avaliação da atividade cardioprotetora da piridostigmina veiculada

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
ESCOLA DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CARDIOPROTETORA DA
PIRIDOSTIGMINA VEICULADA EM LIPOSSOMAS
MULTILAMELARES ADMINISTRADOS POR VIA
SUBCUTÂNEA
ANA CAROLINA MOREIRA SOUZA
OURO PRETO- MG- BRASIL
Agosto de 2013
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
ESCOLA DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE CARDIOPROTETORA DA
PIRIDOSTIGMINA VEICULADA EM LIPOSSOMAS
MULTILAMELARES ADMINISTRADOS POR VIA SUBCUTÂNEA
ANA CAROLINA MOREIRA SOUZA
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pósgraduação em Ciências Farmacêuticas da Escola de
Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto para
obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Linha de Pesquisa: Química e Farmacologia de Substâncias
Bioativas
Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos
Orientadora: Profa. Dra. Andrea Grabe Guimarães
Co-orientadora: Profa. Dra. Neila Márcia Silva Barcellos
Ouro Preto
Escola de Farmácia – UFOP
Agosto 2013
ii
A779a
Souza, Ana Carolina Moreira.
Avaliação da atividade cardioprotetora da piridostigmina veiculada em
lipossomas multilamelares administrados por via subcutânea [manuscrito] /
Ana Carolina Moreira Souza – 2013.
87 f.: il. Color.; grafs., tabs.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Andrea Grabe Guimarães.
Co-orientadora: Profa. Dra. Neila Márcia Silva Barcellos.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de
Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Fármacos e Medicamentos
1. Piridostigmina - Teses. 2. Pressão arterial - Teses. 3. CardiografiaTeses. - Teses. 5. Medicamentos – Administração - Teses. I. Guimarães,
Andrea Grabe. II. Souza, Jacqueline de. II. Barcelos, Neila Márcia Silva. III.
Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Título.
CDU: 615.015.11
Catalogação: [email protected]
iv
“É melhor tentar e falhar, que preocupar-se e ver a vida
passar; é melhor tentar, ainda que em vão, que sentar-se
fazendo nada até o final. Eu prefiro na chuva caminhar,
que em dias tristes em casa me esconder. Prefiro ser feliz,
embora louco, que em conformidade viver...”.
(Martin Luther King).
iii
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, Celso e Neide, meus
maiores incentivadores e pilares de minha vida, onde sei que
sempre posso me apoiar. Vocês são meu exemplo de vida!
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ser meu guia, iluminando sempre os meus caminhos para que eu pudesse
chegar até aqui.
Aos meus pais, Celso e Neide, pelo incentivo, por sempre acreditarem em meu
potencial e por me apoiarem em todos os momentos de minha vida.
Aos meus irmãos, Camilo e Mariana, pelo carinho e apoio, pois apesar da distância
sempre estavam dispostos a me ajudar.
Ao meu namorado Luiz Rafael, meu melhor amigo e grande amor, pela confiança,
companheirismo, carinho e incentivo.
À Professora Andrea Grabe Guimarães que acreditou em meu potencial como aluna e
pessoa desde os primórdios de minha graduação. Agradeço pelo tempo dedicado a mim, com
ensinamentos científicos e de vida. Obrigada pela amizade, paciência e carinho.
À Professora Neila Márcia Silva Barcellos, pela orientação em boa parcela deste
trabalho. Obrigada pela paciência, oportunidade, confiança e ensinamentos.
Ao Professor Frezard pela colaboração em momentos de dificuldades.
Ao Professor Homero Nogueira Guimarães e ao Adriano Cardoso pelo
desenvolvimento do sistema de aquisição de dados e pelo suporte concedido desde o início
dos experimentos.
Aos Professores Carla Penido Serra e Romulo Leite, pela disposição em ajudar e
orientações na resolução de dificuldades.
A Professora Dênia Antunes Saúde Guimarães e aos alunos do Laboratório de
Farmacognosia, em especial a doutoranda Zilma, pela disponibilização e ajuda no uso do
espectrofotômetro.
À Alessandra Teixeira Vidal Diniz pela colaboração tão preciosa neste trabalho.
À Gisele Vieira Radovalho pela paciência e disposição em ajudar na resolução das
dificuldades.
Aos amigos do laboratório de Farmacologia Experimental, em especial, Thales,
Wallace, Cínthia, Nívea e Gabriela. Muito obrigada a Quênia e Sherliane pela amizade,
paciência e preciosa ajuda nos experimentos e análise de dados. Obrigada pela grande
contribuição neste trabalho para que ele se concluísse.
v
Ao Sr. Wilson Silvestre pela disponibilidade em me ajudar sempre que precisei.
À República Carpe Diem, pela amizade, aconchego e pelos bons momentos vividos
juntas.
À UFOP e ao CIPHARMA por fornecer suporte em toda minha formação academica e
para a concretização deste trabalho.
A CAPES pela bolsa concedida a mim.
À FAPEMIG E REDE NANO pelo suporte técnico e financeiro.
A TODOS AQUELES QUE CONTRIBUIRAM DE FORMA DIRETA OU INDIRETA PARA A
COCRETIZAÇÃO DESTE TRABALHO, MUITO OBRIGADA!
vi
RESUMO
A piridostigmina (PIR), um agente anti-colinesterásico reversível, apresenta efeitos
cardioprotetores
demonstrados
pela
redução
da
dispersão
do
intervalo
QT
do
eletrocardiograma (ECG) em repouso em portadores de cardiopatias e do prolongamento do
intervalo QT induzido por esforço ou, experimentalmente, por estimulação adrenérgica. No
entanto, sua curta meia-vida de eliminação e incidência de efeitos adversos são fatores que
limitam o seu uso prolongado. Este trabalho teve por objetivo principal a investigação da
atividade cardioprotetora da piridostigmina veiculada em lipossomas convencionais
multilamelares administrados por via subcutânea. Para isso, foi validado método
espectrofotométrico em 270 nm para quantificação lipossomal de PIR. Este demonstrou ser
linear entre 0,02-0,09 mg.ml-1. A precisão do método foi determinada intra e inter-dia,
obtendo-se como resultados coeficiente de variação entre 1,73 a 2,72 % e 0,32 a 2,32 %,
respectivamente. A exatidão variou entre 99,45 e 101,12 %. O método não se alterou em
decorrência da matriz lipossomal. Duas formulações lipossomais multilamelares foram
desenvolvidas: uma constituída de dioleil-fosfatidilcolina (DOPC) e colesterol (CHOL) ou
outra constituída de distearoil-fosfatidilcolina (DSPC) e CHOL. A eficiência de encapsulação
foi determinada em 15,4 % e 23,4 %, respectivamente. O método proposto demonstrou
especificidade, precisão, exatidão sendo capaz de quantificar a PIR em lipossomas. A
atividade cardioprotetora de PIR foi avaliada in vivo em ratos Wistar, por sua capacidade em
impedir as alterações cardiovasculares, demonstradas nos sinais de pressão arterial (PA) e
ECG, induzidas pela administração I.V. de noradrenalina (NA). Após administração de
10 µg/kg de NA, as formulações lipossomais DSPC e DOPC contendo PIR foram capazes de
reduzir significativamente o prolongamento do intervalo QT, com máximos de inibição de
76,4 % e 73,0 %, respectivamente. Ambas as formulações, DSPC:CHOL e DOPC:CHOL,
atenuaram o aumento da pressão arterial em até 12 e 24 horas respectivamente. Como o
prolongamento do intervalo QT é um preditor de morte súbita e a PIR foi capaz de impedir
seu prolongamento após a estimulação simpática, pode-se concluir que o brometo de
piridostigmina veiculado em lipossomas e administrado por via subcutânea possui atividade
cardioprotetora.
Palavras-chave: cardioproteção, lipossomas, Piridostigmina. ECG, pressão arterial.
vii
ABSTRACT
Pyridostigmine (PIR), a reversible anticholinestesic, has its cardioprotective effects
demonstrated by the reduction of the QT interval of the electrocardiogram (ECG) dispersion
at rest in patients with heart disease and QT prolongation induced by exertion or
experimentally by adrenergic stimulation. However, its short half-life and the incidence of
side efects are factors that limit its prolonged use. This study was aimed to investigate the
cardioprotective activity of pyridostigmine conveyed in conventional multilamellar liposomes
administered subcutaneously. A spectrophotometric method was validated for quantification
at 270 nm of liposomal PIR. It was linear between 0.02 to 0.09 mg.ml-1. The accuracy of the
method was determined in and between day, and the results obtained were 1.73 to 2.72% , and
0.32 to 2.32 %, for variation coefficient, respectively. The accuracy ranged between 99.45 and
101.12 %. The method was not affected by the liposomal matrix. Two multilamellar
liposomal formulations were developed: one consisting of dioleil phosphatidylcholine
(DOPC) and cholesterol (CHOL) and the other consisting of distearoyl phosphatidylcholine
(DSPC) and CHOL. The encapsulation efficiency determined was 15.4 % and 23.4 %
respectively. The proposed method showed specificity, precision, accuracy being adequate to
quantify PIR in liposomes. The cardioprotective activity of PIR was evaluated in vivo in rats
for its ability to prevent cardiovascular disorders, demonstrated in signs of blood pressure
(BP) and ECG induced by IV administration of noradrenaline (NA). After administration of
10 mg/kg NA, the DSPC and DOPC liposomal formulations containing PIR were able to
reduce significantly the QT interval, with a maximum inhibition of 76.4 % and 73.0 %
respectively. Both formulations DSPC: CHOL and DOPC: CHOL, attenuated the increase in
BP within 12 to 24 hours respectively. As the QT prolongation is a predictor of sudden death
and the PIR was able to prevent its prolongation after sympathetic stimulation, it could be
suggested that PIR in liposomes administered subcutaneously has cardioprotective activity.
Keywords: cardioprotection, liposomes, Pyridostigmine. ECG, blood pressure.
viii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Características estruturais dos lipossomas................................................................. 6
Figura 2: Representação esquemática dos tipos de lipossomas ................................................ 6
Figura 3: Traço normal do ECG ............................................................................................. 18
Figura 4: Perfil de liberação de piridostigmina da formulação lipossomal (37 mg/ml). ........ 27
Figura 5: Variação percentual da PAS após administração I.V. de 1 µg/kg de NA, 1, 2, 4, 6,
8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose de 1
mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10
mg/kg................................................................................................................................ 32
Figura 6: Variação percentual da PAD após administração I.V. de 1 µg/kg de NA, 1, 2, 4, 6,
8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose de 1
mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10
mg/kg... ............................................................................................................................. 33
Figura 7: Variação percentual da PAS após administração I.V. de 3 µg/kg de NA, 1, 2, 4, 6,
8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose de 1
mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10
mg/kg. ............................................................................................................................... 34
Figura 8: Variação percentual da PAD após administração I.V. de 3 µg/kg de NA, 1, 2, 4, 6,
8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose de 1
mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10
mg/kg.. .............................................................................................................................. 35
Figura 9: Variação percentual da PAS após administração I.V. de 10 µg/kg de NA, 1, 2, 4, 6,
8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose de 1
mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10
mg/kg. ............................................................................................................................... 36
Figura 10: Variação percentual da PAD após administração I.V. de 10 µg/kg de NA, 1, 2, 4,
6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose
de 1 mg/kg e piridostigmina na formulação lipossomal DSPC e DOPC na dose de 10
mg/kg.. .............................................................................................................................. 37
Figura 11: Variação percentual do intervalo QT após administração I.V. de 1 µg/kg de NA, 1,
2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na
dose de 1 mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de
10 mg/kg. .......................................................................................................................... 40
ix
Figura 12: Variação percentual do índice QTc após administração I.V. de 1 µg/kg de NA, 1,
2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na
dose de 1 mg/kg e e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose
de 10 mg/kg. ...................................................................................................................... 41
Figura 13: Variação percentual do intervalo QT após administração I.V. de 3 µg/kg de NA, 1,
2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na
dose de 1 mg/kg e e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose
de 10 mg/Kg. ..................................................................................................................... 42
Figura 14: Variação percentual do intervalo QTc após administração I.V. de 3 µg/kg de NA,
1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na
dose de 1 mg/kg e e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose
de 10 mg/Kg. ..................................................................................................................... 43
Figura 15: Variação percentual do intervalo QT após administração I.V. de 10 µg/kg de NA,
1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na
dose de 1 mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de
10 mg/Kg........................................................................................................................... 44
Figura 16: Variação percentual do índice QTc após administração I.V. de 10 µg/kg de NA, 1,
2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na
dose de 1 mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de
10 mg/Kg........................................................................................................................... 45
Figura 17: Variação percentual de PAS, PAD, intervalo QT e índice QTc após administração
I.V. de 3 µg/kg de NA,12 horas após a administração S.C. de salina e piridostigmina na
formulação lipossomal DSPC nas doses de 10 e 20 mg/kg. ............................................. 46
Figura 18: Variação percentual de PAS, PAD, intervalo QT e índice QTc após administração
I.V. de 10 µg/kg de NA,12 horas após a administração S.C. de salina e piridostigmina na
formulação lipossomal DSPC nas doses de 10 e 20 mg/kg.. ............................................ 47
x
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Delineamento grupos/doses/tempo de estudo ......................................................... 17
Tabela 2: Avaliação da linearidade a partir da análise de oito concentrações de brometo de
piridostigmina. .................................................................................................................. 21
Tabela 3: Determinação da precisão intra-dia a partir da análise de três concentrações de
brometo de piridostigmina. ............................................................................................... 21
Tabela 4: Determinação da precisão inter-dia a partir da análise de três concentrações de
brometo de piridostigmina. ............................................................................................... 22
Tabela 5: Determinação da exatidão a partir da análise de três concentrações de brometo de
piridostigmina. .................................................................................................................. 22
Tabela 6: Determinação do parâmetro limite de quantificação por meio de concentrações
decrescentes de brometo de piridostigmina. ..................................................................... 23
Tabela 7: Parâmetros de caracterização das formulações lipossomais. .................................. 24
Tabela 8: Valores absolutos de parâmetros da PA e do ECG após administração de 1 µg/kg
de NA (basal e 15 segundos após) em animais previamente tratados com piridostigmina
em lipossomas de DSPC administrado por via S.C.. ........................................................ 48
Tabela 9: Valores absolutos de parâmetros da PA e do ECG após administração de 3 µg/kg
de NA (basal e 15 segundos após) em animais previamente tratados com piridostigmina
em lipossomas de DSPC administrado por via S.C.. ........................................................ 49
Tabela 10: Valores absolutos de parâmetros da PA e do ECG após administração de 10µg/kg
de NA (basal e 15 segundos após) em animais previamente tratados com piridostigmina
em lipossomas de DSPC administrado por via S.C.. ........................................................ 50
Tabela 11: Valores absolutos de parâmetros da PA e do ECG após administração de 1 µg/kg
de NA (basal e 15 segundos após) em animais previamente tratados com piridostigmina
em lipossomas de DOPC administrado por via S.C.......................................................... 51
Tabela 12: Valores absolutos de parâmetros da PA e do ECG após administração de 3 µg/kg
de NA (basal e 15 segundos após) em animais previamente tratados com piridostigmina
em lipossomas de DOPC administrado por via S.C.......................................................... 52
Tabela 13: Valores absolutos de parâmetros da PA e do ECG após administração de 10 µg/kg
de NA (basal e 15 segundos após) em animais previamente tratados com piridostigmina
em lipossomas de DOPC administrado por via S.C.......................................................... 53
xi
ÍNDICE DE ABREVIATURAS:
AC
Adenililciclase
AcetilCoa
Enzima colina acetilcolinesterase
Ach
Acetilcolina
AMPc
Adenosina monofosfato cíclico
ANVISA
Agencia nacional de vigilância sanitária
CHOL
Colesterol
DCV
Doenças cardiovasculares
DOPC
Dioleil-fosfatidilcolina
DSPC
Distearoil-fosfatidilcolina
ECG
Eletrocardiograma
EE
Eficiência de encapsulação
FC
Freqüência cardíaca
GUV
Lipossomas gigantes
IAM
Infarto agudo do miocárdio
IC
Insuficiência cardíaca
ICH
“International conferenceon harmonization”
INMETRO
Instituto nacional de metrologia, normatização e qualidade industrial
I.P.
Intraperitoneal
IUPAC
“International union of pure and applied chemistry”
I.V.
Intravenosa
LD
Limite de detecção
LipoPIR
Piridostigmina lipossomal
LQ
Limite de quantificação
LUVs
Lipossomas unilamelares grandes
MLVs
Lipossomas multilamelares
xii
NA
Noradrenalina
OMS
Organização Mundial de Saúde
PA
Pressão arterial
PAD
Pressão arterial diastólica
PAS
Pressão arterial sistólica
PE
Polietileno
PEG
Polietilenoglicol
PIR
Piridostigmina
S.C.
Subcutânea
SCV
Sistema cardiovascular
SNA
Sistema nervoso autônomo
SUVs
Lipossomas unilamelares pequenos
UFOP
Universidade Federal de Ouro Preto
USP
U.S. Pharmacopeial Convention
UV
Ultravioleta
xiii
SUMÁRIO
1- INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 1
2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................................... 2
2.1 - BROMETO DE PIRIDOSTIGMINA E SISTEMA CARDIOVASCULAR ...................................................2
2.2-Sistema nervoso autônomo e sistema cardiovascular .................................................................4
2.3-Lipossomas .......................................................................................................................................5
2.4-Validação de Método Analítico .....................................................................................................7
3-OBJETIVOS .............................................................................................................................. 10
3.1-Objetivo geral .................................................................................................................................10
3.2-Objetivos específicos .....................................................................................................................10
4- METODOLOGIAS ................................................................................................................... 10
4.1 - Reagentes e amostras ..................................................................................................................10
4.2 –Doseamento da PIR .....................................................................................................................11
4.3 - Validação do método analítico ...................................................................................................11
4.4-Preparação dos lipossomas contendo piridostigmina:...............................................................12
4.5-Determinação do rendimento de encapsulação ..........................................................................13
4.6-DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE LIPÍDI DOS LIPOSSOMAS E DA
RELAÇÃO PIRIDOSTIGMINA/LIPÍDIO .......................................................................................13
4.7-Determinação do tamanho dos lipossomas .................................................................................14
4.8-Determinação da carga superficial dos lipossomas ...................................................................14
4.9 - Perfil de liberação in vitro ..........................................................................................................14
4.10-Animais experimentais ................................................................................................................15
4.11 - Procedimentos cirúrgicos e obtenção dos sinais cardiovasculares .....................................15
4.12-Modelo de ativação farmacológica do sistema nervoso simpático .......................................16
4.13 - Protocolos Experimentais: ........................................................................................................16
4.14-Análise dos parâmetros cardiovasculares .................................................................................17
4.15-Análise Estatística ........................................................................................................................18
xiv
