título do resumo

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PRODUÇÃO DE ÁCIDO HIALURÔNICO EM MELAÇO DE CANA DE
AÇÚCAR POR Streptococcus zooepidemicus ATCC 39920
Ana Paula Novelli (Bolsista CNPq); Hanny Cristina Braga Pereira; Maria
Antonia P. Colabone (Orientadora) [email protected]
Universidade Estadual de Londrina, Departamento de Bioquímica e
Biotecnologia/CCE)
Área e sub-área do conhecimento: Ciências Biológicas/Área: Microbiologia
Aplicada
Palavras-chave: ácido hialurônico, melaço de cana-de-açúcar, glutamina.
Resumo
O ácido hialurônico é um polissacarídeo de alta massa molar constituído
de unidades dissacarídicas de ácido D-glicurônico e N-acetilglicosamina com
características hidrofílicas e viscoelásticas. Devido as suas características,
apresenta interesse para as indústrias cosmética e farmacêutica. Este trabalho
teve como objetivo avaliar a produção de ácido hialurônico por Streptococcus
zooepidemicus ATCC 39920 utilizando o melaço de cana-de-açúcar acrescido
com acetato de sódio, glutamina, niacina, ácido oxálico e iodoacetato, por
planejamento estatístico. A maior produção de ácido hialurônico foi 0,469 g.L-1,
com 30 g.L-1 de melaço e 4 g.L-1 de glutamina. A análise dos resultados
demonstrou que acetato de sódio, niacina e iodoacetato apresentaram efeito
significativo, porém negativo (p<0,05) e suplementação de glutamina favoreceu
a produção de ácido hialurônico.
Introdução
O ácido hialurônico (AH) é um polissacarídeo linear não sulfatado que
consiste em unidades dissacarídicas polianiônicas de ácido D-glicurônico e Nacetilglicosamina, unidos alternadamente por ligações β (1→3) e β (1→4)
(LAURENT; FRASER, 1992; KOGAN, et al., 2007). Devido às suas
propriedades biológicas e físico-químicas, como elevada capacidade de
retenção de água, viscoelasticidade e biocompatibilidade, este polímero tem
sido amplamente utilizado na área de veiculação de fármacos, oftalmologia,
ortopedia, reumatologia e engenharia de tecidos (LAI et al., 2012; KOGAN et
al., 2007).
O ácido hialurônico microbiano é sintetizado como uma cápsula
extracelular e produzido como um fator de virulência por Streptococcus dos
1
grupos A e C de Lancerfield, em particular Streptococcus equi e Streptococcus
equi subespécie zooepidemicus.
A economia de um processo de fermentação industrial depende além do
micro-organismo o meio de cultivo utilizado, portanto, o objetivo deste trabalho
foi produzir ácido hialurônico por S. zooepidemicus, usando melaço de canade-açúcar, subproduto da indústria sucroalcooleira, como substrato para
fermentação e analisar o efeito de diferentes componentes no meio de cultivo
para aumentar a produção.
Procedimentos metodológicos
Microrganismo: Streptococcus zooepidemicus ATCC 39920 (CBMAI).
Meio de Preservação: Brain Heart Infusion (BHI) com 50 % v/v de glicerol.
Meio de Inoculo (g.L-1): Glicose 30; extrato de levedura 30; K2PO4 2,5; NaCl 2
e MgSO4 1,5. Cultivos a 37 ºC e 150 rpm, 6 h, inoculo a 0,2 g.L-1.
Melaço de cana-de-açúcar: Centrifugado a 9956 x g por 15 min a 4 ºC e
clarificado com 8% (m/v) de carvão ativado a 60 ºC por 1 h, filtrado.
Fermentações: Frascos de Erlenmeyer de 125 mL, contendo 25 mL dos
meios, com 30 g.L-1 de melaço e 30 g.L-1 de extrato de levedura; 2,5 de K2PO4;
2,0 de NaCl e 1,5 de MgSO4, acrescidos de acetato de sódio, glutamina,
niacina, ácido oxálico e iodoacetato (Tabela1), a 100 rpm e 37 ºC por 24 h.
