título do resumo

ANÁLISE DE ADESÃO E INVASÃO DE ESCHERICHIA COLI PATOGÊNICA
EM CÉLULAS DE LINHAGEM
Marcelly Chue Gonçalves (Bolsista PIBIC/CNPq), Paula Signolfi Cyoia, Renata
Katsuko Takayama Kobayashi, e-mail: [email protected]
Universidade Estadual de Londrina/Departamento de Microbiologia/CCB
Área e sub-área do conhecimento: Microbiologia/Microbiologia Aplicada
Palavras-chave: Escherichia coli; invasão; ExPEC.
Resumo
Escherichia coli são enterobactérias que fazem parte da microbiota de animais
homeotérmicos, incluindo determinadas porções do organismo humano.
Eventualmente, essas bactérias podem apresentar fatores de virulência, que
quando expressados são prejudiciais ao hospedeiro, como os patótipos
diarreiogênico (DEC) e extraintestinal patogênico (ExPEC). Neste projeto,
adesão e invasão em células eucarióticas foram identificados em amostras de
bactérias das categorias DEC e ExPEC. Células das linhagens HeLa (câncer
cervical) e HEp2 (câncer de laringe) foram usadas. Alta porcentagem de
aderência foi apresentada por ambos os patótipos nos dois tipos celulares.
Teste de invasão foi realizado apenas com ExPEC, no qual a porcentagem de
invasão foi mais alta em células HEp-2. A caracterização dos mecanismos de
patogenicidade e fatores de virulência de amostras bacterianas é essencial
para estabelecer melhor distinção de modelos de infecção entre diferentes
patótipos e direcionar a atuação de antimicrobianos e vacinas que futuramente
poderão ser criados.
Introdução e objetivo
Escherichia coli patogênica pode ser dividida em E. coli diarreiogênica
(DEC) e E. coli extraintestinal patogênica (ExPEC). São denominadas ExPEC
cepas isoladas de infecções fora do trato intestinal (KÖHLER, 2011), como
infecções do trato urinário (uropatogências – utilizadas neste trabalho),
septicemia ou meningite em recém-nascidos. Cepas de E. coli diarreiogênica
(DEC) também são classificadas em grupos que diferem no mecanismo de
patogenicidade e fatores de virulência usados na infecção (NATARO & KAPER,
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1998). Nessa categoria os grupos apresentam o mesmo sintoma de infecção
no hospedeiro: diarreia.
O objetivo do projeto é identificar a capacidade de aderência e/ou
invasiva de amostras dos patótipos DEC e ExPEC em células animas HeLa e
HeP-2. Sabe-se que os mecanismos de patogenicidade nos estágios de
infecção de cepas diarreiogênicas são bem elucidados no campo científico. No
entanto, para cepas extraintestinais esses ainda não são esclarecidos (KAPER
& NATARO, 2004). Adesão e Invasão são pontos cruciais da infecção celular e
o estabelecimento de doenças. Identificação da capacidade aderente ou
invasiva de patógenos é substancial para possíveis esclarecimentos quanto ao
modelo de infecção atribuída aos patógenos em questão. Essa pesquisa
direciona a caracterização de fatores de virulência, e elaboração de modelos
de infecção celular para patótipos em que esses mecanismos ainda são
obscuros, e abrindo caminhos para novos alvos para vacinas, que atuem no
processo de adesão ou invasão da bactéria na célula hospedeira.
Procedimentos metodológicos
As células HEp-2 e HeLa são cultivadas em garrafas de cultivo,
contendo
DMEM
acrescido
de
soro
fetal
bovino
(SFB;10%)
e
antibiótico/antimicótico (Penicilina na concentração de 10000 U, Estreptomicina
na concentração de 10000ug/mL, e Anfotericina B na concentração de
25ug/mL). A monocamada celular é removida com auxílio de tripsina (1%), e as
células são distribuídas em placa de cultivo de 24 poços para o teste de
invasão; já para o teste de adesão, são adicionadas lamínulas nos poços antes
da adição das células. A placa é incubada até atingir confluência apropriada
para cada teste.