5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................ 20
5.1–Desenvolvimento e validação do método analítico para a quantificação de
piridostigmina lipossomal ....................................................................................................................20
5.2 - Determinação da eficiência de encapsulação ...........................................................................23
5.3 - Determinação do tamanho dos lipossomas ..............................................................................24
5.4 - Determinação da carga superficial dos lipossomas .................................................................25
5.5 - Perfil de liberação in vitro ..........................................................................................................25
5.6 - Determinação da relação fármaco/lipídeo ................................................................................27
5.7-Avaliação das alterações dos parâmetros cardiovasculares em ratos Wistar tratados com
Piridostigmina .......................................................................................................................................28
6- CONCLUSÃO .......................................................................................................................... 56
7-REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................... 57
8-ANEXO I....................................................................................................................................69
xv
1- INTRODUÇÃO
As doenças cardiovasculares (DCV) são um problema de saúde pública nos países
industrializados, incluindo os Estados Unidos e Europa (WHO, 2011). As DCV destacam-se
no topo da lista de causas de morte em todo o planeta matando mais pessoas que qualquer
outra doença. Somente no ano de 2008, 17,3 milhões de pessoas morreram por DCV (WHO,
2011). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) o índice de mortalidade por DCV no
Brasil de indivíduos com idade entre 30 e 70 anos foi de 248 por 100.000 habitantes (WHO,
2013). O custo econômico das DCV cresceu exponencialmente nas últimas décadas. Entre os
anos de 2008 e 2011 o número de internações por doenças do sistema circulatório foi de três
milhões, o que gerou um custo de R$ 5,7 bilhões para o país, segundo dados do
DATASUS/Sistema de Informações Hospitalares do Sistema Único de Saúde (SIH/SUS,
2011). Assim, as DCV representam um dos maiores problemas de saúde pública, com elevada
incidência no mundo ocidental, acometendo tanto países do primeiro mundo como também os
países em desenvolvimento (REDDY & YUSUF, 1998; MAGNUS & BEAGLEHOLE, 2001;
NISSINEN et al.,2001; WHO 2002,2003; BEAGLEHOLE & YACH, 2003; MACKAY &
MENSAH, 2004; MITKA, 2004; WHO 2013). Dessa maneira, é relevante e necessária à
investigação de fármacos com atividade cardioprotetora, com potencial para a prevenção e
tratamento de agravamentos decorrentes de DCV.
Estudos clínicos e experimentais realizados com o brometo de piridostigmina (PIR),
fármaco anti-colinesterásico reversível, demonstraram ser um agente promissor na terapêutica
da doença cardíaca isquêmica (GRABE-GUIMARÃES et al., 1999; SANT’ANNA et al.,
2003, VIDAL et al, 2010). Pacientes com isquemia miocárdica induzida por exercício físico
(CASTRO et al., 2004) ou insuficiência cardíaca (IC) (SERRA et al., 2009) apresentaram
melhora da atividade autonômica após a administração oral de PIR. A PIR é um fármaco
utilizado em clínica para o tratamento da miastenia gravis. No entanto, sua curta meia-vida de
eliminação (GOODMAN & GILMAN, 2010) e a alta incidência de efeitos adversos (KLUWE
et al., 1989) são fatores que podem limitar seu uso prolongado. O desenvolvimento de formas
farmacêuticas que pudessem prolongar sua vida útil e diminuir seus efeitos indesejáveis seria
de grande utilidade terapêutica.
Os lipossomas são vesículas lipídicas contendo espaço aquoso interno e têm sido
utilizados como carreadores coloidais de substâncias ativas hidrofílicas ou lipofílicas,
podendo conferir distribuição corporal diferenciada, maior estabilidade e modificadas
1
interações com células hospedeiras e patogênicas (BLUME & CEVIC, 1990). São
constituídos por lipídeos naturais ou sintéticos, biodegradáveis, não tóxicos, não
imunogênicos e completamente biocompatíveis (LASIC, 1998; TORCHILIN, 1995)
amplamente estudados como sistema de liberação sustentada de fármaco. Permitem, ainda, o
direcionamento a alvos específicos, como células e tecidos, aumento da potência e/ou redução
da toxicidade da substância encapsulada (ver CHON & CULLIS, 1995; LASIC, 1998).
Estudos realizados anteriormente demonstraram que a PIR quando veiculada em
lipossomas administrado por via intravenosa (I.V.) apresenta considerável atividade
cardioprotetora, demonstrada pela redução do intervalo QT do ECG (VIDAL et al.,2010). Em
continuidade, o presente estudo teve por objetivo avaliar uma nova formulação lipossomal
contendo PIR para administração por via subcutânea (S.C.). O presente estudo avaliou a
possibilidade de uso desta preparação como sistema de liberação sustentado da PIR na
prevenção de doença cardíaca isquêmica. Adicionalmente, foi realizada a validação de método
analítico para monitorar a eficiência de encapsulação de PIR em lipossomas.
2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 - BROMETO DE PIRIDOSTIGMINA E SISTEMA CARDIOVASCULAR
As DCV são um dos principais problemas de saúde pública no mundo, incluindo o
Brasil. Portanto, torna-se cada vez mais necessário a busca por novos fármacos no intuito de
controlar a mortalidade de pacientes com doenças cardíacas e infarto agudo do miocárdio
(CASTRO et al, 2000).
Em sua grande maioria as DCV estão associadas a disfunções do SNA, seja por uma
hiperatividade do SNA simpático ou hipoatividade do SNA parassimpático, levando ao
aumento do risco de arritmias e outros eventos cardíacos. Portanto o descontrole do SNA
aumenta a morbidade cardiovascular e mortalidade (SCHWARTZ et al, 1992; LA ROVERE
et al, 1998).
2
Sabe-se que é de grande importância clínica estudos sobre a hiperatividade simpática e
seu tratamento em doenças cardiovasculares (CORR & GILLIS, 1978), no entanto são
escassos os estudos referentes às interferências farmacológicas sobre a hipoatividade vagal.
A PIR é uma amina quaternária que atua como um inibidor reversível da colinesterase
e como consequência de sua ação aumenta os níveis de acetilcolina endógena e assim na fenda
sináptica (GOODMAN & GILMAN, 2010). A principal indicação clínica da PIR é sua
utilização para o tratamento da miastenia gravis, em que a dose diária é de 720 mg/dia.
Também pode ser utilizada na esclerose múltipla, esclerose lateral amiotrófica, miotrofia
espinhal, e paresia consecutivo de poliomielite. Outras indicações menos comuns da PIR
incluem
a
prevenção
de
distúrbios
após
punção
lombar
e
meningismo
após
eletroencefalografia e tratamento de enxaqueca e dor de cabeça (CASTRO, 2000). Outro
relato de uso da PIR foi a ingestão de 30 mg a cada 8 horas aos soldados americanos que
participaram no Guerra do Golfo. O objetivo era evitar a intoxicação por gases com ação
anticolinesterase irreversível no caso de um ataque com armas químicas (VOLANS, 1996).
A ação cardiovascular da PIR é geralmente considerada como um efeito adverso,
porque no tratamento de miastenia grave, o objetivo são os efeitos colinomiméticos sobre a
musculatura esquelética. Desta forma, ainda são poucos os estudos referentes à ação
cardioprotetora da PIR, apesar de na última década ter sido crescente o número de estudos
referentes à cardioproteção ocasionada pela PIR.
A PIR melhora as respostas autonômicas e hemodinâmicas durante o exercício em
pacientes com doença arterial coronariana, (CASTRO et al, 2004; CASTRO et al, 2006;
SERRA et al, 2009), previne a disfunção miocárdica induzida pelo stress mental (NOBREGA
et al, 2008), e reduz a dispersão do QTc (CASTRO et al, 2000).
Grabe e colaboradores (1999), observaram atividade cardioprotetora da PIR
administrada por via oral na dose de 10 mg/kg em até 2 horas após sua administração. Vidal e
colaboradores (2010) observaram ação cardioprotetora da PIR em lipossomas unilamelares
com redução do intervalo QT em até 6 horas após a sua administração I.V.
Assim, no intuito de realizar maiores estudos da atividade cardioprotetora da PIR, foi
proposto por este trabalho a avaliação da atividade cardiovascular da PIR veiculada em
lipossomas multilamelares administrado por via S.C.
3
2.2-SISTEMA NERVOSO AUTÔNOMO E SISTEMA CARDIOVASCULAR
O SNA representa o componente eferente do sistema nervoso visceral e relaciona-se
com a inervação do coração, vasos sanguíneos, glândulas e outros órgãos viscerais, e músculo
liso, sendo importante para a manutenção da constância do meio interno. Possui duas
subdivisões anátomo-funcionais: o sistema simpático e o sistema parassimpático, que em
geral atuam de forma antagônica, mas não independente, colaborando e trabalhando
harmonicamente na coordenação da atividade visceral (GOODMAN & GILMAN, 2010). O
SNA é responsável por modular a atividade elétrica e contrátil do miocárdio. Esta regulação
neuronal é realizada pela interação do SNA simpático e parassimpático. A ação simpática
causa a despolarização celular gerando um efeito cronotrópico positivo sobre as células
cardíacas, enquanto a estimulação vagal cardíaca sobre as células marca-passo acarreta em
hiperpolarização celular causando efeito cronotrópico negativo (GOODMAN & GILMAN,
2010). O sistema cardiovascular (SCV) sofre influências neuro-humorais, quando ocorre
aumento da atividade simpática e redução no tônus parassimpático ocorre aumento da
frequência cardíaca (FC), da contratilidade, do débito cardíaco e da pressão arterial (PA)
(KRANTZ & MANUCK, 1984), além de participar na doença arterial coronariana e na gênese
de arritmias ventriculares ameaçadoras à vida (SCHWARTZ et al, 1990; KJELLGREN et al,
1993).
Existem dois possíveis mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento de isquemia
miocárdica na presença de doença aterosclerótica coronariana: o aumento do tônus vasomotor
coronariano com diminuição do fluxo coronariano e a hiperatividade simpática que determina
um aumento na FC, na PA e na contratilidade miocárdica levando ao aumento do consumo de
oxigênio pelo miocárdico (GOODMAN & GILMAN, 2010). A hiperatividade simpática
também acarreta em prolongamento do intervalo QT do ECG e do índice QTc, fatores estes
preditores de morte súbita (LA ROVERE ET AL, 1998; SCHWARTZ, 1998). A
hipoatividade
vagal,
de
forma
independente,
também
se
correlaciona
a
maior
morbimortalidade cardiovascular, através da diminuição do limiar de fibrilação ventricular,
aumento da frequência cardíaca e diminuição da modulação adrenérgica pré-sináptica. A
atuação específica na disfunção parassimpática, como por exemplo, através do uso do fármaco
anti-colinesterásico PIR, alterou de forma favorável importantes marcadores prognósticos
para doença cardiovascular, em indivíduos normais (NÓBREGA et al, 1999, SERRA et al,
2001). Ainda através da ação de PIR, foi observado que o aumento da atividade
4
parassimpática reduziu a dispersão do prolongamento do intervalo QT e índice QTc, ou seja, o
aumento da ação parassimpática conferiu cardioproteção (VIDAL et al, 2010). Estudos
realizados por Vidal e colaboradores (2010) e por Zimerman e colaboradores (2010)
demonstraram que o aumento da atividade parassimpática mediada por PIR não altera o
complexo QRS e intervalo PR do ECG, assim como não produz distúrbios da condução
eletrofisiológica com aumento do período refratário ventricular.
A redução dos mecanismos vagais e o aumento da atividade simpática parecem ser,
portanto, a preparação para o SCV para as rápidas variações na frequência e débito cardíacos
que ocorrem durante a doença coronariana, embora as ações da noradrenalina possam agravála (BRUM et al, 2006). Alternativas farmacológicas destinadas a contrapor este desequilíbrio
devem ser continuamente desenvolvidas, especialmente no que diz respeito à função
parassimpática.
2.3-LIPOSSOMAS
Os lipossomas são vesículas esféricas, constituídas de uma ou várias bicamadas
concêntricas de lipídeos, que isolam um ou vários compartimentos aquosos internos do meio
externo (BANGHAM et al., 1965)(Figura 1). Geralmente são formados por fosfolípides de
origem natural, sintética ou semi-sintética e possuem grande potencialidade para o transporte
de substâncias hidrofílicas, lipofílicas e anfifílicas (LASIC, 1998). As substâncias hidrofílicas
podem ser encapsuladas no meio aquoso interno, as lipofílicas na porção apolar das
bicamadas e as anfifílicas na interface hidrofílica lipofílica (JUNGINGER et al., 1991).
Os lipossomas podem ser preparados a partir de misturas lipídicas naturais extraídas e
purificadas, ou a partir de lipídeos sintéticos, disponíveis comercialmente (SANTOS
&CASTANHO, 2002). Os lipossomas podem ser classificados em termos de tamanho,
número de lamelas (e sua posição relativa), constituição lipídica (o que também condiciona a
sua carga), estabilidade e modo de preparação (LICHTENBERG &BARENHOLZ, 1988).
Os lipossomas podem ser classificados como vesículas multilamelares (MLV) com
diâmetro entre 400 e 3500 nm, vesículas unilamelares pequenas (SUV) com diâmetro
variando entre 20 e 50 nm, vesículas unilamelares grandes (LUV) diâmetro superior a 100
nm, vesículas unilamelares gigantes (GUV) com dimensões superiores a 1 μm.
(GREGORIADIS, 1993) (Figura 2).
5
Figura 1: Características estruturais dos lipossomas
Figura 2: Representação esquemática dos tipos de lipossomas (SANTOS & CASTANHO,
2002)
Existem várias metodologias para a preparação de lipossomas, as quais, de modo
geral, são compostas por três etapas básicas: 1) diluição dos fosfolipídios em solvente
orgânico seguida de evaporação deste para obtenção do filme lipídico; 2) hidratação do filme
lipídico em meio aquoso; 3) redução do tamanho da vesícula e/ou do número de camadas se
for o caso.
Quando administrados em organismos vivos, os lipossomas interagem, no primeiro
momento, com os componentes dos fluidos biológicos, o que pode alterar a permeabilidade de
sua membrana e a velocidade de liberação da substância encapsulada. Após administração dos
6
lipossomas por via oral, os sais biliares se incorporam na sua membrana, tendendo induzir a
transição da fase lamelar para a fase micelar. Nestas condições, os lipossomas “fluidos”, que
apresentam membrana na fase cristal-líquido, serão desestabilizados. Apenas lipossomas com
membrana na fase gel parecem resistir parcialmente à ação dos sais biliares. Após
administração dos lipossomas por via I.V., estes interagem com as lipoproteínas plasmáticas.
Lipídeos podem ser transferidos dos lipossomas para as lipoproteínas, enquanto componentes
das lipoproteínas (como a apolipoproteína) podem ser incorporados na membrana dos
lipossomas. Nessas condições, lipossomas “fluidos” manterão sua integridade apenas se estes
contiverem colesterol na proporção de pelo menos 30 % do total de lipídeos (FRÉZARD et al,
2005). A administração subcutânea de lipossomas apresenta muitas vantagens como liberação
prolongada, constante e controlada de substâncias e com isso diminuir a variação dos níveis
plasmáticos e os efeitos colaterais, principalmente de fármacos de estreito índice terapêutico.
Pode ainda evitar as variáveis que influenciam na absorção gastrointestinal como pH, volume
de alimento, mobilidade gastrointestinal, também pode evitar o metabolismo pré-sistêmico
que diminui a biodisponibilidade de muitas substâncias como o propranolol, melatonina,
metotrexato, salbutamol, etc. (HONEYWELL-NGUYEN et al., 2005, 2006; CHOI et al.,
2005)
A encapsulação de substâncias em lipossomas permite sua distribuição corporal
diferenciada, podendo demonstrar maior estabilidade, modificadas interações com células
hospedeiras e patogênicas (BLUME & CEVIC, 1990), além de atingir alvos específicos. O
tipo lipossomal utilizado para uma determinada finalidade está diretamente relacionado à sua
composição e estrutura, exemplo disso são lipossomas que possuem carga neutra ou positiva
que se acumulam espontaneamente em tecido cardíaco infartado. Constata-se então que
lipossomas podem ser usados para liberação passiva de fármacos em tecidos isquêmicos para
fins diagnósticos e terapêuticos, particularmente no infarto do miocárdio (TORCHILIN, 1995;
VERMA et al., 2005). No entanto, antes da utilização dos lipossomas, métodos analíticos
devem ser validados para que garantam a eficiência de encapsulação de PIR.
2.4-VALIDAÇÃO DE MÉTODO ANALÍTICO
A validação é o monitoramento analítico de um produto farmacêutico ou de um
ingrediente específico que o componha. Ela é necessária para que seja garantida a segurança e
7
eficácia do produto em todas as fases de seu prazo de validade, incluindo o armazenamento, a
distribuição e o uso (BRENDOLAN, 1997).
Para os métodos analíticos, a validação representa o processo pelo qual o laboratório,
por meio de estudos adequados, comprova que as características de execução do método
atendem às exigências das aplicações analíticas propostas. Além disso, que determinado
procedimento analítico selecionado dê resultados reprodutíveis, confiáveis e adequados aos
fins para os quais são destinados (BRENDOLAN, 1997). A demonstração da habilidade de
um método analítico para quantificar substâncias é de grande importância para assegurar a
qualidade, segurança e eficácia dos produtos farmacêuticos, considerando-se a sua aplicação e
o nível de qualidade pertinente (PINTO et al., 2010).
Órgãos
como
ICH
(International
Conference
on
Harmonization),
IUPAC
(International Union of Pure and Applied Chemistry), ANVISA (Agência Nacional de
Vigilância Sanitária), INMETRO (Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e
Qualidade Industrial) e outros exigem o item validação de métodos analíticos como um
requisito fundamental no credenciamento para qualidade assegurada e demonstração de
competência técnica. O que se pode observar é que não há um procedimento normatizado que
estabeleça como executar a validação de métodos instrumentais de separação. Como estes
órgãos são responsáveis por acompanhar e credenciar a competência de laboratórios de
ensaios é importante ressaltar que as diferentes terminologias e até algumas características de
desempenho do método têm, em sua maior parte, o mesmo significado, porém descrito de uma
maneira distinta, para aplicações diferentes (RIBANI et al., 2004).
Validação de um método é a comprovação, através do fornecimento de evidência
objetiva, de que os requisitos para uma aplicação ou uso específicos pretendidos foram
atendidos (NBR ISO 9000).
No Brasil, há duas agências credenciadoras para verificar a competência de
laboratórios de ensaios, a ANVISA e o INMETRO. Estes órgãos disponibilizam guias para o
procedimento de validação de métodos analíticos, respectivamente, a Resolução ANVISA RE
nº 899, de 29/05/2003 e o documento INMETRO DOQ-CGCRE-008, de março/2003
(RIBANI et al., 2004).
O método analítico utilizado para quantificação de PIR veiculada em lipossomas
multilamelares será validado segundo as normas da ANVISA. Este método analítico
determinará o teor de encapsulação do fármaco nessa matriz lipossomal. De acordo com a
8
resolução ANVISA nº 899 de 29 de maio de 2003, a validação deve garantir, por meio de
estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas,
assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar especificidade,
linearidade, intervalo, precisão, sensibilidade (limite de detecção), limite de quantificação e
exatidão adequados a análise.
Para atestar a eficiência da encapsulação de PIR foi necessário o desenvolvimento e
validação de um método analítico específico que não sofra influencia da matriz lipídica. O
desenvolvimento de métodos analíticos consiste na busca e avaliação de diferentes condições
experimentais que permitam a determinação quantitativa do analito com confiabilidade,
rapidez, baixo custo e com o mínimo de resíduos (BRENDOLAN, 1997). Muitos estudos
sobre PIR têm recorrido a técnicas que extraem e o quantificam em amostras biológicas. As
concentrações de PIR e/ou seus metabólitos podem ser mensurados por estudos empregando
radioisótopos (KORNFELD et al.,1970; BARBER et al., 1975; BIRTLEY et al., 1966),
técnicas por cromatografia gasosa (CHAN et al., 1976), cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE) (YAKATAN et al.,1979; ELLIN et al., 1982; ABU-QARE et al., 2001;
CHERSTNIAKOVAet al., 2006) e por radioimunoensaios (MEYER et al., 1988; MILLER et
al.,1989). Para o doseamento de PIR em comprimidos, El-Kossay e colaboradores em 2009,
utilizaram método eletroquímico com eletrodos de membrana específicos. Dentre as técnicas
descritas a espectroscopia com detecção em ultravioleta (UV) pode ser considerada menos
onerosa, mais facilmente exequível no controle de qualidade de matéria-prima e produtos
farmacêuticos, além de estudos de cinética de liberação de fármacos (SIQUEIRA-MOURA et
al., 2008).
A quantificação de PIR como matéria-prima é descrita nas edições tanto da
Farmacopeia Europeia (2004) quanto na Farmacopeia Americana (USP, 2005). Na
Farmacopeia Europeia 6a edição é utilizada a titulação para o doseamento de PIR. Já na USP
9a edição, para a identificação da matéria prima de PIR utiliza-se absorção no infravermelho
ou absorção no UV Ainda segundo a USP para o doseamento de PIR na forma farmacêutica
injeção, solução oral e xarope foram utilizados espectrofotometria em comprimento de onda
máximo de 269 nm para a injeção e 415 nm para solução oral e xarope. Para comprimidos a
USP preconiza a utilização de cromatografia líquida de alta eficiência em 270 nm para seu
doseamento. Na Farmacopeia Brasileira 5a edição (2010) não há descrições para produtos ou
matéria prima de PIR. Para a forma farmacêutica lipossomal de PIR não foi ainda descrito
método analítico para seu doseamento. Hegay e colaboradores, 2002, determinaram o teor de
9
PIR em microparticulas utilizando espectrofotometria UV á 270 nm. Desta forma, este
trabalho
teve
como
objetivo
a
validação
de
metodologia
analítica
utilizando
espectrofotometria no UV para o doseamento de PIR a partir de formulações lipossomais. Em
seguida foram avaliadas, in vivo, duas formulações lipossomais contendo PIR quanto à ação
cardioprotetora em condições de hiperatividade do sistema nervoso simpático.
3-OBJETIVOS
3.1-OBJETIVO GERAL

