0 universidade federal de pernambuco centro de ciências da saúde

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS CONTENDO
DESIDROCROTONINA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL
TACIANA LIMA SALVIANO LAPENDA
Fevereiro, 2010
Recife-PE
1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS CONTENDO
DESIDROCROTONINA E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTITUMORAL
Dissertação de mestrado submetido ao Programa de
Programa de Pós-graduação do Departamento de
Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da
Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como
pré-requisito para obtenção do grau de mestre na área
de concentração em Produção e Controle de
Medicamentos.
Mestranda: TACIANA LIMA SALVIANO LAPENDA
Orientadora: Profa. Dra. NEREIDE STELA SANTOS MAGALHÃES
Co-orientadora: Profa. Dra. MARIA APARECIDA M. MACIEL
Fevereiro, 2010
Recife – PE
2
Lapenda, Taciana Lima Salviano
Desenvolvimento e caracterização de lipossomas
contendo desidrocrotonina e avaliação da atividade
antitumoral / Taciana Lima Salviano Lapenda. – Recife:
O Autor, 2010.
115 folhas: il., tab., fig., gráf.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2010.
Inclui bibliografia e anexos.
1. Lipossomas. 2.
trans-desidrocrotonina.
3.
Complexo de inclusão de fármaco com ciclodextrina.
4. Validação. 5. Atividade antitumoral. I. Título.
615.012
615.1
CDU (2.ed.)
CDD (22.ed.)
UFPE
CCS2010-051
iii
3
4iv
Dedico esta dissertação a minha família:
aos meus pais pelo exemplo de
determinação, disciplina e força; às
minhas irmãs por toda amizade, incentivo
e carinho; e ao meu marido pelo
companheirismo, dedicação e amor
incondicional.
v5
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pelo dom da vida, pela oportunidade de realizar este
trabalho e, principalmente, por sempre estar ao meu lado;
À minha querida e amada família (Giovanni, João Alberto, Janete, Renatta e Amanda) pelo
amor, carinho, compreensão, doação, força, ensinamentos e apoio em todos os momentos
felizes e difíceis;
À Profª Drª Nereide Stela Santos Magalhães pela orientação, confiança e por todos os
ensinamentos dados desde a minha iniciação científica (2005);
À Profª Drª Maria Aparecida Medeiros Maciel pela co-orientação e confiança, essenciais no
desenvolvimento deste trabalho com a trans-desidrocrotonina (t-DCTN);
À Profª Drª Noemia Pereira dos Santos pela colaboração fundamental em todos os
experimentos in vivo e in vitro;
À todos os colegas e amigos do Grupo de Pesquisa de Sistemas de Liberação Controlada
(SLC) pela amizade e convívio durante o período do mestrado;
À aluna de iniciação científica Marcileide de Holanda pelo esforço e dedicação no
desenvolvimento dos lipossomas, mesmo quando os trabalhos eram realizados nos finais de
semana. Agradeço de coração!
Às doutoras Mariane Lira e Waldenice Alencar
pelas discussões científicas,
companheirismo e contribuições durante toda a pesquisa;
À doutoranda Milena Sales Ferraz pela convivência, pelos ―desabafos‖, apoio e
colaboração. Muito obrigada por tudo!
vi
6
Ao mestrando e amigo Fábio Fidelis pelos auxílios em vários momentos da pesquisa;
Aos alunos de iniciação científica pelo esforço na extração e reisolamento da DCTN no
Laboratório de Produtos Naturais da UFRN sob orientação da Profª Drª Maria Aparecida
Medeiros Maciel: Gineide Conceição dos Anjos, Luan Silveira Alves de Moura, Cássia
Carvalho de Almeida, Gilvani Gomes de Carvalho e Aline Maria Sales Solano;
À todos os amigos e colegas do Laboratório de Bioquímica do LIKA-UFPE pela
convivência em laboratório;
Ao Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA) e ao Centro de Tecnologias
Estratégicas do Nordeste (CETENE-PE) pelo suporte dado a este trabalho;
Ao Ministério de Ciência e Tecnologia (MCT), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq), à Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado
de Pernambuco (FACEPE), e à Pró-Reitoria de Pesquisa da Universidade de Pernambuco
(PROPESQ-UFPE) pelo suporte financeiro durante o curso deste trabalho.
A todos os colegas e amigos que de forma direta e indireta contribuíram para a realização
deste trabalho, meus sinceros agradecimentos.
vii
7
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS...........................................................................................................
ix
LISTA DE TABELAS...........................................................................................................
x
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS..........................................................................
xi
RESUMO...............................................................................................................................
xii
ABSTRACT...........................................................................................................................
xiii
1
INTRODUÇÃO.........................................................................................................
14
2
REVISÃO DE LITERATURA................................................................................
16
2.1 Câncer .................................................................................................................
16
2.1.1 Epidemiologia do câncer...........................................................................
16
2.1.2 Etiologia do câncer....................................................................................
17
2.1.3 Tratamento do câncer...............................................................................
20
2.2 Nanotecnologia e sistemas de liberação controlada........................................
20
2.3 Lipossomas.........................................................................................................
23
2.3.1 Classificação dos lipossomas....................................................................
26
2.3.2 Métodos de preparação.............................................................................
29
2.3.3 Caracterização dos lipossomas.................................................................
30
2.3.4 Liofilização de lipossomas........................................................................
31
2.3.5 Aplicações farmacêuticas..........................................................................
32
2.4 trans- Desidrocrotonina.....................................................................................
35
2.4.1 Atividade antitumoral e citotoxicidade..................................................
36
2.4.2 Mecanismos de ação da t-DCTN.............................................................
38
2.4.3 Toxicidade.................................................................................................
39
3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................
40
4 OBJETIVOS.......................................................................................................................
52
ARTIGO I
Validation
of
UV
spectrophotometric
method
for
the
determination
of
dehydrocrotonin and application in inclusion complexes with hydroxypropyl-βcyclodextrin.
Analytical Letters. Submitted…..............................................................................................
53
8
viii
ARTIGO II
Avaliação da atividade antitumoral in vivo de lipossomas contendo a transdesidrocrotonina e o seu complexo de inclusão com a hidroxipropil-β-ciclodextrina
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. A ser submetido........................................
74
5 CONCLUSÕES.................................................................................................................
110
6 PERSPECTIVAS...............................................................................................................
111
ANEXOS
ANEXO I
Carta de aprovação do comitê de ética para o estudo in vivo.....................................
113
ANEXO II
Resumos enviados para congressos....................................................................
114
9ix
LISTA DE FIGURAS
INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
Figura 1 - Tipos de câncer mais incidentes, estimados para 2010 e válidos para 2011, na
população brasileira, exceto pele não melanoma......................................................................
17
Figura 2 - Formação do câncer................................................................................................. 18
Figura 3 - Disseminação de células tumorais (metástase)........................................................ 19
Figura 4 - Ilustração do tamanho de pequenas estruturas....................................................
21
Figura 5- Sistemas de liberação controlada de medicamentos................................................. 22
Figura 6 – Farmacocinética comparativa de formas farmacêuticas convencionais e de
liberação controlada..................................................................................................................
23
Figura 7 – Esquema ilustrativo de um lipossoma, que pode conter fármacos hidrofílicos no
vacúolo aquoso, enquanto fármacos hidrofóbicos ficam retidos na bicamada lipídica............
24
Figura 8 – Estrutura do fosfolipídio.........................................................................................
25
Figura 9 - Classificação dos lipossomas quanto ao tamanho e ao número de lamelas............
26
Figura 10 - Classificação dos lipossomas quanto à constituição. A- Lipossomas
convencionais. B- Lipossomas sítio-específicos. C- Lipossomas furtivos. D- Lipossomas
direcionados de longa circulação. E- Lipossomas polimórficos : 1- lipossoma sensível ao
pH ; 2- lipossoma catiônico.......................................................................................................
27
Figura 11 - Estrutura química da trans-Desidrocrotonina........................................................ 35
10x
LISTA DE TABELAS
INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA
Tabela 1 - Análises de lipossomas e métodos analíticos..........................................................
31
Tabela 2 – Formulações lipossomais aprovadas ou sobre avaliação para uso
clínico........................................................................................................................................
34
xi
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIPC- Agência Internacional para a Pesquisa do Câncer
CE- carcinoma de Erlich (tumor ascítico)
CHO-K1- células ovarianas de hamster chinenes
DE50 – Dose terapêutica efetiva para 50% dos animais
DL50 – Dose letal para 50% dos animais
DNA – Ácido desoxirribonucléico
DSC – Calorimetria exploratória diferencial
HL 60- Células promielocíticas leucêmicas
HPβCD – 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina
INCA- Instituto Nacional do Câncer
i.p. – via intraperitoneal
CI50 - Concentração do fármaco que inibe 50% da atividade enzimática
LC – lipossomas contendo complexo de inclusão HPβCD: t-DCTN
LD - lipossomas contendo t-DCTN
LUV- vesículas unilamelares grandes (large unilamellar vesicle)
MLV- vesículas multilamelares (multilamellar vesicles)
NK- células natural killer
nm- nanômetro
OMS- Organização Mundial de Saúde
pH – Potencial hidrogeniônico
RMN – Ressonância magnética nuclear
S-180- Tumor ascítico sarcoma-180
s.c. – via subcutânea
SH- grupamentos sulfidrilas
SUV-vesículas unilamelares pequenas (small unilamellar vesicles)
t-DCTN – trans-desidrocrotonina
Tc- Temperatura de transição de fase
v.o. – via oral
V79- células fibroblástica pulmonares de Hamsters chineses
α-TNF- fator de necrose tumoral (tumour necrosis factor-α)
12
xii
RESUMO
A trans-desidrocrotonina (t-DCTN), um diterpeno do tipo 19-nor-clerodano, é o
componente majoritário isolado da espécie Croton cajucara. A literatura relata várias
atividades farmacológicas para a t-DCTN , dentre as quais a atividade antitumoral merece
destaque. Entretanto, a sua baixa solubilidade em água e hepatotoxicidade restrigem a sua
aplicação terapêutica. Uma alternativa bastante promissora para diminuir o efeito tóxico e
otimizar a ação antitiumoral da t-DCTN é a encapsulação deste bioativo em lipossomas. No
presente estudo, um método espectrofotométrico UV foi desenvolvido e validado de acordo
com os parâmetros do ICH para determinação da t-DCTN em complexos de inclusão com
hidroxipropil-β-ciclodextrina (t-DCTN:HPβCD). Lipossomas contendo a t-DCTN (LD) e o
seu complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD (LC) foram obtidos pelo método de formação
do filme lipídico seguido de sonicação e submetidos a avaliações de estabilidade a curto e
a longo prazo e estudos de cinética de liberação in vitro. A atividade antitumoral das duas
formas lipossomais também foi avaliada contra o tumor ascítico Sarcoma 180 em
camundongos Swiss. Além disso, análises histopatológicas e hematológicas foram
efutuadas. A t-DCTN em acetonitrila exibiu um pico máximo de absorção (max) em 234
nm. A faixa de linearidade foi de 1–20 µg mL-1 e a equação de regressão da curva padrão
foi A = -0.00147 + 0.04214C, com coeficiente de correlação ≥ 0.99987 (n = 6). O método
foi robusto, preciso e exato. Após o processo de fabricação, todas as formulações
lipossomais apresentaram-se homogêneas, esbranquiçadas, translúcidas com reflexo
azulado. O tamanho médio das vesículas de LD e LC foi respectivamente 78,67 ± 6,51nm e
77,33 ± 3,00 nm. O índice de polidispersão de LD e LC foi de 0,30 e 0,33 respectivamente.
Os potenciais zeta de LD e LC foram, na correspondente ordem, +39,94 ± 2,62 mV e
+36,27 ± 1,98 mV. As quantidades t-DCTN e do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD
encapsuladas foram equivalentes a 1 mg/mL do fármaco, a eficiência de encapsulação de
LD foi de 95,0 ± 3,8 %, enquanto que a de LC foi de 91,1 ± 5,6%. Observou-se que as
formulações LD e LC mantiveram-se estáveis após 120 dias e após serem submetidas aos
testes de agitação mecânica e de centrifugação. No que se refere a cinética de liberação in
vitro, os perfis apresentaram uma boa correlação com o modelo fickiano, indicando que a
difusão está envolvida no mecanismo de liberação. Um efeito burst (25%), tanto para
LD quanto para LC, ocorreu nas primeiras 2 h de liberação, seguida de uma liberação
gradual constante nas primeiras 8 h, atingindo um máximo de fármaco liberado para tDCTN de 95% e para t-DCTN:HPβCD de 98% dentro de 96 h. Em relação a inibição
tumoral, LD e LC apresentaram as respectivas inibições tumorais de 79,4 ± 9,6% e 63,5 ±
5,5%. Na análise histopatológica, observou-se poucas alterações no fígado dos animais
tratados com LD e com LC. Os achados hematológicos, por sua vez, não mostram qualquer
efeito relacionado ao tratamento e não há diferença significativa em relação ao grupo
controle. Os resultados mostram que o desenvolvimento das formulações lipossomais
contendo a t-DCTN e o seu complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD consiste num
importante avanço na terapêutica deste fármaco, repercutindo em um impulso técnicocientífico, podendo ser uma alternativa em potencial no combate ao câncer.
Palavras-chave: Lipossomas, trans-desidrocrotonina, complexo de inclusão de fármaco
com ciclodextrina , validação, atividade antitumoral.
13
xiii
ABSTRACT
The trans-dehydrocrotonin (t-DCTN), a 19- nor-clerodane diterpene, is the major
component obtained from Croton cajucara. The literature reports several pharmacological
activities for the t-DCTN, such as antitumor activity. However, its lower water solubility
and hepatotoxicity limit its therapeutic application. Development of t-DCTN-loaded
liposomes could be a promising alternative to reduce toxic effects and to optimize the
antitumor activity of t-DCTN. In this study, a spectrophotometric UV method was
developed and validated for various parameters according to ICH guidelines and applied
for the estimation of t-DCTN in hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) inclusion
complexes (t-DCTN:HP-β-CD). t-DCTN-loaded liposomes (LD) and its inclusion
complexes t-DCTN:HP-β-CD-loaded liposomes (LC) were prepared by the thin film
hydration technique. Lipossomal formulations were evaluated using standart stability tests
and in vitro kinetic. Antitumor activity of t-DCTN-loaded liposomes and t-DCTN:HP-βCD-loaded liposomes were investigated against Sarcoma 180 in Swiss mice. Additionally,
histopathological and haematological analyses were carried out. The t-DCTN in acetonitrile
exhibited a maximum absorption peak (max) at 234 nm. The standard curve of absorbance
(A) versus t-DCTN concentration (C) was prepared in the range of 1–20 µg mL-1. The
regression equation for the t-DCTN standard curve was A = -0.00147 + 0.04214C with a
correlation coefficient ≥ 0.99987 (n = 6). The precision, accuracy and robustness of the
method were satisfactory. After the manufacture process, all liposomal formulations were
uniform, white, translucent with a bluish appearance reflection. The mean size of vesicles
of LD and LC were 78,67 ± 6,51 nm e 77,33 ± 3,00 nm respectively. The surface charge of
LD was +39,94 ± 2,62 mV and of LC was +36,27 ± 1,98 mV. The amounts of t-DCTN and
t-DCTN:HP-β-CD inclusion complex encapsulated were equivalent to 1 mg of t-DCTN, the
encapsulation efficiency of LD was 95,0 ± 3,8 %, while LC was 91,1 ± 5,6%. It was
observed that LD and LC maintained their stability after 120 days and after mechanical
agitation and centrifugation tests. The good agreement between kinetics profiles and fickian
model indicated that the diffusion is involved on release mechanism. A burst effect (25%),
for both LD and for LC, occurred in the first 2 h of release, this was followed with a
sustained release stage during a period of about 8 h. At present study, 95% of t-DCTN and
98% of t-DCTN:HPβCD contents were released from liposomes within 96h. In respect
to antitumor activity, LD and LC showed 79,4 ± 9,6% and 63,5 ± 5,5% of tumor inhibition
respectively. In the histopathological analyses of liver of animals treated with LD and LC
few alterations were observed. The haematological findings did not show any treatmentrelated effects and were not significantly different from control group. The results show that
the development os liposomal formulations with t-DCTN and its inclusion complexes tDCTN:HPβCD are an important advance in this drug therapy, thereby being an impulse
technical and scientific, and could be a potential alternative against cancer.
Keywords: Liposomes, trans-dehydrocrotonin, drug inclusion complex with cyclodextrin,
validation, antitumor activity.
14
1. INTRODUÇÃO
Câncer é um termo genérico usado para englobar um grupo de mais de duzentas
doenças que compartilham a característica comum de crescimento celular descontrolado, o
que leva a uma massa de células chamada de tumor. Esta é uma das doenças que mais
atinge a população mundial (KUMA; ABBAS, 2005).
Apesar da diversidade de fármacos utilizados no tratamento do câncer, a
administração sistemática de algumas dosagens destes medicamentos pode provocar efeitos
tóxicos sistêmicos, baixa biodisponibilidade do fármaco e pouca aceitação da terapia pelo
paciente. Alcançar, portanto, uma concentração terapêutica de fármacos e minimizar a
toxicidade no organismo é um problema crítico no tratamento do câncer. Avanços na
terapia do câncer estão progredindo, tanto no emprego de novos agentes quimioterápicos
como em pesquisas baseadas em novas formas de ―entregar‖ o fármaco (BRANNONPEPPAS; BLANCHETTE, 2004; RAJKAPOOR et al., 2007).
A nanotecnologia farmacêutica tem por objetivo desenvolver sistemas coloidais de
liberação controlada para a veiculação de agentes quimioterápicos na forma de
nanodispositivos. Estes sistemas podem oferecer um aumento da eficácia terapêutica,
liberação progressiva e controlada do fármaco, manutenção de níveis plasmáticos do
fármaco em concentrações constantes, diminuição expressiva da toxicidade, menor
necessidade de administrações e aumento da aceitação da terapia pelo paciente
(BRANNON-PEPPAS,1997; LO et al., 2001; VERMA et al.,2002; DUNNE et al.,2003).
Dentre os vários sistemas de liberação controlada de fármacos os lipossomas,
pequenas vesículas esféricas formadas por uma ou mais bicamadas lipídicas concêntricas
separadas por um meio aquoso, despertam grande interesse (LASIC, 1998). Tais vesículas
são consideradas excelentes nanodispositivos devido a sua flexibilidade estrutural seja no
tamanho, composição e fluidez da bicamada lipídica, como na sua capacidade de
encapsular substâncias hidrofílicas e/ou lipofílicas. Os lipossomas também são
biodegradáveis, biocompatíveis e não imunogênicos (NISHIKAWA et al., 1974; NEW,
1990; BRANDL; GREGORIADIS,1994; EDWARDS; BAEUMNER,2006).
A trans-desidrocrotonina (t-DCTN), um diterpeno do tipo 19-nor-clerodano, é o
componente majoritário isolado da espécie Croton cajucara, popularmente conhecida por
15
sacaca (AGNER et al., 1999). A t-DCTN apresenta várias atividades farmacológicas
comprovadas e correlacionadas ao uso popular da sacaca, dentre elas, antitumoral
(GRYNBERG et al., 1999; MELO et al., 2004), hipoglicêmica (FARIAS et al., 1997;
SILVA et al., 2001a), hipolipidêmica (SILVA et al., 2001a; SILVA et al., 2001b; SILVA
et al., 2001c; BIGHETTI et al., 2004), antigenotóxica (AGNER et al., 1999; AGNER et al.,
2001), antiulcerogênica (HIRUMA-LIMA et al., 1999; MELO et al., 2003; RODRÍGUEZ
et al., 2004), antiinflamatória e antinociceptiva (CARVALHO et al., 1996), antiestrogênica
(LUNA-COSTA et al., 1999) e cardiovascular (SILVA et al., 2005).
Dentre as atividades farmacológicas da t-DCTN, a atividade antitumoral merece
destaque. A atividade citotóxica da t-DCTN foi estudada em diversas células tumorais:
células fibroblásticas pulmonares de hamsters chineses (SOUZA-BRITO et al., 1998;
GRYNBERG et al., 1999; MELO et al., 2001; RODRIGUEZ; HAUN, 1999; FREIRE et
al., 2003), células promielocíticas leucêmicas (HL60) (ANAZETTI et al., 2003;
ANAZETTI et al., 2004; CORRÊA et al., 2005), hepatócitos de ratos (RODRIGUEZ;
HAUN, 1999; CORRÊA et al., 2005) e células de carcinoma de Ehrlich (MACIEL et al.,
2002a; GRYNBERG et al., 1999; MELO et al., 2004). Nos testes que avaliaram a atividade
antitumoral in vivo dois modelos de tumores experimentais ascíticos, sarcoma-180 e
Carcinoma de Erlich, foram utilizados (GRYNBERG et al.,1999; MELO et al., 2004).
Entretanto, a baixa solubilidade aquosa (36,6 ± 3,16 µg/mL a 37 ºC) (MORAIS et al, 2008)
e a hepatotoxicidade (MACIEL et al., 2002a; MACIEL et al, 2002b) da t-DCTN são fatores
limitantes da sua aplicação terapêutica (CORRÊA et al., 2005). Portanto, a diminuição do
efeito hepatotóxico, a melhora da solubilidade e da ação antitumoral da DCTN podem ser
alcançados com a incorporação desse composto em lipossomas.
Nesse contexto, este estudo pretende conciliar as vantagens da nanotecnologia
farmacêutica juntamente com a ação antitumoral do bioativo t-DCTN. Essa proposta de
trabalho foi desenvolvida para obter e caracterizar lipossomas contendo a t-DCTN e avaliar
a atividade antitumoral, in vivo e in vitro, desse novo sistema de liberação controlada.
Portanto, o presente trabalho viabiliza a ampliação dos estudos com o diterpeno clerodânico
t-DCTN com uma abordagem nanotecnológica, o que consiste num importante avanço na
terapêutica da DCTN, podendo ser uma alternativa em potencial no combate ao câncer.
16
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 - Câncer
2.1.1 - Epidemiologia do câncer
Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS) e a Agência Internacional para a
Pesquisa do Câncer (AIPC), o impacto global do câncer mais que dobrou em 30 anos.
Estima-se que, no ano de 2008, ocorreram 12,4 milhões de novos casos e 7,6 milhões de
óbitos por câncer no mundo. Destes, os mais incidentes foram o câncer de pulmão (1,52
milhões de novos casos), mama (1,29 milhões) e cólon e reto (1,15 milhões) (WORLD
CANCER REPORT, 2008). Prevê-se, que a nível mundial, o número de novos casos
aumentará para 15,5 milhões até 2030 e a mortalidade por câncer aumentará em 45% entre
2007 e 2030 (passará de 7,9 milhões para 11,5 milhões de mortes) (OMS, 2007).
