USO DE ANTIBIÓTICOS CONVENCIONAIS E ANTIMICROBIANOS

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
USO DE ANTIBIÓTICOS CONVENCIONAIS E ANTIMICROBIANOS A
BASE DE LÚPULO NO CONTROLE DA INFECÇÃO BACTERIANA EM
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
JOSIMARA LACERDA PRADO
Dissertação apresentada à Faculdade de
Ciências Agronômicas da Unesp – Campus
de Botucatu, para obtenção do título de
Mestre em Agronomia (Energia na
Agricultura)
BOTUCATU – SP
Janeiro – 2014
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
USO DE ANTIBIÓTICOS CONVENCIONAIS E ANTIMICROBIANOS A
BASE DE LÚPULO NO CONTROLE DA INFECÇÃO BACTERIANA EM
FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
JOSIMARA LACERDA PRADO
Orientador: Prof. Dr. Waldemar Gastoni Venturini Filho
Dissertação apresentada à Faculdade de
Ciências Agronômicas da Unesp – Campus
de Botucatu, para obtenção do título de
Mestre em Agronomia (Energia na
Agricultura)
BOTUCATU – SP
Janeiro – 2014
“[...] Talvez não tenha conseguido fazer o melhor,
mas lutei para que o melhor fosse feito [...].
Não sou o que deveria ser, mas graças a Deus, não sou o que era antes”.
(Marthin Luther King)
IV
Dedico
Aos meus pais, Antonio e Amélia e ao meu amor Jackson.
V
AGRADECIMENTOS
À Deus e a minha família, meus pais Antonio e Amélia, pela grandiosa força concedida ao
longo de mais uma jornada.
Ao Prof. Dr. Waldemar Gastoni Venturini Filho, meu orientador, pelos ensinamentos,
delicadeza e confiança a mím depositada.
À empresa em que trabalho, pelos dados fornecidos e pela disponibilização de meus horários.
Aos membros da banca examinadora Prof.ª Dr.ª Andressa Nogueira e ao Prof.Dr. Ricardo
Figueira pelas sugestões e contribuições para o aperfeiçoamento deste trabalho.
A Luciana Trevisan, Profa. Dra. Martha Mischan pela ajuda com a estatística deste trabalho.
Ao professor Bruno, pela ajuda com o inglês.
Ao meu amor e companheiro Jackson Naves por me acompanhar nesta jornada e
compreender as minhas ausências.
Agradeço aos meus queridos amigos Paulo Affonso, Gedaías Silva e minhas queridas amigas
Milena Mileski, Mariana Wagner, Gisele Souza e todos os demais amigos do mestrado, pelo
apoio e ajuda nos momentos que mais precisei.
Ao programa Energia na Agricultura, a todos os funcionários e professores que tive o prazer
de conviver.
VI
SUMÁRIO
Página
LISTA DE TABELAS........................................................................................................VII
CAPÍTULO I..........................................................................................................................1
CONSIDERAÇÕES INICIAIS..............................................................................................6
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................................6
1.2 Revisão bibliográfica...................................................................................................7
1.2.1 Microbiologia da fermentação alcoólica..............................................................7
1.2.2 Leveduras de processo.........................................................................................9
1.2.3 Taxonomia...........................................................................................................9
1.2.4 Citologia.............................................................................................................10
1.2.5 Reprodução........................................................................................................14
1.2.6 Metabolismo......................................................................................................15
1.2.7 Bactérias contaminantes.....................................................................................20
1.2.8 Formas de contaminação bacteriana nos processos fermentativos....................21
1.2.9 Controle da fermentação....................................................................................22
1.2.10 Antimicrobianos...............................................................................................23
1.2.11 Antimicrobianos convencionais.......................................................................24
1.2.12 Antimicrobianos à base de lúpulo....................................................................25
1.3 REFERÊNCIAS........................................................................................................28
CAPÍTULO II.......................................................................................................................33
2 INTRODUÇÃO.................................................................................................................34
2.1 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................37
2.1.1 Planejamento experimental................................................................................38
2.1.2 Método de contagem em placas de bactérias láticas..........................................39
2.1.3 Cálculo da taxa de redução populacional (TRP)................................................39
2.1.4 Análise estatística...............................................................................................40
2.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................................40
2.3 CONCLUSÕES.........................................................................................................42
2.4 REFERÊNCIAS........................................................................................................43
VII
LISTA DE TABELAS
Páginas
Tabela 2.1 Análise de variância para as taxas de redução populacional dos
antimicrobianos convencionais (Kamoran WP, Alcapen 1030, Corstan) e
antimicrobianos a base de lúpulo: IsoStab e BetaBio..................................................
40
Tabela 2.2 Teste de Tukey da taxa de redução populacional (TRP) de bactérias
láticas, durante a fermentação alcoólica na safra de 2008/2009, para
antimicrobianos convencionais (Kamoran WP, Alcapen 1030, Corstan) e na safra
2011/2012, para os antimicrobianos a base de lúpulo: IsoStab e BetaBio..................
41
1
CAPÍTULO I
2
USO DE ANTIBIÓTICOS CONVENCIONAIS E ANTIMICROBIANOS A BASE DE
LÚPULO NO CONTROLE DA INFECÇÃO BACTERIANA EM FERMENTAÇÃO
ALCOÓLICA
Dissertação (Mestrado em Energia na Agricultura) – Faculdade de Ciências
Agronômicas, Universidade Estadual Paulista
Autor: Josimara Lacerda Prado
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi comparar a eficiência de antibióticos
convencionais em relação aos antimicrobianos à base de lúpulo, em escala de produção
industrial de bioetanol. A comparação foi feita por meio de cálculo da redução
populacional de bactérias láticas em dois ciclos consecutivos de fermentação. O
experimento teve cinco tratamentos (três antibióticos convencionais: Kamoran WP,
Corstan e Alcapen 1030, e dois antimicrobianos à base de lúpulo: BetaBio e IsoStab). As
amostras foram coletadas na dorna de fermentação. Para quantificar a população inicial de
bactérias láticas, foi coletada amostra no final do processo fermentativo (vinho) antes do
tratamento com antibióticos ou lúpulo, e para determinar a população final, a coleta das
amostras foi realizada ao final do processo fermentativo (vinho) após o tratamento com
esses produtos. O experimento foi inteiramente casualizado e a análise estatística foi
realizada por meio da análise de variância (ANOVA) para as variáveis transformadas pela
equação y’ = మඥlog (‫ ݕ‬+ 1) . Após a transformação dos dados foi aplicado o teste de
Levene para verificar a aderência dos dados á distribuição normal, e as médias comparadas
3
por meio do teste de Tukey em nível de 5% de probabilidade. Os resultados mostraram que
os antimicrobianos a base de lúpulo (IsoStab e Beta Bio) podem substituir os antibióticos
convencionais (Kamoran, Alcapen e Corstan), pois não houve diferença estatística entre os
tratamentos.
Palavras-chave: álcool, cana, bactérias láticas, contaminantes.
4
USE OF CONVENTIONAL ANTIBIOTICS AND HOP-BASED ANTIMICROBIALS IN
CONTROL OF BACTERIAL INFECTION IN ALCOHOLIC FERMENTATION
Dissertação (Mestrado em Energia na Agricultura) – Faculdade de Ciências
Agronômicas, Universidade Estadual Paulista
Author: Josimara Lacerda Prado
SUMMARY
The objective of this work was to compare the efficiency of
conventional antibiotics in relation to hop-based antimicrobials, in industrial-scale
production of bioethanol. The comparison was made by calculating the lactic acid bacteria
population reduction in two consecutive fermentation cycles. The experiment used five
treatments (three conventional antibiotics: Kamoran WP, Corstan and Alcapen 1030, and
two hop-based antimicrobials: BetaBio and IsoStab). The samples were collected in the
fermentation vat. In order to quantify the initial lactic acid bacteria population, a sample
was collected at the end of the fermentation process (wine) before the treatment with
antibiotics or antimicrobials, and to determine the final population, the sample collection
happened at the end of the fermentation process (wine) after the treatment with antibiotics
or antimicrobials. The experiment was completely randomized and the statistical analysis
was performed through analysis of variance (ANOVA) for the transformed analysis y’ =
మ
ඥlog (y + 1) . After the data transformation, Levene's test was applied to verify the
adherence of the data to the normal distribution, and the averages were compared through
Tukey’s test at 5% probability. The results showed that the hop-based antimicrobials
5
(IsoStab and BetaBio) can be used instead of the conventional antibiotics (Kamoran,
Alcapen and Corstan), since there was no statistical difference between the treatments.