Avaliar a ação cardioprotetora da piridostigmina veiculada em dois diferentes tipos de
lipossomas multilamelares administrados por via S.C.
3.2-OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Desenvolver e validar um método analítico para quantificação de PIR veiculada em
lipossomas.

Preparar e caracterizar a formulação lipossomal de PIR constituída de dioleilfosfatidilcolina
(DOPC) e colesterol (CHOL)

Preparar
e
caracterizar
a
formulação
lipossomal
de
PIR
constituída
de
distearoilfosfatidilcolina (DSPC) e colesterol (CHOL).

Avaliar a ação cardioprotetora de PIR veiculada nas preparações lipossomais, administradas
por via S.C., em ratos Wistar, em um modelo de estimulação simpática periférica, 30 min a
24 horas após a administração de PIR S.C.
4- METODOLOGIAS
4.1 - REAGENTES E AMOSTRAS
A PIR e o CHOL foram obtidos do laboratório Sigma, EUA. Os lipídeos DSPC e
DOPC foram obtidos da Lipoid GmbH, (Ludwigshafen, Alemanha). Os solventes e todos os
outros produtos químicos eram comercialmente disponíveis. A água foi purificada por osmose
reversa (185 Symplicity System, Millipore, EUA).
10
4.2 –DOSEAMENTO DA PIR
Para o doseamento da PIR foram utilizados como solvente o metanol e como condição
espectrofotométrica os comprimentos de onda entre 240 e 300 nm, sendo selecionado 270 nm.
Todas as análises quantitativas de doseamento de PIR foram realizadas em espectrofotômetro
Modelo B582 Micronal, utilizando cubetas de quartzo. Maiores detalhes serão descritos no
item 4.5.
4.3 - VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
Antes de um método analítico totalmente novo ser implementado na rotina, deve
preliminarmente ser validado para demonstrar que é adequado para seu propósito (HEGAZY,
2002; NAYAR, 1989; PINTO, 2010). Os parâmetros de validação avaliados no presente
trabalho foram: especificidade, linearidade, limite de quantificação (LQ), precisão inter e
intra-dia e exatidão. Os procedimentos foram realizados de acordo com Resolução ANVISA
RE no 899, de 29/05/2003.
Linearidade
A linearidade foi estabelecida pela análise estatística de cinco curvas padrão
elaboradas a partir da quantificação das soluções padrão diluídas entre as concentrações 0,02 a
0,09 mg/ml por espectrofotometria na região do U.V. no comprimento de onda de 270 nm.
Para preparo da solução estoque padrão foram pesados 25 mg de PIR e solubilizados
em 25 ml de metanol. A concentração final de PIR foi de 1,0 mg.ml-1. Foram pipetadas da
solução padrão estoque alíquotas de PIR de 200, 300, 400, 500 e 600 µl sendo diluídas em
metanol para 10.0 ml e 350, 400 e 450 µl, as mesmas, foram diluídas em 5 ml de metanol
obtendo-se as concentrações finais de 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07; 0,08 e 0,09 mg.ml-1
Precisão
Foram avaliadas a repetibilidade (intra-dia) e a precisão intermediária (inter-dia),
através da determinação de três concentrações de PIR (0,03; 0,06 e 0,09 mg.ml-1.) em
11
quintuplicata cada. As análises foram realizadas em dois dias diferentes, por dois analistas
diferentes.
Exatidão
A exatidão foi avaliada por meio da recuperação de quantidades conhecidas de PIR em
soluções metanólicas de diferentes concentrações: 0,03; 0,06 e 0,09 mg.ml-1 (baixa, média e
alta). Foram realizadas leituras em quintuplicatas de cada concentração. A porcentagem de
recuperação foi utilizada para avaliar a exatidão, a qual é expressa pela relação entre a
concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente.
Exatidão = Concentração experimentalx 100
Concentração teórica
Limite de Quantificação (LQ)
O limite de quantificação foi estabelecido por meio da análise de soluções contendo
concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível determinável com precisão e
exatidão aceitáveis.
4.4-PREPARAÇÃO DOS LIPOSSOMAS CONTENDO PIRIDOSTIGMINA:
Lipossomas convencionais constituídos de DSPC e CHOL ou DOPC e CHOL na
relação molar 5:4 foram preparados por metodologia de congelamento/descongelamento
proposta por Nayar, (1989). Resumidamente: os lipídios foram solubilizados em clorofórmio e
este evaporado com auxílio de um evaporador rotatório (Laborota4000®, Heidolph
Instruments, Alemanha) a 70 G. e 60° C por 10 minutos, levando à formação de um fino filme
lipídico nas paredes do balão. Após completa remoção do solvente orgânico, o filme lipídico
foi hidratado por solução de PIR, isosmótica em relação ao plasma (37,0 mg/ml - Sigma,
USA), para obtenção de lipossomas contendo a substância ativa, ou por solução salina
tamponada (NaCl 0,15 M, fosfato 0,01 M, pH 7,2) para a obtenção de lipossomas “brancos ou
vazios”. As soluções obtidas foram, então, homogeneizadas por 5 minutos em evaporador
rotatório e submetidas a 10 ciclos de congelamento e descongelamento utilizando nitrogênio
12
líquido e banho a 60 °C, para formação de grandes vesículas multilamelares. A separação da
substância ativa não encapsulada dos lipossomas contendo PIR foi realizada mantendo-se a
preparação em diálise em tampão fosfato (pH= 7,2), durante 24 horas, utilizando membrana
de celulose de 6 mm de diâmetro (Sigma, USA) e sendo separada pequena fração da
preparação antes da diálise para determinação do rendimento de encapsulação.
4.5-DETERMINAÇÃO DO RENDIMENTO DE ENCAPSULAÇÃO
Para a quantificação da PIR presente na preparação de lipossomas, antes da diálise
foram retiradas alíquotas de 5, 10 e 20 µl que foram solubilizadas em 5,0 ml de metanol para
rompimento da membrana vesicular e sua consequente liberação. Após a diálise foram
retiradas alíquotas de 10, 20 e 30 µl que também foram solubilizadas em 5,0 ml de metanol.
Foram realizados doseamentos, em triplicata, por metodologia de espectrofotometria no U.V.
no comprimento de onda de 270 nm adaptado por Hegazy e colaboradores (2002). Leituras de
absorção dos lipossomas vazios foram utilizadas para correção das leituras das amostras de
lipossomas contendo PIR.
O rendimento de encapsulação foi determinado como o teor de PIR presente na
formulação após diálise de 24 horas, em relação ao total encontrado na preparação não
submetida à diálise, através da equação:
EE % = Concentração de PIR nos lipossomas após a diálise x 100
Teor total de PIR antes da diálise
4.6-DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE LÍPIDE DOS LIPOSSOMAS E DA
RELAÇÃO PIRIDOSTIGMINA/LIPÍDIO
A partir do método proposto por Stewart (1980), no qual uma solução de clorofórmio
contendo fosfolipídios é misturada ao ferrotiocianato de amônio à temperatura ambiente,
sendo formado um complexo colorido que absorve luz visível (comprimento de onda máximo
- 488 nm), o teor de fosfolipídios contido nas preparações lipossomais foi determinado.
Uma curva padrão em função de diferentes concentrações de DSPC ou DOPC (lipídios
base) foi obtida misturando-se 2 ml de solução de ferrotiocianato de amônio a 2 ml de
13
clorofórmio contendo concentrações crescentes
do fosfolipídio. As concentrações dos
fosfolipídios presentes nas amostras de lipossomas foram determinadas em duplicata,
utilizando-se uma curva padrão de DSPC e outra de DOPC, linear no intervalo de
concentração entre 0,03 e 0,15 mg/ml. A relação PIR/Lipídeo foi determinada pela razão entre
PIR presente na preparação lipossomal e o teor de lipídio, em p/p.
4.7-DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DOS LIPOSSOMAS
O tamanho das partículas e índice de polidispersão da preparação foram determinados
por espectroscopia de correlação de fótons, utilizando Nanosizer N5 (Beckman Coulter,
EUA). As preparações contendo PIR e salina tamponada foram diluídas na proporção de
1:250 em água Milli-Q® e a distribuição de tamanho e a polidispersão avaliadas efetuando-se
três leituras para cada amostra.
4.8-DETERMINAÇÃO DA CARGA SUPERFICIAL DOS LIPOSSOMAS
O potencial zeta foi determinado pela mensuração da mobilidade eletroforética,
utilizando o Zetasizer3000 HS (Malvern Instruments, Reino Unido). As preparações contendo
PIR e salina tamponada foram diluídas na proporção de 1:200 em água purificada por osmose
reversa e as leituras efetuadas em triplicata.
4.9 - PERFIL DE LIBERAÇÃO IN VITRO
Com o objetivo de avaliar a capacidade dos lipossomas reterem PIR em condições
fisiológicas, realizou-se uma diluição 1:5 da formulação lipossomal em solução salina
tamponada de forma a garantir a condição sink (excesso de volume de meio que irá permitir
que o ativo dissolva-se continuamente). Amostras foram então incubadas a 37 °C e após 0, 2,
4, 6, 12, 24, 48 e 72 horas, alíquotas de 200 μl foram centrifugadas à 14.000 g por 120
minutos para separação do fármaco liberado nos diferentes tempos e amostras do
sobrenadante foram, então, submetidas à dosagem do teor de PIR liberada, por
14
espectrofotometria no UV, a fim de determinar o perfil de liberação in vitro do fármaco partir
dos lipossomas.
4.10-ANIMAIS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 230 a 270 g, fornecidos pelo
Centro de Criação Animal da Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). A utilização dos
animais foi aprovada pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFOP (CEUAUFOP) sob
no. 2011/52.
4.11
-
PROCEDIMENTOS
CIRÚRGICOS
E
OBTENÇÃO
DOS
SINAIS
CARDIOVASCULARES
Os animais foram anestesiados por cetamina (100 mg/kg) e xilasina (14 mg/kg), por
via intraperitoneal (I.P.). Após a anestesia ter alcançado a profundidade necessária, os animais
foram traqueostomizados utilizando um tubo de polietileno (PE) e deixados sob respiração
espontânea. Após tricotomia e assepsia da região inguinal esquerda, uma pequena incisão para
exposição do feixe femoral foi realizada. Para obtenção dos sinais da PA e para a
administração I.V. das formulações, foram inseridos cateteres de polietileno na artéria e veia
femorais, respectivamente. Os cateteres foram confeccionados unindo-se por aquecimento
5,0 cm de tubo de PE 10 a 15,0 cm de tubo de PE 50, preenchidos com solução salina e
ocluídos por agulhas 25 x 7 cortadas. Após a cateterização, a extremidade PE 10 foi localizada
na aorta abdominal, abaixo das artérias renais, para registro da pressão arterial, e veia cava
inferior, para injeção das formulações. A extremidade PE 50 do cateter inserido na artéria
femoral foi, então, acoplada a um transdutor de pressão TruWave® (Edwards Life science,
Canadá) para aquisição dos sinais de PA.
Para possibilitar a medição da diferença de potencial relativa à derivação DII do ECG,
agulhas hipodérmicas de aço inoxidável foram inseridas no tecido subcutâneo dos animais. Os
sensores de ECG e transdutor de PA foram acoplados a um sistema condicionador que fornece
sinais em tempo real a uma frequência de 1200 Hz, processados por uma placa conversora
analógico-digital (DaqBoard/2001, EUA).
15
4.12-MODELO DE ATIVAÇÃO FARMACOLÓGICA DO SISTEMA NERVOSO
SIMPÁTICO
A simulação das condições de hiperatividade do sistema nervoso simpático foi
realizada pela administração I.V. de noradrenalina (NA) nas doses de 1, 3 e 10 µg/kg in bolus
em cada animal, alternando-se a ordem de administração das doses.
4.13 - PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS:
1. Administração subcutânea de PIR lipossomal, nas doses de 10 mg/kg e 20mg/kg, ou PIR
livre, na dose de 1 mg/kg ou lipossomas vazios (Tabela 1);
2. Anestesia nos animais 30 min, 1,5; 3,5; 5,5; 7,5; 9,5; 11,5; e 23,5 horas após a
administração subcutânea das formulações;
3. Realização do procedimento cirúrgico;
4. Registro da PA e ECG controle por 5 min nos tempos 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a
administração.
5. Administração de 3 doses de NA, com intervalos de 5 minutos entre as doses.
Foram realizados assim 24 grupos de 8 animais cada:
16
Tabela 1: Delineamento grupos/doses/tempo de estudo
(n=8)
Tempo
estudado
em horas
Dose de
1 mg/kg#
Dose de
10 mg/kg#
Dose de
20 mg/kg#
1A2
Salina
1e2
__
__
__
3A6
PIR livre
1, 2, 4 e 6
X
__
__
7A8
Lipovazio_DSPC
1e2
__
__
__
9 A 10
Lipovazio_DOPC
1e2
__
__
__
11 A 18
LipoPIR_DSPC
1, 2, 4, 6, 8,
10 e 12
__
X
X
19 A 24
LipoPIR_DOPC
1, 2, 4, 6, 12
e 24
__
X
__
Número
dos grupos
Grupos*
*PIR livre, piridostigmina livre; Lipovazio_DSPC, lipossomas constituídos pelo lipídio DSPC
em sua membrana e que não carreiam o fármaco pridostigmina e sim solução tampão;
Lipovazio_DOPC, lipossomas constituídos pelo lipídio DOPC em sua membrana e que não
carreiam o fármaco piridostigmina e sim solução tampão; LipoPIR_DSPC, lipossomas
constituídos pelo lipídio DSPC em sua membrana e que carreiam o fármaco piridostigmina;
LipoPIR_DOPC, lipossomas constituídos pelo lipídio DOPC em sua membrana e que
carreiam o fármaco priridostigmina. #A dose 1 mg/kg foi utilizada apenas para o tratamento
com o fármaco piridostigmina livre administrada por via subcutânea; a dose 10 mg/kg foi
utilizada para o tratamento com o fármaco piridostigmina veiculada em ambas as formulações
lipossomais por via subcutânea em todos os tempos estudados; a dose 20 mg/kg foi utilizada
apenas para o tratamento com o fármaco piridostigmina veiculada na formulação lipossomal
DSPC por via subcutânea apenas no tempo de 12 horas.
4.14-ANÁLISE DOS PARÂMETROS CARDIOVASCULARES
Os registros digitais dos experimentos, obtidos em DaqBoard, foram convertidos pelo
software Matlab 7.0 (MathWorks, EUA) e analisados por inspeção visual com o auxílio do
software WinDaq (DATAQ Instruments, EUA). Foram selecionados segmentos em instantes
específicos, os quais foram gravados para posterior obtenção dos parâmetros cardiovasculares,
sendo 16 segmentos após cada dose de NA administrada por animal, desta forma perfazendo
17
um total de 48 segmentos para cada animal. Os seguintes parâmetros cardiovasculares foram
extraídos: pressão arterial sistólica e diastólica, frequência cardíaca e intervalos QT, RR, PR e
complexo QRS do ECG (figura 3) e correção do intervalo QT pelo índice de Fridericia
(1920): QTc = QT / (RR)1/3.
Figura 3: Traço normal do ECG
Onda P: corresponde à despolarização atrial, esta é a primeira onda do ECG normal.
Intervalo PR: é um intervalo sem alteração da linha isoelétrica do ECG de superfície. É o
intervalo entre o início da onda P e início do complexo QRS. É um indicativo da velocidade
de condução entre os átrios e os ventrículos e corresponde ao tempo de condução do impulso
elétrico desde o nodo atrioventricular até aos ventrículos.
Complexo QRS: representa a despolarização dos ventrículos. É composto por uma deflexão
ascendente, a onda R, a qual é precedida e sucedida por deflexões descendentes - onda Q e
onda S, respectivamente.
Onda T: Representa a regularização atrial.
Intervalo QT: Intervalo de tempo medido entre o início do QRS ao final da onda T.
Corresponde à sístole elétrica total ventricular. Intervalo QT varia inversamente em relação à
frequência cardíaca, sendo menor na FC mais rápida e maior na FC mais lenta.
Intervalo RR: É o intervalo entre duas ondas R. Corresponde à frequência de despolarização
ventricular.
4.15-ANÁLISE ESTATÍSTICA
18
Os dados foram analisados utilizando-se One-way ANOVA seguida do pós-teste de
Tukey. Foi utilizado o software Graph Pad Prism® 5.0 (Graph Pad Software, EUA) como
ferramenta para as análises estatísticas. Os dados foram expressos como média ± erro padrão
da média (e.p.m), foi utilizado intervalo de confiança de 95 % e as diferenças foram
consideradas significativas quando o valor de P for menor ou igual a 0,05 (P < 0,05).
19
5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1–DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO PARA A
QUANTIFICAÇÃO DE PIRIDOSTIGMINA LIPOSSOMAL
O desenvolvimento de métodos de análise consiste na avaliação de diferentes
condições experimentais que permitem a determinação quantitativa do analito com
confiabilidade, rapidez do processo, baixo custo e com geração mínima de resíduos
(BRENDOLAN, 1997). A espectrofotometria U.V. atinge estes objetivos e a PIR diluída em
metanol mostrou absorção máxima no comprimento de onda de 270 nm, como descrito
anteriormente, sendo este o comprimento de onda selecionado.
Especificidade
A análise de amostras contendo apenas a matriz lipossomal produziu dados
coincidentes com a linha de base do espectro que mostra que a matriz não parece interferir
com a quantificação da PIR em lipossomas a um comprimento de onda de 270 nm.
Linearidade
Os dados das curvas analíticas, resultantes da média de oito curvas padrão, foram
ajustados por análise de regressão linear (Tabela 2). A equação da reta obtida foi:
Absorbância = 16,398 [PIR] mg.ml-1 + 0,0351, com coeficiente de correlação r = 0,9993,
significando que 99,93% da variação total em torno da média é explicada pela regressão
linear, com os resíduos (erro) de apenas 0,07%. Foram calculados as concentrações médias e
os desvios padrão relativos que se apresentaram dentro dos limites aceitáveis.
20
Tabela 2: Avaliação da linearidade a partir da análise de oito concentrações de brometo de
piridostigmina.
Concentração de
Piridostigmina (mg/ml)
Média das absorbâncias
(± DP )*
Cálculo da Concentração Média
de Piridostigmina (mg/ml)
0,02
0,3430 ± 0,027
0,0188
0,03
0,5325 ± 0,0135
0,0303
0,04
0,05
0,7047 ± 0,0215
0,8661 ± 0,01
0,0408
0,0507
0,06
0,07
1,0163 ± 0,0170
1,1853 ± 0,0166
0,0598
0,0701
0,08
1,3452 ± 0,0222
0,0799
0,09
1,5028 ± 0,0351
0,0895
*DP: desvio padrão.
Precisão
A precisão foi avaliada pelos estudos de repetibilidade e precisão intermediária. A
repetibilidade revelou coeficiente de variância de 1,73 % e 2,72 % (Tabela 3), portanto, menor
do que o valor máximo exigido de 5 %. Para o estudo de precisão intermediária os resultados
se encontram no intervalo de 0,32 a 2,32 % (Tabela 4).
Tabela 3: Determinação da precisão intra-dia a partir da análise de três concentrações de
brometo de piridostigmina.
Concentração Teórica
(mg.ml-1)
Concentração Experimental
(mg.ml-1)
D.P*
C.V.( %)*
0,03
0,0297
0,0316
0,0299
0,0298
0,0307
0,001
2,72
0,06
0,0607
0,0608
0,0597
0,0599
0,0582
0,001
1,73
0,09
0,0898
0,0921
0,0880
0,0908
0,0868
0,0021
2,39
*DP: desvio padrão; C.V.: coeficiente de variação.
21
Tabela 4: Determinação da precisão inter-dia a partir da análise de três concentrações de
brometo de piridostigmina.
Média da
Absorbância (nm)
Concentração
(mg.ml-1)
Concentração
Calculada
C.V(%)*
Dia 1
Dia 2
Dia 1
Dia 2
0,03
0,5325
0,5296
0,030
0,031
2,32
0,06
1,0163
1,0387
0,0598
0,061
1,41
0,09
1,5028
1,5575
0,0895
0,0899
0,32
*C.V: coeficiente de variação.
Exatidão
A exatidão foi verificada para três níveis de concentrações, baixa, média e alta, em
quintuplicatas. Os dados experimentais obtidos revelaram uma recuperação percentual que
variou de 99,45 a 101,12 % (Tabela 5). Os resultados do estudo de exatidão demonstram que
pequenas variações da concentração de PIR, podem ser prontamente quantificadas pelo
método, bem como não há interferência dos excipientes da forma lipossomal no doseamento
do produto final, portanto, o método analítico desenvolvido é suficientemente exato.
Tabela 5: Determinação da exatidão a partir da análise de três concentrações de brometo de
piridostigmina.
Concentração
Teórica (mg.ml-1)
0,03
0,0297
Concentração Real
(mg.ml-1)
0,030
0,0316 0,0299
Media
DP*
0,06
0,0607
0,0598
0,0608
0,09
0,0898
0,0895
0,0921
Exatidão
(%)
101,12
0,0298
0,0307
0,001
0,0597
0,0599
0,0582 0,0010
99,72
0,0880
0,0908
0,0868 0,0021
99,45
*DP: desvio padrão.
22
Limite de Quantificação (LQ)
O valor do limite de quantificação, estabelecido experimentalmente, com precisão e
exatidão aceitáveis à análise foi de 0,02 mg/ml (Tabela 6), demonstrando que o método é
sensível a pequenas concentrações.
Tabela 6: Determinação do parâmetro limite de quantificação por meio de concentrações
decrescentes de brometo de piridostigmina.
Concentração
-1
Teórica (mg.ml )
Concentração
D.P.*
C.V.*
Exatidão (%)
experimental
0,01
0,0083
0,0077
0,0076
0,00
4,685
78,58
0,02
0,0204
0,0203
0,0187
0,001
4,814
99,08
*DP: desvio padrão; C.V.: coeficiente de variação.
5.2 - DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO
O valor do rendimento de encapsulação da PIR para a formulação lipossomal DSPC
foi de 15,43 %, já para a formulação lipossomal DOPC foi de 23,38 % (Tabela 7).
Lipossomas constituídos pelo lipídeo DOPC possuem uma membrana mais fluida e com
maior liberdade de movimento entre cadeias lipídicas quando comparado à membrana
lipossomal constituída pelo lipídeo DSPC. Este fenômeno deve-se a diferença entre as
temperaturas de transição dos lipídeos, sendo menor que 0 ºC para o lipídeo DOPC e igual a
55 ºC para o lipídeo DSPC. Tal fato justifica a diferença entre os teores de encapsulação das
formulações, pois quanto mais fluida a membrana, permite maior hidratação do lipossoma e
assim a maior eficiência de encapsulação. Nardotto em 2009 demonstrou que a eficiência de
encapsulação do remifentamil em lipossomas de fosfatidilcolina foi, em média, de 20,56 %.
Para os fármacos metotrexato e 5-fluorouracilo, Conceição e colaboradores (2009) obtiveram
eficiência de encapsulação de 22,5 % e 13,2 %, respectivamente. Vidal e colaboradores
(2010) obtiveram 15,5 % de encapsulação para o brometo de PIR utilizando DSPC como
lipídio de maior proporção e empregando a mesma metodologia utilizada neste trabalho.
Assim, demonstra-se que os valores de eficiência de encapsulação obtidos no presente
trabalho são considerados satisfatórios e estão dentro dos valores aceitáveis e esperados para a
metodologia empregada no preparo dos lipossomas.
Um fator que pode influenciar na eficiência de encapsulação é a constituição da
bicamada lipídica dos lipossomas. Diferentes associações de lipídeos podem resultar em
23
diferentes características das membranas e valores de encapsulação, visto que cada lipídeo
têm suas características singulares. O CHOL, por exemplo, pode enrijecer ou fluidificar a
membrana lipídica dependendo do lipídeo principal associado a ele (FRÉZARD, 2005)
alterando as características dos lipossomas.
Tabela 7: Parâmetros de caracterização das formulações lipossomais.
Formulação
DOPC (vazio)
DOPC (PIR)
DSPC (vazio)
DSCP (PIR)
Eficiência de
encapsulação(
%) ± DP
23,38 ± 3,43
15,43 ± 0,38
Tamanho
médio
(nm)± DP
2074 ± 399,88
2631 ± 479,45
2885 ± 656,79
3022 ± 824,80
Índice de
Polidispersão
± DP
Potential
Zeta(mV) ±
DP
0,196 ± 0,024
0,390 ± 0,322
0,105 ± 0,042
0,655 ± 0,160
-3,73 ± 0.24
-3,68 ± 0.76
-4,90 ± 0.24
-4,55 ± 0.40
Relação
fármaco lipídeo
(p/p)± DP
0,151
0,095
n=3
5.3 - DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DOS LIPOSSOMAS
Os lipossomas de um modo geral podem ser constituídos de uma única bicamada
lipídica ou possuírem várias bicamadas em torno de seu compartimento interno, sendo
classificados como unilamelares e multilamelares, respectivamente (LASIC, 1998). Os
lipossomas classificados como MLV, por possuírem múltiplas bicamadas lipídicas
concêntricas, podem ter um diâmetro de até 5000 nm (GREGORIADIS, 1993).
A formulação lipossomal desenvolvida no presente trabalho foi classificada como