Na maioria dos países desenvolvidos, o câncer é a segunda principal causa de
morte, em primeiro lugar são mortes decorrentes de doenças cardiovasculares, e os dados
epidemiológicos mostram esta mesma tendência para os países em desenvolvimento. Nas
sociedades mais ricas há uma alta incidência de tumores associados ao tabagismo e ao
estilo de vida, por exemplo, tumores de pulmão, coloretal, mama e próstata. Nos países em
desenvolvimento, mais de 25% dos tumores estão associados com infecções crônicas, por
exemplo: vírus da hepatite B (câncer de fígado), papilomavírus humano (câncer cervical) e
Helicobacter pylori (câncer de estômago) (OMS/AIPC, 2003).
No Brasil, as estimativas para o ano de 2010 e 2011 apontam para a ocorrência de
489.270 casos novos de câncer. Os tipos mais incidentes, à exceção do câncer de pele do
tipo não melanoma, serão os cânceres de próstata e de pulmão no sexo masculino e os
cânceres de mama e do colo do útero no sexo feminino (Figura 1) (Instituto Nacional de
Câncer- INCA, 2010).
17
Figura 1- Tipos de câncer mais incidentes, estimados para 2010 e válidos para 2011, na
população brasileira, exceto pele não melanoma (INCA, 2010).
A distribuição dos casos novos de câncer segundo localização primária é bem
heterogênea entre estados e capitais do país; o que fica em evidência ao observar-se a
representação espacial das diferentes taxas brutas de incidência. As regiões Sul e Sudeste,
de maneira geral, apresentam as maiores taxas, enquanto que as regiões Norte e Nordeste
mostram as menores taxas. As taxas da região Centro-Oeste apresentam um padrão
intermediário (INCA, 2010).
2.1.2- Etiologia do câncer
Câncer não é apenas uma doença, mas um termo genérico usado para englobar um
grupo de mais de duzentas doenças que compartilham a característica comum de
crescimento celular descontrolado, o que leva a uma massa de células chamada de
neoplasia ou tumor. O câncer surge de alterações cumulativas no material genético (DNA)
de células normais que sofrem transformações até se tornarem malignas (Figura 2)
(KUMAR; ABBAS, 2005; GABRIEL, 2007).
18
Figura 2- Formação do câncer (adaptado de http://www.cancervic.org.au/about-cancer/forschools/general_cancer).
As células normais apresentam mecanismos moleculares que regulam o seu
crescimento, diferenciação e morte. Nas células cancerígenas este equilíbrio é rompido por
perda no controle do crescimento celular e/ou dos mecanismos de apoptose. Todos os
processos desde a iniciação tumoral, transformação, invasão até a metástase ocorrem em
múltiplas etapas e podem envolver vários genes, por meio de mutações intragênicas,
quebras e perdas cromossômicas, amplificações gênicas, instabilidades genômicas e
eventos epigenéticos (como metilação e acetilação do DNA) (GUIMARÃES, 2007). Os
pronto-oncogenes e os genes supressores do tumor desempenham um papel fundamental no
controle do ciclo celular. Os proto-oncogenes codificam proteínas que são importantes no
controle da proliferação celular, diferenciação, controle do ciclo celular e apoptose. Os
genes supressores tumorais inibem a proliferação celular por prender a progressão através
do ciclo celular e o bloqueio da diferenciação. A iniciação e o desenvolvimento da
neoplasia estão associados a mutações nesses dois genes. Além disso, alterações em genes
envolvidos no processo de reparo do DNA, genes que codificam proteínas (tais como
proteases e enzimas capazes de perturbar tecidos) e fatores de permeabilidade vascular têm
sido mostrados por estarem envolvidos na carcinogênese (MACDONALD et al., 2005;
GUIMARÃES, 2007).
Fatores específicos incluindo agentes físicos (radiação ionizante, luz ultravioleta),
químicos (consumo do tabaco e álcool) e biológicos (vírus da hepatite B e o papilomavírus
humanos 16 e 18) também desempenham um papel fundamental nas alterações genéticas
causadoras do câncer, estimando-se que 80% dos cânceres humanos surgem em
19
consequencia da interação desses agentes com os fatores genéticos (KLUG; CUMMINGS,
2002; OMS).
O envelhecimento é outro fator que contribui para o desenvolvimento do câncer. A
maioria dos cânceres resulta de uma série de erros genéticos que ocorrem durante um
período prolongado, pela combinação do acumulo geral dos fatores de risco com a perda da
eficácia dos mecanismos de reparação do organismo, por conseguinte, a incidência de
câncer aumenta com a idade (OMS).
As neoplasias são dividas em benignas e malignas, onde a primeira é recoberta por
uma capsula fibrosa e não possui a característica de invadir tecidos circunvizinhos,
enquanto a segunda invade os mesmos e em geral geram metastase em locais mais distantes
no corpo (Figura 3). As células dos tumores malignos têm sua adesividade reduzida para
com as células vizinhas. Isto permite seu deslocamento da colônia neoplásica, dando-lhe a
capacidade de movimentação, infiltração nos tecidos normais vizinhos, penetração nos
vasos sanguíneos e capilares linfáticos e assim formam novos tumores (metástases)
(BRASILEIRO FILHO et al.,1994).
Figura 3- Disseminação de células tumorais (metástase)
http://www.cancervic.org.au/about-cancer/for-schools/general_cancer).
(adaptado
de
20
2.1.3- Tratamento do câncer
A remoção cirúrgica de um tumor e dos tecidos circunvizinhos afetados é
considerado o procedimento primário para tumores grandes o suficiente para manipular.
Entretanto, dificilmente a cirurgia é suficiente e, geralmente, é inevitável a permanência de
células residuais afetadas. Além da cirurgia, outros recursos terapêuticos podem ser usados
como a quimioterapia (WANG et al., 2008).
Na oncologia, o tratamento quimioterápico é entendido como a utilização de agentes
químicos direcionados para matar ou controlar células tumorais. Ele carrega um alto risco
devido à toxicidade das drogas e aos efeitos colaterais que essas causam, diminuindo ainda
mais a qualidade de vida do paciente. A eficácia da quimioterapia depende ainda de vários
fatores como as drogas e as doses utilizadas, a via de administração e a condição do
paciente (JAIN, 2001). Além disso, durante o percurso até o tumor, a droga pode interagir
com outros tecidos e ser metabolizada pelo organismo, comprometendo a sua
biodisponibilidade na colônia neoplásica e, por conseguinte, sua eficácia (OOYAMA et al.,
2008).
Apesar da diversidade de drogas já utilizadas no tratamento do câncer, as
dificuldades encontradas na quimioterapia convencional (efeitos tóxicos sistêmicos, baixa
biodisponibilidade do fármaco e pouca aceitação da terapia pelo paciente, por exemplo)
incentivaram pesquisadores a desenvolver novas formas de ―entregar‖ os fármacos.
Portanto, avanços na terapia do câncer estão progredindo devido ao emprego de sistemas de
liberação controlada de fármacos, os quais têm o intuito de melhorar o transporte e as
propriedades dos fármacos quimioterápicos.
2.2-Nanotecnologia e sistemas de liberação controlada
Nanotecnologia deriva, etimologicamente, da palavra grega ―anão‖. Ela pode ser
definida como a ciência e a engenharia envolvidas na concepção, síntese, caracterização e
aplicação de materiais e dispositivos cuja organização funcional, em pelo menos uma
dimensão, está na escala nanométrica (SAHOO et al, 2006). Um nanômetro (nm) é igual a
um bilionésimo de um metro ou aproximadamente a largura de 6 átomos de carbonos. Um
glóbulo vermelho e um cabelo humano tem cerca de 7.000 nm e 80.000 nm de largura
respectivamente (Figura 4). Essa tecnologia emergente é a responsável pelos avanços
21
revolucionários da medicina, genômica, comunicação e robótica (MIYAZAKI; ISLAM,
2007).
Figura 4. Ilustração do tamanho de pequenas estruturas
(http://www.ofitexto.com.brconteudoimagens.gif).
Atualmente, 95% de todas as moléculas com potencial terapêutico têm
farmacocinética e propriedades biofarmacêuticas pobres. Portanto, há uma necessidade de
desenvolver sistemas de liberação adequados, que distribuam o fármaco no sítio de ação,
sem afetar órgãos e tecidos saudáveis (KOO et al., 2005). A nanociência e a nanotecnologia
têm um enorme potencial em trazer benefícios à saúde humana, principalmente na área de
desenvolvimento de medicamentos com os nanocarreadores, promovendo uma melhoria
clara na liberação de fármacos com baixa solubilidade em água, baixa biodisponibilidade e
alta toxicidade (SAHOO et al, 2006).
Nanosistemas ou nanocarreadores são definidos como sistemas de liberação, em
tamanho nanométrico (preferencialmente de 1 a 100 nm), contendo fármacos encapsulados,
dispersos, adsorvidos ou conjugados (KOO et al., 2005).
A nanotecnologia farmacêutica conseguiu desenvolver sistemas coloidais de
liberação controlada para a veiculação de agentes bioativos na forma de nanodispositivos
(Figura 5), que podem oferecer um aumento da eficácia terapêutica, diminuição da
instabilidade e decomposição dos fármacos lábeis, diminuição expressiva da toxicidade,
possibilidade de direcionamento a alvos específicos, possibilidade de incorporação tanto de
22
substâncias hidrofílicas quanto lipofílicas nos sistemas (BRANNON-PEPPAS,1997;
LO et al., 2001; VERMA et al., 2002; ; DUNNE et al., 2003).
Figura 5- Sistemas de liberação controlada de medicamentos.
23
O principal objetivo dos sistemas de liberação controlada, por sua vez, é a liberação
progressiva e controlada do fármaco pelo condicionamento a estímulos do meio a que se
encontram, manutenção dos níveis plasmáticos do fármaco em concentrações constantes
dentro da faixa terapêutica, eliminando desta forma as variações que geralmente são
observadas no decorrer do tratamento como os efeitos tóxicos (picos além da faixa
terapêutica) e falta de efetividade (dose subterapêutica) da substância ativa (Figura 6).
Portanto, estes sistemas oferecem o uso otimizado do fármaco, uma menor necessidade de
administrações e aumento da aceitação da terapia pelo paciente (LO et al., 2001; DUNNE
et al., 2003).
Figura 6 – Farmacocinética comparativa de formas farmacêuticas convencionais e de
liberação controlada (LIRA, 2007).
2.3-Lipossomas
Das várias formas de sistema de liberação controlada de fármacos, os lipossomas
despertam grande interesse para pesquisa, aplicações analíticas e terapêutica. Eles vêm
sendo estudados há mais de 40 anos. Alec Bangham foi o pioneiro nas pesquisas com
lipossomas, essas tinham como objetivo investigar as características físicas e físicoquímicas das membranas artificiais formadas por compostos anfifílicos em soluções.
Percorreu-se um longo caminho para que os lipossomas convertessem-se de simples objetos
de pesquisa biofísica em carreadores terapêuticos de uma diversidade de agentes como
quimioterápicos, antígenos, hemoglobina e cofatores, imunomoduladores e material
genético (TORCHILIN, 2005; BATISTA et al, 2007).
24
Lipossomas são pequenas vesículas esféricas formadas por uma ou mais bicamadas
lipídicas
que
se
organizam
espontaneamente
em
meio
aquoso
(BRANDL;
GREGORIADIS,1994). Tais partículas são consideradas excelente forma de sistema de
liberação controlada de fármacos e substâncias biologicamente ativas devido a sua
flexibilidade estrutural seja no tamanho, composição e fluidez da bicamada lipídica, como
na sua capacidade de encapsular substâncias hidrofílicas e/ou lipofílicas, sendo que as
primeiras ficam no compartimento aquoso e as lipofílicas inseridas ou adsorvidas na
membrana lipídica (Figura 7). Além disso, os lipossomas também apresentam algumas
propriedades biológicas bastante atrativas: são biodegradáveis, biocompatíveis e não
imunogênicos (NISHIKAWA et al., 1974; NEW, 1990; BRANDL; GREGORIADIS,1994;
EDWARDS; BAEUMNER, 2006).
Figura 7 – Esquema ilustrativo de um lipossoma, que pode conter fármacos hidrofílicos no
vacúolo aquoso, enquanto fármacos hidrofóbicos ficam retidos na bicamada lipídica
(modificado de http://www.nano/greens.net/images/nanosorb).
Os lipossomas são constituídos principalmente por fosfolipídios, os quais podem ter
origem natural ou sintética. A estrutura química geral de um fosfolipídio tem um glicerol,
cuja três funções alcoóis são esterificadas por ácidos graxos de cadeia longa (na posição 1 e
2) e pelo ácido fosfórico (na posição 3), sendo esta última a porção polar do lipídio (Figura
8). O ácido fosfórico pode ainda ser esterificado por várias molecular orgânicas como
glicerol, colina, serina e amina, dando origem aos lipídeos mais utilizados nas formulações
25
de lipossomas como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina e fosfatidilamina,
respectivamente (VEMURI; RHODES, 1995; BATISTA et al, 2007).
Figura 8– Estrutura do fosfolipídio (modificado de
http://www.optimapharma.de/files/liposom).
Os fosfolipídios são caracterizados por uma temperatura de transição de fase (Tc),
na qual a membrana passa de uma fase gel ou ―rígida‖, onde a cadeia hidrocarbonada do
lipídio está em estado ordenado com movimentos restritos e com conformação ―trans‖, para
uma fase de cristal-líquido ou ―fluida‖, onde as moléculas ficam com grande liberdade de
movimento e os radicais hidrofílicos agrupados tornam-se completamente hidratados
(FRÉZARD et al., 2005; BATISTA et al., 2007). O comprimento, grau de insaturação e
ramificação da cadeia lipídica influenciam o valor da Tc. Portanto lipossomas compostos
por diferentes lipídios podem exibir diferentes níveis de fluidez da membrana na mesma
temperatura (VEMURI; RHODES, 1995). Por exemplo, um lipossoma formado por
dioleilfosfatidilcolina (Tc < 0 ºC) apresenta, a 25 ºC, fluidez na bicamada, resultando na
perda
do
material
encapsulado;
enquanto
que
um
lipossoma
formado
por
diestearoilfosfatidilcolina (Tc = 55 ºC), nas mesmas condições, vai se encontrar na fase gel,
com menor permeabilidade na membrana (FRÉZARD et al., 2005).
Um componente lipídico relevante, parte da maioria das formulações lipossomais, é
o colesterol. Este melhora a fluidez da bicamada lipídica, aumentando rigidez das
membranas no estado ―cristal-líquido‖ e reduzindo a rigidez e os defeitos estruturais das
membranas no estado ― gel‖. O colesterol também melhora a estabilidade da vesícula na
26
presença de fluidos biológicos como o sangue, através da redução da interação das
proteínas plasmáticas com as membranas dos lipossomas, diminuindo assim a
desestrututuração dos mesmos (VEMURI; RHODES, 1995; KIM, 2006).
Algumas preparações também possuem lipídios apresentando carga efetiva
negativa, por exemplo, fosfatidilserina e fosfatidilglicerol, ou positiva, como a
estearilamina. A presença de cargas nos lipossomas pode influenciar a taxa de incorporação
de substâncias, impedir a agregação/fusão das vesículas lipídicas por repulsão eletrostática
e modular o seu destino no organismo, por exemplo, lipossomas carregados negativamente
são mais capturados pelo baço do que os carregados positivamente (BANERJEE , 2001;
FRÉZARD et al., 2005; LIRA, 2007) .
2.3.1-Classificação dos lipossomas
O tamanho das vesículas, o número de lamelas e a composição química dos lipossomas,
ou seja, as suas características de interação com os sistemas biológicos, são as formas mais
comuns de classificação dos lipossomas (TORCHILIN, 2005).
Os lipossomas podem conter uma única ou várias bicamadas lipídicas em torno do
compartimento aquoso e, portanto são classificadas de unilamelar e multilamelar,
respectivamente. As vesículas multilamelares (MLV- multilamellar vesicles) possuem um
tamanho que varia de 500 a 5000 nm. Em relação ao tamanho, as vesículas unilamelares
podem ser pequenas ou grandes, sendo caracterizadas lipossomas unilamelares pequenos
(SUV- small unilamellar vesicles), cujo tamanho é em torno de 100 nm, e lipossomas
unilamelares grandes (LUV- large unilamellar vesicle), os quais podem ter o diâmetro
variando entre 200 e 800 nm (Figura 9) (TORCHILIN, 2005; BATISTA et al, 2007).
Figura 9- Classificação dos lipossomas quanto ao tamanho e ao número de lamelas
(LASIC, 1998).
27
De acordo com a composição química, os lipossomas podem ser classificados em
convencionais, furtivos, sítio-específicos e polimórficos (Figura 10).
Figura 10- Classificação dos lipossomas quanto à constituição. A- Lipossomas
convencionais. B- Lipossomas sítio-específicos. C- Lipossomas furtivos. D- Lipossomas
direcionados de longa circulação. E- Lipossomas polimórficos : 1- lipossoma sensível ao
pH ; 2- lipossoma catiônico (modificado de TORCHILIN, 2005).
Os lipossomas convencionais são compostos basicamente de fosfolipídeos,
colesterol e um lipídio com carga (positiva ou negativa). Eles foram os primeiros a serem
preparados sendo então conhecidos como lipossomas de primeira geração. Em
administrações intravenosas, esses lipossomas podem se associar com as opsoninas do
plasma e serem reconhecidos pelo sistema fagocitário mononuclear sendo removidos da
circulação, principalmente pelo fígado e pelo baço. O tamanho de partícula é um fator
crítico para a ativação do complemento e captura das vesículas pelos macrófagos.
Lipossomas do tipo LUV e MLV são rapidamente reconhecidos e eliminados da circulação,
enquanto que os SUV têm meia-vida mais longa. Portanto, lipossomas com diâmetro maior
que 100 nm necessitam de estratégias adicionais para prevenir a opsonização (KOO et al.,
2005; IMMORDINO et al., 2006). Esse problema levou ao desenvolvimento de lipossomas
de longa duração na circulação sanguínea, furtivos ou stealth liposomes (TORCHILIN,
2005).
Os lipossomas de longa circulação são obtidos pelo revestimento da superfície da
bicamada lipídica com componentes hidrofílicos naturais, como o monossialogangliosídeo
GM1 e fosfatidilinositol, ou com polímeros hidrofílicos sintéticos inertes e biocompatíveis,
especificamente os polietilenoglicóis (TORCHILIN, 2005; IMMORDINO et al., 2006). A
característica mais importante dos lipossomas furtivos é a prevenção da opsonização e
28
consequente diminuição da captura pelas células do sistema fagocitário mononuclear, o que
aumenta a sua biodisponibilidade.
Na tentativa de aumentar a acumulação de fármacos carreados por lipossomas nos
tecidos e órgãos alvos, a pesquisa neste campo foi focada no desenvolvimento de
lipossomas direcionados ou sítio-específicos (BATISTA et al, 2007). Anticorpos, proteínas,
peptídeos, carboidratos e folato são algumas moléculas bastante utilizadas na obtenção de
nanocarreadores direcionados. Essas moléculas ficam acopladas na superfície dos
lipossomas, sem comprometer a integridade da membrana e as propriedades do ligante,
através de ligação covalente ou pela inserção na membrana lipídica depois de serem
modificadas com resíduos hidrofóbicos. Ainda assim, apesar da melhoria visando o
aumento da eficácia, a maioria dos lipossomas sítio-específicos são acumulados no fígado
como consequencia do pouco tempo para interação entre a célula alvo e o vetor. Esse
problema levou ao aperfeiçoamento dos lipossomas sítio-específicos através da combinação
de suas propriedades com as dos lipossomas furtivos em uma só preparação, obtendo-se
então lipossomas direcionados de longa circulação (TORCHILIN, 2005; TORCHILIN,
2006; IMMORDINO et al., 2006).
Por fim, os lipossomas polimórficos são aqueles que se tornam reativos devido à
mudança na sua estrutura desencadeada por uma alteração de pH, temperatura ou carga
eletrostática. Lipossomas sensíveis ao pH são utilizados para liberar o fármaco no
citoplasma ou no tecido intersticial de tumores, visto que estes têm o pH menor que o
fisiológico. Eles são preparados com constituintes sensíveis ao pH como a
fosfatidiletanolamina (TORCHILIN, 2006; CARVALHO JR et al 2007). Os lipossomas
termo-sensíveis, por sua vez, são formados por uma mistura de lipídios que têm sua Tc um
pouco acima da temperatura fisiológica. Em locais com hipertermia, como tecidos
tumorais, há a liberação do conteúdo lipossomal (SANDIP et al., 2000). Os lipossomas
catiônicos, por sua vez, apresentam carga positiva na superfície e eles têm sido utilizados
para terapia gênica, liberando ácidos nucléicos dentro das células (TORCHILIN, 2005;
TORCHILIN, 2006; IMMORDINO et al., 2006; BATISTA et al, 2007; MAITANI et al.,
2008).
29
2.3.2- Métodos de preparação:
Hidratação do filme lipídico
Este método é mais utilizado para a obtenção de lipossomas. Primeiramente os
lipídios e o fármaco lipofílico são dissolvidos em solvente orgânico, seguido da evaporação
do solvente e formação com consequente formação do filme lipídico. O segundo passo é a
hidratação do filme com água ou solução tampão, sob agitação, promovendo a formação de
lipossomas multilamelares; caso o fármaco seja hidrofílico, ele será solubilizado no meio
aquoso (VEMURI; RHODES, 1995; GLAVAS-DODOV et al., 2005; CHRISTENSEN et
al., 2007).
Ultra-som
Preparações de MLV, normalmente, são submetidas à ação do ultra-som para a
obtenção de SUV, com a ajuda de um banho ou de uma sonda. Este é um método rápido e
resulta em lipossomas com tamanho homogêneo (VEMURI; RHODES, 1995; ANDRADE
et al., 2004; HATZI et al, 2007).
Extrusão
A extrusão é realizada pela utilização de um Prensa de French ou Membranas de
Policarbonato. Na Prensa de French os lipossomas MLV são submetidos a altas pressões
em um reservatório cilíndrico com orifício final que promove a fragmentação lipossomal
através de forças de cisalhamento, desta forma são obtidos SUV. Quando as Membranas de
Policarbonato são utilizadas há uma uniformização no tamanho das vesículas através da
passagem da formulação por membranas com diferentes diâmetros de poros que diminuem
gradativamente (FATTAL et al., 1993; DEOL; KHULLER, 1997; PIEL et al., 2006;
MAITANI et al.,2008).
Evaporação em fase reversa
Nesta técnica os lipídios são solubilizados com solvente orgânico em excesso e, em
seguida, a fase aquosa é adicionada a fase orgânica. Através de agitação mecânica vigorosa
ou por ultra-som, forma-se uma emulsão do tipo água em óleo (a/o). Posteriormente,
elimina-se todo o solvente orgânico, sob pressão reduzida, formando assim lipossomas do
30
tipo LUV com tamanho médio de 500 nm e com eficiência de encapsulação de 60-65%
(FATTAL et al., 1993; VEMURI; RHODES, 1995; PESCHKA et al.,1998).