Keywords: alcohol, sugar cane, lactic acid bacteria, contaminants.
6
CONSIDERAÇÕES INICIAIS
1 INTRODUÇÃO
A produção de etanol no Brasil é feita por via fermentativa,
podendo ocorrer a competição entre os microrganismos de processo (leveduras) com os
contaminantes da fermentação alcoólica (bactérias) que utilizam o substrato (sacarose) para
o seu metabolismo. As bactérias produzem substâncias indesejáveis, como ácidos
orgânicos, sendo que o principal deles é o ácido lático.
No processo fermentativo, o grupo de bactérias mais importante é o
lático (Gram-positivas).
A infecção bacteriana durante o processo fermentativo diminui o
rendimento da produção de álcool, devido ao consumo da sacarose pelas bactérias. Além
disso, pode promover a formação de goma, floculação do fermento, inibição do
crescimento e queda da viabilidade das leveduras, causando prejuízos ao processo. Outro
aspecto negativo é a queda de produtividade da fermentação.
O método adotado pelas usinas sucroalcooleiras para o controle das
bactérias é a adição de antibióticos convencionais e antimicrobianos a base de lúpulo. Os
antibióticos deixam resíduos no fermento após a sua secagem, o qual é utilizado como
matéria-prima no preparo de rações para animais ou ingrediente de alimentos para
humanos.
As usinas que secam o excedente de leveduras, para que não ocorra
a ingestão desses antibióticos por humanos ou animais domésticos, adotaram o uso de
7
substâncias naturais extraídas da planta do lúpulo que já eram utilizadas em processos de
produção de cerveja.
Para atender às inúmeras exigências do mercado consumidor de
levedura seca, que demanda produtos que não possuam resíduos de antibióticos, as usinas
sucroalcooleiras iniciaram a eliminação do uso dos antibióticos convencionais em seu
processo fermentativo. Entretanto, as destilarias não poderão deixar de usar produtos
químicos para o controle da infecção bacteriana, devido aos inúmeros prejuízos que as
bactérias causam no processo fermentativo.
Sendo assim, as indústrias produtoras de antimicrobianos naturais,
com grau alimentício, desenvolveram ou adaptaram seus produtos, antes utilizados em
indústrias cervejeiras, para as indústrias alcooleiras. Os antimicrobianos naturais são
produtos extraídos da flor de lúpulo e diferenciam-se dos antibióticos convencionais em
sua função química e modo de ação.
O presente trabalho teve por objetivo comparar o potencial
antibacteriano dos ácidos de lúpulo com os antibióticos convencionais no controle de
populações de bactérias láticas durante o processo fermentativo, em uma usina
sucroalcooleira do interior do estado de São Paulo.
1.2 Revisão bibliográfica
1.2.1 Microbiologia da fermentação alcoólica
A utilização de microrganismos na transformação dos elementos da
matéria acontece desde a antiguidade. Através da observação do ambiente, o ser humano
detectou que certos processos se desenvolviam devido à presença de microrganismos no
meio. O conhecimento de que microrganismos modificam os substratos, possivelmente foi
feita ao acaso, como ao notar que a carne seca resiste à deterioração; ou ao deixar o leite
azedar para retirar o coalho para fabricar queijo; ou que ao secar os grão antes da
estocagem era possível evitar o aparecimento de fungos. Desde então, foi possível entender
melhor e utilizar esses microrganismos a fim de atender as nossas necessidades
(TORTORA et al., 2006).
O cultivo de microrganismos pode ocorrer através de substratos
com valor comercial baixo, podendo até mesmo, ser resíduos de outros processos. A
8
produção do etanol e outros solventes orgânicos, pode ocorrer através da utilização de
resíduos como fonte de carbono ou nitrogênio, como por exemplo, o bagaço de cana,
considerado de grande importância para indústria alcooleira. Considera-se viável no
cultivo de microrganismos, porém, para o cultivo de células animais isso não torna-se
possível pois, devido ás várias exigências da célula, há o encarecimento do processo de
cultivo de células animais (NAJAFPOUR, 2007).
O termo “fermentação” pode apresentar significados distintos
perante o setor que o utiliza. De modo genérico, o termo significa qualquer processo de
cultivo microbiológico que ocorre com ou sem ar. Bioquimicamente, significa o processo
metabólico onde o substrato orgânico atua como doador e como receptor final de elétrons,
ocorrendo em condições anaeróbias, mas sem a utilização de uma cadeia respiratória, como
acontece na respiração anaeróbia. (TORTORA et al., 2006).
O termo “fermentador” também apresenta discordância devido a
conceitos. Inicialmente, foi utilizado para descrever os tanques onde ocorria o cultivo.
Devido a maior porção dos cultivos realizados nesses tanques serem de forma aeróbica, um
novo nome foi proposto para não contradizer a definição bioquímica de fermentação. A
nova nomenclatura “biorreator” passou a ser utilizada para descrever o local onde eram
realizados cultivos de microrganismos em condições aeróbicas e anaeróbicas
(NAJAFPOUR, 2007).
O etanol ou simplesmente álcool, pode ser obtido basicamente de
duas formas distintas: por fermentação alcoólica ou por síntese química a partir do petróleo
(TORTORA et al., 2006)
A levedura e outros microrganismos fermentam a glicose em etanol
e gás carbônico (MAHAN; MYERS, 2002).
Nesse processo, a glicose é convertida em piruvato pelas reações
bioquímicas da glicólise e o piruvato é convertido em etanol e gás carbônico em dois
passos, sendo o primeiro, a descarboxilação do piruvato, catalisada de forma irreversível
através da enzima piruvato descarboxilase. Esta reação é uma descarboxilação simples e
não envolve a oxidação do piruvato. A tiamina pirofosfato é uma coenzima firmemente
ligada ao piruvato descarboxilase que demanda de Mg2+. No segundo passo, o acetaldeído
é reduzido a etanol pois ocorre a ação da enzima álcool desidrogenase por meio da
oxidação do NADH, que é derivado da atividade da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
(MAHAN; MYERS, 2002).
9
1.2.2 Leveduras de processo
Os processos fermentativos com maiores rendimentos são aqueles
que utilizam leveduras selecionadas para obtenção do etanol (FIGUEIREDO, 2012).
As leveduras de processo foram selecionadas em função de suas
características durante a fermentação, como elevados rendimento e produtividade,
tolerância ao etanol, baixa produção de espuma e resistência à floculação (MEIRELLES,
2006).
O uso de linhagens selecionadas permite maior uniformidade de
produtos mesmo em safras distintas (CABRINI; GALLO, 1998), pois há alterações de
clima, solo, variedades de cana, alterações de processo e outros fatores que contribuem
para alterações na produção do álcool.
Saccharomyces é o gênero de maior predominância nos processos
fermentativos. No Brasil, a espécie que apresenta a melhor adaptação às condições
industriais é a Saccharomyces cerevisiae. Também existem outras espécies do mesmo
gênero Saccharomyces e outros gêneros isolados em destilarias no Brasil, como por
exemplo, S. ellypsoideus, S. fragilis, S. coreanus, S. bayanus, S. chevalieri, S. pretoriensis
(Torulaspora pretoriensis) e Schizosaccharomyces pombe, entre outras (CINELLI, 2012).
As linhagens que existem são muito variadas e seu desempenho é
diferenciado dependendo da região onde é utilizada no Brasil. Encontram-se denominadas
comercialmente como linhagens industriais de S. cerevisiae: CAT-1, PE-1, PE-2, SA-1,
FT858L, BG-1, dentre outras (FARREL, et al., 2006).
1.2.3 Taxonomia
Leveduras são microrganismos também conhecidos como fungos
unicelulares. Estão descritas cerca de 600 espécies que formam 80 gêneros (TRABULSI et
al., 2004).
De modo geral, as leveduras são capazes de sobreviver a condições
mais restritas de umidade que as bactérias, porém são mais sensíveis que os bolores quanto
à umidade necessária para seu desenvolvimento. Sua faixa de temperatura ideal para o
desenvolvimento é de 25ºC a 30ºC. Tem como característica, o crescimento favorecido em
meio ácido, multiplicando-se melhor em aerobiose (com exceção das leveduras
10
fermentadoras que se multiplicam melhor em anaerobiose) usam açúcar como fonte de
energia (MAHAN; MYERS, 2002).