MLV, conforme esperado, visto que os lipossomas obtidos em ambas as formulações
apresentaram um alto tamanho médio conforme pode ser visualizado na Tabela 7, ficando
abaixo do tamanho máximo de 5000 nm descrito na literatura (GREGORIADIS, 1993).
O índice de polidispersão reflete a homogeneidade de tamanho das vesículas
lipossomais, e quando encontrado em valores abaixo de 0,3 representa formulações
monodispersas (HUNTER, 1998) em relação ao tamanho, ou seja, sem grandes variações
entre os tamanhos dos lipossomas.
Para este trabalho o índice de polidispersão é um dado de pequena relevância, visto
que em nenhum momento objetivou-se a preparação de uma formulação de tamanho calibrado
24
e monodispersa, e sim de uma formulação com grandes e multilamelares vesículas que,
possam servir como depósito do fármaco quando administrado pela via subcutânea. Dessa
forma, os dados obtidos foram os esperados, para ambas as formulações lipossomais
estudadas.
5.4 - DETERMINAÇÃO DA CARGA SUPERFICIAL DOS LIPOSSOMAS
A carga da superfície dos lipossomas é também conhecido como o potencial zeta. No
módulo, um valor alto para a carga de superfície significa uma boa estabilidade das
formulações, uma vez que leva as partículas a se afastarem umas das outras, e evitar colisões
de agregação entre as vesículas, que podem resultar em perda de formulação (FREZZARD,
2005). Assim, a repulsão eletrostática entre as vesículas é um fator importante para a
estabilidade da formulação (HEURTAUL, 2003). A formulação DSPC: CHOL mostrou uma
estabilidade mais elevada em comparação com a formulação DOPC: CHOL e ambas
mostraram carga superficial negativa (Tabela 7). Embora composta de lipídios neutros, as
vesículas de DOPC e DSPC exibem uma pequena rede de carga negativa na superfície com
baixa força iônica, sendo que, as vesículas de DSPC apresentaram maior carga negativa que
DOPC. Estudos realizados por Howard e Levin em 2010 demonstram que as vesículas
lipídicas com baixa densidade de carga de superfície como as formulações de DSPC e DOPC
presentes neste trabalho, podem agregar em baixas temperaturas, mas não rapidamente. Desta
forma, apesar de estudos demonstrarem que altos valores de potencial zeta serem os mais
adequados para preparações lipossomais, às formulações desenvolvidas neste trabalho
também são adequadas para o uso in vivo, o que sugere que não se agregam facilmente em
temperaturas ambiente e/ou fisiológica.
5.5 - PERFIL DE LIBERAÇÃO IN VITRO
A avaliação da concentração da PIR in vitro (Figura 4) a partir dos lipossomas, ou
seja, a determinação do perfil de liberação do fármaco a partir da formulação lipossomal
mostrou-se gradual ao longo do tempo avaliado, até 72 horas. A formulação composta de
DOPC: CHOL liberou maior teor de PIR no período avaliado (70,44%) quando comparada à
25
formulação composta de DSPC: CHOL (65,61%).
Os fosfolipídeos são caracterizados por uma temperatura de transição de fase (Tc), na
qual a membrana passa de uma fase gel, onde a cadeia hidrocarbonada do lipídeo está em
estado ordenado, para uma fase de cristal-líquido, onde as moléculas ficam com movimentos
mais livres e os radicais hidrofílicos agrupados tornam-se completamente hidratados. O
comprimento e a saturação da cadeia lipídica influenciam o valor da Tc. Portanto, diferentes
membranas compostas por lipídeos distintos podem exibir diferentes níveis de fluidez na
mesma temperatura (FRÉZARD, 2005; LASIC, 1998; ver revisão BATISTA, 2007). A
permeabilidade dos lipossomas é relativamente baixa quando a temperatura é menor que a Tc
dos lipossomas, sendo a mesma medida pelo fluxo ou pela taxa em que o soluto sai do
compartimento aquoso, através da bicamada. Esta propriedade vai depender, no entanto, da
natureza do soluto e da fluidez da membrana (FRÉZARD, 1999).
O DOPC é um lipídeo que origina uma bicamada fluida, pois possui temperatura de
transição de fase menor que a temperatura ambiente e, consequentemente, tem maior
movimentação das cadeias lipídicas (FREZARD, 2005, ver revisão BATISTA 2007). Isto
induziu uma maior permeação da PIR encapsulada, no período de 72 horas avaliado. Por outro
lado, o DSPC origina uma bicamada mais rígida, por possuir temperatura de transição de fase
maior que 60 oC, sendo suas cadeias mais estáticas, o que resulta em uma menor
permeabilidade das substâncias ativas encapsuladas (FREZARD, 2005; ver revisão
BATISTA, 2007). Assim, torna-se claro que as características físico-químicas dos lipídeos
DSPC e DOPC interferem na maior ou menor fluidez da bicamada lipídica formada, que por
sua vez interfere na permeabilidade da mesma ao fármaco.
O CHOL é adicionado na formulação contendo DOPC para diminuir a fluidez da
bicamada, já na formulação contendo DSPC ele exerce o efeito oposto, aumentando a fluidez
da bicamada evitando que ela fique extremamente rígida. O CHOL também é utilizado para
diminuir as deformações de membrana (FRÉZARD, 2005; ver revisão BATISTA, 2007).
26
75
70
Liberação de Piridostigmina (%)
65
60
55
50
45
40
35
DSPC:CHOL
DOPC:CHOL
30
25
20
15
10
5
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
Tempo (horas)
Figura 4: Perfil de liberação de piridostigmina da formulação lipossomal (37 mg/ml).
5.6 - DETERMINAÇÃO DA RELAÇÃO FÁRMACO/LIPÍDEO
A análise da concentração de fármaco em relação à concentração de lipídeo utilizado
mostrou que a relação fármaco/lipídeo da preparação composta por DOPC: CHOL é maior
que a encontrada para a formulação composta de DSPC: CHOL (Tabela 7). O ideal é que esta
relação seja maximizada, pois assim a quantidade de lipídeo administrada ao paciente seria
menor, resultando em redução dos efeitos adversos associado à formulação lipídica
(FRÉZARD, 2005).
Além disso, a relação fármaco/lipídeo apresenta relação direta para o volume
encapsulado do fármaco na formulação. Assim, a formulação lipossomal de DOPC: CHOL
em comparação com a formulação de DSPC: CHOL possui um maior teor de PIR encapsulada
(23,38%) (Tabela 7).
27
5.7-AVALIAÇÃO
DAS
CARDIOVASCULARES
ALTERAÇÕES
EM
RATOS
DOS
WISTAR
PARÂMETROS
TRATADOS
COM
PIRIDOSTIGMINA
Para a avaliação da potencial atividade cardioprotetora de duas novas formulações
lipossomais contendo PIR, foram utilizadas as doses de 10 e 20 mg/kg administradas por via
S.C.. A dose de 10 mg/kg foi a mesma já utilizada por via oral em ratos, e que apresentou tal
atividade (GRABE-GUIMARÃES et al., 1999) e é 10 vezes maior que a dose de PIR em
lipossomas unilamelares administrados por via I.V..
A administração S.C. de 3, 5 e 10 mg/kg de PIR livre induziu a efeitos tóxicos
característicos de hiperestimulação colinérgica, como piloereção, aumento da secreção nasal,
da motilidade intestinal, da micção, rigidez da cauda, qualitativamente observados, e
bradicardia severa observada no sinal de ECG, sendo descontinuados os experimentos para
estas doses, e sendo utilizada então a dose de 1 mg/kg. A encapsulação da PIR em ambas as
formulações (DSPC e DOPC) foi capaz de reduzir os sinais de toxicidade, uma vez que não
foram observados os mesmos efeitos após a administração de 10 mg/kg da formulação em
lipossomas. Após a administração de PIR lipossomal DSPC na dose de 20 mg/kg foi
observado qualitativamente, cerca de 1 hora e 30 minutos à 2 horas e 30 minutos de sua
administração S.C., piloereção e lacrimejamento. Estes efeitos foram atenuados ao longo do
tempo e cessaram em 4 à 5 horas após seu início. Os animais foram continuamente
monitorados e não foram observados os demais efeitos ocasionados por hiperestimulação
colinérgica.
A administração de NA 1, 3 e 10 µg/kg não alterou significativamente a FC dos
animais tratados com PIR livre. Já para os animais tratados com PIR lipossomal DSPC foi
observado redução significativa de FC no tempo de 6 horas, após a estimulação simpática na
dose de 3 µg/kg de NA. Para as demais doses de NA não foi observado redução significativa
de FC (Figura 1-ANEXO). Ainda para animais tratados com PIR lipossomal DSPC, na dose
de 20 mg/kg, foi observado redução significativa da FC no tempo estudado, 12 horas, após a
estimulação adrenérgica com 10 µg/kg de NA. Para este grupo, após a administração de 1 e
3 µg/kg de NA não houve diferença estatística entre os animais tratados e grupo controle. Em
relação aos animais tratados com PIR lipossomal em formulação DOPC, a administração de 1,
3 e 10 µg/kg NA não alterou significativamente a FC, em todos os tempos avaliados (Figura
2-ANEXO).
28
O efeito basal (período controle) de PIR, ou seja, administrado aos animais antes da
estimulação simpática com NA, na dose de 1 mg/kg para a forma livre e 10 e 20 mg/kg para a
formulação lipossomal, não induziu a alterações relevantes da PA e dos parâmetros do ECG
(Figuras 5 a 16 e Tabelas 8 a 13).
Nóbrega e colaboradores (1996) demonstraram que a PIR é capaz de produzir
bradicardia em indivíduos sadios. Além da bradicardia a PIR aumenta a variabilidade da
frequência cardíaca (REIS et al, 1998) e inibe as respostas hemodinâmicas ao estresse físico
(SERRA et al, 1998) e mental (NÓBREGA et al, 1999), sem prejudicar a função miocárdica
(PONTES et al, 1998). Assim, a redução dos valores absolutos de FC, tanto no tempo
controle como no tempo de 15 segundos após a administração de NA, dos animais tratados
com PIR seja em sua forma livre como em suas formas lipossomais quando comparados ao
grupo salina (Tabelas 8 a 13) está de acordo com o esperado.
Os dados apresentados para os grupos salina e PIR livre 1 mg/kg se repetem nas
tabelas 8 e 11 para 1 µg/kg de NA, 9 e 12 para 3 µg/kg de NA e 10 e 13 para 10 µg/kg de NA,
ou seja, são os mesmos grupos utilizados para a comparação com as duas formulações
lipossomais de PIR.
A PIR, um carbamato, é um agente anticolinesterásico reversível, com uma meia-vida
de aproximadamente 2,5 horas (GOODMAN & GILMAN, 2010). Sabe-se que a estimulação
muscarínica cardíaca por inibição da acetilcolinesterase, permite o aumento da concentração
sináptica do neurotransmissor, promovendo assim um efeito parassimpaticomimético
(GOODMAN & GILMAN, 2010). Tanto a PIR como outros anticolinesterásicos exercem
suas ações em sinapses colinérgicas, onde a ACh, liberada sob estimulação neural não é
hidrolizada e continua ligada aos receptores disponíveis na fenda sináptica. Por ter uma amina
quaternária, a PIR tem uma ação de caráter periférico, pois não atravessa a barreira
hematoencefálica.
Vidal e colaboradores (2010) após a administração I.V. de PIR veiculada em
lipossomas LUV foram capazes de observar resposta cardioprotetora em até 6 horas após a
administração. No entanto, neste trabalho, foi observado prolongamento do tempo de ação da
PIR em até 12 e 24 horas, respectivamente. O prolongamento do tempo de ação da PIR devese a utilização de lipossomas do tipo MLV constituídos de DSPC:CHOL ou DOPC:CHOL o
que permitiu liberação sustentada do fármaco.
29
O prolongamento do tempo de ação da priridostigmina acarreta em benefícios para o
paciente como maior comodidade, que ocorrerá devido à via de administração utilizada, via
S.C. e ao menor número de dosagens necessário para a manutenção da resposta
cardioprotetora. Além disso, a via S.C. é menos invasiva que a I.V. e o próprio paciente
poderá realizar sua administração após orientação adequada, não necessitando de profissional
treinado. Estudos realizados por Bernatova e colaboradores (2002) demonstraram que a
administração S.C. de PIR na dose de 1 mg/kg ou 3 mg/kg durante 7 dias, foi capaz de inibir
de forma significativa enzimas colinesterase e acetilcolinesterase com inexistência de efeitos
tóxicos comportamentais e cardiovasculares. A utilização da via S.C. pode ser uma maneira
útil de administração de PIR, eliminando problemas de subdosagem bem como superdosagem
(BERNATOVA et al, 2002).
Vale destacar que o desenvolvimento e caracterização de novas formulações
lipossomais de PIR que possam aumentar seu tempo de ação e reduzir os efeitos colaterais,
são avanços necessários na área farmacológica e biofarmacotécnica visando uma terapia
medicamentosa mais eficiente para doenças cardíacas isquêmicas, com maior comodidade e
segurança (AZEVEDO, 2011).
A fim de verificar a influência da composição lipídica dos lipossomas sobre os
parâmetros analisados, foi realizada a administração S.C. de lipossomas vazios de DSPC e
DOPC aos animais, os quais foram submetidos à estimulação simpática pela administração de
NA 1, 3 e 10 µg/kg nos tempos de 1 e 2 horas após o tratamento. Não foram observadas
diferenças nos valores de variação percentual entre os parâmetros do ECG e PA entre estes
animais e aqueles tratados com salina (grupos controle –Tabelas 8 a 13).
Neste trabalho foi utilizado o mesmo modelo de ativação simpática pela administração
de NA in bolus I.V. padronizado e utilizado por Vidal e colaboradores (2010), o qual
demonstrou igualmente eficaz para o objetivo proposto. A NA gera inotropismo,
cronotropismo e vasoconstrição generalizada por ação no músculo liso vascular aumentando a
PA, simulando um quadro semelhante às alterações cardiovasculares durante esforço físico e
situações de estresse (GOODMAN & GILMAN, 2010). A estimulação simpática por este
modelo é de fácil execução e não apresentou problemas no decorrer dos experimentos. Além
do método utilizado para ativação simpática, são descritos outros na literatura que muitas
vezes necessitam de equipamentos especiais, como o uso de estereotáxico (GRABEGUIMARÃES et al, 1999) ou cirurgias invasivas (SOUZA, 2005; GOLDMAN E RAYA,
1995).
30
Estudos realizados por Franco em 2008 demonstraram que na dose 10 mg/kg de
cetamina e 1,1 mg/kg de xilasina não foi suficientemente capaz de desencadear alterações na
condução elétrica atrial. Ainda sobre os resultados obtidos por Franco em 2008, foi
demonstrado que os dados obtidos referentes ao intervalo QT permaneceram dentro da
normalidade sugeridos por TILLEY (1992). Assim, indicando não haver indícios de alterações
sobre a dinâmica cardíaca, corroborando com as informações descritas por OGUCHI &
HAMLIN (1993), de que a avaliação do intervalo QT é rotineiramente empregada para
monitorar os possíveis efeitos de fármacos e eletrólitos sobre a dinâmica cardíaca. Também
Švorc e colaboradore em 2013, concluíram que o uso da anestesia cetamina/xilasina causa um
aumento na atividade parassimpática e suprime a atividade simpática resultando em
bradicardia marcado de forma independente do ciclo luz/escuro. Com tudo, tal anestésico
pode ser aplicável em estudos cardiovasculares, mas não em estudos cronobiológicos porque
modifica a ritmicidade diária da atividade do SNA.
A NA induziu a aumentos marcantes da PA, como esperado. Para a PAS (Tabelas 8 a
13), foram observados aumentos máximos de 57,7; 54,1 e 79,7 % após 15 segundos da
administração de NA 1, 3 e 10 µg/kg, respectivamente. O tratamento prévio com PIR
lipossomal da formulação DSPC 10 mg/kg foi capaz de impedir significativamente o aumento
da PAS, nos tempos de 4, 10 e 12 horas após o tratamento quando comparado ao grupo salina,
com inibição máxima de 50,6 %, em 12 horas (Figuras 5, 7 e 9). As variações máximas
causadas pelas doses de 1, 3 e 10 µg/kg de NA sobre a PAD dos animais não tratados foram
55,1; 51,4 e 70,0 %, respectivamente (Figuras 6, 8 e 10), e o tratamento com PIR lipossomal
na formulação DSPC dose 10 mg/kg foi capaz de reduzir significativamente a PAD no tempo
de 12 horas após a administração subcutânea da formulação (Figura 10). O tratamento com a
mesma formulação, porém na dose de 20 mg/kg, também foi capaz de impedir
significativamente o aumento da PAS, mas não de forma significativa para a PAD, quando
comparado ao grupo salina, com inibição máxima de 66,2 % e de 57,6 %, respectivamente
(Figuras 17 e 18).
O tratamento prévio com PIR lipossomal da formulação DOPC foi capaz de impedir o
aumento significativo da PAS causado por 1, 3, 10 µg/kg de NA, nos tempos de 1, 2, 4, 6, 24
horas, com inibição máxima de 89,3 %, quando comparado ao grupo salina (Figuras 5, 7 e 9)
e foi capaz de reduzir significativamente os aumentos da PAD no tempo de 24horas após a
administração subcutânea da formulação (Figuras 6, 8 e 10), com inibição máxima de
69,98 %.
31
1 hora
Salina
Pir livre
LipoPIR_DSPC
LipoPIR_DOPC
50
40
30
20
10
# #
2 horas
60
Variação PAS%
Variação PAS%
60
0
50
40
30
20
10
#
0
0
20
40
60
80
100
0
120
20
40
Tempo (seg)
4horas
50
40
30
20
#
10
*
0
20
40
60
80
100
120
100
120
100
120
50
40
30
20
10
120
#
0
Tempo (seg)
8 horas
20
40
50
40
30
20
10
0
60
80
Tempo (seg)
10horas
60
Variação PAS%
60
Variação PAS%
100
0
0
50
40
30
20
10
*
0
0
20
40
60
80
100
120
0
20
40
Tempo (seg)
Variação PAS %
60
50
40
30
20
*
10
60
80
Tempo (seg)
12 horas
60
Variação PAS%
80
6 horas
60
Variação PAS%
Variação PAS%
60
60
Tempo (seg)
0
24 horas
50
40
30
#
20
10
#
#
#
0
0
20
40
60
80
100
120
0
20
Tempo (seg)
40
60
80
100
120
Tempo (seg)
Figura 5: Variação percentual da PAS após administração I.V. de 1 µg/kg de NA, 1, 2, 4, 6,
8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose de 1
mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10 mg/kg.
ANOVA, seguido de teste Tukey •P < 0,05 grupo piridosstigmina livre (Pir livre) em relação
ao grupo salina. * P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em lipossomas DSPC
(LipoPIR_DSPC) em relação ao grupo salina. # P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em
lipossomas DOPC (LipoPIR_DOPC) em relação ao grupo salina.
32
1hora
2 horas
Salina
Pir livre
LipoPIR_DSPC
LipoPIR_DOPC
50
40
30
20
10
60
Variação PAD%
Variação PAD%
60
0
50
40
30
20
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0
0
20
40
60
80
100
120
0
20
40
Tempo (seg)
4 horas
50
40
30
20
10
0
100
120
100
120
100
120
50
40
30
20
10
0
0
20
40
60
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100
120
0
20
40
Tempo (seg)
8 horas
60
80
Tempo (seg)
10 horas
60
Variação PAD%
60
Variação PAD%
80
60
Variação PAD%
Variação PAD%
60
50
40
30
20
10
0
50
40
30
20
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0
0
20
40
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80
100
120
0
20
40
Tempo (seg)
60
80
Tempo (seg)
24 horas
12 horas
60
Variação PAD%
60
Variação PAD%
60
Tempo (seg)
6 horas
50
40
30
20
10
50
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30
#
20
10
0
0
0
20
40
60
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100
120
0
20
Tempo (seg)
40
60
80
100
120
Tempo (seg)
Figura 6: Variação percentual da PAD após administração I.V. de 1 µg/kg de NA, 1, 2, 4, 6,
8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose de 1
mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10 mg/kg.
ANOVA, seguido de teste Tukey. •P < 0,05 grupo piridosstigmina livre (Pir livre) em relação
ao grupo salina. * P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em lipossomas DSPC
(LipoPIR_DSPC) em relação ao grupo salina. # P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em
lipossomas DOPC (LipoPIR_DOPC) em relação ao grupo salina.
33
40
60
80
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
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0
20
40
60
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2 horas
0
20
20
20
40
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90
80
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30
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10
0
Variação PAS%
120
40
60
80
100
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*
0
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80
100
20
40
60
80
100
120
100
120
Tempo (seg)
12 horas
0
80
Tempo (seg)
10horas
Tempo (seg)
90
80
70
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50
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0
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* *
0
120
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Tempo (seg)
6horas
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Tempo (seg)
8horas
90
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50
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0
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50
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0
120
Tempo (seg)
4horas
0
Variação PAS%
20
Variação PAS%
Variação PAS%
0
Salina
Pir livre
LIPOPIR_DSPC
LipoPIR_DOPC
Variação PAS%
1hora
Variação PAS%
Variação PAS%
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100
120
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
24 horas
## # # #
0
20
Tempo (seg)
#
40
#
60
80
Tempo (seg)
Figura 7: Variação percentual da PAS após administração I.V. de 3 µg/kg de NA, 1, 2, 4, 6,
8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose de 1
mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10 mg/kg.
ANOVA, seguido de teste Tukey. •P < 0,05 grupo piridosstigmina livre (Pir livre) em relação
ao grupo salina. * P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em lipossomas DSPC
(LipoPIR_DSPC) em relação ao grupo salina. # P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em
lipossomas DOPC (LipoPIR_DOPC) em relação ao grupo salina.
34
Salina
Pir livre
LipoPIR_DSPC
LipoPIR_DOPC
0
20
40
60
80
100
Variação PAD%
Variação PAD%
1 hora
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60
50
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0
2 horas
80
70
60
50
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30
20
10
0
120
0
20
4 horas
80
70
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50
40
30
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10
0
0
20
40
60
80
100
120
40
60
80
20
100
120
40
60
80
Variação PAD%
Variação PAD%
Tempo (seg)
60
80
100
120
20
40
60
80
100
120
Tempo (seg)
Variação PAD%
20
120
10 horas
0
12 horas
0
40
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Tempo (seg)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100
Tempo (seg)
Variação PAD%
20
80
6 horas
0
8 horas
0
60
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Tempo (seg)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
40
Tempo (seg)
Variação PAD%
Variação PAD%
Tempo (seg)
100
120
24 horas
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
20
40
60
80
100
120
Tempo (seg)
Figura 8: Variação percentual da PAD após administração I.V. de 3 µg/kg de NA, 1, 2, 4, 6,
8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose de 1
mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10 mg/kg.
ANOVA, seguido de teste Tukey. •P < 0,05 grupo piridosstigmina livre (Pir livre) em relação
ao grupo salina. * P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em lipossomas DSPC
(LipoPIR_DSPC) em relação ao grupo salina. # P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em
lipossomas DOPC (LipoPIR_DOPC) em relação ao grupo salina.
35
2horas
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Salina
Pir livre
LipoPIR_DSPC
LipoPIR_DOPC
***
***
Variação PAS%
Variação PAS%
1hora
*
0
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50
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0
120
 