Microfluidização
Neste método, a suspensão de lipossomas MLV é forçada a passar por um filtro de
poros calibrados sob alta pressão chegando a uma câmera de integração onde a formulação
é separada por dois canais que se encontram ao fim em alta velocidade promovendo
colisões entre as vesículas. Lipossomas SUV, com tamanho inferior a 100 nm, são obtidos
após o choque de colisões em 10 passagens. Esta técnica é fundamentada nos princípios da
dinâmica dos fluidos e é utilizada para produção de lipossomas em escala industrial
(FATTAL et al., 1993; VEMURI; RHODES, 1995; BATISTA et al, 2007).
Injeção de uma solução etanólica de lipídios
Lipossomas unilamelares pequenos também podem ser obtidos pela injeção de uma
solução lipídica de solvente miscível em água. Os lipídeos são dissolvidos em etanol e
rapidamente injetados através de uma seringa ou bomba peristáltica em um meio aquoso
sob agitação. O álcool etílico forma uma mistura azeotrópica com a água, por isso a sua
remoção não pode ser feita por processos de destilação. O etanol é eliminado por diálise ou
por filtração em gel (FATTAL et al., 1993; VEMURI; RHODES, 1995; LE ; CUI , 2006).
2.3.3- Caracterização dos lipossomas
Vários métodos de caracterização são utilizados para garantir o controle de
qualidade dos lipossomas imediatamente após a sua preparação e durante o seu
armazenamento. Os parâmetros físico-químicos utilizados para caracterização dos
lipossomas são diversos: estudos de estabilidade acelerada e a longo prazo, avaliação
macroscópica e microscópica, tamanho de partícula, índice de polidispersão, eficiência de
encapsulação e potencial zeta (SANTOS-MAGALHÃES et al., 2000, ANDRADE et al.,
2004).
No laboratório, estudos de estabilidade acelerado e a longo prazo são bastante
utilizados e ajudam na escolha da melhor formulação durante o processo de otimização. No
estudo de estabilidade acelerada, as formulações são submetidas a condições críticas
31
através de testes de centrifugação e estresse mecânico. Já no estudo de estabilidade a longo
prazo é avaliada a durabilidade das formulações. Os parâmetros avaliados neste estudo são:
eficiência de encapsulação, diâmetro da partícula e o índice de polidispersão, potencial zeta
e o pH das formulações ao longo do tempo. Os aspectos macroscópicos e microscópicos
também são empregados na avaliação deste estudo, de acordo com a presença de
aglomerados, precipitados e cristais do fármaco nas suspensões lipossomais. A morfologia
dos lipossomas pode ser determinada através da microscopia óptica e eletrônica de
varredura e de transmissão (ANDRADE et al., 2004; MORAIS et al. 2008).
A Tabela 1 resume algumas das principais análises e métodos analíticos necessários
para avaliar os lipossomas (VEMURI; RHODES, 1995; EDWARDS; BAEUMNER, 2006).
Tabela 1. Análises de lipossomas e métodos analíticos
Análises
Carga de superfície
Temperatura de transição de fase
Determinação do número de lamelas
Determinação do diâmetro e distribuição
do tamanho
Determinação da concentração da
substância encapsulada e Eficiência de
encapsulação
pH
Análise quantitativa de lipídios
Métodos Analíticos
Potencial Zeta
Calorimetria Exploratória diferencial (DSC)
Microscopia Eletrônica, Fluorescência,
31
P RMN
Espalhamento de luz dinâmica e estática,
Microscopia Eletrônica, Cromatografia de
exclusão de tamanho, Centrifugação analítica
Espectrofotometria, Espectrofluorimetria,
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência,
Métodos enzimáticos, Ultrafiltraçãocentrifugação
pHmetro
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência,
Cromatografia Gasosa, Cromatografia de
Camada Delgada, Métodos enzimáticos,
Métodos químicos (Teste de Bartlett)
2.3.4- Liofilização de lipossomas
A liofilização é um processo de remoção de água amplamente usado para aumentar
a estabilidade de vários produtos farmacêuticos, como vacinas e carreadores coloidais
(lipossomas, nanopartículas, nanoemulsões) (VEMURI; RHODES, 1995). O ciclo da
liofilização pode ser dividido em congelamento (solidificação) e secagem (sublimação do
gelo). O congelamento é a primeira etapa da liofilização e, durante esta fase, a suspensão
32
líquida é congelada e cristais de gelo da água pura são formados. No estágio de secagem,
por sua vez, ocorre a sublimação do gelo no produto congelado. No fim da sublimação um
liófilo poroso é formado e estes poros correspondem aos espaços que eram ocupados pelos
cristais de gelo (ABDELWAHED et al., 2006).
Na liofilização de lipossomas, deve-se ter algumas características desejáveis, como
por exemplo, a preservação das características físicas e químicas iniciais do produto (liófilo
uniforme, rápido tempo de reconstituição e manutenção do tamanho de partícula, índice de
polidispersão e eficiência de encapsulação) e uma longa estabilidade do liófilo
(CHRISTENSEN et al., 2007). Porém, durante o processo da liofilização, muitos estresses
podem ser gerados acarretando na desestabilização da suspensão lipossomal. Sabe-se que
durante o congelamento da amostra pode haver a agregação e fusão dos lipossomas. Além
disso, os cristais de gelo podem gerar um estresse mecânico que também desestabiliza as
vesículas. Por estas razões, excipientes especiais devem ser adicionados na suspensão
lipossomal antes do congelamento da amostra para proteger o sistema nas estapas de
solidificação e secagem. Esses excipientes são chamados de lio/crioprotetores e os mais
relatados na literatura são os açúcares: trealose, sacarose, glicose e manitol
(ABDELWAHED et al., 2006).
2.3.5- Aplicações Farmacêuticas
Devido à sua versatilidade estrutural e habilidade de incorporar fármacos
hidrofílicos e/ou lipofílicos, lipossomas se tornaram potentes carreadores para terapia
gênica, vacinas, antibióticos e antitumorais, aumentando a eficácia e reduzindo os efeitos
tóxicos dos fármacos (BATISTA et al., 2007). Os lipossomas podem ainda ser utilizados
como carreadores de agentes de contraste de diagnósticos experimentais para imagens do
fígado, baço, cérebro, sistema cardiovascular, tumores, inflamações e infecções
(TORCHILIN, 2005).
As aplicações clínicas dos lipossomas são bem conhecidas (Tabela 2). Atualmente
há no mercado várias formulações lipossomais aprovadas ou em fase de teste clínico. Uma
formulação da Anfotericina B à base de lipossomas (AmBisome ®) foi aprovada pelo FDA
para o tratamento do calazar e para o tratamento de infecções causadas por fungo
(FRÉZARD et al., 2005; IMMORDINO et al., 2006). Myocet® e Daunoxone® são
33
formulações lipossomais que têm como agentes antineoplásicos a Doxorrubicina e a
Daunorrubicina respectivamente. Uma nova formulação lipossomal de Vincristina
(Marqibo®) tem mostrado ser bastante eficaz no tratamento de linfoma não-Hodgkin. Uma
outra formulação de lipossomas convencionais contendo o agente antitumoral Lurtotecano,
denominada OSI-211™ , está na fase II de testes clínicos. Nyotran ® e Aroplatin® também
estão em fase clínica de desenvolvimento; o primeiro produto contém a Nistatina, um
antifúngico análogo da Anfotericina B, e o segundo tem como substância encapsulada um
análogo da Oxiplatina, utilizado para combater diversos tipos de câncer. DepoCyt é uma
formulação que contém Citarabina, utilizada contra leucemia linfomatosa, mielóide e
meníngea (TORCHILIN, 2005; IMMORDINO et al., 2006; BAWARSKI et al., 2008).
Lipossomas peguilados contendo a doxorrubicina (DOXIL/Caelyx ®) foi a primeira
formulação de lipossomas furtivos aprovada tanto nos Estados Unidos quanto na Europa
para o tratamento do sarcoma de Kaposi e câncer de ovário recorrente. O Doxil/Caelyx ®
também tem sido usado no tratamento de tumores sólidos em pacientes com mestástase de
carcinoma de mama, resultando no aumento da sobrevida. Lipoplatin™ é uma formulação
de lipossomas furtivos contendo cisplatina que está sendo testada clinicamente no combate
ao câncer. Lipossomas peguilados contendo Mitoxantrona (Novantrone ®), foram aprovados
pelo FDA para o tratamento de esclerose múltipla, leucemia mielóide aguda e câncer de
mama metastático (TORCHILIN, 2005; IMMORDINO et al., 2006).
34
Tabela 2 – Formulações lipossomais aprovadas ou em avaliação para uso clínico.
Fármaco
Ácido trans-retinóico
Nome do
Produto
Altragen
Análogo da oxiplatina
Anfotericina B
Annamicina
Cisplatina
Citarabina
Compostos de platina
Daunorrubicina
Doxorrubicina
Aroplatin
AmBisome
Lipoplatin
Depocyt
Platar
DaunoXome
Doxil/Caelyx
Indicações
Sarcoma de Kaposi, carcinoma de células
renais, leucemia pró-mielocítica, linfoma
não-Hodgkin
Câncer coloretal
Leishmaniose, infecções fúngicas
Tumores resistentes a doxorrubicina
Vários tipos de câncer
Leucemia linfomatosa, mielóide e meníngea
Tumores sólidos
Sarcoma de Kaposi
Sarcoma de Kaposi, câncer de ovário,
câncer de mama recorrente
Câncer de mama
Vários tipos de tumores
Melanoma metastásico
Doxorrubicina
Myocet
Gene E1A
Allovectin-7
HLA-B7 e 𝜶-2microglobulina
codificadas em DNA
de plasmídeo
Lutortecano
OSI-211
Câncer de ovário, cabeça e pescoço.
Nistatina
Nyotran
Infecções fúngicas
Paclitaxel
MBT-0206
Câncer de mama
Vincristina
Marqibo
Linfoma não-Hodgkin
Fontes : TORCHILIN et al,. 2005; IMMORDINO et al., 2006; BAWARSKI et al., 2008.
Anticorpos monoclonais que reconhecem antígenos da superfície do tumor foram
adicionados à superfície de lipossomas de longa duração contendo Doxorrubicina (Doxil ®)
e um aumento da citotoxicidade desses lipossomas sítio-específicos foi constatado por
Lukyanov et al. (2004) nas células cancerígenas .
Na área dermocosmética, os lipossomas vêm sendo utilizados para aumentar a
incorporação de substâncias ativas às células (MAGDASSI, 1997; HAYWARD; SMITH,
1990; SUZUKI; SAKON, 1990). Eles têm sido empregados na prevenção da queda de
cabelos, promoção do crescimento capilar, desaceleração do processo de envelhecimento da
pele, clareamento da pigmentação cutânea e prevenção e tratamento da lipodistrofia ginóide
(celulite) (DI SALVO, 1996; SUZUKI; SAKON, 1990). A primeira formulação em
produtos de cosméticos foi preparada em 1986 pelo Laboratório da Christian Dior em
colaboração com o Instituto Pasteur (BANGHAM, 1995).
35
2.4- trans-Desidrocrotonina (t-DCTN)
Várias plantas têm sido tradicionalmente utilizadas por populações em todos os
continentes no controle e combate a várias doenças. Dentre as famílias de plantas
medicinais, destaca-se a Euphorbiaceae, amplamente distribuída na região amazônica. O
gênero Croton pertence a esta família e, no Brasil, há mais de 300 das 700 espécies desse
gênero. Uma das espécies mais conhecidas no Norte do Brasil é o Croton cajucara,
conhecida popularmente por sacaca, que significa feitiço na língua tupi (COSTA et al.,
2007).
Em Belém, as folhas e cascas do caule do Croton cajucara são utilizadas na medicina
popular na forma de chá ou pílula e em muitos casos essa planta é usada sem nenhum
controle ou recomendação médica. Farmacoetnologicamente a sacaca é indicada para
combater diarréia, malária, febre, problemas estomacais, inflamação do fígado, rins,
vesícula e no controle da diabetes e dos níveis de colesterol. Além disso, o pó das folhas é
comercializado com indicação para dietas de emagrecimento (MACIEL et al., 2000;
MACIEL et al., 2002 a).
Estudos fitoquímicos mostraram que a casca do caule da sacaca é uma rica fonte de
diterpenos do tipo clerodano, sendo a trans-desidrocrotonina (t-DCTN) (Figura 11) o
componente isolado com maior rendimento e com ações biológicas mais eficazes.
O
O
O
H
O
H
Figura 11 - Estrutura química da trans-Desidrocrotonina.
A literatura relata várias atividades farmacológicas para a t-DCTN: antitumoral
(GRYNBERG et al., 1999; MELO et al., 2004), hipoglicêmica (FARIAS et al., 1997;
SILVA et al., 2001a), hipolipidêmica (SILVA et al., 2001a; SILVA et al., 2001b; SILVA
36
et al., 2001c; BIGHETTI et al., 2004), antigenotóxica (AGNER et al., 1999; AGNER et al.,
2001), antiulcerogênica (HIRUMA-LIMA et al., 1999; MELO et al., 2003; RODRÍGUEZ
et al., 2004), antiinflamatória e antinociceptiva (CARVALHO et al., 1996), antiestrogênica
(LUNA-COSTA et al., 1999) e cardiovascular (SILVA et al., 2005). Com o intuito de
elucidar o mecanismo de ação da t-DCTN, derivados semi-sintéticos da molécula estão
sendo desenvolvidos e utilizados em estudos que objetivam a avaliação da relação
estrutura/atividade biológica da t-DCTN (MACIEL et al., 2000; MELO et al., 2001; MELO
et al., 2003; ANAZETTI et al., 2003; MELO et al., 2004; ANAZETTI et al., 2004).
2.4.1- Atividade antitumoral e citotoxicidade
Dentre as atividades farmacológicas da t-DCTN, a atividade antitumoral merece
destaque. Grynberg et al. (1999) avaliou a ação antitumoral deste bioativo em camudongos
fêmeas DBA/2 em dois modelos experimentais de tumores ascíticos, sarcoma-180 (S-180)
e carcinoma de Erlich (CE), nas respectivas doses de 84 mg/kg (2 dias consecutivos) e 120
mg/Kg (3 dias consecutivos). O aumento do tempo de sobrevida dos camundongos tratados
com a t-DCTN comparado com o grupo não-tratado (T/C%) foi determinado para avaliar
esta atividade (T/C% ≥ 125, atividade antitumoral significativa). Após administração
intraperitoneal (i.p.), a t-DCTN apresentou atividade contra S-180 e CE, obtendo
respectivamente T/C% de 128 e 140. Adicionalmente a este estudo, foi verificada a indução
do fator de necrose tumoral (α-TNF) após tratamento dos animais com t-DCTN. Uma
significante atividade do α-TNF (p < 0.05) foi obtida no sobrenadante ascítico após o
tratamento com a t-DCTN na dose de 120 mg/kg. Este resultado sugere que a prolongação
no tempo de sobrevida dos camundongos tratados com a t-DCTN pode ser devido a morte
direta do tumor causada pelo aumento da secreção do α-TNF na área de crescimento celular
da neoplasia.
Melo et al. (2004) utilizaram camundongos machos BALB/c com tumor ascítico de
Erlich para testar o efeito antitumoral da t-DCTN com doses de 2,5 a 20 mg/kg de peso.
Após quatro administrações consecutivas da t-DCTN i.p., na dose de 20 mg/kg, a sobrevida
dos animais apresentou um significante aumento de 80%. O efeito da desidrocrotonina na
atividade das células natural killer (NK) nos camundongos também foi avaliado com o
objetivo de determinar uma possível ação imunomoduladora. Os resultados demonstraram
37
que a t-DCTN (20 mg/kg) induziu de forma significativa (p < 0.05) a atividade esplênica de
células NK, apesar de não ser observada esplenomegalia nos animais. Portanto a t-DCTN
age indiretamente por imunomodulação na redução do tumor.
O efeito da citotoxicidade da t-DCTN foi avaliado em diversas linhagens de células
tumorais: células tumorais de Ehrlich (GRYNBERG et al., 1999; MACIEL et al., 2002a;
MELO et al., 2004), células promielocítica leucêmica (HL60) (ANAZETTI et al, 2003;
ANAZETTI et al., 2004; CORRÊA et al., 2005), células fibroblástica pulmonares de
Hamsters chineses (V79) (SOUZA-BRITO et al., 1998; RODRÍGUEZ; HAUN, 1999;
MELO et al., 2001; FREIRE et al., 2003), hepatócitos de ratos (RODRÍGUEZ ; HAUN,
1999; CORRÊA et al., 2005).
O efeito citotóxico da t-DCTN verificado em células tumorais de Erlich mostrou
uma redução da viabilidade celular com CI50 (concentração da droga que inibe 50% da
proliferação celular) de 52,2 μg/mL (16 μM) (GRYNBERG et al., 1999). Nas células
promielocíticas leucêmicas e em células mononucleares sanguíneas humanas este bioativo
causou diferenciação celular e indução de apoptose por inibição de fosfatase nas células
HL60 e baixa toxicidade nas células sanguíneas (ANAZETTI et al, 2003; ANAZETTI et
al., 2004, CORRÊA et al., 2005). Em células fibroblásticas pulmonares de hamsters
chineses a CI50 da desidrocrotonina foi de 240 μM (SOUZA-BRITO et al., 1998). Em
hepatócitos de ratos uma toxicidade seletiva foi observada após tratamento subcrônico com
a t-DCTN (8 μM) (RODRÍGUEZ ; HAUN, 1999). No estudo de citotoxicidade bacteriana
com a Escherichia coli este diterpeno, por sua vez, não mostrou nenhum efeito tóxico
(MELO et al., 2001). Poersch et. al (2007) verificou que o efeito citotóxico da t-DCTN em
diferentes concentrações (400, 320, 240, 160 e 80 μM) em células ovarianas de hamster
chinenes (CHO-K1) é discreto e não houve indução de apoptose, mas foi observado necrose
celular com as concentrações de 320 e 400 μM de t-DCTN devido a um aumento na
formação de radicais livres, proporcional a concentração desse bioativo. Com o intuito de
controlar a liberação da t-DCTN, complexos de inclusão da desidrocrotonina com a βciclodextrina foram obtidos. A citotoxicidade destes complexos foi testada em células de
V79 e cultura de hepatócitos, observando-se uma diminuição da mesma (CORRÊA et al,
2005).
38
2.4.2- Mecanismo de ação da t-DCTN
Estudos da relação estrutura/atividade de lactonas sesquiterpênicas mostraram que
três grupos químicos são essenciais para a atividade antitumoral: a α-metileno-γ-lactona , a
ciclopentanona α-β-insaturada e o sistema O=C-C=CH2, este último funciona como um
centro alquilante (GIORDANO et al., 1992).
Kupchan et al. (1971) mostraram que o grupamento α-metileno-γ-lactona participa
das reações do tipo Michael com moléculas biológicas e inativa enzimas chaves. A
presença da lactona na estrutura química da t-DCTN é essencial para a atividade
antitumoral in vivo, já que a abertura deste anel provocou a perda desta atividade da
molécula (MELO et al, 2004).
Além disso, o grupo eletrofílico O=C-C=CH2 da t-DCTN pode interagir com
biomoléculas, fazendo ligações com grupamentos sulfidrilas (SH) de proteínas e bases
nitrogenadas, principalmente com a guanidina por ataque eletrofílico (MELO et al, 2001).
Anazzetti et al. (2004) sugerem também que este componente da t-DCTN pode reagir com
o oxigênio molecular, formando peróxido de hidrogênio e, consequentemente, alterando o
equilíbrio intracelular de oxi-redução. O estresse oxidativo provocado por esta reação
representa um importante papel na citotoxicidade da t-DCTN. De acordo com Pallardy et
al. (1997), se os radicais livres estiverem em baixas concentrações, a apoptose pode ser
induzida em diferentes tipos de células, enquanto que em altas concentrações pode ocorrer
a necrose.
A subunidade ciclopentanona α-β-insaturada também é essencial para a atividade
antitumoral da t-DCTN, já que esse grupo reativo é capaz de se ligar a receptores celulares
que induzem o aumento da atividade de enzimas de ―fase II‖, como por exemplo as
glutationas s-transferases, responsáveis pela metabolização de compostos xenobióticos.
Como a t-DCTN possui esta espécie química eletrofílica reativa, provavelmente ocorre
interação química com biomoléculas que favorem sua atividade antitumoral (GRYNBERG
et al., 1999).
O mecanismo de ação da atividade antitumoral da t-DCTN não está totalmente
elucidado. No entanto, avanços foram obtidos, tendo sido evidenciado necrose em células
ovarianas de hamster chineses (POERSCH et al, 2007), apoptose e uma possível ação
39
imunomoduladora pelo aumento de células NK após o tratamento em animais com
carcinoma de Erlich (CORRÊA et al., 2005; MELO et al., 2004).
2.4.3- Toxicidade
Quanto à toxicidade subaguda da t-DCTN, um ensaio foi realizado em ratos Wistar
adultos de ambos os sexos, em que a t-DCTN foi administrada diariamente por via oral
(v.o) (25, 50 e 100 mg/Kg) durante 35 dias. Após esse período, foi observado um aumento
do peso do fígado de todos animais que receberam doses mais elevadas. Uma redução nos
níveis de fosfatase alcalina e colesterol e um aumento da γ-glutamil transpeptidase foram
observados em ratas que receberam doses 100 mg/Kg desse bioativo. Algumas alterações
histopatológicas no fígado foram causadas pela t-DCTN que incluiu tumefação turva,
degeneração microvacuolar e alterações nucleares (RODRÍGUEZ et al., 2004).
Maciel et al. (2000) estudaram a toxicidade aguda da t-DCTN por um período de
72h após administração oral. A DL50 da DCTN foi de 555mg/Kg (v.o.) em camundongos e
a DE50 dez vezes menor. Nenhum sintoma de ação tóxica ao sistema nervoso central foi
detectado. Souza-Brito et al. (1998) também avaliaram a toxicidade aguda da t-DCTN em
camundongos Swiss machos. Após jejum de 12 h, os animais receberam tratamento com a
t-DCTN por via oral (125, 250, 500, 750 e 1000 mg/Kg) e intraperitoneal (25, 31, 62,5,
125, 250 e 500 mg/Kg). O número de animais sobreviventes foi monitorado por 14 dias. Os
resultados monstraram a baixa toxicidade da t-DCTN, com valores de DL50 de 876 mg/Kg
(12 h) e 47,2 mg/Kg para via oral e intraperitoneal respectivamente.
Apesar dos estudos de toxicidade aguda e subaguda da t-DCTN, o uso indevido de
folhas da sacaca na medicina popular pode provocar efeitos hepatotóxicos irreversíveis.