As principais são representadas pelas espécies: Saccharomyces
cerevisiae (panificação e cervejaria), a Kluyveromyces marxianus (soro leite),
Shizosaccharomyces pombe (modelo científico), Cryptococcus neoformans (patógeno
humano e causa várias micoses sistêmicas), Candida albicans (um patógeno humano que
causa micoses superficiais e profundas), Blastomyces spp (micoses profundas sistêmicas,
invasivas de órgãos e tecidos), Paracoccidioides brasiliensis (micoses superficiais e
profundas) (TORTORA et al., 2006).
A classificação taxonômica de microrganismos, incluindo a
levedura, inicialmente, baseava-se nas características macromorfológicas, ou seja, eram
consideradas as características de colônia, além de considerar a forma da célula no
microscópio. Informações como características fisiológicas e bioquímicas também eram
observadas, mas considerando as técnicas atuais de biologia molecular, apresentam
desvantagens e incertezas (MATIENZO, 2002).
O primeiro sistema de identificação que descreve muitas das
espécies conhecidas nos dias atuais foi descrito por Emil Christian Hansen em 1896. Emil
considerou as características fisiológicas, habilidades de fermentação da glicose, demais
açúcares e compostos nitrogenados para estabelecer o procedimento para classificação
(TORTORA et al., 2006).
As leveduras alcoólicas pertencem ao domínio Eukaryota, reino
Fungi, filo Ascomycota, classe Saccharomycetes, ordem Saccharomycetales e família
Saccharomycetaceae (ALCARDE et al., 2007).
1.2.4 Citologia
As leveduras são amplamente encontradas na natureza, como no
solo, nas cascas de frutas, nas superfícies de órgãos dos vegetais, principalmente em flores
e
frutos,
no
trato
intestinal
de
animais,
em
líquidos
açucarados
(STECKELBERG, 2011).
Possuem a forma esférica, ovoide, globosas ou alongadas.
Apresentam de 1 a 8 µm de largura e 3 a 15 µm de comprimento, variando de acordo com
idade e ambiente (ALCARDE et al., 2007).
11
Estruturalmente, a levedura é composta principalmente por parede
celular, membrana citoplasmática, citoplasma, organelas e núcleo (KOCKOVÁKRATOCHVÍLOVÁ, 1990).
A parede celular é uma estrutura formada principalmente de
polissacarídeos glicanos (entre 30 a 34%) e manano (cerca de 30%), havendo também
lipídeos com concentrações entre 8,5 a 13,5%, além de 6 a 8% de proteínas. É rígida,
dando forma e resistência mecânica à célula. A parede celular sempre será mais fina em
células jovens quando comparadas às células mais antigas (ALCARDE et al., 2007).
A parede celular inicialmente confere proteção à célula por ser uma
barreira física (ALCARDE et al., 2007), principalmente contra o rompimento da célula
quando há excesso de turgor. Porém é uma estrutura que permite passagem de moléculas
até atingirem a membrana celular.
Os polissacarídeos e proteínas presentes na estrutura da parede
mantém a estabilidade eletroquímica, permitindo a passagem das moléculas e não
apresentam seletividade neste transporte. A interação dos polissacarídeos com as proteínas
são importantes na regulação da floculação desses microrganismos (KHALAF, 2009).
A membrana citoplasmática ou membrana plasmática está
localizada entre a parede celular e o citoplasma. Inicialmente, retém e limita o conteúdo
celular. Quimicamente é constituída predominantemente de fosfolipídios dispostos em
dupla camada, representando cerca de 50% de seus constituintes (KURTZMAN; FELL,
1998). Outro componente são as proteínas, substância funcional na membrana. As
proteínas localizam-se entre a camada de fosfolipídios, portanto, estrutura de composição
lipoproteica. Da mesma forma, todas as membranas de organelas presentes na célula da
levedura como as mitocôndrias, retículos e aparelho de Golgi são constituídas por
fosfolipídios. As proteínas possuem papel importante na seletividade da membrana, mas
também desempenham funções de enzimas e receptor de membrana ao reconhecer
substâncias seja do meio interno ou externo da levedura, para permitir ou não sua interação
(BAMFORTH, 2005).
A seletividade da membrana citoplasmática é a capacidade de
permitir a passagem de determinadas substâncias e impedir de outras para o interior ou
para o exterior da célula. Moléculas neutras, pequenas e lipossolúveis não encontram
dificuldade para atravessar a membrana citoplasmática enquanto que, moléculas grandes,
íons e moléculas insolúveis em gordura precisam de mecanismos específicos para atingir o
12
lado oposto da membrana em que estão. A entrada e saída de água na célula da levedura
ocorrem através das regras da osmose (ALCARDE et al., 2007).
Outra estrutura que compõe a célula de levedura é o citoplasma.
Ele está localizado entre membrana celular e membrana nuclear. Apresenta grande
variedade de componentes responsáveis pelas atividades da célula. O citosol, substância
gelatinosa que acomoda as organelas citoplasmáticas, é composto por água em sua maioria,
além de íons e macromoléculas solúveis, entre elas enzimas, carboidratos, sais e proteínas,
substâncias essenciais ao funcionamento de todas as organelas e do núcleo (FERNANDES,
2007).
No citoplasma das leveduras existem organelas de forma
membranosa ou microtubular, as do tipo membranosas são representadas pelos retículo
endoplasmático, ribossomos, complexo de Golgi, lisossomos, vacúolos e mitocôndria. As
organelas do tipo microtubulares são representadas pelos centríolos (KOCKOVÁKRATOCHVÍLOVÁ, 1990).
A organela denominada retículo endoplasmático, é um sistema de
membranas constituído pela invaginação da membrana plasmática. O retículo
endoplasmático está em contato com o citoplasma externamente e internamente, possui um
espaço denominado lúmen que está isolado do citoplasma (FERNANDES, 2007).
O retículo endoplasmático é formado por túbulos e sacos
achatados, e pode ser denominado retículo endoplasmático rugoso, quando apresenta em
sua superfície externa, ribossomos aderidos, porém quando está livre de ribossomos em sua
superfície, denomina-se retículo endoplasmático liso ou agranular (ALCARDE et al.,
2007).
O retículo endoplasmático rugoso está associado à síntese proteica.
As principais funções do retículo endoplasmático são transportar e armazenar substâncias,
facilitar reações químicas do citoplasma devido sua associação de membranas e enzimas e,
sintetizar lipídeos como triglicerídeos, fosfolípides e esteroides (FERNANDES, 2007).
Os ribossomos estão soltos ou aderidos à membrana no retículo
endoplasmático. Quando estão agrupados em fileiras, presos por uma fita de RNA
mensageiro denomina-se polissomo ou polirribossomo. Possuem em sua composição RNA
ribossômico e proteínas e são formados no interior do nucléolo (KURTZMAN; FELL,
1998).
13
O complexo de Golgi ou aparelho de Golgi está localizado entre o
retículo endoplasmático e as vesículas secretoras que se destacam dos dictiossomos. O
dictiossomo é um empilhamento de sáculos e vesículas achatadas. O complexo de Golgi é
o conjunto de dictiossomos. Sua função na levedura está relacionada com o
armazenamento, empacotamento e exportação de substâncias (FERNANDES, 2007).
Os lisossomos são vesículas formadas pelo complexo de Golgi.
Possuem em seu interior, enzimas digestivas que estão relacionadas com a digestão
intracelular (FERNANDES, 2007).
As enzimas contidas nos lisossomos são produzidas pelo retículo
endoplasmático rugoso e são transferidas ao complexo de Golgi que produzem as vesículas
envolvendo a enzima. Após a levedura inserir em seu interior qualquer substância, entre
elas as moléculas de glicose, forma-se um vacúolo alimentar. O lisossomo é expelido e se
funde ao vacúolo possibilitando o contato da enzima com a molécula a ser digerida. Esta
digestão celular pode ocorrer com moléculas inseridas na célula ou mesmo moléculas
produzidas pelo metabolismo da levedura (KURTZMAN; FELL, 1998).