0
20
40
Tempo (seg)
Variação PAS%
#
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40
60
80
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*
0
40
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8horas
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100
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0
0
120
20
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60
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Tempo (seg)
12 horas
24 horas
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120
100
120
100
120
***
Tempo (seg)
* **
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Tempo (seg)
40
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*
#
0
Variação PAS%
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50
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100
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0
0
80
Tempo (seg)
Variação PAS%
Variação PAS%
0
Variação PAS%
Variação PAS%
4horas
100
90
80
70
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50
40
30
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0
60
Tempo (seg)
6horas
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100
120
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
##
#
#
0
20
Tempo (seg)
40
60
80
100
120
Tempo (seg)
Figura 9: Variação percentual da PAS após administração I.V. de 10 µg/kg de NA, 1, 2, 4, 6,
8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose de 1
mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10 mg/kg.
ANOVA, seguido de teste Tukey. •P < 0,05 grupo piridosstigmina livre (Pir livre) em relação
ao grupo salina. * P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em lipossomas DSPC
(LipoPIR_DSPC) em relação ao grupo salina. # P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em
lipossomas DOPC (LipoPIR_DOPC) em relação ao grupo salina.
36
1 hora
Variação PAD%
Salina
Pir livre
Pirlipo_DSPC
Pirlipo_DOPC
0
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40
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2 horas
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Variação PAD%
100
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30
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0
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0
20
40
Tempo (seg)
4 horas
Variação PAD%
Variação PAD%
100
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60
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0
0
20
40
60
80
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120
80
100
100
120
6 horas
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80
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60
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0
120
0
20
40
Tempo (seg)
60
80
Tempo (seg)
8 horas
10 horas
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Variação PAD%
Variação PAD%
100
90
80
70
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50
40
30
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10
0
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Tempo (seg)
0
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40
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80
100
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0
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Tempo (seg)
12 horas
Variação PAD %
*
0
20
40
60
80
100
120
24 horas
100
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80
70
60
50
40
30
20
10
0
Variação PAD%
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
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Tempo (seg)
80
100
120
*
0
20
Tempo (seg)
40
60
80
100
120
Tempo (seg)
Figura 10: Variação percentual da PAD após administração I.V. de 10 µg/kg de NA, 1, 2, 4,
6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose de 1
mg/kg e piridostigmina na formulação lipossomal DSPC e DOPC na dose de 10 mg/kg.
ANOVA, seguido de teste Tukey. •P < 0,05 grupo piridosstigmina livre (Pir livre) em relação
ao grupo salina. * P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em lipossomas DSPC
(LipoPIR_DSPC) em relação ao grupo salina. # P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em
lipossomas DOPC (LipoPIR_DOPC) em relação ao grupo salina.
37
Em relação à análise dos parâmetros do ECG, foi observado que a administração S.C.
de PIR foi capaz de reduzir as alterações causadas pela NA sobre o intervalo QT (Tabelas 8 a
13, figuras 11, 13 e 15). Para os animais que receberam PIR livre (1 mg/kg) foi observado
redução significativa do intervalo QT quando realizada a estimulação simpática com 3 e
10 μg/kg de NA em relação ao grupo salina. Esse efeito também foi observado para ambas às
formulações lipossomais. Para os animais tratados com PIR lipossomal na formulação de
DSPC 10 mg/kg houve redução significativa do prolongamento do intervalo QT em até
57,1 %, em relação ao grupo salina, no tempo de 8 horas após o tratamento, para 3 μg/kg de
NA (Figura 13). Nos tempos de 4, 6, 8, 10, 12 horas, também foi observada redução
significativa do prolongamento do intervalo QT em até 76,4 %, para 10 μg/kg de NA, em
relação ao grupo salina (Figura 15). O tratamento na dose de 20 mg/kg com PIR lipossomal na
formulação DSCP também foi capaz de atenuar de forma significativa o prolongamento do
intervalo QT no tempo estudado, com redução máxima de 67,5 % e de 60,0 %, em relação ao
grupo salina, após a estimulação simpática com 3 e 10 μg/kg de NA, respectivamente (Figura
17 e 18). Não foi observado redução significativa do prolongamento do intervalo QT para
ambas as formulações lipossomais após 1 μg/kg de NA (Figura 11). Para todos os grupos, as
alterações foram máximas entre 15, 20 e 25 segundos após a administração. Como não foi
observado grandes variações na FC o intervalo QTc apresentou perfil de variação semelhante
ao intervalo QT. Foi observado redução significativa dos aumentos do QTc para animais
tratados com 10 mg/kg PIR lipossomal de DSPC, nos tempos de 6, 8, e 10 horas após a
estimulação simpática nas doses de 3 e 10 µg/kg de NA (Figuras 14 e 16). Para a mesma
formulação na dose de 20 mg/kg também foi observado redução significativa do intervalo
QTc após a estimulação simpática nas doses de 3 e 10 µg/kg de NA, 12 horas.
Após o tratamento com PIR, tanto livre quanto em formulação lipossomal DSPC, em
ambas as doses estudadas não foram observadas alterações significativas no intervalo PR do
ECG (Tabelas 8 a 10). Para os mesmo grupos citados acima, também não foram encontradas
alterações relevantes do complexo QRS do ECG (Tabelas 8 a 10).
Em relação aos parâmetros do ECG para animais tratados com PIR na formulação
lipossomal DOPC foi observado redução significativa do prolongamento do intervalo QT nos
tempos de 4, 6, 12 e 24 horas, sendo esta de até 60,9 %, para 3 μg/kg de NA, em relação ao
grupo salina (Figura 13). Para 10 μg/kg de NA, houve redução significativa do prolongamento
do intervalo QT em todos os tempos avaliados, sendo o máximo 73,0 % (Figura 15). O
intervalo QTc apresentou perfil de variação semelhante ao intervalo QT, sendo observado
38
redução significativa nos tempos 2 e 12 horas após a administração de PIR e sob a
estimulação simpática por 3 µg/kg NA; e também em todos os tempos avaliados após a
estimulação simpática de 10 µg/kg de NA (Figuras 14 e 16).
Semelhante ao grupo tratado com PIR livre o grupo tratado com PIR lipossomal em
formulação DOPC, não foram observadas alterações significativas do intervalo PR e
complexo QRS do ECG após estimulações simpáticas com NA.
39
2 horas
1 hora
Salina
Pir livre
LipoPIR_DSPC
LipoPIR_DOPC
20
15
10
5
25
Variação QT %
Variação QT %
25
0
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
120
0
20
Tempo (seg)
4 horas
Variação QT %
Variação QT %
80
100
120
100
120
100
120
100
120
25
20
15
10
5
0
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
120
0
20
40
60
80
Tempo (seg)
Tempo (seg)
8 horas
10 horas
25
Variação QT %
25
Variação QT %
60
Tempo (seg)
6 horas
25
20
15
10
5
0
20
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
120
0
20
40
60
80
Tempo (seg)
Tempo (seg)
12 horas
24 horas
25
25
Variação QT %
Variação QT %
40
20
15
10
5
0
20
15
10
#
5
0
0
20
40
60
80
100
120
0
20
Tempo (seg)
40
60
80
Tempo (seg)
Figura 11: Variação percentual do intervalo QT após administração I.V. de 1 µg/kg de NA, 1,
2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose
de 1 mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10
mg/kg. ANOVA, seguido de teste Tukey. •P < 0,05 grupo piridosstigmina livre (Pir livre) em
relação ao grupo salina. * P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em lipossomas DSPC
(LipoPIR_DSPC) em relação ao grupo salina. # P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em
lipossomas DOPC (LipoPIR_DOPC) em relação ao grupo salina.
40
30
30
1 hora
20
25
LipoPIR_DSPC
LipoPIR_DOPC
15
10
5
Variação QTc %
Variação QTc %
25
Salina
Pir livre
0
15
10
5
0
20
-5
40
60
80
100
120
20
-5
Tempo (seg)
30
40
60
80
100
120
Tempo (seg)
30
25
25
4 horas
Variação QTc %
Variação QTc %
2 horas
20
20
15
10
5
6 horas
20
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10
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#
0
20
40
-5
60
80
100
0
120
20
-5
Tempo (seg)
25
8 horas
Variação QTc %
Variação QTc %
25
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15
10
5
0
80
100
120
100
120
100
120
10 horas
20
15
10
5
0
20
-5
40
60
80
100
120
20
-5
Tempo (seg)
40
60
80
Tempo (seg)
30
30
25
12 horas
Variação QTc %
25
Variação QTc %
60
Tempo (seg)
30
30
20
15
10
5
0
-5
40
20
40
60
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Tempo (seg)
100
120
20
15
10
5
0
20
-5
-10
40
60
80
Tempo (seg)
Figura 12: Variação percentual do índice QTc após administração I.V. de 1 µg/kg de NA, 1,
2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose
de 1 mg/kg e e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10
mg/kg. ANOVA, seguido de teste Tukey. •P < 0,05 grupo piridosstigmina livre (Pir livre) em
relação ao grupo salina. * P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em lipossomas DSPC
(LipoPIR_DSPC) em relação ao grupo salina. # P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em
lipossomas DOPC (LipoPIR_DOPC) em relação ao grupo salina.
41
Variação QT %
Salina
Pir livre
LipoPIR_DSPC
LipoPIR_DOPC
20
15
10
5
 