Casos de hepatite aguda, crônica e fulminante foram notificados na região Amazônica em
pacientes que fizeram uso da sacaca em dietas de emagrecimento e na redução do colesterol
(MACIEL et al., 2002 a; MACIEL et al.,2002 b; SOARES, 2004; MACIEL et al., 2006;).
Uma alternativa bastante promissora para diminuir os efeitos tóxicos e otimizar a
ação antitiumoral da t-DCTN é a encapsulação deste composto em lipossomas. O uso de
lipossomas como carreadores de fármacos antineoplásicos é estratégico para alcançar a
acumulação seletiva do fármaco no tecido onde se encontra o tumor ou nas células
40
tumorais, visto que eles alteram a farmacocinética e biodistribuição do fármaco (MAMOT
et al., 2003).
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABDELWAHED, W.; DEGOBERT, G.; STAINMESSE, S.; FESSI, H. Freeze-drying of
nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Adv. Drug Deliv. Rev.,
v.58, p. 1688– 1713, 2006.
AGNER, A.R.; MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; CÓLUS, I.M.S. Antigenotoxicity of
trans-dehydrocrotonin, a clerodane diterpene from Croton cajucara. Planta Med. v. 67, p.
815-819, 2001.
AGNER, A.R.; MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; PAMPLONA, S.G.S.R.; CÓLUS, I.M.S.
Investigation of genotoxic activity of trans-dehydrocrotonin, a clerodane diterpene from
Croton cajucara. Teratogen. Carcin. Mut. v. 19, p. 377-384, 1999.
ANAZETTI, M.C.; MELO, P.S.; DURÁN, N.; HAUN, M. Comparative cytotoxicity of
dimethylamide-crotonin in the promyelocytic leukemia cell line (HL60) and human
peripheral blood mononuclear cells. Toxicology v.188, p. 261-274, 2003.
ANAZETTI, M.C.; MELO, P.S.; DURÁN, N.; HAUN, M. Dehydrocrotonin and its
derivative, dimethylamide-crotonin induce apoptosis with lipid peroxidation and activation
of caspases-2, -6 and -9 in human leukemic cells HL60. Toxicology v. 203, p. 123-137,
2004.
ANDRADE, C.A.S., CORREIA, M.T.S., COELHO, L.C.B.B., NASCIMENTO, S.C.,
SANTOS-MAGALHÃES, N.S. Antitumor activity of Cratylia mollis lectin encapsulated
into liposomes. Int. J. Pharm. v. 278, p. 435-445, 2004.
41
BANERJEE, R. Liposomes: aplications in medicine. J. Biomat. Applied, v. 16, p. 3-21,
2001.
BANGHAM, A.D. Surrogate cells or Trojan horses. The discovery of liposomes.
Bioessays. v.17, p.1081-1088, 1995.
BATISTA, C.M.; CARVALHO, C.M.B.; SANTOS-MAGALHÃES, N.S. Lipossomas e
suas aplicações terapêuticas: Estado da arte. Rev. Bras. Cienc. Farm. v. 43, p 167-179,
2007.
BAWARSKI, W.E.; CHIDLOWSKY, E.; BHARALI, D.J.; MOUSA, S.A. Emerging
nanopharmaceuticals. Nanomed.: Nanotec. Biol. Med.,v. 4, p. 273–282, 2008.
BIGHETTI, E.J.B.; SOUZA-BRITO, A.R.M.; DE FARIA, E.C.; OLIVEIRA, H.C.F.
Chronic treatment with bark infusion from Croton cajucara lowers plasma triglyceride
levels in genetic hyperlipidemic mice. Can. J. Physiol. Pharmacol. v. 82, p. 387-392,
2004.
BRANDL, M.; GREGORIADIS, G. Entrapment of hemoglobin into liposomes by the
dehydratation-rehydratation method: vesicles characterization and in vivo behavior.
Biochim. Biophys. Acta - Biomembranes v.1196, p. 65-75, 1994.
BRANNON-PEPPAS, L.; BLANCHETTE, J.O. Nanoparticle and targeted systems for
cancer therapy. Adv. Drug Del. Rev. v. 56, p. 1649-1659, 2004.
BRANNON-PEPPAS, L.B. Polymers in controlled drug delivery. Medical plastics and
biomaterials
magazine,
1997.
www.devicelink.com/mpb/archive/97/11/003.html.
Disponível
em:
42
BRASILEIRO FILHO, G., PITTELLA, J.E.H.; PEREIRA, F.E.L.; BABIRRA, E.A.;
BARBOSA, A.J.A. Bogliolo Patologia. Ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro-RJ, 5ª ed.,
p.153-186, 1994.
CARVALHO, J.C.T.; SILVA, M.F.C.; MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; NUNES, D.S.;
LIMA, R.M.; BASTOS, J.K.; SARTI, S.J. Investigation of anti-inflammatory and
antinociceptive activities of trans-dehydrocrotonin, a 19-nor-clerodane diterpene from
Croton cajucara. Part 1. Planta Med., v. 62, p. 402-404, 1996.
CARVALHO Jr, A. D.; MOTA, L.G.; NUNAN, E. A.; WAINSTEIN, A. J. A.;
WAINSTEIN, A.P.D.L.; LEAL, A. S.; CARDOSO, V. N.; OLIVEIRA, M. C. Tissue
distribution evaluation of stealth pH-sensitive liposomal cisplatin versus free cisplatin in
Ehrlich tumor bearing mice. Life Science, v. 80, p. 659-664, 2007.
CHRISTENSEN ,D.; FOGED, C.; ROSENKRANDS, I.; NIELSEN, H.M.; ANDERSEN,
P.; AGGER, E.M. Trehalose preserves DDA/TDB liposomes and their adjuvant effect
during freeze-drying. Biochim. Biophys. Acta, v. 1768, p. 2120– 2129, 2007.
CORRÊA, D.H.A.; MELO, P.S.; DE CARVALLHO, C.A.A.; DE AZEVEDO, M.B.M.;
DURÁN, N.; HAUN, M. Dehydrocrotonin and its beta-cyclodextrin complex: Cytotoxicity
in V79 fibroblasts and rat cultured hepatocytes. Eur. J. Pharmacol. v. 510, p. 17-24, 2005.
COSTA, M.P.; SANTOS-MAGALHÃES, N.S.; GOMES, F.E.S.; MACIEL, M.A.M. Uma
revisão das atividades biológicas da trans-desidrocrotonina, um produto natural obtido de
Croton cajucara. Rev. Bras. Famacog., v.17, p. 275-286, 2007.
DEOL, P.; KHULLER, G.K. Lung specific stealth liposomes: Stability,
biodistribution
and toxicity of liposomal antitubercular drugs in mice. Biochim. Biophys. Acta, v.
1334, p. 161–172, 1997.
43
DI SALVO, R. M. Controlando o surgimento da celulite. Cosm. Toil. v.8, n.4, p.56-62,
1996.
DUNNE, M.; BIBBY, D.C.; JONES, J.C.; CUDMORE, S. Encapsulation of protamine
sulphate compacted DNA in polylactide and polylactide-co-glycolide microparticles. J.
Contr. Rel., v.92, p.209-219, 2003.
EDWARDS, K. A.; BAEUMNER, A. J. Liposomes in analyses. Talanta, v. 68, p.14321441, 2006.
FARAJI, A.H.; PETER WIPF, P. Nanoparticles in cellular drug delivery. Bioorg. Med.
Chem. v.17, p. 2950–2962, 2009.
FARIAS, R.A.F.; RAO, V.S.N.; VIANA, G.S.B.; SILVEIRA, E.R.; MACIEL, M.A.M.;
PINTO, A.C. Hypoglycemic effect of trans-dehydrocrotonin, a nor-clerodane diterpene.
from Croton cajucara. Planta Med v. 66, p. 558-560, 1997.
FATTAL, E.; COUVREUR, P.; PUISIEUX, F. Méthodes de préparation des liposomes.
Les Liposomes: Aspect Tecnologiques, Biologiques et Pharmacologiques. Paris:
INSERM, 1ª ed., p.43-62, 1993.
FREIRE, A.C.G.; DE ASSIS, C.F.; FRICK, A.O.; MELO, P.S.; HAUN, M.; AOYAMA,
H.; DURÁN, N.; SAUER, M.M.; KÁLLAS, E.G; FERREIRA, C.V. Influence of protein
phosphatase inhibitors on HL60 cells death induction by dehydrocrotonin. Leukemia Res.
v. 27, p. 823-829, 2003.
FRÉZARD, F.; SCHETTINI, D.A.; ROCHA, O.G.F.; DEMICHELI, C. Lipossomas:
propriedades físico-químicas e farmacológicas, aplicações na quimioterapia à base de
antimônio. Quim. Nova, v. 28, p. 511-518, 2005.
GABRIEL, J. The Biology of Cancer. John Wiley & Sons Ltd, 2º ed., 2007.
44
GIORDANO, O.S.; PESTCHANKER, M.J.; GUERREIRO, E.; SAAD, J.R.; ENRIZ, R.D.;
RODRIGUEZ, A.M.; JAUREGUI, E.A.; GUZMÁN, J.; MARÍA, A.O.M.; WENDEL,
G.H. Structure-activity relationship in the gastric cytoprotective effect of several
sesquiterpene lactones. J. Med. Chem. v.35, p. 2452– 2458, 1992..
GLAVAS-DODOVA, M.; FREDRO-KUMBARADZIA, E.; GORACINOVAA, K.;
SIMONOSKAA, M.; CALISB, S.; TRAJKOVIC-JOLEVSKAA, S.; HINCALB, A.A. The
effects of lyophilization on the stability of liposomes containing 5-FU. Int. J. Pharm., v.
291, p. 79–86, 2005.
GRYNBERG, N.F.; ECHEVARRIA, A.; LIMA, J.E.; PAMPLONA, S.S.R.; PINTO, A.C.;
MACIEL, M.A.M. Anti-tumor activity of two 19-nor-clerodane diterpenes, transdehydrocrotonin and trans-crotonin, from Croton cajucara. Planta Med. v. 65, p. 687-689,
1999.
GUIMARÃES, J.R.Q. Manual de Oncologia. BBS Editora , São Paulo , 2º Ed., 2006.
HATZI, P.; MOURTAS, S.; KLEPETSANIS, P.G.; ANTIMISIARIS, S.G. Integrity of
liposomes in presence of cyclodextrins:Effect of liposome type and lipid composition. Int.
J. Pharm., v. 333, p. 167–176, 2007.
HAYWARD, J.A.; SMITH, W.P. Potential of liposomes in cosmetic science. Cosm. Toil.,
v.105, p.47-54, 1990.
HIRUMA-LIMA, C.A.; SPADARI-BRATFISCH, R.C.; GRASSI-KASSISSE, D.M.;
BRITO, A.R.M. Antiulceronic mechanisms of dehydrocrotonin, a diterpene lactone
obtained from Croton cajucara. Planta Med. v. 65, p. 325-330, 1999.
IMMORDINO, M.L.; DOSIO, F.; CATTEL, L. Stealth liposomes: review of the basic
science, rationale, and clinical applications, existing and potential. Int. J. Nanomed., v.1,
p. 297–315, 2006.
45
INCA (Instituto Nacional do Câncer)- Estimativa 2010- Incidência de Câncer no Brasil.
Disponível
on-line
em:
http://www1.inca.gov.br/estimativa/2010/.
Acessado
em:
10/01/2010.
JAIN, R.K. Delivery of molecular medicine to solid tumors: lessons from in vivo imaging
of gene expression and function. J. Control. Rel., v.74, p.7-25, 2001.
KIM, K.Y. Nanotechnology platforms and physiological challenges for cancer therapeutics.
Nanomed.: Nanotech. Biol. Med., v. 3, p. 103–110, 2007.
KLUG, W.S.; CUMMINGS, M.R. Essentials of Genetics. Prentice-Hall, New Jersey, 4ª
ed., 2002.
KOO, O.M.; RUBINSTEIN, I.; ONYUKSEL, H. Role of nanotechnology in targeted drug
delivery and imaging:a concise review. Nanomed.: Nanotech. Biol. Med.,v. 1, p. 193–
212 , 2005.
KUMAR, V.; ABBAS, A. As Bases Patológicas das Doenças, Ed. Elservier, Rio de
Janeiro-RJ, 7º Ed., 2005.
KUPCHAN, S.M.; EAKIN, M.A.; THOMAS, A.M. Tumor inhibitors: 69.Structurecytotoxicity relationships among sesquiterpene lactones. J. Med. Chem. v.14, p.1147–
1152, 1971.
LASIC, D. Novel application of liposomes. Trends in Biotech., v. 16, p. 307-321, 1998.
LE, U.M.; CUI, Z. Biodistribution and tumor-accumulation of gadolinium (Gd)
encapsulated in long-circulating liposomes in tumor-bearing mice for potential neutron
capture therapy. Int. J. Pharm., v. 320, p. 96–103, 2006.
46
LIRA, M.C.B. Complexo de inclusão Ácido Úsnico: -Ciclodextrina; Preparação,
Caracterização e Nanoencapsulação em Lipossomas. 2007. 90 p. dissertação (Mestrado
em Ciências Farmacêuticas) - Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade
Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, 2007.
LO, E.H.; SINGHAL, A.B.; TORCHILIN, V.P.; ABBOTT, N.J. Drug delivery to damage
brain. Brain Res. Rev., v.38, p.140-148, 2001.
LUKYANOV, A. N.; ELBAYOUMI, T. A.; CHAKILAM, A.R.; TORCHILIN, V.P.
Tumor-targeted liposomes:doxorubicin-loaded long-circulating liposomes modified with
anti-cancer antibody. J. Control. Rel., v. 100, p.135-144, 2004.
LUNA-COSTA, A.M.; SILA, J.C.R.; CAMPOS, A.R.; RAO, V.S.N.; MACIEL, M.A.M;
PINTO, A.C. Antioestrogenic effect of trans-dehydrocrotonin, a nor-clerodane diterpene
from Croton cajucara Benth in rats. Phytother. Res. v. 13, p. 689-691, 1999.
MACDONALD, F.; FORD, C.H.J.; CASSON, A.G. Molecular Biology of Cancer. Taylor
& Francis e-Library, 2ª ed., 2005.
MACIEL,
M.A.M.;
PINTO,
A.C.;
ARRUDA,
A.C.;
PAMPLONA,
S.G.S.R.;
VANDERLINDE, F.A.; LAPA, A.J.; ECHEVARRIA, A.; GRYNBERG, N.F.; CÓLUS,
I.M.S.;
FARIAS, R.A.F.;
COSTA,
A.M.L.;
RAO, V.S.N.
Ethnopharmacology,
phytochesmistry and pharmacology: a successful combination in the study of Croton
cajucara. J. Ethnopharmacol. v. 70, p. 41-55, 2000.
MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; VEIGA JR., V.F..; MARTINS, J.R.; GRYNBERG,
N.F.; ACHEVARRIA, A.; LAPA, A.J.; VANDERLINDE, F.A. Croton cajucara as an
alternative to traditional medicine in a modern health system. Phytochem. Pharmacol. II
Ser. Recent Prog. Med. Plants v. 8, p. 459-475, 2002a.
47
MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; VEIGA JR, V.F. Plantas Medicinais:a necessidade de
estudos multidiscilplinares. Quim. Nova, v. 25, p. 429-438, 2002b.
MACIEL, M.A.M.; CORTEZ, J.K.P.C; GOMES, F.S. O gênero Croton e aspectos
relevantes de diterpenos clerodanos. Revista Fitos (ALANAC) v. 2, p. 54-73, 2006.
MAGDASSI, S. Delivery systems in cosmetics. Colloids and Surfaces, v.123-124, p.
671-679, 1997.
MAITANI, Y.; ASO,Y.; YAMADA, A.; YOSHIOKA, S. Effect of sugars on storage
stability of lyophilized liposome/DNAcomplexes with high transfection efficiency. Int. J.
Pharm., v. 356, p. 69–75, 2008.
MAMOT, C.; DRUMMOND, D. C.; HONG, K.; KIRPOTIN, D.B.; PARK, J. W.
Liposome-based approaches to overcome anticancer drug resistance. Drug Res. Update, v.
6, p. 271-279, 2003.
MELO, P.S.; DURAN, N.; HAUN, M. Cytotoxicity of derivatives from dehydrocrotonin
on V79 cells and Escherichia coli. Toxicology v. 159, p. 135-141, 2001.
MELO, P.S.; DURAN, N.; HIRUMA-LIMA, C.A.; SOUZA-BRITO, A.R.M.; HAUN, M.
Comparison of the gastroprotective effect of a diterpene lactone isolated from Croton
cajucara with its synthetic derivatives. J. Ethnopharmacol. v. 87, p. 169-174, 2003.
MELO, P.S.; JUSTO, G.Z.; DURÁN, N.; HAUN, M. Natural killer cell activity and antitumour effects of dehydrocrotonin and its synthetic derivatives. Eur. J. Pharmacol. v. 487,
p. 47-54, 2004.
MIYAZAKI, K.; ISLAM, N. Nanotechnology systems of innovation—An analysis of
industry and academia research activities. Technovation, v. 27, p. 661–675, 2007.
48
MORAIS, W.A.; COSTA, M.; PAIXÃO, A.D.O.; MACIEL, M.A.M; SANTOS MAGALHAES, N.S. Encapsulation and release characteristics of
DCTN/PLGA
microspheres. J. Microencapsul. v. 1, p. 1464–5246, 2008.
NEW, R.R.C. Liposomes: A practical approach. IRL/ Oxford University Press, Oxford,
p.432, 1990.
NISHIKAWA, I; OKKI, R.; TAKAHASHI, K.; KURONO, G.; FUKUOKA, K.; EMORI,
M. Studies on water soluble constituents of lichens. II) Antitumor polysaccharides of
Lasalia, Usnea and Cladonia species. Chem. Pharm. Bull., v. 22, p. 2692-2702, 1974.
OMS
(Organização
Mundial
de
Saúde).
Disponível
on-line
em:
http://www.who.int/topics/cancer/en/ . Acessado em: 20/01/2010
OMS/AIPC (Organização Mundial de Saúde/ Agência Internacional para a Pesquisa do
Câncer).
World
Cancer
Report,
2003.
Disponível
http://www.iarc.fr/en/publications/pdfs-online/wcr/2003/index.php.
on-line
Acessado
em:
em:
26/01/2010.
OOYAMA, A.; OKA,T.; ZHAO, H.; YAMAMOTO, M.; AKIYAMA, S.; FUKUSHIMA,
M. Anti-angiogenic effect of 5-Fluorouracil-based drugs against human colon cancer
xenografts.Canc. Letters, v. 267, p. 26-36, 2008.
PALLARDY, M.; PERRIN-WOLFF, M.; BIOLA, A. Cellular stress and apoptosis.
Toxicol. in Vitro, v. 11, p. 573–578, 1997.
PESCHKA, R.; DENNEHY, C.; SZOKA JR, F.C. A simple in vitro model to study the
release kinetics of liposome encapsulated material. J. Control. Rel., v. 56, p. 41–51, 1998.
49
PIEL, G.; PIETTE, M.; BARILLARO, V.; CASTAGNE, D.; EVRARD, B.; DELATTRE,
L.
Betamethasone-in-cyclodextrin-in-liposome:
The
effect
of
cyclodextrins
on
encapsulation efficiency and release kinetics. Int. J. Pharm. v. 312, p. 75–82, 2006.
POERSCH, A.; SANTOS, F.V.; MACIEL, M.A.M; CÂMARA, J.K.P.; DANTAS, T.N.C.;
CÓLUS, I.M.S. Protective effect of DCTN (trans-dehydrocrotonin) against induction of
micronuclei and apoptosis by different mutagenic agents in vitro. Mut. Res. v. 629, p. 14–
23, 2007.
RAJKAPOOR, B.; SANKARI, M.; SUMITHRA, M.; ANBU, J.; HARIKRISHNAN, N.;
GOBINATH, M.; SUBA, V.; BALAJI, R. Antitumor and Cytotoxic Effects of Phyllanthus
polyphyllus on Ehrlich Ascites Carcinoma and Human Cancer Cell Lines. Biosc. Biothec.
Biochem., v. 71, p. 2177-2188, 2007.
RODRÍGUEZ, J.A.; HAUN, M. Cytotoxicity of trans-dehydrocrotonin from Croton
cajucara on V79 Cells and rat hepatocytes. Planta Med. v. 65, p. 522-526, 1999.
RODRÍGUEZ, J.A.; HIRUMA-LIMA, C.A.; SOUZA-BRITO, A.R.M. Antiulcer activity
and subacute toxicity of trans-dehydrocrotonin from Croton cajucara. Hum. Exp. Toxicol.
v. 23, p. 455-461, 2004.
SAHOO, S.K.; PARVEEN, S.; PANDA, J.J. The present and future of nanotechnology in
human health care. Nanomed.: Nanotech. Biol. Med., v 3, p. 20– 31, 2007.
SANDIP, B. T.; UDUPA, N.; RAO, B. S. S.; DEVI, P. U. Thermosensitive liposomes and
localised hyperthermia – an effective bimodality approach for tumour management. Ind. J.
Pharmacol., v. 32, p. 214-220, 2000.
SANTOS-MAGALHÃES, N.S.; PONTES, A.; PEREIRA, V.M.W.; CAETANO, M.N.P.
Colloidal carriers for benzantine penicillin G: nanoemulsions and nanocapsules. Int. J.
Pharm. v. 208, p. 71-80, 2000.
50
SILVA, R.M.; OLIVEIRA, F.A.; CUNHA, K.M.A.; MAIA, J.L.; MACIEL, M.A.M.;
PINTO, A.C.; NASCIMENTO, N.R.F.; SANTOS, F.A.; RAO, V.S.N. Cardiovascular
effects of trans-dehydrocrotonin, a diterpene from Croton cajucara in rats. Vascul.
Pharmacol. v. 43, p. 11-18, 2005.
SILVA, R.M.; SANTOS, F.A.; RAO, V.S.N.; MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C. Blood
glucose-and triglyceride-lowering effect of trans-dehydrocrotonin, a diterpene from Croton
cajucara Beth in rats. Diabetes Obes. Metab. v. 3, p. 452-456, 2001a.
SILVA, RM; SANTOS, FA; MACIEL, MAM; PINTO, AC; RAO, VSN. Effect of transdehydrocrotonin, a 19-nor-clerodane diterpene from Croton cajucara on experimental
hypertriglyceridaemia and hypercholesterolaemia induced by triton WR1339 (tyloxapol) in
mice. Planta Med. v. 67, p. 763-765, 2001b.
SILVA, R.M.; SANTOS, F.A.; RAO, V.S.N.; MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C. The lipidlowering effect of trans-dehydrocrotonin, a clerodane diterpene from Croton cajucara
Benth. in mice fed on high-fat diet. J. Pharm. Pharmacol. v. 53, p. 535-539, 2001c.
SINGH, R.; LILLARD JR, J.W. Nanoparticle-based targeted drug delivery. Exp. Mol.