A organela denominada mitocôndria está relacionada a respiração
celular. Apresentam forma cilíndrica e possuem dupla membrana sendo, a membrana
externa lisa e a interna contendo pregas, denominadas cristas mitocondriais (ALCARDE et
al., 2003). A membrana externa é responsável pelo controle de entrada e saída de
substâncias. Na membrana interna, ocorre a cadeia transportadora de elétrons. No seu
interior, há a matriz mitocondrial, cavidade interna preenchida por substância viscosa que
comporta várias enzimas envolvidas com a respiração celular, DNA e RNA, além de
ribossomos (ALCARDE et al., 2003).
O núcleo é definido como o centro de controle das atividades
celulares. Contém o material genético da levedura e participa ativamente da divisão celular
através da produção de RNA e da síntese de proteínas. Como toda célula eucarionte, o
núcleo da levedura possui carioteca, suco nuclear, nucléolo e cromatina (KURTZMAN;
FELL, 1998).
A carioteca é a membrana que delimita o material nuclear. É
constituída por dupla camada e quimicamente semelhante à membrana plasmática,
lipoproteica. O lado externo da carioteca, face voltada para o citoplasma, pode apresentar
ribossomos. Há diversos poros presentes na totalidade da carioteca. Estes poros permitem a
14
passagem de moléculas como, por exemplo, m-RNA para atuar na formação de proteínas e
duplicação do DNA (FERNANDES, 2007).
O suco nuclear contém a cromatina e os nucléolos, sendo
conhecido como nucleoplasma. O suco nuclear é uma substância consistente, um gel
proteico e preenche o núcleo. Devido à presença de água e diferentes enzimas, diversas
reações do metabolismo celular são favorecidas. A comunicação do suco nuclear com o
citoplasma ocorre através de poros existentes na carioteca (KURTZMAN; FELL, 1998).
Os nucléolos, estruturas esféricas, não possuem membrana.
Quimicamente sua constituição é principalmente de RNA ribossômico associado à
proteínas. Atua nos primeiros estágios da divisão celular (ALCARDE et al., 2003).
A cromatina é o material genético que aparece em forma de um
conjunto de filamentos no interior da celular e é visível apenas na fase da divisão celular
chamada interfase (parte da divisão celular onde o material genético duplica) e com
técnicas de coloração no microscópio se mostra como um emaranhado de filamentos
individualizados (KURTZMAN; FELL, 1998).
1.2.5 Reprodução
As leveduras apresentam duas formas de reprodução: sexuada e
assexuada (STECKELBERG, 2011).
A forma mais comum de reprodução da levedura alcoólica é a
assexuada, realizada por gemulação ou brotamento. Esse tipo de reprodução ocorre com o
surgimento de uma protuberância na parede da célula-mãe que aumenta de tamanho com o
decorrer do tempo, até atingir o tamanho semelhante à célula original. Em seguida, a
parede de ambas as células (mãe e filha) se fecham, formando uma dupla camada,
completando assim, o brotamento. Neste caso, surgirá uma cicatriz permanente na célulamãe e neste local não haverá mais brotamento (STECKELBERG, 2011).
A formação de um broto ocorre aproximadamente a cada 2 horas.
Esta estratégia utilizada pelas leveduras não permite variação genética entre as célulasmães e células-filhas (STECKELBERG, 2011).
Para que a variabilidade genética ocorra, a levedura utiliza a
reprodução sexuada. A produção deste tipo de esporo se faz por meio de meiose (processo
redutor e formador de gametas), ou seja, há a formação de indivíduos com metade da
15
informação gênica (n – haploide) que, futuramente, irão se fundir novamente, formando
um novo indivíduo com a carga gênica completa (2n – diploide) (STECKELBERG, 2011).
A presença de esporos sexuais ocorre conforme a atividade das
leveduras. Podem ocorrer na natureza e também na dorna de fermentação industrial. As
leveduras dispõem deste mecanismo por uma questão adaptativa ao meio e de
sobrevivência (STECKELBERG, 2011).
1.2.6 Metabolismo
As
leveduras
alcoólicas
apresentam
metabolismo
respirofermentativo, isto é, respiram e fermentam durante o seu cultivo em substratos
açucarados. Durante o processo de fermentação de leveduras ocorre liberação de energia
sem a participação de oxigênio. Essa liberação acontece após várias reações enzimáticas
que degradam uma molécula orgânica, no caso o açúcar (glicose), em compostos mais
simples com liberação de energia (MARTINS, 2004).
No processo de glicólise, cada molécula de glicose é desdobrada
em duas moléculas de piruvato (ácido pirúvico), com liberação de hidrogênio e energia,
por meio de várias reações químicas. O hidrogênio combina-se com moléculas
transportadores de hidrogênio (NAD), formando um composto reduzido (NADH) (ZAGO
et al., 2005).
As Figuras 1.1 e 1.2 mostram o processo da glicólise que ocorre
nas leveduras alcoólicas.
16
Figura 1.1 Glicólise fase I. Fonte: Nelson e Cox (2008).
Figura 1.2 Glicólise fase II. Fonte: Nelson e Cox (2008).
17
A Equação 1.1 mostra o processo de glicólise ou quebra da glicose:
Glicose + 2NAD+ + 2ADP + 2Pi → 2 Piruvato + 2 NADH + 2H+ + 2ATP + 2H2O
(1.1)
A fermentação alcoólica é um processo anaeróbico que leva a
transformação de açúcares em etanol e gás carbônico (CO2), via reações catalisadas por
enzimas. Este processo ocorre no citoplasma das células de leveduras com o objetivo de
produzir energia (ATP), a qual é empregada na realização de suas atividades fisiológicas,
tais como o crescimento. Assim, o etanol é um subproduto desse processo de geração de
energia (LIMA et al., 2001).
Este processo celular rende ao microrganismo um saldo energético
muito baixo, pois a conversão de açúcar em álcool e CO2 promove a produção de uma
pequena quantidade ATP, molécula utilizada em todos os processos metabólicos da
levedura com gasto energético (BASSO, 2007).
Este processo se dá pela conversão de ácido pirúvico presente no
meio intracelular que é ionizado na forma de piruvato com produção de um intermediário
reduzido NADH. O piruvato sofre descarboxilação (perda de um átomo de C na forma de
CO2) pela ação da enzima piruvato descarboxilase, resultando o aldeído acético. Através da
enzima álcool desidrogenase, o aldeído acético é reduzido, por meio da oxidação do
NADH para NAD+, havendo a formação do etanol (BASSO, 2007).
A equação geral da fermentação alcoólica é mostrada na Equação
1.2.
C6H12O6 2 CH3CH2OH + 2 CO2 + 23,5 kcal
(1.2)
A capacidade de sobreviver em condições anaeróbias dos
microrganismos tem seu preço. A geração de energia por via anaeróbia é 19 vezes menos
eficiente na formação de moléculas de ATP quando comparada à via metabólica aeróbica,
pois, nas fermentações para obtenção de etanol, a levedura gera apenas 2 ATP por
molécula de glicose enquanto que, na presença de oxigênio, o saldo final de ATP é de 38
por molécula de glicose (BASSO, 2007).
O Quadro 1.1 mostra o balanço energético da glicólise e respiração
das leveduras.
18
Quadro 1.1 Balanço energético da glicólise, síntese e ciclo de Krebs.
Balanço Energético
Etapa
Ocorrência
Glicólise
Formação direta de ATP
Formação de 2 NADH2
(x 3 ATP na cadeia respiratória)
Síntese da Acetil-CoA
Formação de 2 NADH2
(x 3 ATP na cadeia respiratória)
Ciclo de Krebs
Formação direta de ATP
Formação de 6 NADH2 (x 3 ATP na
cadeia respiratória)
Formação de 2 FADH2 (x 2 ATP na
cadeia respiratória)
Total
Fonte: adaptado de Nelson e Cox (2008).
Rendimento
(em moléculas de ATP)
2
6
6
2
18
14
38
As reações químicas que ocorrem na respiração podem ser
agrupadas em duas fases: a anaeróbica e a aeróbica.
Na primeira, ocorre a glicólise na ausência do oxigênio no citosol
da célula e na segunda, ocorrem as reações vinculadas ao ciclo de Krebs e cadeia
respiratória na presença de oxigênio nas células eucarióticas e dentro das mitocôndrias
(LEHNINGER et al., 2006).
O mecanismo anaeróbio é considerado o mais primitivo dos
mecanismos para a obtenção de energia dos seres heterotróficos, estando presente em todos
os organismos (BASSO, 2007).