0
0
20
2 horas
25
Variação QT %
1 hora
25
20
15
10
5
  
0
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60
80
100
120
0
20
40
Tempo (seg)
Variação QT %
Variação QT %
15
10
5
120
100
120
100
120
20
15
10
5
## # #
0
0
0
20
40
60
80
100
0
120
20
40
Tempo (seg)
80
10 horas
Variação QT %
25
20
15
10
**
5
60
Tempo (seg)
8 horas
25
Variação QT %
100
6 horas
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15
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0
0
0
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60
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100
0
120
20
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12 horas
20
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5
0
0
## #
20
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24 horas
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Variação QT %
25
60
Tempo (seg)
Tempo (seg)
Variação QT %
80
Tempo (seg)
4 horas
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##
5
#
#
0
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100
120
0
20
Tempo (seg)
40
60
80
100
120
Tempo (seg)
Figura 13: Variação percentual do intervalo QT após administração I.V. de 3 µg/kg de NA, 1,
2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose
de 1 mg/kg e e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10
mg/Kg. ANOVA, seguido de teste Tukey. •P < 0,05 grupo piridosstigmina livre (Pir livre) em
relação ao grupo salina. * P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em lipossomas DSPC
(LipoPIR_DSPC) em relação ao grupo salina. # P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em
lipossomas DOPC (LipoPIR_DOPC) em relação ao grupo salina.
42
Variação QTc %
25
20
15
10
5
0
-5

20
40
80
100
120
15
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-5

20
40
60
80
100
120
Variação QTc %
15
10
****
0
40
60
 
0
#
#
20
40
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100
120
Variação QTc %
Variação QTc %
20
15
10
5
# # ##
0
-5
20
40
60
80
Tempo (seg)
100
120
120
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5
** **
0
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40
60
80
100
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Tempo (seg)
10 horas
25
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10
5
*
**
*
0
20
40
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100
120
100
120
Tempo (seg)
24 horas
30
25
100
25
-5
12 horas
80
6 horas
Tempo (seg)
30
60
Tempo (seg)
30
20
20
5
-5
8 horas
25
-5
10
-5
Tempo (seg)
30
5
15
30
20
0
20
4 horas
25
5
25
Variação QTc %
Variação QTc %
60
2 horas
30
Tempo (seg)
30
Variação QTc %
Salina
Pir livre
LipoPIR_DSPC
LipoPIR_DOPC
Variação QTc %
1 hora
30
25
20
15
10
5
0
-5
20
40
60
80
Tempo (seg)
Figura 14: Variação percentual do intervalo QTc após administração I.V. de 3 µg/kg de NA,
1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na
dose de 1 mg/kg e e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de
10 mg/Kg. ANOVA, seguido de teste Tukey. •P < 0,05 grupo piridosstigmina livre (Pir livre)
em relação ao grupo salina. * P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em lipossomas DSPC
(LipoPIR_DSPC) em relação ao grupo salina. # P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em
lipossomas DOPC (LipoPIR_DOPC) em relação ao grupo salina.
43
Variação QT %
Salina
Pir livre
LipoPIR_DSPC
LipoPIR_DOPC
20
15
10
# ##
5
  
0
0
20
2 horas
25
Variação QT %
1 hora
25
20
15
10
# ##
5

 
0
40
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80
100
120
0
20
40
Tempo (seg)
Variação QT %
Variação QT %
25
4 horas
25
20
15
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**
####
5
0
0
*
 
20
60
80
100
120
20
15
*
10
*

*
5
## ##
0
120
20
40
60
80
100
120
Tempo (seg)
8 horas
10 horas
25
Variação QT %
Variação QT %
100
0
40
25
20
15
***
5
0
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10
** * *
5
0
0
20
40
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0
20
Tempo (seg)
60
80
100
120
100
120
24 horas
Variação QT %
25
20
15
10
40
Tempo (seg)
12 horas
25
Variação QT %
80
6 horas
Tempo (seg)
10
60
Tempo (seg)
**
5
###
0
20
15
10
#
# # #
5
0
0
20
40
60
80
100
120
0
20
Tempo (seg)
40
60
80
Tempo (seg)
Figura 15: Variação percentual do intervalo QT após administração I.V. de 10 µg/kg de NA,
1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na
dose de 1 mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10
mg/Kg. ANOVA, seguido de teste Tukey. •P < 0,05 grupo piridosstigmina livre (Pir livre) em
relação ao grupo salina. * P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em lipossomas DSPC
(LipoPIR_DSPC) em relação ao grupo salina. # P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em
lipossomas DOPC (LipoPIR_DOPC) em relação ao grupo salina.
44
30
25
20
15
10
5
0
-5

##

20#
40
60
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Variação QTc %
Salina
Pir livre
LipoPIR_DSPC
LipoPIR_DOPC
120
30
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5
0
-5
Tempo (seg)
2 horas