Pathol. v. 86, p. 215-223, 2009.
SOARES, M.C.P. Would sacaca, Croton cajucara Benth (Euphorbiaceae)
hepatotoxic
plant
be
an
like Germander, Teucrium chamaedrys L. (Labiatae)? Ver. Soc.
Bras. Med. Trop., v. 37, p. 96-97, 2004.
SOPPIMATH, K.S.; AMINABHAVI, T.M.; KULKARNI, A.R.; RUDZINSKI, W.E.
Biodegradable polymeric nanoparticles as drug delivery devices. J. Control. Release v. 70,
p. 1-20, 2001.
51
SOUZA-BRITO, A.R.M.; RODRÍGUEZ, J.A.; HIRUMA-LIMA, C.A.; HAUN, M.;
NUNES, D.S. Antiulcerogenic activity of trans-dehydrocrotonin from Croton cajucara.
Planta Med. v. 64, p. 126-129, 1998.
SUZUKI, K.; SAKON, K. The application of liposomes to cosmetics. Cosm. Toil., v.
105, p. 65-78, 1990.
TORCHILIN, V.P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carrier. Nature
Rev. Drug Disc., v. 4, p. 145-160, 2005.
TORCHILIN, V.P. Multifunctional nanocarriers. Adv. Drug Deliv. Rev., v. 58, p. 1532–
1555, 2006.
VEMURI, S.; RHODES, C. T. Preparation and characterization of liposomes as therapeutic
delivery systems: a review. Pharm. Acta Helvetica, v. 70, p. 95-111, 1995.
VERMA, R.K.; KRISHNA, D.M.; GARG, S. Formulation aspects in the development of
osmotically controlled oral drug delivery systems. J. Cont. Rel., v.79, p.7-27 , 2002.
WANG, Y.; CHANG, H.I.; WERTHEIM, D.F.; JONES, A.S.; JACKSON, C.; COOMBES,
A.G.A. Characterisation of the macroporosity of polycaprolactone-based biocomposites
and release kinetics for drug delivery. Biomaterials, v. 28, p. 4619-4627, 2007.
52
4. OBJETIVOS
Objetivo geral
Obter e caracterizar lipossomas convencionais contendo o bioativo t-DCTN e o
complexo de inclusão t-DCTN:hidroxipropil-β-ciclodextrina (t-DCTN:HPβCD) que sejam
eficazes no combate ao câncer.
Objetivos específicos

Desenvolver e validar um método espectrofotométrico UV para a determinação da
DCTN no complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD;

Obter lipossomas contendo DCTN e complexo de inclusão DCTN:hidroxi-propil-β-
ciclodextrina (DCTN:HPβCD);

Realizar a caracterização físico-química dos sistemas desenvolvidos;

Determinar a taxa de encapsulação do fármaco nos lipossomas;

Realizar ensaios de cinética de liberação in vitro do fármaco a partir dos
lipossomas;

Avaliar a estabilidade acelerada e de longa duração;

Avaliar a atividade antitumoral contra sarcoma-180 em camundongos do fármaco
livre e encapsulado;

Realizar análise histopatológica do fígado e do tumor dos animais;

Realizar análise hematológica padrão dos animais tratados e não-tratados;
53
ARTIGO I
Validation of UV spectrophotometric method
for the determination of dehydrocrotonin and
application
in
inclusion
complexes
hydroxypropyl-β-cyclodextrin.
Analytical Letters. Submitted.
with
54
Validation of a UV spectrophotometric method for determining transdehydrocrotonin in inclusion complexes with hydroxypropyl-β-cyclodextrin
using acetonitrile as a solvent
Taciana Lima Salviano Lapenda1, Waldenice de Alencar Morais1, Maria Aparecida Medeiros
Maciel2, Nereide Stela Santos-Magalhães1*
1
Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami
(LIKA), Av. Prof. Moraes Rego, 1235 Cidade Universitária, Recife, PE, Brazil, 2Universidade
Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Departamento de Química, Natal, RN, Brazil.
* Corresponding author
Dr. Nereide Stela Santos-Magalhães
Universidade Federal de Pernambuco
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA)
Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária.
50670-901, Recife-PE, Brazil.
Phone: + 55 81 21012501; fax: +55 81 21012508
E-mail: [email protected]
55
Abstract
An UV method was validated for determining t-DCTN in HPβCD inclusion complex at 234
nm using acetronitile as a solvent. The regression equation of the standard curve
(1–20 µg mL-1) was [t-DCTN] = Area + 0.00147/0.04214. The precision of the method was
satisfactory, producing values of relative standard deviation less than 2% for the all samples
analyzed. The accuracy, determined from recovery studies, was between 99.6 and 100.02%.
The content of t-DCTN in t-DCTN: HPβCD was 99.8%. The UV validated method was
practical and is suitable for use in the routine analysis of t-DCTN using acetonitrile as a
solvent.
Keywords: trans-Dehydrocrotonin; UV spectrophotometry; Validation; Hydroxypropyl-βcyclodextrin; Inclusion complex.
56
1. Introduction
The diterpene 19-nor-clerodane trans-dehydrocrotonin (t-DCTN) (Fig. 1) is the major
component isolated from the stem bark of the brazilian medicinal plant Croton cajucara Beth
(Euphorbiaceae). The t-DCTN has been shown to have hypoglycemic (Farias 1997 and Silva
2001), cardiovascular (Silva et al., 2005), antiulcerogenic (Hyruma-Lima et al., 1999, Melo
2003 and Rodriguez 2004), anti-inflammatory and antinociceptive (Carvalho et al., 1996), and
even antitumor activity (Grynberg 1999 and Melo 2004). The low water solubility (34.23 
1.38 µg mL-1) and hepatotoxicity (Maciel et al., 2002a,b) of t-DCTN have limited its use in
clinical studies. However, inclusion complexes with cyclodextrins (CDs) and controlled
delivery systems can be used as potential carriers to solve these problems. In fact, the
cytotoxicity of t-DCTN in rat hepatocytes and V79 fibroblasts was reduced when it was
complexed with βCD (Corrêa et al., 2005). Furthermore, the t-DCTN hypoglycemic effect has
been improved by encapsulation into microspheres prepared with a copolymer of lactic and
glycolic acids (PLGA) (Morais et al., 2008).
Figure1. Chemical structure of the trans-dehydrocrotonin (t-DCTN).
57
The quality control of pure drugs and in pharmaceutical dosage forms is performed by
official or validated methods. Chromatographic techniques such as high-performance liquid
chromatography (HPLC) are frequently used in drug quality control for their sensibility and
specificity, but they are time-consuming, costly and require expertise. However,
spectrophotometry is considered a simpler and lower cost analytical technique being widely
employed in the routine of quality control laboratories (Darwish et al., 2009). A variety of
studies have been published on validated spectrophotometric methods with data comparable
with those obtained by the HPLC for different drugs (García et al., 2005, Lastra et al., 2003,
Sarkar et al., 2006, Venugopal and Saha 2005; Bosch et al., 2006).
The t-DCTN has been studied since 1995, and its degree of purity had already been
evaluated by nuclear magnetic resonance, ultraviolet, infrared and mass spectroscopy (Itokawa
et al., 1989; Maciel et al., 1998; 2000; Melo et al., 2001; 2002; Souza-Brito et al., 1998).
Moreover, t-DCTN content was determined in PLGA-microspheres (Morais et al., 2009) and
L-ascorbic-6-sterate functionalized PLGA-nanoparticles (Frungillo et al., 2009) by UV
spectrophotometry using methanol as a solvent and absorption length of t-DCTN at 238 nm
and 230 nm, respectively. However, no validated method for quantifying this molecule in
plant extract or pharmaceutical dosage forms has been reported.
The aim of the present study was thus to develop and validate a simple, precise,
accurate and economic analytical method to quantify t-DCTN UV by spectrophotometry using
acetonitrile as a solvent. Furthermore, the UV method was applied to determine the content of
t-DCTN in hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) inclusion complexes (t-DCTN:HP-βCD).
58
2. Experimental
2.1.Apparatus
A UV spectrophotometer (Ultrospec 3000 Pro, Amersham Pharmacia Biotech,
Sweden) equipped with 10 mm quartz cells was used for all the measurements. A freezedrying apparatus (EZ-DRY, FTS System, USA) was used to lyophilize t-DCTN:HP-β-CD
inclusion complexes.
2.2.Reagents and materials
The t-DCTN was extracted and purified (> 99%) from the stem bark of Croton
cajucara (Maciel et al., 1998; 2000). Plant material was collected in Jacundá, state of Pará
(Amazon Region of Brazil) and identified by Nelson A. Rosa. A voucher specimen (# 247)
was deposited in the Herbarium of the ―Museu Paraense Emílio Goeldi‖ (Belém, Brazil). 2Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD, Mw ≈1380, m.p. ≈278°C dec., degree of
substituition ≈0.6) was purchased from Sigma (St. Louis, USA). Purified water (Human UP
900, Human Corporation, Korea) was used in the preparation of the t-DCTN:HP-β-CD
inclusion complexes. Acetonitrile, methanol and ethanol (Merck, Darmstadt, Germany) were
of analytical grade.
2.3.t-Dehydrocrotonin standard solutions
The standard solutions were prepared by transferring 10 mg of t-DCTN to a 25 mL
volumetric flask and dissolved in 5 mL acetonitrile in an ultrasonic bath for 5 min. The
volume was filled with acetonitrile to obtain a stock solution of 400 µg mL−1. This stock
solution was further diluted with acetonitrile to obtain working solutions in concentrations
59
ranging from 1 to 20 µg mL−1. Standard solutions were prepared in triplicate to validate the
analytical method.
2.4.Method validation
The UV spectrophotometric method to quantify t-DCTN was validated by determining
the linearity, detection and quantification limits, precision, accuracy, specificity and
robustness according to international guidelines of ICH for validation of analytical procedures
(ICH guidelines, 1996). All assays were performed at 25°C except for the robustness assay,
when samples were also stored at 4°C before analysis.
2.4.1. Linearity
The linearity of the method was verified by the average of six standard curves of tDCTN at concentration levels of 1, 3, 5, 10, 15 and 20 g mL-1. The linearity of the
standard curve was evaluated by linear regression analysis, through the least square
regression method and analysis of variance (ANOVA).
2.4.2.
Detection and quantification limits
Limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) were estimated according to the ICH
guidelines (ICH guidelines, 1996). The limit of detection was calculated by:
LOD = 3.3(σ/S)
60
Where, σ is the standard deviation of the response of the blank and S is the slope of the
standard curve (Ulu, 2007).
The limit of quantification was calculated by:
LOQ = 10(σ/S)
2.4.3. Precision
The precision of the method was determined by intraday (repeatability) and inter-day
variation (intermediate precision). The repeatability of the method was evaluated using three
different concentration levels (3, 5 and 10 g mL-1) of t-DCTN on the same day under the
same experimental conditions for three different days. To asses the intermediate precision,
three different concentrations of t-DCTN (3, 5 e 10 g mL-1) were analyzed by two analysts
on two different days. Precision was expressed as the relative standard deviation (R.S.D%).
Statistical analyses were performed using one-way ANOVA, Student’s t-test and the F-test.
The analysis of samples was carried out in triplicate.
2.4.4. Accuracy
The accuracy of the method was determined by the recovery of a known amount of the
drug added to HP-β-CD solutions. Briefly, an accurately weighed amount of HP-β-CD
equivalent to that in the t-DCTN:HP-β-CD inclusion complex (Section 2.6) was solubilized
with methanol (1 mL) and transferred to 10 mL volumetric flasks containing 0.3, 0.5 and 1 mL
of a standard t-DCTN solution at 2 mg mL-1. The volume was filled with a mixture of
61
methanol and acetonitrile (1:10) to give t-DCTN concentrations of 60, 100 and 200 g mL-1.
Next, dilutions were made with acetonitrile to yield concentrations of 3, 5 and 10 g mL-1 and
analyzed by the proposed method. The samples were prepared in triplicate. The relative
standard deviation and the recovery percentage were employed to evaluate the accuracy of the
method by the equation (ICH guidelines 1996 and Ulu, 2007):
Recovery (%) = 100  [found/added drug concentration]
2.4.5. Specificity
The specificity of the method was evaluated by comparing the UV spectra of blank
samples (HP-β-CD) and t-DCTN standard solution. The scans were performed from 200 to
400 nm and checked for the presence of interfering peaks (ICH guidelines, 1996).
2.4.6. Robustness
The robustness of the method was evaluated by changing the solvent suppliers and the
temperature of the t-DCTN samples (10 μg mL-1) at 4°C and 25°C. The samples were
previously prepared and transferred to sealed tubes and refrigerated at 4ºC or maintained at
room temperature (25°C) before analysis. Assays were performed six times in the same
conditions and the mean recovery percentage of t-DCTN was determined (ICH guidelines,
1996).
62
2.5.Preparation of t-DCTN:HP-β-CD inclusion complexes
Inclusion complexes of t-DCTN:HP-β-CD with a 1:1 molar ratio were prepared by the
freeze-drying method. Appropriate amounts of drug and HP-β-CD were solubilized in a 1:1
ethanol:water solution. The mixture was stirred at room temperature for 48 h, cooled by
immersion in frozen liquid-nitrogen and maintained at -80°C until lyophilization (EZ-DRY,
FTS System, US). The storage of lyophilized inclusion complexes was performed at room
temperature in vacuum desiccators. The samples were prepared in triplicate. The yield of tDCTN complexation in HP-β-CD was calculated using the equation:
Yield complexation (%) = 100 (wl/wi)
Where, wl is the weight of the lyophilized t-DCTN:HP-β-CD inclusion complex and wi is the
initial weight of t-DCTN and HP-β-CD used to prepare the inclusion complex.
2.6. Assay of t-DCTN in t-DCTN: HP-β-CD inclusion complex
An amount of t-DCTN:HP-β-CD inclusion complex, equivalent to 1 mg of t-DCTN,
was accurately weighed and transferred to a 10 mL calibrated flask. The analyte was extracted
with a mixture of methanol and acetonitrile (1:10) to obtain a theoretical concentration of 100
µg mL−1. The sample was centrifuged (12 000 rpm for 10 min at 25°C) to separate the
insoluble HP-β-CD. An aliquot of 500 µL of the supernatant was transferred to 5 mL
volumetric flask and filled with acetonitrile to obtain a concentration of 10 µg mL−1. The
amount of t-DCTN in the inclusion complex was determined using the standard curve of the
validated method. This procedure was performed in triplicate. The content of t-DCTN in tDCTN:HP-β-CD inclusion complex was calculated from the equation:
63
t-DCTN complexed (%) = 100 (Cl/Ct)
Where, Cl is the concentration of t-DCTN determined by the proposed method in solid
inclusion complex, and Ct is the theoretical concentration of t-DCTN, considering the initial
weight of t-DCTN and the yield of t-DCTN:HP-β-CD inclusion complex.
3. Results and discussion
3.1. Method validation
The absorption spectra of t-DCTN in acetonitrile were recorded at concentrations
ranging from 1 to 20 μg mL-1 (Fig. 2a). It was found that t-DCTN exhibits a maximum
absorption peak (max) at 234 nm with a molar absorptivity (ε) of 1.31 × 104 L mol−1 cm−1. The
absorption spectra of t-DCTN in methanol (1 to 20 μg mL-1) showed shoulder peaks with
interference next to the max of t-DCTN (Fig. 2b). The acetonitrile was thus shown to be the
more appropriate solvent to validate the proposed method, since it had less interference in
analysis and promoted more reproducibility of the results in comparison with methanol. These
unpublished results are very important and should be taken into consideration for further
analysis of t-DCTN in pharmaceutical dosage forms using UV spectrophotometry.
64
Figure 2. Scanning UV spectra of t-DCTN at concentrations of 1, 3, 5, 10, 15 and 20 μg mL-1:
samples in acetronitrile (a) and samples in methanol (b).
3.1.1. Linearity
The absorbance at max= 234 nm and the concentration of the t-DCTN presented a
linear relationship at the concentration range from 1 to 20 µg mL-1. The regression analysis
data are summarized in Table 1. The regression equation was C t-DCTN = Area + 0.00147/
0.04214 (r2 = 0.99987; n = 6). A good correlation coefficient and lower calculated lack-of-fit
65
F-value (1.78) indicate that the linear model is suitable. In addition, the reliability of the
method is confirmed by the intercept and slope values within the 95% confidence interval and
their lower standard deviations. The LOD and LOQ, calculated according to ICH guidelines,
were 0.16 and 0.48 µg mL-1, respectively.
Table 1. Parameters of the UV method for quantifying t-DCTN.
Parameters
Values
Measurement wavelength (nm)
234 nm
Linear range (µg mL-1)
1 – 20
Intercept (± Standard deviation)
- 0.00147 (± 0.00062)
Confidence Limits of Intercept
0.01395
Slope (±Standard deviation)
0.04214 (± 0.00022)
Confidence Limits of Slope
0.00181
Correlation coefficient (r2)
0.99987
Limit of detection, LOD (µg mL-1)
0.048
Limit of quantification, LOQ (µg mL-1)
0.15
Molar absorptivity, ε (l mol−1 cm−1)
Lack-of-fit (Fcal) a
a
1.31 × 104
1.78
Fcal is the calculated value. Theoretical value Fcrit =2.50 based on one-way ANOVA at a
p=0.05 level.
66
3.1.2. Precision
The intra-day and inter-day relative standard deviation (R.S.D%) values obtained by
the proposed method were found to be 0.72 - 1.62% and 1.01 -1.60%, respectively (Table 2).
The method gave satisfactory precision since R.S.D. did not exceed 2% and the calculated tand F-values were below critical values (Table 2).
Table 2. Precision evaluation of the UV method for quantifying t-DCTN.
Precision
Added t-DCTN
(μg mL-1)
Found t-DCTN
(μg mL-1)
R.S.D.
(%)
Statistical
parameter
tcala
3.04
5.04
10.00
3.05 ± 0.05
5.01 ± 0.05
9.87 ± 0.16
1.56
0.99
1.60
1.04
1.73
0.54
Day 2
3.04
5.04
10.00
3.14 ± 0.04
5.13 ± 0.08
10.10 ± 0.11
1.31
1.62
1.06
2.60
1.52
2.83
Day 3
3.04
5.04
10.00
3.07 ± 0.02
5.06 ± 0.04
9.82 ± 0.14
0.77
0.72
1.46
0.87
0.00
1.24
3.04
5.04
10.00
3.06 ± 0.05
5.03 ± 0.06
9.84 ± 0.14
1.92
1.19
1.39
0.69
0.87
0.99
Intra-day
Analyst 1
Day 1
Analyst 2
Day 4
Fcalb
3.04
3.08 ± 0.04
1.41
3.24
5.04
5.06 ± 0.05
1.01
2.21
10.00
9.91 ± 0.13
1.33
2.76
is the calculated value. Theoretical value t crit =4.30 based on the t-test comparing
Inter-day
a
tcal
average with standard value at a p=0.05 level.
b
Fcal is the calculated value. Theoretical value Fcrit =4.07 based on one-way ANOVA at a
p=0.05 level.
67
3.1.3. Accuracy
The accuracy of the method was determined by recovering known amounts (3, 5 and
10 µg mL-1) of t-DCTN added to an amount of HP-β-CD equivalent to that found in the tDCTN:HP-β-CD inclusion complex and applied to the assay for quantifying the t-DCTN in
the t-DCTN: HP-β-CD inclusion complex. The lower concentrations were used because they
are more susceptible to error during the recovery process, which may impart greater
confidence to the experimental results. The maximum concentration of 10 µg mL-1 was chosen
as the reference concentration to quantify t-DCTN in that study. The accuracy of the analytical
technique was verified by means of the recovery test, ranging from 99.62 to 100.02% (Table
3).
Table 3. Recovery of t-DCTN in HP-β-CD matrix to evaluate the accuracy of the UV
method.
t-DCTN (μg mL-1)
a
Added
Found ± SDa
Recovered ± SDa (%)
3.04
3.04 ± 0.11
100.02 ± 3.52
5.04
5.04 ± 0.14
100.01 ± 2.79
10.00
9.96 ± 0.05
99.62 ± 0.49
Values are the mean of three determinations.
68
3.1.4. Robustness
In the robustness results no significant differences could be observed when the solvent
from different suppliers and sample temperature were changed. Recovery values were from
99.02 to 99.67% (Table 4). The method described is specific for the determination of t-DCTN
in inclusion complex, since no interfering signals were observed in blank samples (HP-β-CD
without t-DCTN) at 234 nm and t-DCTN was totally recovered when the proposed method
was employed (Fig. 3). The satisfactory recovery of t-DCTN (>99%) obtained in the
robustness study at different temperatures confirms that the molar absorptivity of t-DCTN
does not depend on the temperature of the sample. The regression equations of standard curves
were the same at different sample temperatures (data not shown).
Table 4. Robustness of the UV method using different solvents and varying the
temperatures of the t-DCTN samples.
Parameters
a
t-DCTN (μg mL-1)
Recovery ± SDa (%)
tcalb
Added
Found ± SDa
Solvent 1
10
9.95 ± 0.12
99.49 ± 1.18
1.78
Solvent 2
10
9.90 ± 0.16
99.02 ± 0.16
1.55
4 C
10
9.95 ± 0.12
99.67 ± 0.89
1.60
25 C
10
9.97 ± 0.09
99.49 ± 1.18
0.92
Values are the mean of six determinations. btcal is the calculated value. Theoretical value
tcrit =2.57 based on t-test comparing average with standard value at a p=0.05 level.
69
The t-DCTN content was determined in the inclusion complex at the reference
concentration of 10 µg mL-1 using the regression equation: Ct-DCTN = Area + 0.00147/ 0.04214.
Daily reduced standard curves (3 points) were performed on the same day as the analysis to
confirm this regression equation. The solid inclusion complex obtained by freeze-drying
yielded excellent results namely, 95.77 ± 1.91%. The content of t-DCTN in inclusion complex
with HP-β-CD was 99.78 ± 0.71% (n=3) using the validated UV method.
Figure 3. Scanning UV spectra of the HP-β-CD (a) and t-DCTN (10 μg mL-1) (b) in
acetonitrile.
4. Conclusions
The proposed UV spectrophotometric method for determining the t-DCTN was
shown to be simple, rapid, reproducible, robust and precise. It was possible to successfully
quantify the t-DCTN in HP-β-CD inclusion complex without any interference from the
cyclodextrin. The validated UV method can, therefore, be applied to routine analyses in
70
quality control of the t-DCTN in t-DCTN:HP-β-CD inclusion complex and pharmaceutical
dosage forms using acetonitrile as the solvent.
Acknowledgments
W.A.M. is grateful for a PhD scholarship from the Brazilian Council for Scientific and
Technological Development (CNPq) and T.L.S. is grateful for an MSc scholarship from the
Pernambuco State Foundation for the Advancement of Science (FACEPE). This research
project was founded by the CNPq (Grant # 474071/2007-3).