Algumas espécies de bactérias podem realizar um tipo diferenciado
de respiração, denominado respiração anaeróbia. Sendo, neste caso, em vez do uso de O2,
utilizam nitritos, nitratos, sulfatos ou carbonatos para oxidar a matéria orgânica. Como
exemplo, há as bactérias desnitrificantes do solo, como a Pseudomonas denitrificans
(NELSON; COX, 2008).
Segundo Lehninger et al. (2006), elas participam do ciclo do
nitrogênio, devolvendo à atmosfera o N2.
Por somente realizarem esse processo na ausência de O2, a
desnitrificação não é um mecanismo frequente em solos oxigenados, sendo comum em
regiões pantanosas onde a taxa de O2 é reduzida (NELSON; COX, 2008).
Segundo Nelson e Cox (2008), na mitocôndria, ocorre a respiração
celular, que acontece em duas etapas. Na primeira, o piruvato é descarboxilado e entra no
19
ciclo de Krebs, onde sofrerá mais duas descarboxilações. Na segunda etapa, conhecida
como cadeia respiratória, as coenzimas reduzidas
reduzidas (NADH e FADH) produzidas na
glicólise e ciclo de Krebs são oxidadas, com a correspondente produção de ATP.
A Figura 1.33 mostra representação esquemática do Ciclo de Krebs.
Figura 1.3 Ciclo de Krebs. Fonte: Nelson e Cox (2008).
Analisando o processo de glicólise, Lehninger et al. (2006)
descreveram que quando atravessam a membrana da mitocôndria, as recém-geradas
recém
moléculas de NADH gastam mais 2 ATPs dando ao final da glicólise um saldo de 4 ATP.
O mecanismo aeróbico é representado
representado pela equação a seguir:
C6H12O6 + 6 O2 ⇒ 6CO2 + 6 H2O + 38 ATP
(1.3)
20
1.2.7 Bactérias contaminantes
O processo de produção do etanol atualmente praticado no Brasil
envolve a participação de leveduras em várias etapas e, com isso, os contaminantes
também podem fazer parte de várias etapas da produção, causando diversos distúrbios tais
como: consumo de açúcar e etanol pelos contaminantes, queda da viabilidade e morte das
células de levedura devido às toxinas lançadas no meio pelo contaminante, fermentações
secundárias oriundas da atividade desses microrganismos, além do problema de floculação
das células de levedura provocado tanto por bactérias como por leveduras (ALTHERTUM
et al., 1984).
Segundo Basso (2007), a floculação do fermento usado nas
indústrias produtoras de etanol leva à decantação das leveduras nos fundo das dornas e
dificulta a conversão do açúcar em etanol porque, para uma máxima conversão de açúcar
em etanol e gás carbônico, é essencial que as leveduras permaneçam suspensas no líquido
de fermentação e não floculadas.
Este fenômeno causa perda de células na centrífuga e a
obrigatoriedade de reposição celular, trazendo gastos para o processo e proporcionando
queda no rendimento alcoólico (LUDWIG et al., 2001).
A floculação impede a ação do antibacteriano por impedir o contato
da substância utilizada no processo e a bactéria. Devido a isso, não ocorre a diminuição da
proliferação desses contaminantes, que provocam aumento de acidez, devido produção de
ácidos orgânicos que prejudicam a qualidade do etanol produzido, tanto na indústria
sucroalcoleira quanto para a indústria de alimentos (ROSE, 1980).
Para o controle da infecção bacteriana, e de suas consequências no
processo de obtenção de etanol, visando uma fermentação sem contaminantes, com rapidez
e alta eficiência, é necessário estudos para soluções práticas e viáveis que atenuem ou
eliminem a contaminação e consequentemente a floculação do fermento nas destilarias,
reduzindo assim o custo do etanol (LUDWIG et al., 2001).
Apesar dos danos gerados, ainda não há métodos totalmente
eficazes no controle industrial para caracterização e monitoramento destes agentes (ROSE
et al., 1995).
21
1.2.8 Formas de contaminação bacteriana nos processos fermentativos
Nos processos de fermentação alcoólica, qualquer espécie de
bactéria presente no meio de fermentação é considerada contaminante (WARD, 1991).
Inúmeros microrganismos infectantes da fermentação alcoólica são
provenientes da flora natural da cana e do solo, ficando aderidos à cana, sendo
transportados até as destilarias, onde se multiplicam (ROSE, 1980).
As bactérias oriundas do solo e matéria-prima aderem aos
equipamentos de extração de caldo, e quando há condições favoráveis, esses
microrganismos podem se multiplicar e causar problemas ao processamento (YOKOYA,
1989).
No processo fermentativo, bactérias dos gêneros Bacillus,
Lactobacillus, Acetobacter, Clostridium, Leuconostoc são normalmente encontradas no
caldo. Estes gêneros de microrganismos produzem ácidos orgânicos tais como o butírico,
acético, fórmico e lático (ANDRIETTA et al., 2011).
Diversos estudos são realizados para determinar a influência dos
ácidos acético e lático quanto à inibição do crescimento e a queda da viabilidade celular da
levedura Saccharomyces cerevisiae. Ao utilizar cultura mista com bactérias contaminantes
da fermentação alcoólica, observa-se que, ocorre queda no rendimento alcoólico
significativamente ao obter contaminação bacteriana acima de 106 ou 107 células/mL no
mosto (ALCARDE et al., 2007).
Dentre as bactérias produtoras de ácido lático, o gênero
Leuconostoc se destaca por ser comum contaminante na produção tanto de açúcar quanto
de álcool. Este microrganismo utiliza o açúcar disponível no caldo e produz goma. Há
outros gêneros produtores de goma como Klebsiella e Acetobacter, encontrados
geralmente, na condução de caldo na usina. Levantamentos da predominância da
microbiota predominante no processo fermentativo, revelam que 98,52% das bactérias
encontradas e isoladas foram classificadas como pertencentes ao grupo Gram-positivo
sendo o gênero Lactobacillus, o mais frequente entre eles (59,75%) (ANDRIETTA et
al.,2011).
O fator mais crítico da contaminação bacteriana para as
fermentações, especialmente nas destilarias que extraem levedura para secagem, é a
floculação. Esse fenômeno ocorre quando há interação entre os lactobacilos e a levedura,
22
potencializado por altas concentrações de cálcio no mosto. Tais condições levam as
bactérias a se aderirem nas paredes das leveduras, por meio de ligações entre moléculas
constituintes da superfície desses microrganismos, fazendo com que toda biomassa se
precipite (VENTURA; ZINK, 2002).
O corte apresenta grande diferencial para a contaminação
bacteriana, pois no corte manual a exposição de áreas da cana é menor se comparada ao
corte mecanizado. Esse último proporciona às bactérias possibilidades maiores de
proliferação, além da contaminação no campo e no transporte. O caldo de cana pode sofrer
contaminação em todas as fases do processamento que antecede a fermentação como, por
exemplo, na moagem, trocadores de calor, preparo e adição de insumos entre outros
(SILVA, 2010).
1.2.9 Controle da fermentação
Denominam-se antibióticos, compostos orgânicos, podendo ser
naturais ou sintéticos, e que inibem o crescimento ou possam causar a morte de
microrganismos específicos. Tem a característica de apresentar seletividade quanto aos
alvos. Outra característica, é que, devido os microrganismos alvos serem específicos, o
constante uso de antibióticos para o controle de contaminação em indústrias pode induzir à
seleção de microrganismos resistentes (EGUCHI, 2007).
Em diversos países, não é permitido a utilização de levedura, tanto
para alimentação animal ou alimentação humana, que contenha residual de antibióticos,
tornando o uso de antimicrobianos de origem natural uma alternativa segura, eficaz e
econômica (BREGAGNOLI, 2006).
Biocidas
naturais,
quando
utilizados
para
controle
de
contaminantes da fermentação, estão reduzindo com sucesso a carga microbiana, mas os
resultados são demonstrados de forma isolada. As formas de utilização dos biocidas
naturais podem, de certa forma, auxiliar nas decisões para o controle em que se apresentam
de acordo com as exigências atuais de redução de resíduos. Além disso, há elevado custo
na utilização de antibióticos no controle microbiológico da produção de etanol, enquanto o
controle exercido pelos biocidas apresenta baixos custos de utilização (CAETANO;
MADALENO, 2011).