O teste de aderência em células eucarióticas é realizado de acordo com
o protocolo de Cravioto et al. (1979) adaptado. As células são lavadas com
PBS (salina tamponada 0,01M) e meio DMEM suplementado com 2% SFB são
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adicionados em cada orifício da placa de 24 poços. Em seguida, cultura
bacteriana crescida por 18 horas sem agitação, é adicionada a cada orifício.
Após incubação a 35ºC durante 180 min (correspondente ao período de
infecção) em ambiente com 5% de CO2, as monocamadas celulares são
lavadas com PBS para eliminar as bactérias não aderidas as células, seguida
de nova incubação para multiplicação das bactérias aderentes. As células são
fixadas às lamínulas com a utilização de metanol, em seguida são coradas com
corantes May Grunwald e Giemsa, para observação em microscópio óptico
comum, utilizando objetiva de imersão.
O teste de invasão em células de linhagem, adaptado de Sansonetti et.
al. (1986) é realizado como o teste de aderência, a diferença se encontra após
a incubação da bactéria. Para invasão, após crescimento bacteriano, lavagem
com PBS seguida de adição de Gentamicina (50ug/mL) e nova incubação.
Após incubada, a placa é lavada com PBS, e Triton 1% é adicionado em para
lise celular e liberação das bactérias invasoras. Diluição seriada e
plaqueamento de cada poço são realizados em placas de ágar Mac Conkey, e
após 24 horas de incubação em estufa de 37ºC a contagem de colônias é
realizada.
Resultados e discussão
Aproximadamente 50 cepas de cada patótipo (DEC e ExPEC) foram
testadas para adesão. Para DEC, 72% das cepas apresentaram adesão
agregativa. Já ExPEC, 81% apresentaram adesão. Não houve diferenças de
adesão de DEC e ExPEC entre HeLa e HEp-2.
27 cepas ExPEC (aderentes) foram utilizadas para invasão, todas não
resistentes à gentamicina. 25% das cepas foram invasoras em teste com HeLa,
enquanto 46% das cepas foram invasoras em teste com HEp-2. Testes de
invasão por DEC não foram realizados, pela ausência de gene de invasão
(ipaH) nas cepas diarreiogênicas.
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Para entender as bases biológicas de invasão por ExPEC, muitos
fatores ainda devem ser esclarecidos pela comunidade científica. Já a
categoria DEC, que é bem elucidada, foi utilizada neste estudo como base de
comparações. Para cepas do grupo DEC, existem genes de virulência bem
definidos para cada estágio de infecção, um exemplo é o gene ipaH, um gene
que auxilia a invasão às células do hospedeiro. Já para ExPEC, os testes de
invasão abriram uma questão interessante quanto a diferença de invasão entre
as células desse estudo.
Conclusão
ExPEC e DEC apresentaram alta porcentagem de aderência, como era
o esperado pois a aderência é um dos primeiros estágios de infecção; HEp-2 é
mais suscetível à invasão por ExPEC quando comparada à HeLa, o que
permanece uma questão aberta para futuros estudos.
Referências
CRAVIOTO, A., R. J. GROSS, S. M. SCOTLAND, and B. ROWE. An adhesive
factor found in strains of Escherichia coli belonging to the traditional infantile
enteropathogenic serotypes. 1979. Curr. Microbiol. 3:95–99.
KAPER, J.B., NATARO, J.P., MOBLEY, H.L. Pathogenic Escherichia coli. 2004.
Nat. Rev. Microbiol. 2, 123-140.
KÖHLER, C.D., DOBRINDT, U. What defines extraintestinal Escherichia coli?
2011. Int. J. Med. Microbiol. 301(8):642-7. Doi: 10.1016/j.ijmm.2011.09.006.
Review.
NATARO, J.P. & KAPER, J.B. Diarrheagenic Escherichia coli. 1998. Clin.
Microbiol. Rev. 11, 142-201.
SANSONETTI, P.J.; RYTER, A.; CLERC, P.; MAURELLI, A.T. & MOUNIER, J.
– 1986. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the
phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect. Immun.
51: 461-469.
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