References
Bosch, M. E., A. J. R. Sánchez, F. S. Rojas and C. B. Ojeda. 2006. J. Pharmaceut. Biomed.
42: 291-321.
Carvalho, J. C. T., M. F. C. Silva, M. A. M. Maciel, A. C. Pinto, D. S. Nunes, R. M. Lima,
J. K. Bastos and S. J. Sarti. 1996. Planta Med. 62: 402-404.
Corrêa, D. H. A., P. S. Melo, C. A. A. Carvalho, M. B. M. Azevedo, N. Durán and M.
Haun. 2005. Eur. J. Pharmacol. 510: 17-24.
Darwish, I.A., H. H. Abdine, S. M. Amer and L. I. Al-Rayes. 2009. Spectrochim. Acta A
72: 897–902.
Farias, R. A. F., V. S. N. Rao, G. S. Viana, E. R. Silveira, M. A. M Maciel and A. C. Pinto.
1997. Planta Med. 63: 558-560.
71
Frungillo, L., Martins, D., Teixeira, S., Anazetti M.C., Melo, P.S. and Durán, N. 2009.
Targeted antitumoral dehydrocrotonin nanoparticles with L-ascorbic acid 6-stearate. J.
Pharm. Sci. 98: 4796 -4807.
García, P. L., M. I. R. M. Santoro, E. R. M. Kedor-Hackman and A. K. Singh. 2005. J.
Pharmaceut. Biomed. 39: 764-768.
Grynberg, N. F., A. Echevarria, J. E. Lima, S. S. R. Pamplona, A. C. Pinto and M. A. M.
Maciel. 1999. Planta Med. 65: 687-689.
Hiruma-Lima, C. A., R. C. Spadari-Bratfisch, D. M. Grassi-Kassisse and A. R. M. SouzaBrito. 1999. Planta Med. 65: 325-330.
International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of
Pharmaceuticals for Human Use (ICH). 1996. Q2B: Guideline on Validation of
Analytical Procedure-Methodology. London.
Itokawa, H. I, Y. Ichihara, H. Kojima, K. Watanabe and K. Takeya. 1989. Phytochemi.
28: 1667-1669.
Lastra, O. C., I. G. Lemus, H. J. Sánchez and R. F. Pérez. 2003. J. Pharmaceut. Biomed.
33: 175-180.
Maciel, M.A.M, A. C. Pinto, S.N. Brabo and M. N. Da Silva. 1998. Phytochem. 49: 823828.
Maciel, M. A. M., A. C. Pinto, A. C. Arruda, S. G. S. R. Pamplona, F. A. Vanderlinde, A. J
Lapa, A. Echevarria, N. F. Grynberg, I. M. S. Côlus, R. A. F. Farias, A. M. Luna Costa
and V. S. N. Rao. 2000. J. Ethnopharmacol. 70: 41-55.
Maciel, M. A. M., A. C. Pinto, V. F and Veiga Jr. 2002b. Quim Nova 25: 429-438.
72
Maciel, M. A. M., A. C. Pinto, V. F. Veiga Jr, J. R. Martins, N. F. Grynberg, A. Echevarria,
A. J. Lapa and F. A. Vanderlinde. 2002a. Phytochem Pharmacol IISer Recent Prog
Med Plants 8: 459-475.
Melo, P. S., G. Z. Justo, N. Duran and M. Haun. 2004. Eur. J. Pharmacol. 487: 47-54.
Melo, P. S., N. Durán, C. A. Hiruma-Lima, A. R. M. Souza-Brito and M. Haun. 2003. J.
Ethnopharmacol. 87: 169-174.
Melo, P. S., N. Durán and M. Haun. 2001. Toxicol. 159: 135-141.
Melo, P.S., N. Durán and M. Haun. 2002. Human Exp. Toxicol. 21:281– 288.
Morais, W. A., M. P. Costa, A. D. O. Paixão, M. A. M. Maciel and N. S. SantosMagalhães. 2008. J. Microencapsul. 26: 187-191.
Rodríguez, J. A., C. A. Hiruma-Lima and A. R. M. Souza Brito. 2004. Hum. Exp. Toxicol.
23: 455-461.
Sarkar, M., S. Khandavilli and R. Panchagnula. 2006. J. Chromatogr. B 830: 349-354.
Silva, R. M., F. A. Oliveira, K. M. A. Cunha, J. L. Maia, M. A. M. Maciel, A. C. Pinto, N.
R. F. Nascimento, F. A. Santos and V. S. N. Rao. 2005. Vasc. Pharmacol. 43: 11-18.
Silva, R. M., F. A. Santos, V. S. N. Rao, M. A. Maciel and A. C. Pinto. 2001. Diab. Obes.
Metabol. 3: 452-456.
Souza-Brito, A.R.M., J.A. Rodriguez, C.A. Hiruma-Lima, M. Haun and D.S. Nunes.
1998. Planta Med. 64:126– 129.
Ulu S. T. 2007. Spectrochim. Acta A 67: 778–783.
Venugopal, K. and R. N. Saha. 2005. Il Farmaco 60: 906-912.
73
CARTA DE SUBMISSÃO
74
ARTIGO II
Avaliação da atividade antitumoral in vivo de
lipossomas contendo a trans-desidrocrotonina
e o seu complexo de inclusão com a
hidroxipropil-β-ciclodextrina.
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas. A
ser submetido.
75
Avaliação da atividade antitumoral in vivo de lipossomas contendo a
trans-desidrocrotonina e o seu complexo de inclusão com a hidroxipropilβ-ciclodextrina
Taciana Lima Salviano Lapenda1, Marcileide de Holanda Santos1, Waldenice de Alencar
Morais1, Noemia Pereira da Silva Santos1, Maria Aparecida Medeiros Maciel2, Nereide
Stela Santos-Magalhães1*
1
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami, Universidade Federal de Pernambuco
2
Departamento de Química, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
* Correspondência:
Dra. Nereide Stela Santos Magalhães
Universidade Federal de Pernambuco
Grupo de Sistemas de Liberação Controlada de Medicamentos
Laboratório de Imunopatologia Keizo-Asami (LIKA)
Av. Prof. Moraes Rego, 1235, Cidade Universitária.
50670-901, Recife-PE, Brasil.
Telefone: 81- 21012501; fax: 81- 21012508
E-mail: [email protected]; [email protected]
76
RESUMO
Lipossomas contendo a t-DCTN (LD) e o seu complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD (LC)
foram obtidos pelo método de formação do filme lipídico seguido de sonicação e
submetidos a estudos de cinética de liberação in vitro. A atividade antitumoral de LD e LC
foi avaliada contra o tumor ascítico Sarcoma 180 em camundongos Swiss. Análises
histopatológicas e hematológicas também foram realizadas. Após o processo de fabricação,
todas as formulações lipossomais apresentaram-se homogêneas, leitosas com reflexo
azulado. As quantidades t-DCTN e do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD encapsuladas
foram equivalentes a 1 mg/mL do fármaco, a eficiência de encapsulação de LD foi de 95,0
± 3,8 % e a de LC foi de 91,1 ± 5,6%. Em relação à cinética de liberação in vitro, os perfis
apresentaram uma boa correlação com o modelo fickiano. Na avaliação antitumoral, LD e
LC apresentaram as respectivas inibições tumorais de 79,4 ± 9,6% e 63,5 ± 5,5%. Na
análise histopatológica, observaram-se poucas alterações no fígado dos animais tratados
com LD e com LC. Os achados hematológicos não indicam qualquer efeito relacionado ao
tratamento. Os resultados mostram que o desenvolvimento das formulações lipossomais
contendo a t-DCTN e o seu complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD consiste em um
importante avanço na terapêutica deste fármaco.
Unitermos: Câncer, lipossomas, trans-desidrocrotonina, complexo de inclusão de fármaco
com ciclodextrina , atividade antitumoral.
77
ABSTRACT
t-DCTN-loaded liposomes (LD) and its inclusion complexes t-DCTN:HP-β-CD-loaded
liposomes (LC) were prepared by the thin film hydration followed sonication technique and
lipossomal formulations were evaluated in vitro kinetic. Antitumor activity of LD and LC
were investigated against Sarcoma 180 in Swiss mice. Histopathological and
haematological analyses were carried out. After the manufacture process, all liposomal
formulations were uniform, milky with a bluish appearance reflection. The amounts of tDCTN and t-DCTN:HP-β-CD inclusion complex encapsulated were equivalent to 1 mg of
t-DCTN, the encapsulation efficiency of LD was 95,0 ± 3,8 % and LC was 91,1 ± 5,6%. In
relation the release kinetics in vitro, the profiles presented a good agreement with fickian
model. In respect to antitumor activity, LD and LC showed 79,4 ± 9,6% and 63,5 ± 5,5% of
tumor inhibition respectively. In the histopathological analyses of liver of animals treated
with LD and LC few alterations were observed. The haematological findings did not show
any treatment-related effects. The results show that the development os liposomal
formulations with t-DCTN and its inclusion complexes t-DCTN:HPβCD are an important
advance in this drug therapy.
Keywords: Cancer, Liposomes, trans-dehydrocrotonin, drug inclusion complex with
cyclodextrin, antitumor activity.
78
INTRODUÇÃO
A DCTN, um diterpeno do tipo 19-nor-clerodano, é o componente majoritário
isolado da espécie Croton cajucara, popularmente conhecida por sacaca. Esta planta
pertence a família Euphorbiaceae e é bastante utilizada na medicina popular na Região
Amazônica no combate a diabetes, diarréia, malária, febre, problemas estomacais,
inflamação do fígado, rins, vesícula e no controle de altos índices de colesterol (Costa et
al.,2007).
A literatura relata várias atividades farmacológicas para a t-DCTN: antitumoral
(Grynberg et al., 1999; Melo et al., 2004), hipoglicêmica (Farias et al., 1997; Silva et al.,
2001a), hipolipidêmica (Silva et al., 2001a; Silva et al., 2001b; Silva et al., 2001c; Bighetti
et al., 2004), antigenotóxica (Agner et al., 1999; Agner et al., 2001), antiulcerogênica
(Hiruma-Lima et al., 1999; Melo et al., 2003; Rodríguez et al., 2004), antiinflamatória e
antinociceptiva (Carvalho et al., 1996), antiestrogênica (Luna-Costa et al., 1999) e
cardiovascular (Silva et al., 2005). Dentre as atividades farmacológicas da t-DCTN, a
atividade antitumoral merece destaque. O seu efeito citotóxico foi avaliado em diversas
linhagens de células tumorais: células tumorais de Ehrlich (Grynberg et al., 1999; Maciel et
al., 2002; Melo et al., 2004), células promielocítica leucêmica (HL60) (Anazetti et al,
2003; Anazetti et al., 2004; Corrêa et al., 2005), células fibroblástica pulmonares de
Hamsters chineses (V79) (Souza-Brito et al., 1998; Rodríguez; Haun, 1999; Melo et al.,
2001; Freire et al., 2003) e hepatócitos de ratos (Rodríguez ; Haun, 1999; Corrêa et al.,
2005). A atividade antitumoral in vivo da t-DCTN também foi avaliada em dois modelos
experimentais de tumores ascíticos: Sarcoma 180 (S-180) (Grynberg et al., 1999) e
Carcinoma de Erlich (Grynberg et al., 1999; Melo et al., 2004). Porém a t-DCTN pode
causar efeitos hepatotóxicos, o que pode limitar seu uso prolongado (RODRÍGUEZ et al.,
2004; Maciel et al.,2000).
A nanotecnologia farmacêutica, por sua vez, conseguiu desenvolver sistemas
coloidais de liberação controlada para a veiculação de agentes bioativos na forma de
nanodispositivos. O principal objetivo dos sistemas de liberação controlada é a liberação
progressiva e controlada do fármaco pelo condicionamento a estímulos do meio a que se
encontram, manutenção dos níveis plasmáticos do fármaco em concentrações constantes
79
dentro da faixa terapêutica, eliminando desta forma as variações que geralmente são
observadas no decorrer do tratamento como os efeitos tóxicos (picos além da faixa
terapêutica) e falta de efetividade (dose subterapêutica) da substância ativa. Portanto, estes
sistemas oferecem o uso otimizado do fármaco, uma menor necessidade de administrações
e aumento da aceitação da terapia pelo paciente (Lo et al., 2001; Dunne et al., 2003).
Dos vários nanocarreadores, os lipossomas despertam grande interesse para
pesquisa e aplicações terapêuticas. Lipossomas são pequenas vesículas esféricas formadas
por uma ou mais bicamadas lipídicas que se organizam espontaneamente em meio aquoso
(Torchilin, 2005). Tais partículas são consideradas excelente forma de sistema de liberação
controlada de fármacos devido a sua flexibilidade estrutural seja no tamanho, composição e
fluidez da bicamada lipídica, como na sua capacidade de encapsular substâncias hidrofílicas
e/ou lipofílicas. Além disso, os lipossomas também apresentam algumas propriedades
biológicas bastante atrativas: são biodegradáveis, biocompatíveis e não imunogênicos
(New, 1990; Brandl; Gregoriadis,1994; Edwards; Baeumner, 2006).
Uma alternativa bastante promissora para diminuir os efeitos tóxicos e otimizar a
ação antitiumoral da t-DCTN é a encapsulação deste bioativo em lipossomas. O uso de
lipossomas como carreadores de fármacos antineoplásicos é estratégico para alcançar um
acúmulo seletivo do fármaco no tecido, onde se encontra o tumor ou nas células tumorais,
visto que eles alteram a farmacocinética e biodistribuição do fármaco (Mamot et al.,2003).
No presente estudo, lipossomas contendo a t-DCTN e o seu complexo de inclusão tDCTN:HPβCD foram obtidos e submetidos a avaliações de estabilidade a curto e a longo
prazo e estudos de cinética de liberação in vitro. A atividade antitumoral das duas formas
lipossomais também foi avaliada contra o tumor ascítico Sarcoma 180 em camundongos.
Além disso, análises histopatológicas e hematológicas foram efutuadas.
80
MATERIAL E MÉTODOS
Material
O diterpeno clerodano t-DCTN foi extraído e purificado das cascas do caule do
Croton cajucara, seguindo metodologia previamente descrita (Maciel et al., 2000). O
material foi coletado no município de Jacundá, no estado do Pará (Região Amazônica do
Brasil) e identificado por Nelson A. Rosa. A caracterização físico-química da t-DCTN foi
realizada na Universidade Federal do Rio de Janeiro (Brasil). A fosfatidilcolina de soja
(PC) foi obtida da Lipoid, GmbH (Ludwigshafen, Germany). Colesterol (CH),
estearilamina (SA), 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPβ-CD, MM ≈1380 u, grau de
substituição ≈0.6) e trealose foram obtidos da Sigma-Aldrich (St Louis, USA). Tween®80
foi fornecido pela Synth (São Paulo, Brasil). Todos os demais reagentes utilizados foram de
grau analítico fornecidos pela Merck (Darmstadt, Alemanha). As soluções aquosas foram
preparadas com água purificada obtida pelo sistema de purificação Human UP 900 (Human
Corporation, Korea).
Preparação e quantificação do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD
O método de preparação do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD, bem como sua
caracterização foram previamente descritos por Lapenda et al. (2010). Em resumo, os
complexos de inclusão t-DCTN:HPβCD (1:1) foram obtidos pela técnica de freeze-drying
(liofilização). Quantidades da t-DCTN e da HPβCD correspondentes a proporção1:1 em
mol foram solubilizadas em solução etanol:água (1:1). A solução permaneceu sob agitação
magnética à 25 ºC por 48 h, em seguida foi congelada em nitrogênio líquido e liofilizada
(EZ-DRY,
FTS
System,
US).
A
quantidade
de
t-DCTN
foi
analisada
por
espectrofotometria (λ = 234 nm) utilizando metodologia previamente validada segundo as
normas técnicas preconizadas pela ANVISA e ICH. Uma amostra do complexo equivalente
a 1mg de t-DCTN foi pesada e solubilizada em 10 mL de uma mistura de metanol e
acetonitrila (1:10). Posteriormente uma alíquota da solução foi retirada e diluída em
acetonitrila até a concentração teórica de 10 µg/mL (n=3).
81
Preparação de lipossomas
Lipossomas unilamelares pequenos foram obtidos através do método de formação e
hidratação do filme lipídico seguido de sonicação descrito por Lira et al. (2009). A
fosfatidilcolina de soja, o colesterol e a estearilamina (7:2:1, 120mM) foram solubilizados
em uma mistura de clorofórmio:metanol (3:1 v/v) sob agitação magnética. Em seguida a
mistura de solvente foi retirada por rotaevaporação por 1 h (37 ºC/ 80 rpm) havendo a
formação do filme lipídico. O filme formado foi então hidratado com 10 mL de tampão Tris
(pH 7,4) contendo diferentes concentrações da trealose (0, 1, 5, 10 e 15 % m/v) utilizada
como agente crioprotetor. Os lipossomas multilamelares obtidos foram submetidos por
sonicação usando sonda Vibra Cell (Branson, USA) em 200 W e 50 Hz por 600s, obtendose assim lipossomas unilamelares pequenos. Por fim, os lipossomas foram congelados a –
80°C e liofilizados (EZ-DRY, FTS System, USA) a 200 bars por 24 h. Os lipossomas
liofilizados foram armazenados a 25  1°C em um dissecador a vácuo. Os lipossomas
contendo t-DCTN (LD) e aqueles contendo o complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD (LC)
foram obtidos pela mesma técnica descrita, sendo a t-DCTN solubilizada na fase orgânica e
o complexo de inclusão na solução aquosa, ambos na concentração de 1 mg/ml de fármaco.
Avaliação da estabilidade dos lipossomas
As formulações lipossomais contendo o fármaco e seu complexo de inclusão foram
submetidas a testes de estabilidade acelerada e a longo prazo com o objetivo de verificar a
durabilidade das preparações (Santos-Magalhães et al., 2000). Nestes testes características
físico-químicas dos lipossomas como aspecto macroscópico, tamanho de partícula, índice
de polidispersão e variação de pH foram avaliadas. O objetivo do teste de estabilidade
acelerada é submeter as formulações a condições de estresse que conduzem ao
envelhecimento a curto prazo. Suspensões lipossomais foram submetidos à centrifugação a
10.000 rpm por 1h a 4 ºC (KN-70 Centrifuge, Kubota, Japão) e ao estresse mecânico a 180
vibrações por min a 37 ºC por 48h (Polytest ® 20 Bioblock Scientific). Na estabilidade a
longo prazo as análises foram efetuadas imediatamente após a preparação das formulações
e, subsequentemente, em intervalos regulares de 7, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 dias. Para
82
avaliar as suspensões lipossomais durante este período, os lipossomas liofilizados foram
reidratados com quantidade suficiente de tampão Tris para manter as mesmas condições
anteriores a liofilização.
Análise do tamanho de partícula
O diâmetro médio de partículas e o índice de polidispersão (PI) dos lipossomas, prée pós-liofilizados, foram determinados pela técnica de espectroscopia de correlação de
fótons (PSC) utilizando analisador de partícula a laser Delsa TM Nano-S a 25 ºC com ângulo
de detecção de 90 º (Beckman Coulter, UK).
As amostras de lipossomas (n=3) foram
diluídas adequadamente em água ultra-purificada para contagem de partículas. Os
resultados obtido são apresentados pela média ± desvio padrão (DP).
Determinação do potencial-zeta
A carga superficial (potencial zeta) dos lipossomas foi determinada através da
mobilidade eletroforética pelo equipamento Zetatrac Legacy (Nanotrac®, USA). As
medidas (n=3) foram realizadas a 25 ºC com dispersões das amostras a 0,3% (m/v) em
solução aquosa de eletrólito NaCl 1 mM. Os resultados são apresentados pela média ± DP
das medidas realizadas.
Eficiência de encapsulação
A eficiência de encapsulação da t-DCTN nos lipossomas LD e LC foi determinada
por espectrofotometria UV-Vis (Ultrospec 3000 pro, Amersham Biosciences, Suécia). A tDCTN foi quantificada retirando-se primeiramente uma alíquota da suspensão lipossomal
(50 μL), a qual foi diluída em metanol (5 mL) e ultrassonicada por 5 minutos. Em seguida,
o composto ativo foi quantificado por espectrofotometria (248 nm) utilizando curva padrão
da t-DCTN com concentrações de 3 a 20 µg/mL em metanol. Os lipossomas brancos, ou
seja sem o composto ativo, foram analisados visando demonstrar a ausência de
interferência dos cosntituintes utilizados na preparação. Para estimar o conteúdo de
83
t-DCTN que não foi encapsulada nos lipossomas, empregou-se a técnica de
ultrafiltração/ultracentrifugação usando unidades de Microcon® (Millipore, USA).
Primeiramente, uma alíquota da dispersão lipossomal (400 μL) foi centrifugada a 10.000
rpm durante 1h a 4 ºC. Em seguida, o filtrado, contendo a t-DCTN não encapsulada, foi
quantificado em espectrofotômetro UV-Vis (248 nm). Os fatores de diluição foram
considerados no cálculo da DCTN livre e total. O valor correspondente a quantidade de tDCTN encapsulada nos lipossomas foi obtida subtraindo a t-DCTN livre do conteúdo total.
As análises foram realizadas em triplicata e os valores foram descritos pela média ± DP. A
percentagem da eficiência de encapsulação (EE %) foi calculada segundo a equação: EE %
= (t-DCTN total – t-DCTN livre)/ t-DCTN total × 100%.
Cinética de liberação in vitro
O estudo do perfil de liberação in vitro da t-DCTN e do complexo de inclusão
(t-DCTN:HPβCD) encapsulados em lipossomas foi realizado utilizando a técnica de diálise
direta em condições sink . Uma alíquota de 1 mL das formulações lipossomais contendo o
fármaco foi inserida em um saco de diálise (membrana de celulose, cut-off = 15-20 ,
Sartorius, Germany), o qual foi em seguida fechado e imerso no meio contendo 250 mL de
tampão. O sistema permaneceu sob agitação constante (60 rpm) a 37  1ºC. Em intervalos
de tempo pré-determinados, alíquotas de 1 mL do meio foram retiradas. Volumes iguais de
tampão Tris (1 mL) foram transferidos para reposição do meio. O conteúdo de t-DCTN foi
quantificado por espectrofotometria UV-Vis como previamente descrito. Os ensaios foram
realizados em triplicata e os resultados expressos em percentagem dos valores médios de
t-DCTN liberada (em relação à quantidade de t-DCTN encapsulada)  DP.
Os dados experimentais da cinética de liberação in-vitro foram ajustados a um
modelo exponencial, usando a seguinte equação: Mt/M∞= (1-k1e-k2t), onde Mt e M∞ são o
valor absoluto da quantidade de droga liberada no tempo t e do conteúdo inicial do
fármaco, respectivamente; a constante K2 está associada ao coeficiente de difusão da droga
nos lipossomas (Siepmann; Siepmann, 2008; Klose et al., 2008). As primeiras horas da
cinética foram ajustadas ao modelo Fickiano pela raiz quadrada do tempo (t1/2) e a taxa de
liberação determinada pela inclinação da regressão linear.