23
Segundo Bregagnoli (2006), para o problema das contaminações, a
utilização de antissépticos e antibióticos que atuam de forma diferente, pode ser uma
solução viável, devido à ação ocorrer sobre um ou mais grupos de microrganismos. Porém,
existe a possibilidade de deixarem resíduos nos destilados. Dosagens nas proporções de
0,01 a 0,05 g/L de mosto de pentaclorofenol ocorreram durante anos, com bons resultados,
porém seu uso é hoje proibido. O hexaclorofeno em dose de 4 mg/L de mosto, segundo
pesquisas, contribui para boas fermentações. São citados na literatura também sulfato de
cobre, embora o mais utilizado na indústria seja o ácido sulfúrico que se adiciona nas cubas
de tratamento de fermento.
A utilização de substâncias proibidas na alimentação animal, ou
que contenham coadjuvantes inertes prejudiciais à levedura, são muito comuns e,
recentemente, esse grupo de produtos é objeto de monitoramento e regulamentação em
levedura seca. Este monitoramente partiu das autoridades regulatórias dos países
compradores desse material, e isso ocorreu devido a detecção de residual de antibióticos
acima do esperado em lotes exportados (VENTURA, 2009).
Além disso, a resistência microbiana aos antibióticos é um
crescente problema, e a entendimento do uso de drogas antimicrobianas no futuro é
duvidosa, o que torna o uso de antimicrobianos de origem natural uma alternativa eficaz e
econômica (VARGAS et al., 2004).
1.2.10 Antimicrobianos
Existem três efeitos distintos quando um agente antimicrobiano é
inserido à uma cultura bacteriana na fase exponencial do crescimento: o efeito
bacteriostático, o efeito bactericida e o bacteriolítico (EGUCHI, 2007).
O primeiro consiste na inibição do crescimento, porém sem morte
celular. Esses agentes são frequentemente inibidores de síntese proteica e atuam por
ligação aos ribossomos. É o caso dos antibióticos que inibem a síntese da parede celular
em bactérias como a penicilina (SILVA, 2010).
O segundo refere-se a uma morte das células, mas não há lise
celular. Por fim, o efeito bacteriolítico provoca a indução da morte celular por lise, levando
à diminuição da turbidez do meio de cultura e do número de células viáveis (SILVA,
2010).
24
1.2.11 Antibióticos convencionais
Os microbiocidas específicos, com ação seletiva sobre as principais
bactérias contaminantes da fermentação são representados por uma diversidade de
substâncias, classificadas segundo seu mecanismo de ação (EGUCHI, 2007).
A indústria sucroalcooleira trata o fermento com antibiótico e ácido
sulfúrico para o controle da infecção bacteriana. Os princípios ativos dos antibióticos são
de origem do metabolismo de microrganismos selecionados e o seu grau de pureza
depende do refinamento do processo de purificação de cada empresa produtora de
antibióticos (CHERUBIN, 2003).
Antibióticos como penicilina e a tetraciclina são utilizados nas
fermentações. A penicilina é a mais vantajosa economicamente, devido sua dosagem ser de
500 a 1000 UI/L mosto, sendo esta dosagem menor que a dos demais antibióticos
disponíveis para uso em fermentações (BREGAGNOLI, 2006).
Os antibióticos mais utilizados no Brasil são a penicilina e
antibióticos a base de monensina. A monensina é uma substância monitorada em países
europeus importadores de levedura seca quanto ao seu residual no produto final. Ambos
agem em bactérias Gram-positivas, sendo a monensina considerada a mais eficiente
(MORAES et al., 2006).
A penicilina, composto beta-lactâmico, inibe a biossínese de
constituintes essenciais da membrana plasmática (EGUCHI, 2007). Os beta-lactâmico
ligam-se a receptores denominados PBP (Penicillin Binding Protein) na membrana das
bactérias impedindo a ação da enzima responsável pela ligação entre as cadeias de
peptídeos que compõe a formação da membrana celular (SILVA, 2010).
O antibiótico denominado Kamoran age seletivamente como
bactericida e bacteriostático. É obtido a partir da fermentação de Streptomyces
cinnamonensis que produz o princípio ativo monensina sódica cristalina. Esta molécula
impede o transporte de cátions na membrana das bactérias Gram-positivas (REVISTA
QUIMICA REAL, 2009).
A oxitetraciclina atua em bactérias Gram-negativas e positivas,
pois é um antibiótico de amplo espectro. O mecanismo de ação das tetraciclinas está em
bloquear o receptor no ribossomo que se liga aos t-RNA na transcrição genética,
25
conferindo capacidade de inibir a síntese proteica e posterior inibição da replicação das
bactérias (SILVA, 2010).
A virginiamicina, substância química extremamente utilizada na
produção animal a partir de 1950, possui ação sobre as bactérias Gram-positivas
atuando por meio de ligação com os ribossomos, inibindo a síntese proteica
(ANDREOTTI; NICODEMO, 2004). A virginiamicina é um antibiótico com moléculas
denominadas estreptograminas que formam um grupo pequeno de antibióticos e todos
relacionados como pristinamicina, virigniamicina, micamicina e vernamicina que inibem a
formação de pontes peptídicas, resultando na formação de cadeias proteicas incompletas
(SILVA, 2010).
A substância clindamicina, produzida pela cepa Streptomyces
lincolnensis, inibe a síntese proteica do microrganismo alvo, por meio do impedimento das
ligações peptídicas. É um antibiótico considerado bacteriostático em baixas dosagens, mas
quando em altas dosagens pode ser bactericida. (YEWALE; DHARMAPALAN, 2012).
Troppa (1998) descreveu que ao comparar o uso de tetraciclina e
penicilina foi possível observar que é necessário maior concentração de tetraciclina para
inibir o desenvolvimento de bactérias no mosto do que penicilina, e que ambos não causam
alterações no metabolismo das leveduras.
Segundo o autor, a associação de antibióticos é uma prática
utilizada nas destilarias e pode ser vantajoso no combate à contaminação bacteriana
(TROPPA, 1998).
O uso indiscriminado e contínuo dos antibióticos convencionais
durante os processos fermentativos nas indústrias de álcool provocam seletividade nas
cepas de bactérias presentes nestes processos. Com isso, as bactérias selecionadas tornamse menos sensíveis à ação dos antibióticos (CINELLI, 2012).
Quando o antibiótico Kamoran WP foi lançado, a indicação de
dosagem era de 1 a 3 ppm, mas esta foi alterada atualmente para 4 ppm, demonstrando
assim, a resistência das bactérias a este composto (SILVA, 2010).
1.2.12 Antimicrobianos à base de lúpulo
A origem da planta do lúpulo é a Europa e Ásia Ocidental, mas é
cultivada em zonas de clima temperado em todo o mundo, concentrando-se em maior
26
proporção na Alemanha, Estados Unidos, China, Inglaterra, República Checa, Eslovênia,
Austrália e França (RUCKLE; SENN, 2006).
O lúpulo (Humulus lupulus) pertence à família Cannabinaceae e à
ordem Urticales. Portanto, botanicamente, está relacionada com as urtigas irritantes. É uma
planta perene trepadora, que atinge até 6 metros de altura. São dioicas (flores masculinas e
femininas em plantas diferentes que se distinguem pelo tamanho) e o período de
florescimento é durante julho e agosto por toda Europa e Ásia Ocidental (HORNSEY,
1999).
As flores femininas apresentam uma estrutura morfológica
denominada “cone de lúpulo”, cujas pétalas contêm glândulas de lupulina, que é
constituída por uma resina rica em ácidos alfa e beta (RUCKLE; SENN, 2006).
A lupulina contém óleos essenciais (0,2 – 3%), ácidos beta ou
lupulonas (1,5 – 9,5%) e ácidos alfa ou humulonas (2,0 – 16%) que variam em suas
proporções nas diferentes variedades da planta (SILVA; FARIA, 2008).
Os ácidos do lúpulo interferem no transporte de metabólitos na
membrana celular e modificam o pH intracelular o que provoca a morte das bactérias por
meio de insuficiência nutricional. Sua ação é mais eficiente em bactérias Gram-positivas
(SILVA; FARIA, 2008).
Para obtenção do efeito bacteriostático, a dosagem do extrato de
lúpulo deve manter a concentração mínima do princípio ativo entre 3 a 5 mg L-1. Nessa
faixa de dosagem, não há alteração no crescimento e metabolismo das Saccharomyces
cerevisiae (OLIVEIRA et al., 1996).
