PROPOSIÇÃO DE UM NOVO MÉTODO PARA DETECÇÃO DE

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PROPOSIÇÃO DE UM NOVO MÉTODO PARA DETECÇÃO DE INVASÃO DE
CÉLULAS DE MAMÍFEROS POR ESCHERICHIA COLI
Victor Dellevedove Cruz (Bolsista PIBIC/CNPq), Marcelly Chue Gonçalves,
Renata Katsuko Takayama Kobayashi, e-mail: [email protected]
Universidade Estadual de Londrina/Departamento de Microbiologia/CCB
Área e sub-área do conhecimento: Microbiologia/Microbiologia Aplicada
Palavras-chave: Escherichia coli; invasão; ExPEC.
Resumo
Escherichia coli faz parte da microbiota intestinal e é um dos principais agentes
de infecções gastrointestinais (DEC) e extraintestinais (ExPEC), sendo a
invasão do tecido hospedeiro um importante mecanismo de patogenicidade. E.
coli uropatogênica (UPEC) é o principal patógeno associado a infecções do
trato urinário (ITU). Cepas de UPEC podem promover infecções urinárias
recorrentes, pielonefrites e até mesmo quadros infecciosos mais graves como a
meningite neonatal e a sepse de origem urinária. A patogênese da ITU, e de
quadros correlatos, está relacionada à adesão e invasão tecidual, bem como
capacidade de evasão do sistema imunológico. Neste estudo, invasão em
células eucarióticas foi identificada em amostras de bactérias da categoria
ExPEC. Células das linhagens HeLa (câncer cervical), HEp2 (câncer de
laringe) e VERO (rim de macaco verde africano) foram usadas. Nos resultados
a porcentagem de cepas invasoras em células VERO foi de 50%, em células
HEp-2 foi de 23% e em células HeLa 27%. Com as porcentagens médias de
invasão, 0,0037% para células HEp-2, 0,0035% para células HeLa e 0,018%
para VERO notou-se a grande diferença existente entre tais taxas, mostrou
assim uma maior eficiência das células VERO para tais testes.
Introdução e objetivo
Escherichia coli é um microrganismo Gram negativo, oxidase negativa,
pertencente à família Enterobacteriaceae, que coloniza o trato gastrointestinal
poucas horas após o nascimento e constitui o anaeróbio facultativo mais
abundante da microbiota intestinal (KAPER, NATARO, MOBLEY, 2004). Exceto
nos casos em que a barreira gastrointestinal é rompida ou no caso de
1
imunocomprometidos, E. coli se comporta como um comensal que coexiste em
harmonia com o hospedeiro com benefícios mútuos (NATARO, KAPER, 1998).
Contudo, a evolução do microrganismo permitiu o surgimento de vários clones,
altamente adaptados, através da aquisição de atributos específicos de
virulência comumente codificados em elementos gênicos móveis, como
plasmídeos e transposons. Os novos atributos de virulência permitiram a
adaptação a novos nichos e conferiram a capacidade de causar doenças em
hospedeiros que até então viviam em harmonia, dando origem aos patotipos de
E. coli com potencial de causar infecções extraintestinais (ExPEC) e infecções
gastrointestinais (KAPER, NATARO, MOBLEY, 2004).
O objetivo deste estudo foi identificar a capacidade invasiva de amostras
de Escherichia coli em células animas HeLa, HEp-2 e VERO.
Procedimentos metodológicos
As células HEp-2, HeLa e VERO foram cultivadas a 35ºC por 24 horas, em
garrafas de cultivo, contendo DMEM acrescido de 10% de soro fetal bovino
(SFB) e 1% de uma solução contendo os antimicrobianos: Penicilina na
concentração de 100 UI, Estreptomicina na concentração de 100 µg/mL, e
Anfotericina B na concentração de 0,25 µg/mL. A monocamada celular foi
removida com auxílio de tripsina obtendo-se suspensão celular homogênea. As
células foram distribuídas em cada orifício da placa de cultivo de 96 poços para
o teste de invasão. A placa foi incubada a 35ºC por 24 a 48 horas, até atingir
100% de confluência, sob atmosfera de 5% de CO2, em estufa apropriada
(Forma Scientific). Meio DMEM, SFB, antibiótico/antimicótico e tripsina foram
adquiridos da marca Gibco ®.