Determinações Bioquímicas:
Açúcares Totais: Fenol-sulfúrico. Padrão sacarose (20 a 100 ug.mL-1).
Ácido Hialurônico: Cromatógrafo líquido de alta eficiência (CLAE) detector de
índice de refração, coluna OHpak SB-806M HQ 80×300mm, sendo NaNO3 8,5
g.L-1 a fase móvel. Padrão de AH (sigma).
Resultados e Discussão
A maior produção de AH açúcar foi de 0,469 g.L-1, com de 4 g.L-1 de
glutamina variáveis (Tabela 1), quando todos os nutrientes foram adicionados
ocorreu a menor produção (0,164 g.L-1) no ensaio 16 demonstrando que esses
fatores associados não tiveram efeito na produção.
As variáveis, acetato de sódio, niacina e iodoacetato apresentaram efeito
significativo porém negativo na produção, demonstrando que sua
suplementação reduz a produção. A Figura 1 mostra a otimização onde apenas
o aumento da glutamina foi favorável. Esse pode ser doador do grupamento
amino para a formação de UDP-acetilglicosamina, precursor do ácido
hialurônico.
2
Tabela 1. Produção de ácido hialurônico por Streptococcus zooepidemicus
ATCC 39920 por planejamento fatorial fracionado Box Hunter x Hunter 2 5-1
variando a composição do meio.
Variável
Variáveis Codificadas
Resposta
Ensaios
Ácido
x1
x2
x3
x4
x5
Hialurônico
(Y)
1
-1
-1
-1
-1
1
0,312
2
1
-1
-1
-1
-1
0,326
3
-1
1
-1
-1
-1
0,469
4
1
1
-1
-1
1
0,220
5
-1
-1
1
-1
-1
0,338
6
1
-1
1
-1
1
0,286
7
-1
1
1
-1
1
0,315
8
1
1
1
-1
-1
0,312
9
-1
-1
-1
1
-1
0,298
10
1
-1
-1
1
1
0,240
11
-1
1
-1
1
1
0,329
12
1
1
-1
1
-1
0,344
13
-1
-1
1
1
1
0,313
14
1
-1
1
1
-1
0,312
15
-1
1
1
1
-1
0,361
16
1
1
1
1
1
0,164
17
0
0
0
0
0
0,345
18
0
0
0
0
0
0,325
19
0
0
0
0
0
0,355
Níveis
Fatores
(g.L-1)
-1
0
1
Acetato de Sódio (X1)
0
10
20
Glutamina (X2)
0
2
4
Niacina (X3)
0
2
4
Ácido oxálico (X4)
0
0,2
0,4
Iodoacetato (X5)
0
0,005
0,010
3
Figura 1. Otimização da produção de ácido hialurônico por Streptococcus
zooepidemicus em melaço de cana-de-açúcar variando os nutrientes.
Conclusões
O microrganismo apresentou potencial de produção de ácido hialurônico
em melaço de cana-de-açúcar, um substrato abundante e rico em açucares. A
maior produção de ácido hialurônico foi 0,469 g.L-1 com 30 g.L-1 de melaço de
cana-de-açúcar e 4 g.L-1 de glutamina.
Agradecimentos
CNPq pela bolsa e a orientadora pelo incentivo.
Referências
KOGAN, G.; ŠOLTÉS, L.; STERN, R.; GEMEINER, P. Hyaluronic acid: a
natural biopolymer with a broad range of biomedical and industrial application.
Biotechnology Letters, v. 29, p.17-25, 2007.
LAI, Z.-W.; RAHIM, R. A.; ARIFF, B. A; MOHAMAD, R. Biosynthesis of high
weight hyaluronic acid by Streptococcus zooepidemicus using oxygen vector
and optimum impeller tip speed. Journal of bioscience and bioengineering,
v. 14, n. 3, p. 286-292, 2012.
LAURENT, T. C.; FRASER J. R. E. Hyaluronan. Faseb Journal, v. 6, p. 23972404, 1992.
4
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