Atuam principalmente sobre as bactérias dos gêneros Lactobacillus
e Pediococcus, limitando seus metabolismos e melhorando as condições fermentativas para
as leveduras. Isso proporciona melhores condições para o crescimento das leveduras que
irão fermentar mais rapidamente o mosto e com maior produção de álcool (RUCKLE;
SENN, 2006).
Em 2007, o extrato de lúpulo 45% foi lançado no setor
sucroalcooleiro brasileiro. O uso do extrato para controle bacteriano mostrou vantagens,
como a redução no gasto com ácido sulfúrico no tratamento do levedo e incremento no
rendimento de etanol. Além disso, o extrato é um produto natural que as empresas
produtoras de levedura seca podem aderir ao uso, pois não deixa residual químico em
27
alimentos. Em relação aos custos para as usinas, o uso do extrato de lúpulo é semelhante
aos antibióticos (CAETANO; MADALENO, 2011).
28
1.3 REFERÊNCIAS
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33
CAPÍTULO II
34
1 INTRODUÇÃO
O Brasil detém uma tecnologia única no mundo para utilização em
grande escala de um combustível renovável (etanol) que não depende do petróleo. De
acordo com dados da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB), na safra
2010/2011, mais de 660 milhões de toneladas de cana que foram processadas em açúcar,
álcool e derivados, sendo 28,5 bilhões de litros de álcool. Na região sul do Brasil, 26,3
bilhões de litros foi produzido e 16,2 bilhões de litros no estado de São Paulo (BRESSAN;
ANDRADE, 2013).
O conhecimento do processo fermentativo é fundamental para o
aperfeiçoamento na produção de etanol, pois a produção do álcool ocorre essencialmente
por esta via (COSTA, 2010).
São muitos os fatores que podem causar danos ao processo de
fermentação na produção do etanol e a infecção bacteriana é um deles. Ela pode causar
consumo de açúcar, formação de goma, floculação do fermento, inibição de crescimento e
queda da viabilidade das leveduras devido às toxinas e ácidos orgânicos excretados no
meio, promovendo assim a redução no rendimento e na produtividade da fermentação
(OLIVA-NETO; YOKOYA, 2001).
Algumas substâncias são comumente empregadas para impedir
essas contaminações e tornar a produção livre de agentes que promovam situações de
baixo rendimento e produtividade; são os antibióticos, os antimicrobianos, além de
substâncias que podem impedir a contaminação como os ácidos de lúpulo (MUTHAIAN et
al., 2010).
35
Os antibióticos são substâncias sintéticas ou naturais elaboradas por
fungos, bactérias, entre outros seres vivos, apresentando atividade bactericida. O uso
indevido e incorreto de antibióticos pode trazer consequências agravantes na fermentação.
As bactérias têm a capacidade para criar resistência aos antibióticos através de vários
mecanismos (PELCZAR, 1996).
Segundo Badin (2010), os antibióticos convencionais podem deixar
resíduos no creme de levedura, o qual é utilizado por algumas empresas como matériaprima na produção de levedura seca. Este produto é usado na fabricação de ração animal
ou ingrediente para produtos de consumo humano. Por esse motivo, há a necessidade de
desenvolvimento de substâncias para o controle de bactérias contaminantes, não
prejudiciais à saúde de animais e seres humanos, que consigam a mesma eficiência de
controle microbiano nas dornas de fermentação.
A Figura 2.1 mostra principais estruturas ou etapas metabólicas
afetadas por antibióticos.
Figura 2.1 Exemplos das principais estruturas ou etapas metabólicas afetadas por
antibióticos. Fonte: adaptado de Ruckle e Senn (2006).
36
As substâncias antimicrobianas são muito utilizadas e objetivam
proteger o processo fermentativo, são agentes químicos que inibem o crescimento de
microrganismos (REVISTA FOOD INGREDIENTS, 2010).
O cloreto de sódio (sal de cozinha) é considerado o mais antigo
agente antimicrobiano. Atualmente, são utilizados como agentes antimicrobianos em
alimentos com baixo valor de pH, ácidos orgânicos como o acético, benzóico, propanóico e
sórbico. Para inibir o crescimento da bactéria Clostridium botulinum em alimentos que
contenham carne crua como, por exemplo, linguiça, presunto, bacon e salame, são
utilizados nitratos e nitritos. Em frutas secas, sucos e vinhos, dióxido de enxofre e sulfitos
é usado para controlar o crescimento de microrganismos. Para inibir o crescimento de
bactérias e fungos, utiliza-se nisina e natamicina (REVISTA FOOD INGREDIENTS,
2010).
O lúpulo é utilizado na indústria como agente bacteriostático e o
uso de produtos à base de lúpulo, técnica já utilizada na fabricação de cerveja, foi
incorporado ao processo de produção de álcool etílico carburante. O lúpulo na forma de
péletes ou extrato confere gosto amargo às cervejas, mas também inibe o crescimento de
espécies bacterianas contaminantes do processo fermentativo (RUCKLE; SENN, 2006).
O lúpulo é utilizado na indústria como agente bacteriostático e o
uso de produtos à base de lúpulo, técnica já utilizada na fabricação de cerveja, foi
incorporado ao processo de produção de álcool etílico carburante. O lúpulo na forma de
péletes ou extrato confere gosto amargo às cervejas, mas também inibe o crescimento de
espécies bacterianas contaminantes do processo fermentativo (LEITE et al., 2012).
O lúpulo (Humulus lupulus) é uma planta do tipo dioica, sendo as
flores femininas responsáveis por produzir material resinoso denominado lupulina, que é
responsável em conferir o gosto amargo e aroma à cerveja (LOPES; SILVA, 2011).
O lúpulo pertence ao reino Plantae, Classe Magnoliopsida, ordem
Rosales, família Cannabaceae, gênero Humulus, espécie H. lupulus (SILVA; FARIA,
2008).
37
Figura 2.2 Humulus lupulus. Fonte: Google Imagens.
No extrato de lúpulo existem naturalmente os ácidos alfa e beta que
atuam sobre os microrganismos contaminantes, inibindo o seu crescimento (RUCKLE;
SENN, 2006).
O ácido beta é extraído com gás carbônico supercrítico que mantém
suas propriedades naturais. É dissolvido em propileno glicol de grau alimentício.
Resultados de pesquisas mostram que o beta ácido possui propriedades antimicrobianas e
são particularmente ativos contra bactérias Gram-positivas. As pesquisas também
revelaram que a atividade contra bactérias Gram-negativas é insignificante. Outra
descoberta indica que o produto não produz nenhum efeito maléfico na levedura
(REVISTA ALCOOLBRAS, 2007).
Neste contexto, o presente trabalho objetivou comparar a eficiência
dos antibióticos convencionais em relação aos antimicrobianos à base de lúpulo, em escala
de produção industrial de bioetanol.
2.1 MATERIAL E MÉTODOS
Os testes experimentais foram realizados em usina sucroalcooleira
do Estado de São Paulo que opera com processo de fermentação descontínua alimentada. A
planta de fermentação é constituída por 14 fermentadores com capacidade de 800 m3, 6
pré-fermentadores (60 m3) e 6 centrífugas para a separação do fermento. A condução do
38
processo fermentativo por batelada alimentada possibilita o rastreamento das infecções que
ocorrem em cada fermentador.
2.1.1 Planejamento experimental
O trabalho foi realizado a partir da coleta de dados de contagem de
bactérias láticas durante o processo de fermentação alcoólica, em duas safras.
Os dados utilizados foram coletados na safra de 2008/2009, em que
o controle da infecção bacteriana foi realizado exclusivamente por meio de antibióticos
convencionais, e na safra de 2011/2012, na qual o controle das bactérias contaminantes foi
realizado com a adição de antimicrobiano à base de extrato de lúpulo.
A comparação da eficiência dos antibióticos convencionais em
relação aos antimicrobianos à base de lúpulo foi feita por meio taxa de redução
populacional em dois ciclos consecutivos de fermentação.
Os antibióticos avaliados foram Kamoran WP, Alcapen 1030 e
Corstan. Os antimicrobianos à base de lúpulo foram IsoStab e Beta Bio. O Kamoran WP e
o Corstan têm como princípio ativo a monensina sódica (REVISTA QUIMICA REAL,
2009), o Alcapen 1030, a oxitetraciclina e penicilina (LOPES; SILVA, 2011), enquanto
que o IsoStab e BetaBio, alfa e beta ácidos obtidos do extrato de lúpulo (RUCKLE; SENN,
2006).