O novo protocolo criado para o teste de invasão a células de mamíferos
foi baseado ao de Sansonetti et al. (1986), com modificações, é mais adequado
sendo de menor custo e com taxas menores de contaminação durante sua
realização. O meio em que as células aderentes estavam na placa de 96 poços
foi retirado, em seguida, foi feita a lavagem de cada poço com PBS, por 5
vezes, 95µL de meio DMEM suplementado com 2% SFB foi adicionado à cada
poço, seguida de adição 5µL de bactérias e incubação por 180 minutos a 35ºC
e 5% de CO2. A placa foi lavada 3 vezes com PBS, e foram adicionados 100µL
por poço de meio DMEM com 50 a 300ug/mL de Gentamicina e a placa foi
incubada por 10 a 80 minutos a 37ºC, para eliminação das bactérias não
invasoras. A placa foi novamente lavada 3 vezes com PBS, e 50µL de Triton
1% foram adicionados em cada poço para lise celular e liberação das bactérias
invasoras. Diluição seriada e plaqueamento de cada poço foram feitos em
MacConkey, e após 18 horas em estufa a 37ºC, a contagem de colônias foi
realizada.
2
Entre as três linhagens celulares utilizadas no teste invasão, HEp-2,
HeLa e VERO, houve uma expressiva diferença na contagem de colônias por
poços, mostrando que as células VERO continham mais colônias que as
demais e estas outras duas variam conforme a amostra bacteriana utilizada. No
experimento ao total foram utilizadas 30 amostras bacterianas, sendo uma
EIEC e 29 UPEC, cada amostra foi colocada em 3 poços em uma placa de 96
poços, isto para cada célula de linhagem. Para a determinação do número de
colônias nos poços utilizou-se a média feita dos 3 poços existentes para cada
amostra bacteriana de cada célula, posteriormente, calculou-se o número de
UFC/poço através da fórmula UFC x Diluição x Fator Alíquota, sendo a diluição
utilizada igual a 10¹.
Resultados e discussão
O teste de invasão de células animais, adaptado de Sansonetti et. al. (1986) foi
realizado com células HEp-2, HeLa e VERO. Invasinas, que são fatores de
virulência que contribuem para invasão de E. coli diarreiogênicas, ainda são
pouco conhecidas para cepas extraintestinais patogênicas (MOKADY et. al.,
2004). É de essencial importância identificar ExPEC com capacidade invasiva
para um futuro estabelecimento e distinção de um modelo de infecção à célula
animal atribuído a esse patótipo.
O experimento feito demonstrou caráter invasor da cepa EIEC e de 15
(52%) cepas UPEC, considerando as cepas como invasoras quando
apresentavam %Tang (porcentagem de invasão) acima de 0,005. Esta
porcentagem de invasão é feita através do cálculo de número de bactérias
sobreviventes ao tratamento com gentamicina dividido por número de bactérias
adicionadas a monocamada de células vezes cem por cento. Nos resultados a
porcentagem de cepas invasoras em células VERO foi de 50%, em células
HEp-2 foi de 23% e em células HeLa 27%. Com as porcentagens médias de
invasão, 0,0037% para células HEp-2, 0,0035% para células HeLa e 0,018%
para VERO notou-se a grande diferença existente entre tais taxas, sendo a
porcentagem de VERO superior em cinco vezes as demais, ocasionando assim
melhores resultados para o experimento e para o método adaptado utilizado
nele.
3
Conclusão
A porcentagem de cepas invasoras em células VERO foi de 50%, em células
HEp-2 foi de 23% e em células HeLa 27%. Com as porcentagens médias de
invasão, 0,0037% para células HEp-2, 0,0035% para células HeLa e 0,018%
para VERO notou-se a grande diferença existente entre tais taxas, sendo a
porcentagem de VERO superior em cinco vezes as demais.
Referências
KAPER, J.B.; NATARO, J.P.; MOBLEY, H.L.T. Pathogenic Escherichia coli.
Nature Reviews Microbiology. v. 2, n. 2, p. 123-140, 2004.
KÖHLER, C.D., DOBRINDT, U. What defines extraintestinal Escherichia coli?
International Journal of Medical Microbiology. v. 301, n. 8, p. 642-7, 2011.
NATARO, J.P; KAPER, J.B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical
Microbiology Reviews. v. 11, n. 1, p. 142-201, 1998.
SANSONETTI, P. J. Molecular and cellular biology of Shigella flexneri
invasiveness: from cell assay systems to shigellosis. Current Topics in
Microbiology and Immunology. v.180, p. 1-19, 1992.
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