84
Atividade antitumoral
Este estudo foi realizado com o objetivo de avaliar a atividade antitumoral in vivo,
frente ao tumor sarcoma-180, da t-DCTN nas suas formas livre e encapsulada. Tambem foi
analisada a influência dos complexos t-DCTN:HPβCD encapsulados nos lipossomas.
Células do tumor ascítico (5,0 x 106 células/ml) foram inoculadas via subcutânea (s.c) na
região axilar direita de camundongos machos albinos Swiss (idade de 35 a 60 dias, peso
médio 30-40 g). Os animais foram divididos em 5 grupos, contendo 5 animais distribuídos
aleatoriamente. Após 24 h da inoculação do tumor, o tratamento foi iniciando tendo
duração de 7 dias consecutivos. Injeções da suspensão de t-DCTN , LD, LC e do placebo
(solução salina) foram administrados pela via intraperitoneal numa dose equivalente a
20 mg/kg de peso do animal (Melo et al., 2004) . A suspensão de t-DCTN foi preparada em
solução estéril de NaCl a 0,9% contendo Tween 80 a 5% (v/v) (Costa et al., 2007; Melo et
al., 2004). Os animais do grupo controle positivo e negativo foram tratados com solução de
NaCl a 0,9 estéril, em idênticas condições (Santos et al., 2006). Após o tratamento, os
animais foram anestesiados com Urethame ® (1,25 g/kg) e sacrificados por punção cardíaca.
Amostras de sangue foram coletadas em tubos MiniCollect® K3EDTA (Greiner Bio-One,
Austria) para análise hematológica. Os tumores e o fígado foram removidos, pesados e
submetidos a estudos histopatológicos. A atividade antitumoral foi determinada pelo
cálculo do percentual de inibição tumoral (IT%) : IT% = (C – T)/C × 100%, onde C é o
peso médio dos tumores nos animais controle e T é a média dos pesos dos tumores dos
animais tratados (Wang et al, 1996) .
Durante o experimento, os animais foram mantidos à temperatura ambiente
(25 C  2 C), sob ciclo dia/noite natural (12h luz e 12h escuro), com livre acesso à água e
alimento.
Toda a metodologia estava de acordo com o protocolo sugerido pelo Instituto
Nacional do Câncer (INCA) e aprovada pelo Comitê de Ética para Ensaio de
Experimentação Animal da Universidade Federal de Pernambuco- UFPE (Recife, Brasil).
85
Estudo histopatológico
O fígado e o tumor dos animais foram submetidos a análises histopatológicas. Os
tecidos foram mantidos em solução tamponada de formalina a 10% até inclusões em
parafina. Cortes (4 m) da amostra de tecidos fixados em Hematoxilina e corados em
Eosina (HE) foram analisados por microscopia óptica (Olympus BH-2, Japan).
Análise hematológica
As amostras de sangue dos camundongos foram submetidas a determinações de
índices hematimétricos tais como: concentração de hemoglobina (Hb), hematócrito (Hct),
volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM), concentração
de hemoglobina corpuscular média (CHCM), largura de distribuição dos eritrócitos (RDW),
contagem de células brancas do sangue (WBC), contagem de glóbulos vermelhos (RBC) e
contagem de plaquetas. Estes parâmetros foram medidos no laboratório de análises do
Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco (Recife, Brasil).
Análise estatística
A análise estatística foi realizada usando o Teste de Tukey, através do software
Statistica 8.0 (StarSoft Inc., Tulsa, OK, USA), sendo os resultados considerados
significativos quando p<0,05. Os resultados experimentais foram expressos como o valor
médio ± DP nas tabelas e figuras.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Estudo de pré-formulação para avaliar o efeito da trealose e da liofilização na
aparência visual e no tamanho de partícula de lipossomas sem a t-DCTN
No presente estudo, a concentração da trealose nos lipossomas (PC:CH:SA) foi
otimizada para garantir a estabilidade dos lipossomas e preservar as suas características
físico-químicas durante a liofilização e a reidratação do liófilo.
86
Suspensões lipossomais sem o fármaco foram liofilizadas na presença de trealose
em diferentes concentrações (0, 1, 5, 10 e 15% m/v). As formulações liofilizadas foram
examinadas por inspeção visual. Uma matriz amorfa e uniforme foi obtida após a
liofilização das vesículas na presença da trealose nas concentrações de 10 e 15%. Nas
concentrações mais baixas, um aglomerado lipídico foi observado, indicando que a
quantidade de trealose era insuficiente para prevenir a agregação das vesículas (Figura 1).
FIGURA 1- Liófilos das suspensões lipossomais obtidos na presença de trealose nas
concentrações de 1% (A) e 10% (B).
Uma liofilização bem sucedida deve permitir que o produto reabsorva rapidamente
o solvente e restabeleça o seu estado original. Formulações contendo 10 e 15% (m/v) de
trealose foram rapidamente reidratadas e não foram observados agregados. Nas
formulações com menores concentrações de açúcar, a reidratação foi lenta e aglomerados
lipídicos foram visualizados.
Para verificar se as características físico-químicas dos lipossomas foram preservadas
após a liofilização, o tamanho de partícula e o índice de polidispersão foram determinados.
Quantidades insuficientes da trealose podem levar a fusão das vesículas e aumentar em até
30 vezes o seu diâmetro (Mohammed et al., 2006). A conservação do tamanho de partícula
após a liofilização é considerada uma ótima indicação no sucesso da liofilização. A razão
do tamanho de partícula antes e depois da liofilização (Sf/Si) pode ser calculado. Um valor
próximo de 1 indica que houve conservação no tamanho dos lipossomas (Abdelwahed et
al., 2006). O índice de polidispersão (PI) das partículas mede a distribuição do tamanho de
87
partícula e também pode ser comparado para avaliar a conservação dos lipossomas.
Valores pequenos de PI (≤ 0,3) indicam uma população homogênea de lipossomas,
enquanto que valores maiores indicam heterogeneidade (Kim et al., 2009).
As características físico-químicas dos lipossomas antes e depois da liofilização
estão apresentadas na Tabela I. O tamanho de partícula médio, antes da liofilização, variou
de 59,9 ± 3,1 a 108,4 ± 1,3 nm em formulações lipossomais sem o crio-/lioprotetor e com
15% de trealose respectivamente. A adição de diferentes concentrações de trealose resultou
em um aumento gradual no tamanho médio das vesículas de acordo com o aumento da
concentração de trealose. Uma hipótese para isto pode ser o aumento do volume
hidrodinâmico dos lipossomas pelo revestimento da sua superfície com a trealose através de
ligações de hidrogênio entre os dois (Christensen et al., 2007). O aumento no tamanho de
partícula não mudou a aparência visual das formulações. Após a liofilização, a razão de
tamanhos de partículas mais próxima da unidade foi obtida na formulação lipossomal com
10% de trealose (Sf/Si= 1,04), indicando que esta concentração foi ideal para a conservação
do tamanho de partícula.
O índice de polidispersão dos lipossomas variou de 0,29 ± 0,04 a 0,41 ± 0,05 e de
0,22 ± 0,01 a 0,43 ± 0,01 antes e depois da liofilização respectivamente. A suspensão
lipossomal contendo 10% de trealose foi a única que teve o PI inferior a 0,3, pré- e pósliofilização, mostrando que nesta formulação os lipossomas tinham tamanho homogêneo de
distribuição.
Estes resultados sugerem que com a trealose na concentração de 10% é possível
liofilizar lipossomas de PC:CH:SA (7:2:1; 120 mM) e obter um liófilo estável.
88
TABELA I – Tamanho de partícula e índice de polidispersão de lipossomas (PC:CH:SA;
120 mM) com diferentes concentrações de trealose.
Trealose %
(m/v)
Tamanho de partícula (nm)
Pré-
Pós-
liofilização
liofilização
0
59,9 ± 3,1
845,4 ± 12,8
1
63,9 ± 1,1
5
Índice de Polidispersão
Pré-
Pós-
liofilização
liofilização
14,11
0,38 ± 0,03
0,42 ± 0,02
715,2 ± 13,9
11,19
0,32 ± 0,01
0,43 ± 0,01
68,1 ± 1,0
79,4± 2,9
1,17
0,32 ± 0,01
0,38 ± 0,01
10
86,6 ± 9,5
90,2 ± 5,9
1,04
0,29 ± 0,04
0,22 ± 0,01
15
108,4 ± 1,3
83,0 ± 6,9
0,77
0,41 ± 0,05
0,29 ± 0,05
Sf/Si
Sf/Si: Razão do tamanho dos lipossomas antes e depois da liofilização.
Características físico-químicas e eficiência de encapsulação de lipossomas contendo a
t-DCTN (LD) e o complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD (LC)
Lipossomas contendo a t-DCTN (LD) e o complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD
(LC) foram obtidos pelo método de hidratação do filme lipídico, com solução de trealose a
10% em tampão Tris (pH = 7,4), seguido de sonicação. As quantidades t-DCTN e do
complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD encapsuladas foram equivalentes a 1 mg/mL do
fármaco. A razão molar fármaco lipídeo foi de 2,7:10. Logo após o processo de fabricação,
todas as formulações apresentaram-se homogêneas, leitosas com reflexo azulado (típico de
lipossomas unilamelares pequenos). O tamanho de partícula, o índice de polidispersão, o
potencial zeta e a eficiência de encapsulação de LD e LC estão apresentados na Tabela II.
O tamanho médio das vesículas de LD e LC foi respectivamente 78,67 ± 6,51 e 77,33 ±
3,00 nm. Não houve diferença significativa entre o tamanho de partícula médio destas duas
formulações entre si e em relação a formulação sem o fármaco (86,6 ± 9,5 nm).
89
TABELA II- Tamanho de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta e eficiência de
encapsulação de LD e LC.
Formulações
Tamanho de
partícula
(nm)
Índice de
polidispersão
Potencial
zeta (mV)
Eficiência de
encapsulação
(%)
LD
78,7 ± 6,5
0,30 ± 0,01
+39,94 ± 2,62
95,0 ± 3,8*
LC
77,3 ± 3,0
0,33 ± 0,01
+36,27 ± 1,98
91,1 ± 5,6*
*A diferença entre as eficiências de encapsulação de LD e LC não foi significativa pelo
Teste de Tukey (p<0,05).
LD= lipossomas contendo a t-DCTN; LC= lipossomas contendo o complexo de inclusão
t-DCTN:HPβCD.
O índice de polidispersão de LD e LC foi de 0,30 e 0,33 respectivamente, indicando
que estas formulações são monodispersas. Os potenciais zeta de LD e LC foram, na
correspondente ordem, +39,94 ± 2,62 e +36,27 ± 1,98 mV. Lipossomas com potencial zeta
acima ±30 mV demonstram uma boa estabilidade em suspensão, prevenindo a agregação
das vesículas (Calvo et al., 1996). Apesar da carga superficial de LD ser ligeiramente maior
que a de LC, elas não diferem significantemente entre si. O valor positivo dos lipossomas já
era esperado e é explicado pela constituição lipídica das vesículas, as quais contêm o
lipídeo estearilamina de carga positiva. Uma hipótese para entender o ligeiro aumento na
positividade de LD em relação a LC é devido a t-DCTN, uma molécula que comporta-se
como um ácido fraco (Morais , 2010), está inserida na bicamada fosfolipídica, enquanto
que o complexo t-DCTN:HPβCD se encontra solubilizado no vacúolo aquoso dos
lipossomas. Tanto LD quanto LC tiveram uma alta eficiência de encapsulação (95,0 ± 3,8%
e 91,1 ± 5,6%, respectivamente) e não houve diferença significativa (p<0,05) entre eles.
Avaliação da estabilidade dos lipossomas
As supensões lipossomais LD e LC foram submetidas aos testes de estabilidade a
curto prazo de estresse mecânico (EM) e de centrifugação (CF). Não houve alteração na
aparência visual (suspensão branca leitosa com reflexo azulado) em nenhuma das duas
90
formulações lipossomais após os testes. O tamanho de partícula, o índice de polidispersão e
o pH também foram avaliados (Tabela III). Observou-se que as formulações LD e LC
mantiveram-se estáveis após o teste de simulação de transporte por agitação mecânica. Em
relação ao teste de centrifugação, o índice de polidispersão da formulação LD foi de 0,43 ±
0,05, indicando que a distribuição do tamanho de partícula tornou-se um pouco
heterogênea. Enquanto que para LC tanto o tamanho de partícula quanto o índice de
polidispersão aumentaram, com respectivos valores de 122,20 ± 0,80 nm e de 0,42 ± 0,01,
porém, apesar disso, LC permaneu estável.
TABELA II- Tamanho de partícula, índice de polidispersão e pH de LD e LC após os
testes de estresse mecânico (EM) e centrifugação (CF).
Formulações
Tamanho de
Índice de
partícula (nm)
polidispersão
pH
EM
CF
EM
CF
EM
CF
LD
79,2± 4,2
73,7±3,1
0,31±0,02
0,43 ± 0,05
7,85 ± 0,06
7,95 ± 0,16
LC
88,7±1,1
122,2±0,8
0,31±0,03
0,42 ± 0,01
7,67 ± 0,02
7,62 ± 0,02
LD= lipossomas contendo a t-DCTN; LC= lipossomas contendo o complexo de inclusão
t-DCTN:HPβCD.
A estabilidade a longo prazo de LD e LC foi avaliada por 120 dias. A avaliação das
formulações nos dias 7, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 foi realizada através da ressuspensão dos
liófilos de LD e LC com quantidade sufuciente de água purificada para atingir as condições
originais. Em todo o período, não foi verificada nenhuma alteração visual nas formulações.
Como mostrado na Figura 2, houve uma pequena diminuição do pH das duas formulações
ao longo do tempo. O pH de LD manteve-se entre 7,58 ± 0,16 e 7,29 ± 0,03 , enquanto que
em LC o pH máximo foi de 7,70 ± 0,07 e o mínimo de 7,33 ± 0,05. Estas variações não
causaram e nem indicaram instabilidade nas formulações.
91
FIGURA 2- Variação do pH das formulações ao longo de 120 dias.
O tamanho de partícula (Figura 3) e o índice de polidispersão (Figura 4) de LD não
tiveram nenhuma variação significativa durante os 120 dias. O valor médio do diâmetro dos
lipossomas foi de 80 nm e o PI manteve-se em torno de 0,28. Estes dados mostram que LD
manteve-se estável durante todo o período da avaliação. Enquanto que para LC, a partir de
90 dias, houve um aumento no diâmetro médio das vesículas (Figura 3). O tamanho médio
dos lipossomas de LC foi inicialmente de 77,3 ± 3,0 nm e passou para 144, 3 ± 8,8 nm em
90 dias e para 270,3 ± 9,3 nm em 120 dias. O PI de LC aumentou de 0,32 (valor médio em
90 dias) para 0,44, mostrando que a população de lipossomas passou a ser menos
homogênea (Figura 4).
92
FIGURA 2- Variação do tamanho de partícula de LD e LC ao longo de 120 dias.
FIGURA 3- Variação do índice de polidispersão das vesículas ao longo de 120 dias.
93
Cinética de liberação in vitro da t-DCTN e do complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD
encapsulados em lipossomas
O perfil cinético da t-DCTN e do complexo t-DCTN:HPβCD encapsulados em
lipossomas, durante 4 dias, em tampão Tris, está ilustrado na Figura 4. As cinéticas de
liberação in vitro foram mostradas em percentual de t-DCTN liberada em função do tempo
para melhor visualização dos dados em termos de aplicação terapêutica. Um modelo
exponencial
baseado
na
segunda
Lei
de
Fick,
representado
pela
equação
M t / M   (1  k1 .e  k2t ) , foi usado para delinear o perfil de liberação. Os símbolos
representam os dados experimentais obtidos e as curvas representam o delinearmento do
modelo matemático. Os parâmetros calculados das cinéticas do fármaco livre e complexado
nos lipossomas estão resumidos na Tabela III.
Como pode ser observado na Figura 4A e 4B, ocorreu um bom ajuste dos dados
experimentais pelo modelo teórico exponencial. Isto indica que um mecanismo simples de
difusão está envolvido no transporte de massa nos sistemas lipossomais. Este fato também
é confirmado pelo gráfico do modelo linear da liberação da t-DCTN pela raiz quadrada do
tempo (t1/2) (r 2≥ 0,99) para o período inicial da cinética (0-8 h). A velocidade de liberação
(µg/mL) foi calculada pelo coeficiente angular da regressão linear (Tabela III).
Um efeito burst (25%), tanto para LD quanto para LC, ocorreu nas primeiras 2 h de
liberação (Tabela III) devido à provavelmente a liberação da t-DCTN não encapsulada,
seguida de uma liberação gradual constante nas primeiras 8 horas. Nas 12 h iniciais, houve
uma liberação de aproximadamente 80% do fármaco nas duas formulações, atingindo um
máximo de fármaco liberado para t-DCTN de 95% e para t-DCTN:HPβCD de 98% dentro
de 96 h. No período inicial da cinética (0-8 h), por sua vez, não houve diferença
significativa na taxa de liberação da t-DCTN quando a mesma foi complexada com a
HPβCD (Tabela III).
94
FIGURA
4-
t-DCTN:HPβCD
Liberação in
(B)
vitro
da t-DCTN (A) e do complexo de inclusão
em lipossomas.
Cada ponto respresenta a média de três
experimentos destintos ± D.P. As linhas representam o delinearmento do modelo não-linear
de difusão Fickiano.
Insert: Gráfico do ajuste da liberação da t-DCTN pela raiz quadrada do tempo (t1/2) (t= 8 h).
Cada ponto respresenta a média de três experimentos destintos ± D.P. As linhas
representam o delinearmento do modelo linear.
95
TABELA III- Parâmetros calculados da liberação da t-DCTN e do complexo de inclusão
t-DCTN:HPβCD encapsulados em lipossomas usando os modelos exponencial e linear.
Formulação
Efeito burst %
(2h)
Modelo exponencial (t0-96h)
M t / M   (1  k1 .e  k2t )
k1
Modelo linear
(t1/2) (t0-8h)
k2
Velocidade de
liberação
(μg/h)
25,88 ± 0,64
1,069 ± 0,019ª
0,188 ± 0,009ª 308,84 ± 12,82ª
LD
25,08 ± 3,22
1,097 ± 0,017ª
0,217 ± 0,007b 278,40 ± 20,51ª
LC
Letras iguais indicam que não houve diferença significativa pelo Teste de Tukey (p<0,05);
letras diferentes indicam que houve diferença significativa (p<0,05).
A complexação da t-DCTN com a ciclodextrina HPβCD não influenciou o efeito
burst, nem a velocidade de liberação da t-DCTN e nem a quantidade final de droga
liberada. Porém o k2 (coeficiente aparentemente relacionado a difusão do fármaco) do tDCTN:HPβCD (k2=0,217) foi maior que o da t-DCTN (k2=0,188). Esta maior
difusibilidade pode estar associada a ação da ciclodextrina em remover os componentes
lipídicos do lipossoma pela formação de complexo com os lipídeos, principalmente o
colesterol. Isto pode desestabilizar a bicamada permitindo a liberação parcial ou total do
complexo das vesículas (Piel et al., 2006).
Avaliação da atividade antitumoral de lipossomas contendo t-DCTN e o complexo de
inclusão t-DCTN:HPβCD
No presente estudo, a atividade antitumoral da t-DCTN e do seu complexo de
inclusão t-DCTN:HPβCD encapsulados em lipossomas foi avaliada contra o S-180
em camundogos tratados diariamente com dose de 20 mg/Kg por 7 dias (Melo et al.,
2004). Para avaliação da atividade antitumoral, comparou-se as formulações lipossomais
com o placebo e a suspensão de t-DCTN em 5% (v/v) de Tween 80.
Após o tratamento dos animais com a suspensão de t-DCTN , LD e LC, uma
variação na massa do tumor foi encontrada. Uma redução no tamanho dos tumores foi
detectada com o tratamento com a t-DCTN. Os animais não tratados apresentaram um
progressivo aumento no crescimento do tumor, com um peso médio de 2,62 ± 0,27 g, 7 dias
96
após a inoculação das células tumorais. Em contrapartida, o tratamento LD e LC produziu
uma diminuição da massa tumoral (0,54 ± 0,25 g e 0,96 ± 0,14 g respectivamente) em
comparação com a solução do fármaco (1,48 ± 0,25 g). Estes resultados mostram que as
formas lipossomais da t-DCTN e do seu complexo de inclusão apresentam um maior efeito
de regressão do tumor em relação a solução do fármaco. Todos os animais sobreviveram
até o final do tratamento e nenhuma anormalidade clínica ou comportamental foi
observada.
Em relação a inibição tumoral, o grupo tratado com a suspensão de t-DCTN
apresentou uma inibição de 43,3 ± 9,5% em comparação com o grupo controle. Já LD e LC
apresentaram as respectivas inibições tumorais de 79,4 ± 9,6% e 63,5 ± 5,5% (Figura 5).
b
c
a
FIGURA 5- Avaliação da atividade antitumoral da t-DCTN livre e de formas lipossomais
contendo a da t-DCTN (LD) e o seu complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD (LC)
contra o tumor Sarcoma 180 inoculado em camundongos Swiss. Letras diferentes indicam
que houve diferença significativa pelo Teste de Tukey (p<0,05).
97
A menor inibição tumoral de LC pode estar associada a complexação do fármaco
com a HPβCD, pois sabe-se que as ciclodextrinas também exercem um retardamento na
liberação do fármaco devido a complexação com o mesmo (Loftsson; Brewster, 1996).
Estes resultados mostram que a nanoencapsulação aumenta a atividade antitumoral da tDCTN, confirmando que lipossomas são potentes carreadores para terapia antitumoral,
aumentando a eficácia dos fármacos (Batista et al., 2007).
Estudos para investigar a ação antitumoral da t-DCTN já haviam sido realizados.
Grynberg et al. (1999) avaliou a ação antitumoral deste bioativo em camudongos fêmeas
DBA/2 em dois modelos experimentais de tumores ascíticos, sarcoma-180 (S-180) e
carcinoma de Erlich (CE), sendo o aumento do tempo de sobrevida dos camundongos
tratados com a t-DCTN comparado com o grupo não-tratado (T/C%) determinado para
avaliar esta atividade (T/C% ≥125, atividade antitumoral significativa). Após administração
intraperitoneal (i.p.), a t-DCTN apresentou atividade contra S-180 e CE, obtendo
respectivamente T/C% de 128 e 140. Melo et al. (2004) utilizou camundongos machos
BALB/c com tumor ascítico de Erlich para testar o efeito antitumoral da t-DCTN com
doses de 2,5 a 20 mg/Kg de peso e, na dose de 20 mg/kg, a sobrevida dos animais teve um
significante aumento de 80%.