#
##
#20
##
20

40
60
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100
120
*** *
40
60
80
100
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# # #
40
60
120
100
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## ##
**
*20
40
60
80
30
25
20
15
10
5
0
-5
10 horas
***
20
40
60
80
100
120
Tempo (seg)
12 horas
20
100
6 horas
Tempo (seg)
8 horas
20
30
25
20
15
10
5
0
-5
80
Tempo (seg)
Variação QTc %
Variação QTc %
60
Tempo (seg)
Tempo (seg)
30
25
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
40
4 horas
Variação QTc %
30
25
20
15
10
5
0
-5
1 hora
Variação QTc %
Variação QTc %
Variação QTc %
Variação QTc %
30
25
20
15
10
5
0
-5
80
Tempo (seg)
100
120
30
25
20
15
10
5
0
-5
24 horas
# ##
20
40
60
80
100
120
Tempo (seg)
Figura 16: Variação percentual do índice QTc após administração I.V. de 10 µg/kg de NA, 1,
2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre na dose
de 1 mg/kg e piridostigmina nas formulações lipossomais DSPC e DOPC na dose de 10
mg/Kg. ANOVA, seguido de teste Tukey. •P < 0,05 grupo piridosstigmina livre (Pir livre) em
relação ao grupo salina. * P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em lipossomas DSPC
(LipoPIR_DSPC) em relação ao grupo salina. # P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em
lipossomas DOPC (LipoPIR_DOPC) em relação ao grupo salina.
45
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Salina
LipoPIR_DSPC_20mg/kg
LipoPIR_DSPC_10mg/kg
Variação PAD%
Variação PAS%
12 horas
^
0
20
40
60
80
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
120
20
25
60
80
100
120
100
120
25
Variação QTc %
Variação QT %
40
Tempo (seg)
Tempo (seg)
20
15
10
5
^^^ ^
0
0
20
20
15
10
5
^ ^^ ^
0
40
60
80
Tempo (seg)
100
120
0
20
40
60
80
Tempo (seg)
Figura 17: Variação percentual de PAS, PAD, intervalo QT e índice QTc após administração
I.V. de 3 µg/kg de NA, 12 horas após a administração S.C. de salina e piridostigmina na
formulação lipossomal DSPC nas doses de 10 e 20 mg/kg. ANOVA, seguido de teste Tukey.
* P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em lipossomas DSPC (LipoPIR_DSPC), dose
10 mg/kg, em relação ao grupo salina. ^ P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em
lipossomas DSPC (LipoPIR_DSPC), dose 20 mg/kg, em relação ao grupo salina.
46
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Salina
LipoPIR_DSPC_20mgKg
DSPC 12h 10mgKg
^
Variação PAD%
Variação PAS%
12 horas
*
** *
0
20
40
60
80
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
120
*
0
20
30
20
25
15
10
*
5
40
60
80
100
120
100
120
Tempo (seg)
25
Variação QTc %
Variação QT %
Tempo (seg)
**
^
^ ^
0
20
15
10
^^^
5
^
0
0
20
40
60
80
Tempo (seg)
100
120
0
20
40
60
80
Tempo (seg)
Figura 18: Variação percentual de PAS, PAD, intervalo QT e índice QTc após administração
I.V. de 10 µg/kg de NA,12 horas após a administração S.C. de salina e piridostigmina na
formulação lipossomal DSPC nas doses de 10 e 20 mg/kg. . ANOVA, seguido de teste Tukey.
* P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em lipossomas DSPC (LipoPIR_DSPC), dose
10 mg/kg, em relação ao grupo salina. ^ P < 0,05 grupo piridostigmina veiculada em
lipossomas DSPC (LipoPIR_DSPC), dose 20 mg/kg, em relação ao grupo salina.
47
Tabela 8: Valores absolutos de parâmetros da PA e do ECG após administração de 1 µg/kg de NA (basal e 15 segundos após) em animais previamente
tratados com piridostigmina em lipossomas de DSPC administrado por via S.C. (n=8/grupo).
Grupos
Tempo
PAS (mmHg)
PAD (mmHg)
Experimentais após
adm.
0
15
0
15
(horas)
125±2,3 192±5,3 91±1,6 141 ±1,4
Salina
1
Pir Livre
Lipovazio
LipoPIR
FC (bpm)
0
300±9,9
15
QT (ms)
0
QTc (ms)
15
0
PR (ms)
15
0
QRS (ms)
15
0
15
301 ±5,6 67,8±1,72 75,4 ±0,75 120,9±5,47 138,5±1,69 54,4±1,51 54,2±1,32 22,6±0,50 22,6±0,72
2
116±2,6 161±2,1 88±3,5 130±3,3 246±11,7 233±10,6 69,5±1,80 80,8±1,08 120,8±5,53 137,9±4,13 52,3±2,35 53,8±2,11 22,3±0,35 23,9±0,66
1
120±2,9 151±11,1 81±4,9 106±6,4
217±1,1
232±4,9 65,0±0,86 71,0±0,61
2
122±3,1 141±6,2 88±4,7
252±9,2
249±8,3 66,3±0,82 71,5±0,92 114,4±4,15 123,0±3,50 56,2±2,95 56,5±2,65 22,6±0,76 22,0±0,44
4
118±5,5 147±12,0 85±5,6 113 ±8,8 271±21,0 256±18,2 60,0±2,01
62,5 ±1,8
104,1±6,47 103,1±4,89 46,4 ±2,0 46,3±2,58 18,57±0,5 18,68±0,63
6
114±6,7 172 ±9,9 85±6,3 136±4,63 296 ±9,5 280±11,3 63,1±0,65
67 ±1,38
110,9±3,21 114,3±4,43 52,6±0,85 54,7±1,18 20,32±0,7 20,77±1,18
1
115±3,9 169±3,0 88±3,5 123±4,1
252±9,2 252±15,7 84,3±1,23 104,3±2,14 136,2±3,61 163,5±5,00 54,3±1,32 55,1±1,24 22,5±0,69 22,6±0,48
2
103±2,7 151±1,8 76±2,4 116±2,1
271±4,3 257±14,9 88,5±3,92 103,7±2,89 139,6±3,23 173,0±7,61 55,0±1,36 54,3±1,27 22,9±0,71 22,4±0,69
1
112±3,7 149±2,8 75±6,0 103±3,1 236±10,9 250±12,9 88,5±5,45 103,5±5,75 131,7±1,63 161,4±3,07 52,4±1,69 52,2±1,83 22,0±1,32 24,2±3,19
2
110±5,6 154±6,4 79±3,8 111±4,2
225±9,4
4
113±0,8 137 ±4,1 79±3,4
275±24,1 255±26,8 86,5±5,23 96,9±5,47 125,3±1,14 143,2±0,20 60,7±0,42 60,2±0,77 22,3±0,49 22,3±0,40
6
111±1,3 145±6,6 74±4,1 101±4,7 277±12,3 254±14,8 79,4±1,11 87,1±0,68 134,3±1,44 146,9±2,94 60,9±1,87 62,4±1,99 22,0±0,62 22,1±0,70
8
121±7,6 168±10,3 91±7,2 128±7,8 281±20,5 337±5,5 66,3±0,93 70,9±1,33 113,7±2,96 122,8±3,32 55,0±0,95 56,1±0,85 21,0±0,56 21,4 ±0,68
10
127±4,5 154±7,1 86±3,8 111±6,6 226±17,6 228±18,0 67,5±1,01 74,1±0,78 109,6±2,89 120,8±3,63 65,1±3,09 65,0±3,22 23,7±0,74 24,3±0,93
12
123±1,2 150±11,2 88±0,6 112±7,1 243±25,1 260±28,4 64,5±0,59 69,4±0,86 102,5±4,01 112,6±4,74 53,7±1,06 56,4±1,58 21,2±0,53 21,4±1,03
99±4,3
99±2,2
99,5±3,91 111,5±4,51 58,2±2,59 57,9 ±2,2 21,8±0,57 21,6±0,76
238±7,9 86,5±0,53 97,1±2,70 139,7±5,37 165,6±6,99 54,8±1,50 53,6±1,62 21,6±0,86 21,2±0,70
48
Tabela 9: Valores absolutos de parâmetros da PA e do ECG após administração de 3 µg/kg de NA (basal e 15 segundos após) em animais
previamente tratados com piridostigmina em lipossomas de DSPC administrado por via S.C. (n=8/grupo).
Grupos
Experimentais
Tempo após
administração
(horas)
1
Salina
2
Pir Livre
1
2
4
6
1
Lipovazio
2
1
2
LipoPIR
4
6
8
10
12
PAS (mmHg)
0
122 ±
3,7
117 ±
3,6
126 ±
7,7
128 ±
6,9
125,7
± 6,5
128,6
± 7,1
109 ±
8,1
105 ±
4,8
117 ±
3,9
110 ±
5,2
114 ±
8,2
105
±5,1
129 ±
6,4
126 ±
9,8
123 ±
1,2
15
188 ±
10,3
188 ±
9,6
173 ±
9,5
200 ±
40,1
194 ±
7,39
170,0
± 14,9
189 ±
4,7
181 ±
4,3
183 ±
6,9
177 ±
7,2
176 ±
8,9
176 ±
7,1
181 ±
10,7
170 ±
13,5
168 ±
13,2
PAD (mmHg)
0
93 ±
1,5
88 ±
3,2
91 ±
7,7
87 ±
2,6
87 ±
3,7
88,12
± 0,6
79 ±
8,4
78 ±
5,9
79 ±
4,3
77 ±
4,6
74 ±
5,8
65 ±
2,9
99 ±
7,1
97 ±
9,2
88 ±
0,6
15
142 ±
7,5
143 ±
5,2
116 ±
4,3
117 ±
6,0
116 ±
4,9
122 ±
9,8
130 ±
3,8
132 ±
2,9
120 ±
3,5
124 ±
3,1
115 ±
5,8
112 ±
4,7
136 ±
9,0
124 ±
10,1
121 ±
8,2
FC (bpm)
0
304 ±
31,1
287 ±
22,8
229 ±
23,2
298 ±
18,3
259 ±
38,9
303 ±
6,99
273 ±
16,1
268 ±
8,2
227 ±
1,3
247 ±
18,2
226 ±
26,6
227 ±
20,0
304 ±
1,9
281 ±
27,5
243 ±
25,0
15
332 ±
23,9
307 ±
20,2
250 ±
22,7
302 ±
23,7
226,4 ±
21,8
266,9 ±
31,1
268 ±
20,6
261 ±
11,2
249 ±
13,5
277 ±
26,2
211 ±
15,4
188 ±
12,1
335 ±
7,9
250 ±
26,7
266 ±
23,4
QT (ms)
0
65,7 ±
0,58
69,9 ±
0,89
68,2 ±
1,93
66,8 ±
1,04
63,3 ±
1,4
62,2 ±
1,16
77,3 ±
0,85
77,3 ±
1,54
80,7 ±
1,19
85,9 ±
4,23
85,3 ±
4,96
85,4 ±
3,38
67,4 ±
0,68
66,5 ±
0,59
64,5 ±
0,59
15
76,7 ±
1,69
79,4 ±
1,20
72,0 ±
0,99
71,1 ±
0,64
67,2 ±
1,06
69,6 ±
2,12
86,3 ±
1,8
85,6 ±
0,19
96,8 ±
1,93
99,7 ±
2,73
99,8 ±
5,24
95,4 ±
4,05
71,6 ±
0,69
74,5 ±
1,51
72,5 ±
0,49
QTc (ms)
0
116,0
± 4,41
119,1
± 4,16
108,5
± 5,6
111,9
± 5,24
108,0
± 3,8
108,8
± 2,95
138,4
± 5,78
139,7
± 5,73
131,1
± 3,90
140,9
± 8,47
130,7
± 4,92
131,9
± 1,33
118,3
± 3,52
110,7
± 3,50
102,5
± 4,01
15
139,3
± 4,51
135,3
±5,13
115,4
± 3,90
122,8
± 2,74
110,4
± 5,7
113,8
± 6,14
157,3
± 5,54
165,9
± 7,81
154,2
± 4,62
170,3
± 7,81
150,8
± 6,27
138,9
± 3,19
122,9
± 3,25
118,7
± 2,65
118,9
± 3,71
PR (ms)
0
53,9 ±
1,72
52,8 ±
2,20
58,1 ±
2,51
57,5 ±
2,02
47,4 ±
1,45
55,5 ±
0,89
55,6 ±
1,83
55,9 ±
0,91
55,8 ±
1,60
53,65
± 1,69
58,7 ±
0,91
59,5 ±
1,79
54,9 ±
0,71
61,2
±1,66
53,3 ±
1,05
15
54,2 ±
1,76
52,1 ±
1,87
57,0
±3,35
57,3 ±
2,39
47,7 ±
2,08
52,77
± 1,40
55,5 ±
1,64
55,6 ±
1,13
53,8 ±
1,69
50,7 ±
2,38
59,1 ±
0,97
59,8 ±
2,22
54,6 ±
1,09
63,8 ±
2,59
58,6 ±
0,86
QRS (ms)
0
22,7 ±
0,47
27,8 ±
4,61
21,6 ±
0,85
21,6 ±
0,85
18,3 ±
0,52
21,8 ±
2,36
22,1 ±
0,65
23,4 ±
0,69
22,2 ±
1,52
21,5 ±
1,21
21,6 ±
0,49
21,1 ±
0,77
21,0 ±
0,66
22,2 ±
0,99
21,2 ±
0,53
15
21,4 ±
0,94
22,5 ±
0,44
22,3 ±
0,63
22,1 ±
0,65
19,4 ±
0,28
19,34
± 0,81
21,8 ±
0,27
22,6 ±
0,55
21,9 ±
1,26
23,9 ±
2,55
21,5 ±
0,35
21,1 ±
0,85
21,7 ±
0,67
23,5 ±
1,05
23,4 ±
0,70
49
Tabela 10:Valores absolutos de parâmetros da PA e do ECG após administração de 10µg/kg de NA (basal e 15 segundos após) em animais
previamente tratados com piridostigmina em lipossomas de DSPC administrado por via S.C. (n=8/grupo).
Grupos
Experimentais
Tempo após
administração
(horas)
1
Salina
2
Pir Livre
1
2
4
6
1
Lipo vazio
2
1
2
LipoPIR
4
6
8
10
12
PAS (mmHg)
0
122 ±
3,7
123 ±
8,3
146 ±
9,5
148 ±
11,1
119 ±
9,26
130 ±
10,76
112 ±
2,3
101 ±
2,2
113 ±
3,2
113 ±
3,9
102 ±
2,5
114 ±
1,5
123 ±
6,5
130 ±
5,7
123 ±
1,2
15
220 ±
7,6
209 ±
4,2
196 ±
9,3
180 ±
11,7
203,05
± 8,90
198 ±
2,99
212 ±
3,4
202 ±
2,4
205 ±
5,8
192 ±
8,2
195 ±
2,3
198 ±
4,3
198 ±
13,9
190 ±
8,9
149 ±
11,0
PAD (mmHg)
0
93 ±
1,5
94 ±
6,5
98 ±
12,3
105 ±
9,4
86 ±
6,93
97 ±
10,13
83 ±
3,1
74 ±
3,4
78 ±
4,2
75
±5,6
66 ±
4,3
71 ±
3,2
96 ±
5,2
90 ±
6,0
88 ±
0,6
15
159 ±
4,5
154 ±
3,0
136 ±
5,2
129 ±
9,0
128 ±
5,11
128 ±
12,7
141 ±
3,2
138 ±
3,3
136 ±
4,1
131 ±
3,0
119 ±
5,0
120 ±
4,7
155 ±
9,3
122 ±
10,0
113 ±
7,3
FC (bpm)
0
334 ±
31,1
297 ±
22,5
247 ±
34,9
295 ±
31,7
313 ±
33,74
287 ±
26,0
272 ±
16,1
322 ±
27,5
248 ±
14,8
296 ±
27,9
244 ±
19,6
241 ±
22,7
324 ±
23,1
253 ±
33,7
243 ±
25,0
15
349 ±
22,7
307 ±
22,3
263 ±
29,0
299 ±
29,0
194 ±
26,64
208 ±
37,7
261 ±
16,7
237 ±
21,3
247 ±
21,1
278 ±
31,2
193 ±
19,6
157 ±
18,8
280 ±
25,4
223 ±
25,6
273 ±
31,4
QT (ms)
0
65,7 ±
0,58
73,0 ±
0,96
68,0 ±
0,64
67,3 ±
0,74
62,58
± 0,88
63,4 ±
1,07
78,4 ±
0,5
78,3 ±
1,88
87,9 ±
4,21
88,9 ±
3,56
86,1 ±
3,56
85,6 ±
3,43
68,2 ±
1,09
68,4 ±
0,84
64,5 ±
0,59
15
78,8 ±
1,23
83,9 ±
1,12
72,4 ±
0,71
69,9 ±
0,54
64,69 ±
0,89
70,4 ±
1,6
88,2 ±
1,3
87,5 ±
0,9
102,5 ±
2,20
102,1 ±
2,60
104,6 ±
2,58
93,9 ±
4,22
74,2 ±
1,31
71,4 ±
1,53
72,4 ±
0,91
QTc (ms)
0
116,0
± 4,41
124,3
± 4,60
107,7
± 6,43
111,9
± 5,19
104,6
± 4,05
97,9 ±
5,56
145,9
± 7,68
145,5
± 5,21
141,4
± 8,93
151,1
± 7,55
137,1
± 5,67
134,4
± 0,66
119,3
± 3,57
109,2
± 4,41
102,5
± 4,01
15
141,1
± 4,13
144,3
± 4,59
117,6
± 3,67
118,8
± 3,52
92,14
± 4,61
107,9
± 8,2
166,4
± 7,48
164,2
± 8,59
163,7
± 6,18
168,5
± 4,92
154,2
± 8,09
128,1
± 5,76
123,5
± 4,62
109,9
± 4,57
119,3
± 4,93
PR (ms)
0
53,9 ±
1,72
52,8 ±
2,04
53,8 ±
2,42
57,3 ±
2,03
46,2 ±
1,56
54,8 ±
1,74
56,6 ±
2,19
56,1 ±
1,26
54,3 ±
1,65
54,8 ±
1,63
59,4 ±
1,07
59,7 ±
1,05
56,8 ±
1,23
64,1 ±
3,5
53,3 ±
1,06
15
52,8 ±
1,86
54,2 ±
2,17
54,5 ±
2,32
56,8 ±
2,32
46,3 ±
1,53
51,3 ±
2,3
57,6 ±
1,90
56,2 ±
1,25
51,9 ±
1,71
53,8 ±
2,18
60,5 ±
0,75
62,5 ±
2,41
53,9 ±
1,31
65,6 ±
3,62
55,7 ±
2,39
QRS (ms)
0
22,7 ±
0,47
23,8 ±
0,42
21,8 ±
0,79
22,5 ±
0,77
18,2 ±
0,31
19,4 ±
1,2
22,8 ±
1,1
23,5 ±
1,15
21,4 ±
1,14
21,2 ±
0,83
21,6 ±
0,39
21,8 ±
0,43
21,4 ±
0,76
23,7 ±
0,85
21,2 ±
0,53
15
21,7 ±
0,46
22,0 ±
0,44
21,4 ±
0,53
22,1 ±
0,66
19,0 ±
0,57
20,4 ±
1,01
21,5 ±
0,53
23,4 ±
1,22
20,8 ±
0,60
21,7 ±
0,87
22,1 ±
0,37
21,7 ±
0,54
21,2 ±
0,87
24,2 ±
0,69
22,9 ±
1,11
50
Tabela 11: Valores absolutos de parâmetros da PA e do ECG após administração de 1 µg/kg de NA (basal e 15 segundos após) em animais
previamente tratados com piridostigmina em lipossomas de DOPC administrado por via S.C. (n=8).
Grupos
Experimentais
Tempo após
administração
(horas)
1
Salina
2
Pir Livre
1
2
1
Lipovazio
2
1
2
LipoPIR
4
6
12
24
PAS (mmHg)
0
125 ±
2,2
116 ±
2,5
120 ±
2,9
122 ±
3,1
118 ±
8,0
131 ±
8,4
128 ±
6,4
126 ±
7,8
131 ±
6,1
138 ±
2,9
123 ±
4,9
130 ±
7,4
15
192 ±
5,3
161 ±
2,0
151 ±
11,1
141 ±
6,2
152 ±
3,4
156 ±
10,7
161 ±
9,2
158 ±
9,0
165 ±
6,3
174 ±
5,8
176 ±
8,8
143 ±
11,2
PAD (mmHg)
0
91 ±
1,5
88 ±
3,4
81 ±
4,9
88 ±
4,7
84 ±
7,5
95 ±
7,4
84 ±
7,1
87 ±
4,3
91 ±
5,6
100 ±
2,1
104 ±
6,8
93 ±
7,3
15
141 ±
1,4
130 ±
3,3
106 ±
6,4
99 ±
4,3
112 ±
4,3
113 ±
8,1
117 ±
7,7
114 ±
4,9
114 ±
4,8
125 ±
5,1
136 ±
4,9
110 ±
9,3
FC (bpm)
0
383 ±
9,9
346 ±
11,7
217 ±
1,1
252 ±
9,2
289 ±
29,6
261 ±
10,1
307 ±
35,8
329 ±
16,9
309 ±
21,8
327 ±
20,8
348 ±
10,4
262 ±
29,8
15
391 ±
5,6
333 ±
10,6
232 ±
4,9
249 ±
8,2
294 ±
22,7
268 ±
12,1
305 ±
32,3
314 ±
19,6
304 ±
22,6
318 ±
19,8
325 ±
14,1
257 ±
30,5
QT (ms)
0
67,8 ±
1,72
69,5 ±
1,80
65,0 ±
0,86
66,3 ±
0,82
67,1 ±
1,09
78,4 ±
2,32
69,4 ±
1,28
69,5 ±
1,14
67,8 ±
1,87
72,7 ±
2,45
64,8 ±
0,92
65,4 ±
0,9
15
75,4 ±
0,75
80,8 ±
1,08
71,0 ±
0,61
71,5 ±
0,92
83,4 ±
1,69
82,3 ±
2,38
73,7 ±
0,93
72,2 ±
0,51
74,1 ±
0,78
78,2 ±
1,49
69,3 ±
1,07
66,8 ±
1,11
QTc (ms)
0
120,9
± 5,47
120,8
± 5,53
99,5 ±
3,91
114,4
± 4,15
112,4
± 3,61
128,3
± 3,19
118,3
± 5,88
122,4
± 2,53
116,5
± 3,25
128,0
± 6,09
118,1
± 2,05
102,6
± 4,15
15
138,5
± 1,69
137,9
± 4,13
111,5
± 4,51
123,0
± 3,5
140,6
± 2,29
135,2
± 4,16
118,6
± 9,75
122,0
± 3,29
126,6
± 3,54
136,2
± 4,15
116,7
± 8,13
107,4
± 3,79
PR (ms)
0
54,4 ±
1,51
52,3 ±
2,35
58,2 ±
2,59
56,2 ±
2,95
63,8 ±
2,94
69,5 ±
4,77
58,9 ±
2,86
57,5 ±
2,35
60,7 ±
2,12
60,6 ±
1,68
52,7 ±
0,62
60,0 ±
3,27
15
54,2 ±
1,32
53,8 ±
2,11
57,9 ±
2,2
56,5 ±
2,65
64,1 ±
3,49
69,7 ±
5,01
71,0 ±
13,07
57,0 ±
2,28
59,6 ±
2,67
58,4 ±
1,69
51,0 ±
1,02
58,8 ±
2,92
QRS (ms)
0
22,6 ±
0,50
22,3 ±
0,35
21,8 ±
0,57
22,6 ±
0,76
30,8 ±
1,89
33,2 ±
1,50
27,3 ±
1,33
27,7 ±
1,69
27,6 ±
2,04
28,8 ±
1,73
19,9 ±
0,85
20,9 ±
0,49
15
22,6 ±
0,72
23,9 ±
0,66
21,6 ±
0,76
22,0 ±
0,44
34,8 ±
2,63
34,3 ±
1,86
28,2 ±
1,62
28,3 ±
1,43
27,1 ±
2,86
27,2 ±
1,63
21,8 ±
0,79
21,0 ±
0,59
51
Tabela 12: Valores absolutos de parâmetros da PA e do ECG após administração de 3 µg/kg de NA (basal e 15 segundos após) em animais
previamente tratados com piridostigmina em lipossomas de DOPC administrado por via S.C. (n=8/grupo).
Grupos
Experimentais
Tempo após
administração
(horas)
1
Salina
2
Pir Livre
1
2
1
Lipovazio
2
1
2
LipoPIR
4
6
12
24
PAS (mmHg)
0
122 ±
3,7
117 ±
3,6
136 ±
7,7
128 ±
6,9
118 ±
5,3
124 ±
4,5
126 ±
11,9
124 ±
7,5
136 ±
5,9
143 ±
5,7
124 ±
5,1
121 ±
8,2
15
188 ±
10,3
188 ±