O experimento teve cinco tratamentos (três com antibióticos
convencionais e dois com antimicrobianos à base de lúpulo), com 17 repetições para
Kamoran WP, 17 repetições para Alcapen 1030 e 13 para Corstan, enquanto que para o
IsoStab 28 repetições e para o Beta Bio 17 repetições.
As amostras foram coletadas na dorna de fermentação para o
mesmo fermento em dois momentos. Para quantificar a população inicial de bactérias
láticas, foi coletada amostra no final do processo fermentativo (vinho) antes do tratamento
com antibióticos ou lúpulo, e para determinar a população final, a coleta das amostras foi
ao final do processo fermentativo (vinho) após o tratamento com esses produtos.
39
2.1.2 Método de contagem em placas de bactérias láticas
O método de contagem total de bactérias láticas foi feito utilizando
a técnica pour plate (contagem de unidade formadora de colônias por ml) descrito no
Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos – ITAL (SILVA et al., 2007).
Essa análise microbiológica foi realizada em câmara de fluxo
laminar devidamente desinfetada. As amostras de vinhos foram inoculadas em placas de
Petri separadas, esterilizadas, com diluições adequadas. Às placas de Petri foi adicionado
meio de cultura MRS esterilizado com sobrecamada. A incubação das placas foi feita de
forma "invertida" em estufa com temperatura controlada de 30°C por 48h. Após o período
de incubação, com o auxílio do contador, efetuou-se a contagem das colônias e obtenção
dos resultados (SILVA et al., 2007).
2.1.3 Cálculo da taxa de redução populacional (TRP)
A taxa de redução populacional para cada antibiótico e
antimicrobiano à base de lúpulo foi calculada pela seguinte equação:
ܴܶܲ =
௉௢௣௨௟௔çã௢ ௜௡௜௖௜௔௟
௉௢௣௨௟௔çã௢ ௙௜௡௔௟
(2.1)
Sendo:
TRP = taxa de redução populacional
População inicial = contagem de bactérias contaminantes no vinho antes do tratamento
com antibiótico ou lúpulo (UFC/mL)
População final = contagem de bactérias contaminantes no vinho após o tratamento com
antibiótico ou lúpulo (UFC/mL)
Após a determinação da taxa de redução populacional para cada
tratamento, foi calculada a média para cada tratamento. O valor médio foi utilizado na
análise estatística.
40
2.1.4 Análise estatística
O experimento foi considerado inteiramente casualizado. A análise
estatística foi realizada por meio da análise de variância (ANOVA). Em função da elevada
variabilidade dos resultados de contagem de bactérias láticas, os dados originais foram
transformados (‫ ݕ‬ᇱ = మඥlog (‫ ݕ‬+ 1)) e submetidos ao teste de Levene para verificar a sua
distribuição normal. Após isso, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey (VIEIRA,
2006).
O software utilizado foi o SAS 9.1 em nível de 5% de
probabilidade (SAS INSTITUTE INCORPORATION, 2003).
2.2 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A elevada variação dos resultados de contagem de bactérias láticas
exigiu a transformação dos dados originais, conforme descrito no item 2.4 (Análise
estatística). Foi constatado em todos os tratamentos que, para algumas contagens, a
população cresceu após o tratamento com os antimicrobianos. Em função disso, resolveuse calcular a taxa de redução populacional (TRP), como demonstrada na Equação 2.1, para
evitar os valores negativos quando se trabalha com TRP expressa em percentagem.
A análise de variância (Tabela 2.1) foi significativa ao nível de 5%
de probabilidade, indicando que há diferença estatística entre os tratamentos. O teste de
Tukey realizado ao nível de 5% de probabilidade mostrou que os produtos de lúpulo
(IsoStab e BetaBio) foram superiores e/ou equivalentes aos antibióticos, porém, nunca
inferiores (Tabela 2.2).
Tabela 2.1. Análise de variância para as taxas de redução populacional dos antimicrobianos
convencionais (Kamoran WP, Alcapen 1030, Corstan) e antimicrobianos a base de lúpulo: IsoStab
e BetaBio.
Causa de Variação
Tratamento
Resíduo
Total
GL
4
87
91
*significativo (p<0,05)
Soma de quadrados
2,9699
21,3368
24,3067
Quadrado médio
0,7425
0,2452
F
3,03
p>F
0,0218*
41
Tabela 2.2. Teste de Tukey da taxa de redução populacional (TRP) de bactérias láticas, durante a
fermentação alcoólica na safra de 2008/2009, para antimicrobianos convencionais (Kamoran WP,
Alcapen 1030, Corstan) e na safra 2011/2012, para os antimicrobianos a base de lúpulo: IsoStab e
Beta Bio.
Tratamento
Kamoran WP
Alcapen 1030
Corstan
IsoStab
BetaBio
N° Observações
17
17
13
28
17
Média TRP ± Desvio Padrão
1,51 ± 0,60 a
1,01 ± 0,43 b
1,50 ± 0,43 ab
1,45 ± 0,47 a
1,45 ± 0,53 ab
Médias seguidas de mesma letra não diferem significativamente, ao nível de 5% pelo teste Tukey.
Segundo os resultados obtidos na Tabela 2.2, a TRP não foi
totalmente eficiente para nenhum dos antimicrobianos utilizados, pois não houve
eliminação das bactérias contaminantes e sim, redução da população. Esta informação está
de acordo com os resultados de Nobre et al. (2007). Quanto à comparação da TRP do
antimicrobiano BetaBio em relação ao Kamoran, o presente trabalho mostrou resultados
diferentes em relação aos publicados por Leite et al. (2012), para quem o antibiótico foi
superior ao lúpulo.
Foi possível observar redução da contagem de bactérias láticas em
tratamentos com antibióticos convencionais Kamoran e Corstan. Estes resultados são
semelhantes ao de Mello (2002) que compararam os mesmos produtos no controle de
bactérias láticas durante o processo fermentativo de caldo de cana.
Os resultados expostos na Tabela 2.2 mostraram que a eficiência da
dosagem do antibiótico Kamoran não foi total ao ponto de eliminar as bactérias
contaminantes com dosagens de 3 ppm. Este fato foi relatado por Lopes e Silva (2011) que
obtiveram melhores resultados com dosagens de 6 ppm, o dobro da recomendada pelo
fabricante.
Pela análise dos resultados mostrados na Tabela 2.2, observou-se
que os antimicrobianos a base de lúpulo se igualam aos antibióticos convencionais ou os
supera o que corrobora com Lopes e Silva (2011) que relataram que os compostos a base
de extrato de lúpulo foram eficazes, apresentando resultados de redução populacional
bacteriana a partir de dosagens de 5 a 10 ppm, quantidade inferior às recomendadas pelo
fabricante.
42
Alcarde et al. (1996) observaram que a penicilina permitiu o
desenvolvimento de bactérias mesmo quando usada em altas dosagens. Nos dados obtidos
no presente trabalho, o produto Alcapen 1030, que apresenta penicilina em sua
composição, demonstrou menor eficiência na TRP, quando comparado ao Kamoran e
IsoStab.
É possível afirmar, a partir da análise da Tabela 2.2, que
estatisticamente o antibiótico convencional Kamoran apresentou resultado semelhante aos
antimicrobianos naturais à base de lúpulo, comportamento semelhante ao obervado por
Badin (2010).
Na rotina da destilaria, objeto deste estudo, constatou-se que os
antibióticos convencionais apresentam custo mais elevado quando comparados aos
antimicrobianos à base de lúpulo. Os valores para os cálculos foram obtidos com o
departamento de compras da empresa.
Comparando valor entre produtos a base de monensina, não há
grandes diferenças. O valor do quilo de Kamoran WP é 2% mais alto que o antibiótico
Corstan. Porém, quanto comparado ao Alcapen 1030, antibiótico a base de oxitetraciclina e
penicilina, a diferença fica em torno de 48% maior para o Kamoran.
Antibióticos a base de monensina, apresentam valor torno de 225%
mais elevados que os antimicrobianos de lúpulo.
2.3 CONCLUSÕES
Dentro das condições em que este estudo foi feito, considerando as
limitações metodológicas do estudo de caso no interior de uma usina sucroalcooleira em
safras diferentes, concluiu-se que os antimicrobianos a base de lúpulo (IsoStab e Beta Bio)
podem substituir os antibióticos convencionais (Kamoran, Alcapen e Corstan), pois os
estudos demonstraram que sua eficácia é igual ou superior aos convencionais.
43
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