulação e quelante
de cálcio), EGTA (quelante de cálcio e magnésio) e Ca2+ na amostra de plasma
incubada com o veneno foram capazes de inibir a ação da fibrinogenase
contida nesse veneno, uma vez que a concentração de fibrinogênio retornou
aos níveis basais no plasma humano após a incubação com esses compostos,
mostrando que a fibrogenase contida é uma metaloprotease. Esse dado
também sugere que o íon cálcio é um cátion importante no bloqueio da
atividade enzimática dessa fibrinogenase. Por outro lado, o Zn2+, potencializou
as atividades enzimáticas da protease, demonstrando que a fibrinogenase
presente no veneno da vespa Polybia occidentalis é uma metaloprotease
dependente de zinco. Experimentos similares com veneno de cobras
demonstram que muitas das enzimas fibrinogenolíticas de peçonha são
metaloproteases dependentes de zinco. Membros desta família são assim
chamados em virtude de apresentarem átomo de zinco em suas moléculas, o
qual é essencial para sua ação catalítica. Nesse sentido, estudos, onde se
disponibiliza o íon zinco junto ao plasma, demonstram que o mesmo impede
mudanças conformacionais e evita perda da atividade da protease. Essas
enzimas fibrinogenolíticas de peçonhas de serpentes têm sido muito usadas
para o tratamento e prevenção de disfunções cardiovasculares. Esse fato
ocasiona uma rápida diminuição do fibrinogênio in vivo, causando um efeito
anticoagulante e diminuição da viscosidade do sangue. Vários estudos
revelaram que essas enzimas induzem trombólise de forma consistente, eficaz
e segura9.
A similaridade nos resultados de testes de degradação de fibrinogênio
realizados com venenos de cobras e vespas demonstra funções análogas das
proteases contidas em ambos os venenos. Vista a utilização farmacológica das
proteases contidas no veneno de cobras, abre-se também a possibilidade de
utilização das proteases do veneno de vespas para esses fins farmacológicos.
Conclusões
A partir desses dados, concluímos que o veneno da vespa Polybia Occidentalis
possui em seus componentes uma metaloprotease, que contribui para a ação
anticoagulante do veneno provocando a degradação do fibrinogênio. Sendo
que a ação dessa metaloprotease pode ser inibida por EDTA, EGTA e íons
Ca2+ e potencializada por íons Zn2+, o que demonstra sua dependência a esse
íon.
Referências
1. da SILVEIRA, R.B.; FILHO, J.F.S.; MANGILI, O.C.; VEIGA, S.S.; GREMSKI,
W.; NADER, H.B.; DIETRICH, C.P. Identification of proteases in the extract of
venom glands from brown spiders. 2002.
2. COMINETTI, M.R. Estudos dos efeitos das metaloproteases/desintegrinas
isoladas do veneno da serpente Bothrops alternatus sobre a adesão celular e
expressão gênica. 2004.
3. BJARNASON, J.B. Hemorragic metalloproteinases from snake venoms.
1994.
4. SANCHÉZ, L.T.G. Subclonagem e expressão do domínio catalítico da
jararagina: estudo do efeito das modificações pós-traducionais na atividade
hemorrágica. 2004.
5. HABERMANN, E. Bee and wasp venoms, Science: v117, p. 314-322, 1972.
6. MARKLAND J.R, F.S. Snake venoms and the hemostatic system. Toxicon. v.
36, p.1749-1800, 1998.
7. MARKLAND, F.S. Snake venom fibrogenolytic and fibrinolytic enzymes: an
updated ventory, Thromb. Haemost, v.79, p. 668-674, 1998.
8. MAZZI, M.V. Caracterização funcional e estrutural de uma metaloprotease
hemorrágica isolada da peçonha de Bothrops jararacussu. 2005.
9. COSTA, J.O; OLIVEIRA, M. C; HAMAGUCHI, A.; OLIVEIRA, F.;
BRANDEBURGO H.I.M. Cromatografia de uma fração proteolítica obtida
no fracionamento da peçonha bruta de Bothrops alternatus e
caracterização bioquímica de suas subfrações. Revisão Bibliográfia –
Revista Eletrônica da PROPP, Edição nº 4, 2005.