9,6
173 ±
9,5
200 ±
40,1
164 ±
5,0
166 ±
10,1
180 ±
17,3
177 ±
10,9
182 ±
5,9
191 ±
5,8
188 ±
4,5
175 ±
9,7
PAD (mmHg)
0
93 ±
1,5
88 ±
3,28
91 ±
7,7
87 ±
2,69
81 ±
5,89
89 ±
2,5
90 ±
9,7
84 ±
4,9
93 ±
5,3
101 ±
5,6
98 ±
4,3
90 ±
6,4
15
142 ±
7,5
143 ±
5,2
116 ±
4,3
117 ±
6,0
119 ±
6,9
122 ±
10,1
125 ±
11,6
128 ±
5,3
133 ±
5,7
136 ±
3,5
145 ±
3,6
131 ±
6,3
FC (bpm)
0
334 ±
31,1
287 ±
22,8
229 ±
23,2
298 ±
18,3
273 ±
24,2
262 ±
15,9
315 ±
26,3
331 ±
8,27
333 ±
18,5
314 ±
21,6
355 ±
14,9
254 ±
24,8
15
362 ±
23,9
307 ±
20,2
250 ±
22,6
302 ±
23,7
276 ±
25,2
267 ±
15,7
302 ±
12,8
306 ±
21,2
324 ±
18,1
289 ±
33,0
339 ±
13,2
244 ±
24,3
QT (ms)
0
65,7 ±
0,58
69,9 ±
0,89
68,2 ±
1,93
66,8 ±
1,04
69,0 ±
1,54
71,0 ±
2,20
70,0 ±
0,70
68,3 ±
0,75
69,8 ±
1,48
71,9 ±
2,48
64,9 ±
0,77
66,4 ±
0,43
15
76,7 ±
1,69
79,4 ±
1,20
72,0 ±
0,99
71,1 ±
0,64
79,5 ±
1,11
83,2 ±
2,68
77,8 ±
0,74
75,6 ±
0,73
74,2 ±
1,58
78,3 ±
1,23
68,3 ±
0,96
70,5 ±
0,32
QTc (ms)
0
116,0
± 4,41
119,1
± 4,16
108,5
± 5,60
111,9
± 5,24
113,8
± 3,73
115,5
± 2,25
115,0
± 5,23
152,2±
24,02
123,5
± 3,97
124,3
± 3,06
141,6±
23,94
104,2
± 2,54
15
139,3
± 4,51
135,3
± 5,13
115,4
± 3,90
122,8
± 2,74
132,0
± 3,62
136,2
± 2,51
132,8
± 1,55
129,9
± 3,35
130,0
± 2,99
131,3
± 6,44
115,6
± 6,35
112,2
± 4,06
PR (ms)
0
53,9 ±
1,72
52,8 ±
2,20
58,1 ±
2,51
57,5 ±
2,02
65,3 ±
3,51
69,6 ±
4,00
57,9 ±
2,79
57,0 ±
2,11
61,0 ±
2,35
57,7 ±
1,39
53,7 ±
1,04
60,3 ±
2,85
15
54,2 ±
1,76
52,1 ±
1,87
57,0 ±
3,35
57,3 ±
2,39
64,0 ±
3,01
69,1 ±
4,54
57,5 ±
2,30
56,3 ±
1,95
60,4 ±
2,18
59,3 ±
3,75
53,1 ±
1,23
59,5 ±
2,46
QRS (ms)
0
22,7 ±
0,47
27,8 ±
4,61
21,6 ±
0,85
21,6 ±
0,85
30,3 ±
2,05
34,0 ±
1,53
26,6 ±
0,87
27,2 ±
1,93
27,3 ±
2,38
28,3 ±
1,44
20,7 ±
1,11
21,6 ±
0,39
15
21,4 ±
0,94
22,5 ±
0,44
22,3 ±
0,63
22,1 ±
0,65
32,2 ±
3,15
34,0 ±
1,42
27,7 ±
1,13
28,1 ±
2,00
28,0 ±
2,75
28,3 ±
2,03
20,9 ±
0,91
21,0 ±
0,29
52
Tabela 13: Valores absolutos de parâmetros da PA e do ECG após administração de 10 µg/kg de NA (basal e 15 segundos após) em animais
previamente tratados com piridostigmina em lipossomas de DOPC administrado por via S.C. (n=8/grupo).
Grupos
Experimentais
Tempo após
administração
(horas)
1
Salina
2
Pir Livre
1
2
1
Lipovazio
2
1
2
LipoPIR
4
6
12
24
PAS (mmHg)
0
122 ±
3,7
123 ±
8,3
146 ±
9,5
148 ±
11,1
122,01
± 4,81
122 ±
7,2
130 ±
7,7
121 ±
13,3
137 ±
4,8
145 ±
7,9
130 ±
7,5
125 ±
5,2
15
220 ±
7,6
209 ±
4,2
196 ±
9,3
180 ±
11,7
191 ±
5,43
182 ±
10,1
198 ±
11,8
199 ±
14,8
197 ±
4,0
207 ±
2,5
205 ±
7,2
168 ±
9,3
PAD (mmHg)
0
93 ±
1,5
94 ±
6,5
98 ±
12,3
105 ±
9,4
86 ±
6,4
86 ±
5,5
89 ±
6,5
82 ±
9,2
95 ±
3,5
102 ±
4,4
109 ±
5,1
94 ±
8,0
15
159 ±
4,5
154 ±
3,0
136 ±
5,2
129 ±
9,0
133 ±
6,6
127 ±
7,7
131 ±
7,7
136 ±
5,3
140 ±
1,3
140 ±
3,2
154 ±
4,5
121 ±
7,9
FC (bpm)
0
334 ±
31,1
297 ±
22,6
247 ±
34,9
295 ±
31,7
290 ±
19,3
278 ±
10,8
323 ±
22,3
328 ±
21,0
343 ±
21,1
317 ±
23,0
375 ±
13,5
292 ±
30,7
15
349 ±
22,72
307 ±
22,36
263 ±
29,04
299 ±
29,04
263 ±
24,90
241 ±
26,07
229 ±
22,79
250 ±
41,81
314 ±
26,75
265 ±
35,39
315 ±
22,60
233 ±
20,98
QT (ms)
0
65,7 ±
0,58
73,0 ±
0,96
68,0 ±
0,64
67,3 ±
0,74
69,9 ±
1,05
75,9 ±
2,04
71,5 ±
1,14
69,0 ±
0,70
70,1 ±
1,54
77,7 ±
1,72
65,9 ±
0,96
66,4 ±
0,95
15
78,8 ±
1,23
83,9 ±
1,12
72,4 ±
0,71
69,9 ±
0,54
79,4 ±
2,53
82,3 ±
0,75
74,7 ±
1,41
75,3 ±
0,66
75,4 ±
1,19
78,8 ±
1,00
71,3 ±
1,33
69,7 ±
0,93
QTc (ms)
0
116,0
± 4,41
124,3
± 4,60
107,7
± 6,43
111,9
± 5,19
117,9
± 2,25
126,3
± 2,59
125,0
± 2,92
121,1
± 1,94
125,1
± 3,65
131,9
± 4,29
121,5
± 2,29
111,9
± 5,47
15
141,1
± 4,13
144,3
± 4,59
117,6
± 3,67
118,8
± 3,52
128,3
± 5,09
129,9
± 4,88
115,4
± 7,77
119,8
± 6,84
130,6
± 5,32
127,9
± 7,02
116,6
± 5,36
109,2
± 4,38
PR (ms)
0
53,9 ±
1,72
52,8 ±
2,04
53,8 ±
2,42
57,3 ±
2,03
65,2
±3,24
71,7 ±
5,14
58,0 ±
2,45
57,6 ±
2,42
60,3 ±
2,66
63,0 ±
2,80
53,7 ±
1,18
57,9 ±
2,81
15
52,8 ±
1,86
54,2 ±
2,17
54,5 ±
2,32
56,8 ±
2,32
64,4 ±
3,43
68,7 ±
4,48
57,6 ±
2,70
55,5 ±
2,44
59,6 ±
3,25
61,3 ±
2,44
52,5 ±
1,27
58,8 ±
2,56
QRS (ms)
0
22,7 ±
0,47
23,8 ±
0,42
21,8 ±
0,79
22,5 ±
0,77
31,9 ±
1,59
32,5 ±
1,54
27,1 ±
0,89
27,4 ±
1,81
27,4 ±
2,69
28,8 ±
2,79
20,3 ±
0,89
20,8 ±
0,60
15
21,7 ±
0,46
22,0 ±
0,44
21,4 ±
0,53
22,1 ±
0,66
30,7 ±
1,36
31,4 ±
1,19
28,1 ±
1,03
26,5 ±
1,86
27,7 ±
3,32
28,2 ±
2,01
20,9 ±
0,77
20,9 ±
0,24
53
Um grande progresso no desenvolvimento de novos fármacos para tratamentos de
cardiopatias vem sendo observado, principalmente quando se trata da insuficiência cardíaca.
Os beta-bloqueadores são os principais fármacos utilizados para esse tipo de enfermidade e
reduzem de forma significativa a mortalidade, principalmente através da redução da morte
súbita (GHEORGHIADE et al, 1993), alem de prevenir o desenvolvimento de eventos
arrítmicos ( MANSUY et al, 2000). A redução do consumo de O2 pelo miocárdio e o bloqueio
da hiperatividade adrenérgica estão associados à redução da mortalidade (WEBB et al, 1972).
No presente trabalho foi proposta a veiculação de PIR em duas diferentes formulações
lipossomais, uma constituída de DSPC:CHOL e outra de DOPC:CHOL. Ambas as
formulações foram eficazes para a manutenção dos efeitos benéficos da PIR sobre o sistema
cardiovascular e na redução de seus efeitos tóxicos sobre outros órgãos (observações
qualitativas). A partir da análise dos resultados obtidos, foi observado que animais tratados
com PIR lipossomal, tanto DSPC quanto DOPC, foram menos sensíveis à estimulação
simpática pela NA do que do grupo não tratado (salina). Este fato pode ser atribuído à
eficiência da PIR em contrapor as alterações simpáticas, pela maior disponibilidade de ACh.
Em ratos sadios a administração de 3, 5 e 10 mg/kg de PIR livre por via S.C. causou aos
animais alterações tóxicas características de hiperestimulação colinérgica. Apenas na dose de
1 mg/kg de PIR livre por via S.C., 10 vezes menor que aquela administrada por PIR
lipossomal, não foi observado tais efeitos colinérgicos. Assim, fica demonstrada a eficiência
do uso da PIR lipossomal, seja em DSPC ou DOPC, ambas capazes de impedir os efeitos
tóxicos por hiperestimulação colinérgica.
Estudos realizados por Kluwe e colaboradores (1989), demonstraram que o tratamento
de cães com uma dose diária de 20 mg/kg de PIR por 14 dias levou à morte vários animais por
intuscepção intestinal e, entre os animais que não morreram, foram observados efeitos
adversos como hipersalivação e tremor. No mesmo estudo, quando os animais foram tratados
por três meses com 2 mg/kg de PIR, foram observados efeitos intestinais como diarreia e
fezes com muco. Em contrapartida, o presente trabalho, fazendo uso da mesma dose de
20 mg/kg de PIR veiculada em lipossoma DSPC, apesar da manifestação de efeitos colaterais
passageiros como piloereção e lacrimejamento, demonstrou ação cardioprotetora com
significativa redução do prolongamento do intervalo QT no tempo estudado (12 horas após
administração S.C.).
No presente estudo, apesar dos ótimos resultados encontrados após a utilização da PIR
em formulação lipossomal DSPC na dose de 10 mg/kg, justifica-se o uso da dose de 20
54
mg/kg, pois a ação cardioprotetora encontrada foi mais intensa havendo também menor
variação entre os animais que receberam este tratamento.
O intervalo QT representa a duração da despolarização e repolarização ventricular e é
mensurado do início do complexo QRS ao final da onda T (GOODMAN & GILMAN, 2010).
Um retardo da repolarização cria alteração eletrofisiológica que favorece o desenvolvimento
de arritmias cardíacas, como Torsade de Points, assim como taquiarritmias. Adicionalmente,
Torsade de Points pode evoluir para fibrilação ventricular, levando a morte súbita
(SCHWARTZ E WOLF, 1978; AHNVE,1991, LANJEWAR et al,2004)
Vidal e colaboradores (2010) observaram que os efeitos inibitórios sobre as variações
do intervalo QT nos grupos tratados com a PIR na forma livre reduziram no tempo de 2 horas
após a administração. No entanto, devido a via de administração escolhida neste trabalho, foi
possível observar ação cardioprotetora por até 6 horas após a administração de PIR livre. No
presente trabalho, 2 horas após o tratamento com a formulação lipossomal tanto de DSPC
quanto de DOPC, contendo PIR na dose 10 mg/kg foram observadas reduções significativas
do prolongamento do intervalo QT. O impedimento do prolongamento do intervalo QT
observado é fator suficiente para reduzir o risco de morte súbita (MURAKAWA, 2000;
WHANG, 2012). Além disso, essa capacidade de impedir o prolongamento do intervalo QT
frente ao estímulo simpático perdurou até o tempo analisado de 12 horas, para a formulação
lipossomal DSPC para as doses 10 e 20 mg/kg de PIR e o tempo analisado de 24 horas, para a
formulação lipossomal DOPC. Tal observação demonstra a capacidade da formulação
lipossomal MLV como depósito do fármaco, liberando-o gradativamente para ser absorvido
(FRÉZARD, 2005) e aumentando o seu tempo de meia-vida que na forma livre se demonstra
curto (KOLKA E STEPHENSON, 1990). Ambas as formulações apresentaram resultados
satisfatórios com potencial efeito cardioprotetor quanto à capacidade de impedir o
prolongamento do intervalo QT, como fator preditor de arritmias cardíacas. Foi observado que
a formulação lipossomal de PIR DOPC foi capaz de manter o efeito cardioprotetor por maior
tempo, com ínício em 1 hora após o tratamento e se manteve até 24 horas após o tratamento.
Já a formulação lipossomal de PIR DSPC foi capaz de manter o efeito cardioprotetor entre os
tempos de 8 e 12 horas após o tratamento. Tal efeito pode, talvez, ser justificado devido a
maior capacidade de liberação da PIR da formulação lipossomal DOPC devido a sua
bicamada fluida, quando comparada à bicamada mais rígida da formulação lipossomal de
DSPC que por sua vez, teria a taxa de liberação mais lenta a partir dos lipossomas de DSPC
não permitindo alcançar a faixa terapêutica (FRÉZARD, 2005).
55
O índice QTc calculado a partir dos valores do intervalo QT e da FC demonstrou
resultados satisfatórios com diferenças significativa na maioria dos tempos analisados.
Quando há redução na FC, os valores de QTc podem ser subestimados, dificultando a análise
precisa dos dados. De qualquer forma, a PIR lipossomal em ambas as formulações não
provocou queda significativa na FC na maioria dos tempos, o que pode sugerir que os dados
de QTc tenham uma precisão maior neste trabalho e, dessa forma, corrobora para a
cardioproteção conferida pela PIR lipossomal aos animais tratados.
O complexo QRS assim como o intervalo PR se mantiveram inalterados nos grupos
tratados com PIR lipossomal DSPC e DOPC. A maior parte dos grupos apresentou uma
redução do intervalo PR após a administração lipossomal DSPC e DOPC por via SC na dose
de 10 mg/kg. Esse resultado pode sugerir benefícios, visto que o prolongamento do intervalo
PR, também conhecido na prática clínica como bloqueio atrioventricular de primeiro grau
(BAV de 1º grau), não está muito bem elucidado, sendo que alguns estudos indicam que o seu
prolongamento está relacionado a um risco aumentado de doença coronariana em homens de
meia idade (MYMIN, 1986; CHENG, 2009).
Conforme os dados apresentados e discutidos, é possível inferir que as formulações
lipossomais DSPC e DOPC contendo PIR foram capazes de proporcionar efeitos benéficos de
cardioproteção aos animais tratados por via S.C. estendendo o tempo de meia vida do fármaco
quando comparado a sua forma livre administrado por via oral ou lipossomal por via I.V.
(GRABE- GUIMARÃES 1999; VIDAL 2010) além de ter atendido aos objetivos propostos
quanto ao seu desenvolvimento e caracterização.
6- CONCLUSÃO
De acordo com os objetivos propostos e os resultados obtidos, conclui-se que a
metodologia analítica proposta para quantificação de piridostigmina em formulação
lipossomal demonstrou-se específica, precisa, linear e exata. O método analítico
espectrofotométrico-UV constitui, portanto, uma ferramenta alternativa, útil, de baixo custo e
fácil execução.
As características de teor de encapsulação, tamanho dos lipossomas, perfil de liberação
e fração fármaco / lipídeo observadas nas duas formulações lipossomais contendo PIR são
satisfatórias para a administração in vivo.
56
A escolha por lipossomas MLV e sua administração por via subcutânea permitiram a
liberação sustentada da PIR e consequente prolongamento de seu tempo de ação, sendo
observada resposta cardioprotetora por até 12 horas, para formulação DSPC, e 24 horas, para
a formulação DOPC. Tal cardioproteção foi demonstrada pela inibição do prolongamento do
intervalo QT e QTc do eletrocardiograma.
Apesar de a formulação lipossomal DOPC ser de mais difícil manipulação, quando
comparada a formulação lipossomal DSPC, a mesma demonstrou –se mais eficiente.
Possibilitou maior tempo de ação cardioprotetora da piridostimina (24h), além de propiciar
uma Redução mais efetiva do prolongamento do intervalo QT.
Este trabalho demonstrou-se de grande relevância ,uma vez que, permitiu o efeito
cardioprotetor prolongado da piridostigmina.
Além disto, as formulações aqui testadas poderão contribuir em nível mundial para
desenvolver arsenal terapêutico de forma racional.
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8- ANEXOS
1-Artigo Publicado
67
68
15
1 ug/kg NA
Variação FC %
10
5
0
-5
-10
1
2
4
6
8
10
12
8
10
12
8
10
12
-15
Tempo (horas)
-20
3 ug/kg NA
15
Variação FC %
10
5
0
-5
-10
-15
-20
1
2
4
*
6
Tempo (horas)
15
10 ug/kg NA
Variação FC %
10
5
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
1
2
4
*
6
Tempo (horas)
Figura 1: Variação percentual máxima de FC após administração I.V. de 1, 3 e 10 µg/kg de
NA, 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre e
piridostigmina na formulação lipossomal DSPC na dose de 10 mg/kg. * P < 0,05 – ANOVA,
seguido de teste de Tukey.
69
1 ug/kg NA
Variação FC %
10
5
0
-5
1
2
4
6
12
24
12
24
12
24
Tempo (horas)
3 ug/kg NA
Variação FC %
10
0
-10
-20
-30
-40
1
2
4
6
Tempo (horas)
10 ug/kg NA
Variação FC %
0
-10
-20
-30
1
2
4
6
Tempo (horas)
Figura 2: Variação percentual de FC após administração I.V. de 1, 3 e 10 µg/kg de NA, 1, 2,
4, 6, 12 e 24 horas após a administração S.C. de salina, piridostigmina livre e piridostigmina
na formulação lipossomal DOPC na dose de 10 mg/kg. * P < 0,05 – ANOVA, seguido de
teste de Tukey.
70
1