Análise histopatológica
As análises histopatológicas do tumor e do fígado dos animais não-tratados e
tratados com a t-DCTN livre e as suspensões coloidais LD e LC estão ilustradas nas figuras
6 e 7, respectivamente. Microfotografias do tumor revelou células pleomórficas e
anaplásicas, com relações núcleo-citoplasma aumentadas. Os núcleos das células
neoplásicas, intensamente corados, demonstravam cromatina frouxa e nucléolos
proeminentes. Observou-se também mitoses típicas e atípicas. O estroma era constituído
por escassas fibras colágenas e delicados capilares. Áreas de necrose variáveis e focos de
hemorragia também foram detectados, além da invasão do tumor em tecido muscular,
tecido adiposo, nervos e vasos sanguíneos, caracterizando, portanto, um comportamento
agressivo local.
98
FIGURA 6- Análise histopatológica do tumor dos animais (HE, 200x): A- placebo; Bsuspensão de t-DCTN em Tween a 5%; C- LD; D-LC. Setas pretas: indicam a área de
necrose tumoral. Setas vermelhas: invasão do tumor no tecido adiposo. Seta amarela:
invasão do tumor no tecido muscular.
Como mostra a figura 6, áreas extensas de necrose e infiltrado inflamatório crônico
foram observadas no tumor dos camundongos do grupo tratado com LD (6D) e LC (6C),
quando comparados com os grupos controle (6A) e tratado com suspensão de t-DCTN
(6B). Uma maior redução, portanto, da área tumoral foi encontrada em camudongos
tratados com LD. A menor área de necrose provocada por LC nos tumores, em comparação
com LD, também está de acordo com o resultado da inibição tumoral (Figura 5). Esses
resultados reforçam o mecanismo de ação sugerido por Anazzetti et al. (2004) que a tDCTN pode reagir com o oxigênio molecular, formando peróxido de hidrogênio e,
99
consequentemente, altera o equilíbrio intracelular de oxi-redução. O estresse oxidativo
provocado por esta reação representa um importante papel na citotoxicidade da t-DCTN,
pois se os radicais livres estiverem em altas concentrações causam a necrose (Pallardy et al.
,1997).
O estresse oxidativo também desempenha um papel importante na hepatotoxicidade
causada pela t-DCTN, pois esta molécula inibe nos hepatócitos a enzima mitocondrial
succinato desidrogenase, produzindo metabólitos tóxicos (Melo et al., 2004). Por esta
razão, o fígado dos animais foram avaliados. Este órgão apresentou arquitetura lobular
com veias hepáticas regularmente distribuídas nos animais. O sistema porta de todos os
camundongos estava bem conservado. No seio do lóbulo, os hepatócitos dos animais do
grupo controle apresentaram na grande extensão do parênquima elementos isomorfos, com
os hepatócitos bem preservados. No entanto, nos animais tratados, com solução de t-DCTN,
LD e LC, foram identificadas áreas focais de esteatose microvesicular e degeneração dos
hepatócitos (Figura 7). Estes resultados estão de acordo Rodríguez et al. (2004), que
avaliou a toxicidade subaguda da t-DCTN em ratos Wistar e observou algumas alterações
histopatológicas no fígado causadas pela trans-desidrocrotonina (tumefação turva,
degeneração microvacuolar e alterações nucleares).
A microesteatose e a degeneração celular foi mais acentuada nos hepatócitos dos
camundogos tratados com a suspensão de t-DCTN (Figura 7B). Observaram-se poucas
alterações no fígado dos animais tratados com LD (7D) e menos ainda nos tratados com LC
(7C). Esta diminuição da hepatotoxicidade nos camundongos tratados com LD e LC pode
ser devida a uma menor concentração do fármaco no fígado pelo acúmulo da t-DCTN e do
complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD no tumor pelo possível direcionamento passivo dos
lipossomas. Além disso, já é comprovada uma diminuição da hepatotoxicidade da t-DCTN
pela formação do complexo de inclusão com a ciclodextrina (Côrrea et al., 2005). Por isso,
ocorreu maior conservação do fígado dos camundogos tratados com LC.
100
FIGURA 7- Análise histopatológica do fígado dos animais (HE, 400x): A- placebo; Bsuspensão de t-DCTN em Tween a 5%; C- LD; D-LC. Setas pretas: sistema porta. Setas
brancas : esteatose microvesicular (degeneração microvacuolar) nos hepatócitos.
Hematologia
Não houve alterações significativas na concentração de hemoglobina (Hb), no
hematócrito (Hct), no volume corpuscular médio (VCM), na hemoglobina corpuscular
média (HCM), na concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), na largura de
distribuição dos eritrócitos (RDW) e na contagem de glóbulos vermelhos (RBC) dos
camundogos não tratados e tratados (Tabela IV). Os achados hematológicos não mostram
qualquer efeito relacionado ao tratamento e não há diferença significativa em relação ao
grupo controle. Nenhuma redução significativa nos níveis de leucócitos ocorreu com os
animais tratados com a solução de t-DCTN, LC e LD em comparação com o grupo não
101
tratado. No entanto foi observado uma diminuição crescente no número de plaquetas nos
animais tratados com a suspensão de t-DCTN, LC e LD na respectiva ordem (Tabela IV).
Estes resultados sugerem que a t-DCTN em solução e as suspensões lipossomais LC
e LD não causaram toxicidade hematológica nos animais tratados.
TABELA IV- Análise hematológica em camundongos tratados com a suspensão de tDCTN e com lipossomas contendo o complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD (LC) e a tDCTN (LD).
Parâmetros
Tratamentos
hematológicos
Placebo
t-DCTN
LC
LD
Hb (g/dl)
16,35 ± 0,64
17,09 ± 0,99
18,18 ± 0,50
17,60 ± 1,02
Hct (%)
51,75 ± 1,35
51,83 ± 3,01
55,98 ± 7,17
52,21 ± 3,71
VCM (μm3)
55,23 ± 3,46
52,31 ± 2,70
53,47 ± 4,31
50,05 ± 0,80
HCM (pg)
17,47 ± 0,50
17,27 ± 0,97
17,43 ±1,03
16,97 ± 0,34
CHCM (g/dl)
31,68 ± 1,74
32,96 ± 0,42
32,78 ± 3,48
33,76 ± 0,70
RDW (%)
18,85 ± 1,21
15,84 ± 3,32
18,33 ± 3,16
20,12 ± 1,54
WBC (103/mm3)
10,48 ± 2,32
8,44 ± 1,40
8,30 ± 1,94
7,62 ± 1,34
0,70 ± 0,07
0,62 ± 0,11
0,45 ± 0,13
Plaquetas(106/mm3) 1,30 ± 0,10
CONCLUSÕES
Os resultados demonstram que foram obtidas formulações lipossomais contendo a tDCTN e o seu complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD com alta eficiência de encapsulação,
mesmo após a liofilização. Eles também se apresentaram estáveis em meio a testes de
estabilidade a curto prazo e a longo prazo, apresentando e mantendo as características
físico-químicas desejáveis para uso intravenoso, como tamanho de partícula, índice de
polidispersão, pH e potencial zeta.
O encapsulamento da t-DCTN e o seu complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD em
lipossomas potencializou a atividade antitumoral in vivo contra o Sarcoma-180 em
102
camundongos em comparação com a suspensão de t-DCTN. Assim como, diminuiu o efeito
hepatotóxico da molécula. Uma diminuição crescente no número de plaquetas foi
observada nos animais tratados com a t-DCTN e com os lipossomas contendo a t-DCTN e
o complexo t-DCTN:HPβCD, porém não foi observada nenhuma toxicidade hematológica
nos animais tratados.
Portanto, o desenvolvimento das formulações lipossomais contendo a t-DCTN e o
seu complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD consiste num importante avanço na utilização
deste fármaco na terapia, repercutindo em um impulso técnico-científico, podendo ser uma
alternativa em potencial no combate ao câncer.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) e a Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de
Pernambuco (FACEPE) pelo suporte financeiro.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABDELWAHED, W.; DEGOBERT, G.; STAINMESSE, S.; FESSI, H. Freeze-drying of
nanoparticles: Formulation, process and storage considerations. Adv. Drug Deliv.
Rev., v.58, p. 1688– 1713, 2006.
AGNER, A.R.; MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; CÓLUS, I.M.S. Antigenotoxicity of
trans-dehydrocrotonin, a clerodane diterpene from Croton cajucara. Planta Med. v.
67, p. 815-819, 2001.
AGNER, A.R.; MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; PAMPLONA, S.G.S.R.; CÓLUS, I.M.S.
Investigation of genotoxic activity of trans-dehydrocrotonin, a clerodane diterpene
from Croton cajucara. Teratogen. Carcin. Mut. v. 19, p. 377-384, 1999.
103
ANAZETTI, M.C.; MELO, P.S.; DURÁN, N.; HAUN, M. Comparative cytotoxicity of
dimethylamide-crotonin in the promyelocytic leukemia cell line (HL60) and human
peripheral blood mononuclear cells. Toxicology v.188, p. 261-274, 2003.
ANAZETTI, M.C.; MELO, P.S.; DURÁN, N.; HAUN, M. Dehydrocrotonin and its
derivative, dimethylamide-crotonin induce apoptosis with lipid peroxidation and
activation of caspases-2, -6 and -9 in human leukemic cells HL60. Toxicology v.
203, p. 123-137, 2004.
BATISTA, C.M.; CARVALHO, C.M.B.; SANTOS-MAGALHÃES, N.S. Lipossomas e
suas aplicações terapêuticas: Estado da arte. Rev. Bras. Cienc. Farm. v. 43, p 167179, 2007.
BIGHETTI, E.J.B.; SOUZA-BRITO, A.R.M.; DE FARIA, E.C.; OLIVEIRA, H.C.F.
Chronic treatment with bark infusion from Croton cajucara lowers plasma
triglyceride levels in genetic hyperlipidemic mice. Can. J. Physiol. Pharmacol. v.
82, p. 387-392, 2004.
BRANDL, M.; GREGORIADIS, G. Entrapment of hemoglobin into liposomes by the
dehydratation-rehydratation method: vesicles characterization and in vivo behavior.
Biochim. Biophys. Acta - Biomembranes v.1196, p. 65-75, 1994.
CALVO, P.; VILA-JATO, J.L.; ALONSO, M.J. Evaluation of cationic polymer-coated
nanocapsules as ocular drug carries. J. Pharm. Sci. v.85, p. 530-536, 1996.
CARVALHO, J.C.T.; SILVA, M.F.C.; MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; NUNES, D.S.;
LIMA, R.M.; BASTOS, J.K.; SARTI, S.J. Investigation of anti-inflammatory and
antinociceptive activities of trans-dehydrocrotonin, a 19-nor-clerodane diterpene
from Croton cajucara. Part 1. Planta Med., v. 62, p. 402-404, 1996.
104
CHRISTENSEN, D.; FOGED, C.; ROSENKRANDS, I.; NIELSEN, H.M.; ANDERSEN,
P.; AGGER, E.M. Trehalose preserves DDA/TDB liposomes and their adjuvant
effect during freeze-drying. Biochim. Biophys. Acta, v. 1768, p. 2120– 2129, 2007.
CORRÊA, D.H.A.; MELO, P.S.; DE CARVALLHO, C.A.A.; DE AZEVEDO, M.B.M.;
DURÁN, N.; HAUN, M. Dehydrocrotonin and its beta-cyclodextrin complex:
Cytotoxicity in V79 fibroblasts and rat cultured hepatocytes. Eur. J. Pharmacol. v.
510, p. 17-24, 2005.
COSTA, M.P.; SANTOS-MAGALHÃES, N.S.; GOMES, F.E.S.; MACIEL, M.A.M. Uma
revisão das atividades biológicas da trans-desidrocrotonina, um produto natural
obtido de Croton cajucara. Rev. Bras. Famacog., v.17, p. 275-286, 2007.
DUNNE, M.; BIBBY, D.C.; JONES, J.C.; CUDMORE, S. Encapsulation of protamine
sulphate
compacted
DNA
in
polylactide
and
polylactide-co-glycolide
microparticles. J. Contr. Rel., v.92, p.209-219, 2003.
EDWARDS, K. A.; BAEUMNER, A. J. Liposomes in analyses. Talanta, v. 68, p.14321441, 2006.
FARIAS, R.A.F.; RAO, V.S.N.; VIANA, G.S.B.; SILVEIRA, E.R.; MACIEL, M.A.M.;
PINTO, A.C. Hypoglycemic effect of trans-dehydrocrotonin, a nor-clerodane
diterpene from Croton cajucara. Planta Med v. 66, p. 558-560, 1997.
FREIRE, A.C.G.; DE ASSIS, C.F.; FRICK, A.O.; MELO, P.S.; HAUN, M.; AOYAMA,
H.; DURÁN, N.; SAUER, M.M.; KÁLLAS, E.G; FERREIRA, C.V. Influence of
protein phosphatase inhibitors on HL60 cells death induction by dehydrocrotonin.
Leukemia Res. v. 27, p. 823-829, 2003.
GRYNBERG, N.F.; ECHEVARRIA, A.; LIMA, J.E.; PAMPLONA, S.S.R.; PINTO, A.C.;
MACIEL, M.A.M. Anti-tumor activity of two 19-nor-clerodane diterpenes, trans-
105
dehydrocrotonin and trans-crotonin, from Croton cajucara. Planta Med. v. 65, p.
687-689, 1999.
HIRUMA-LIMA, C.A.; SPADARI-BRATFISCH, R.C.; GRASSI-KASSISSE, D.M.;
BRITO, A.R.M. Antiulceronic mechanisms of dehydrocrotonin, a diterpene lactone
obtained from Croton cajucara. Planta Med. v. 65, p. 325-330, 1999.
KIM, J.Y.; KIM, J.K.; PARK, J.S.; BYUN, Y.; KIM, C.K. The use of PEGylated
liposomes to prolong circulation lifetimes of tissue plasminogen activator.
Biomaterials, doi:10.1016/j.biomaterials.2009.07.021, 2009.
KLOSE, D.; SIEPMANN, F.; ELKHARRAZ, K.; SIEPMANN, J. PLGA-based drug
delivery systems: Importance of the type of drug and device geometry. Int. J.
Pharm. v. 354, p. 95–103, 2008.
LAPENDA, T.L.S.; MORAIS, W.A.; MACIEL, M.A.M.; SANTOS-MAGALHÃES,
N.S. Validation of an UV spectrophotometric method for determining transdehydrocrotonin
in
inclusion complexes with hydroxypropyl-β-cyclodextrin.
Anal. Letter, 2010.Submetido.
LIRA, M.C.B.; SIQUEIRA-MOURA,M.P.; ROLIM-SANTOS, H.M.; GALETTI, F.C.;
SIMIONI, A.R.; SANTOS, N.P.; TABOSA DO EGITO, E.S.; SILVA, C.L.;
TEDESCO,
A.C.;
SANTOS-MAGALHÃES,
N.S.
In
vitro
uptake
and
antimycobacterial activity of liposomal usnic acid formulation. J. Liposome Res., v.
19, p.49-58, 2009.
LO, E.H.; SINGHAL, A.B.; TORCHILIN, V.P.; ABBOTT, N.J. Drug delivery to damage
brain. Brain Res. Rev., v.38, p.140-148, 2001.
LOFTSSON, T., BREWSTER, M.E. Pharmaceutical application of cyclodextrins.1. Drug
solubilization and stability. J. Pharm. Sci., v. 85,p. 1017–1025, 1996.
106
LUNA-COSTA, A.M.; SILA, J.C.R.; CAMPOS, A.R.; RAO, V.S.N.; MACIEL, M.A.M;
PINTO, A.C. Antioestrogenic effect of trans-dehydrocrotonin, a nor-clerodane
diterpene from Croton cajucara Benth in rats. Phytother. Res. v. 13, p. 689-691,
1999.
MACIEL,
M.A.M.;
PINTO,
A.C.;
ARRUDA,
A.C.;
PAMPLONA,
S.G.S.R.;
VANDERLINDE, F.A.; LAPA, A.J.; ECHEVARRIA, A.; GRYNBERG, N.F.;
CÓLUS,
I.M.S.;
FARIAS,
R.A.F.;
COSTA,
A.M.L.;
RAO,
V.S.N.
Ethnopharmacology, phytochesmistry and pharmacology: a successful combination
in the study of Croton cajucara. J. Ethnopharmacol. v. 70, p. 41-55, 2000.
MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; VEIGA JR., V.F..; MARTINS, J.R.; GRYNBERG,
N.F.; ACHEVARRIA, A.; LAPA, A.J.; VANDERLINDE, F.A. Croton cajucara as
an alternative to traditional medicine in a modern health system. Phytochem.
Pharmacol. II Ser. Recent Prog. Med. Plants v. 8, p. 459-475, 2002.
MAMOT, C.; DRUMMOND, D. C.; HONG, K.; KIRPOTIN, D.B.; PARK, J. W.
Liposome-based approaches to overcome anticancer drug resistance. Drug Res.
Update, v. 6, p. 271-279, 2003.
MELO, P.S.; DURAN, N.; HAUN, M. Cytotoxicity of derivatives from dehydrocrotonin
on V79 cells and Escherichia coli. Toxicology v. 159, p. 135-141, 2001.
MELO, P.S.; DURAN, N.; HIRUMA-LIMA, C.A.; SOUZA-BRITO, A.R.M.; HAUN, M.
Comparison of the gastroprotective effect of a diterpene lactone isolated from
Croton cajucara with its synthetic derivatives. J. Ethnopharmacol. v. 87, p. 169174, 2003.
107
MELO, P.S.; JUSTO, G.Z.; DURÁN, N.; HAUN, M. Natural killer cell activity and antitumour effects of dehydrocrotonin and its synthetic derivatives. Eur. J. Pharmacol.
v. 487, p. 47-54, 2004.
MOHAMMED,
A.R.;
BRAMWELL,
V.W.;
COOMBES,
A.G.A.;
PERRIE,Y.
Lyophilisation and sterilisation of liposomal vaccines to produce stable and sterile
products. Methods, v.40, p. 30–38, 2006.
MORAIS, W. A.
Desenvolvimento e caracterização de microesferas contendo trans-
desidrocrotonina e complexo de inclusão de trans-desidrocrotonina com 2hidroxipropil- β- ciclodextrina, 2010. 133 p. tese (Programa de Pós-graduação em
Ciências Farmacêuticas) - Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade
Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, 2010.
NEW, R.R.C. Liposomes: A practical approach. IRL/ Oxford University Press, Oxford,
p.432, 1990.
PALLARDY, M.; PERRIN-WOLFF, M.; BIOLA, A. Cellular stress and apoptosis.
Toxicol. in Vitro, v. 11, p. 573–578, 1997.
PIEL, G.; PIETTE, M.; BARILLARO, V.; CASTAGNE, D.; EVRARD, B.; DELATTRE,
L. Betamethasone-in-cyclodextrin-in-liposome: The effect of cyclodextrins on
encapsulation efficiency and release kinetics. Int. J. Pharm. v.312, p. 75–82, 2006.
RODRÍGUEZ, J.A.; HAUN, M. Cytotoxicity of trans-dehydrocrotonin from Croton
cajucara on V79 Cells and rat hepatocytes. Planta Med. v. 65, p. 522-526, 1999.
RODRÍGUEZ, J.A.; HIRUMA-LIMA, C.A.; SOUZA-BRITO, A.R.M. Antiulcer activity
and subacute toxicity of trans-dehydrocrotonin from Croton cajucara. Hum. Exp.
Toxicol. v. 23, p. 455-461, 2004.
108
SANTOS, N. P. S.; NASCIMENTO, S. C.; WANDERLEY, M. S. O.; PONTES - FILHO,
N. T.; DA SILVA, J. F.; DE CASTRO, C. M. M. B.; PEREIRA, E. C.; DA
SILVA,
N. H.; HONDA, N. K.; SANTOS - MAGALHÃES, N. S.
Nanoencapsulation of usnic acid: An attempt to improve antitumour activity and
reduce hepatotoxicity. Eur. J. Pharm. Biopharm. v. 64, p. 154-160, 2006.
SANTOS-MAGALHÃES, N.S.; PONTES, A.; PEREIRA, V.M.W.; CAETANO, M.N.P.
Colloidal carriers for benzantine penicillin G: nanoemulsions and nanocapsules. Int.
J. Pharm. v. 208, p. 71-80, 2000.
SIEPMANN, J.; SIEPMANN, F. Mathematical modeling of drug delivery. Int. J. Pharm. v.
364, p. 328–343, 2008.
SILVA, R.M.; OLIVEIRA, F.A.; CUNHA, K.M.A.; MAIA, J.L.; MACIEL, M.A.M.;
PINTO,
A.C.;
NASCIMENTO,
N.R.F.;
SANTOS,
F.A.;
RAO,
V.S.N.
Cardiovascular effects of trans-dehydrocrotonin, a diterpene from Croton cajucara
in rats. Vascul. Pharmacol. v. 43, p. 11-18, 2005.
SILVA, R.M.; SANTOS, F.A.; RAO, V.S.N.; MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C. Blood
glucose-and triglyceride-lowering effect of trans-dehydrocrotonin, a diterpene from
Croton cajucara Benth in rats. Diabetes Obes. Metab. v. 3, p. 452-456, 2001a.
SILVA, R.M.; SANTOS, F.A.; MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C.; RAO, V.S.N. Effect of
trans-dehydrocrotonin, a 19-nor-clerodane diterpene from Croton cajucara on
experimental hypertriglyceridaemia and hypercholesterolaemia induced by triton
WR1339 (tyloxapol) in mice. Planta Med. v. 67, p. 763-765, 2001b.
SILVA, R.M.; SANTOS, F.A.; RAO, V.S.N.; MACIEL, M.A.M.; PINTO, A.C. The lipidlowering effect of trans-dehydrocrotonin, a clerodane diterpene from Croton
cajucara Benth in mice fed on high-fat diet. J. Pharm. Pharmacol. v. 53, p. 535-539,
2001c.
109
SOUZA-BRITO, A.R.M.; RODRÍGUEZ, J.A.; HIRUMA-LIMA, C.A.; HAUN, M.;
NUNES, D.S. Antiulcerogenic activity of trans-dehydrocrotonin from Croton
cajucara. Planta Med. v. 64, p. 126-129, 1998.
TORCHILIN, V.P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carrier. Nature
Rev. Drug Disc., v. 4, p. 145-160, 2005.
110
5. CONCLUSÕES
 Uma metodologia de doseamento da t-DCTN por espectrofotometria UV foi
validada de acordo com as diretrizes do ICH, e perfeitamente aplicada aos
complexos de inclusão t- DCTN:HPβCD 1:1 mol/mol preparados para incorporação
em lipossomas;
 Com a trealose na concentração de 10%, foi possível liofilizar lipossomas de
PC:CH:SA (7:2:1; 120 mM) e obter um liófilo estável;
 Lipossomas contendo a t-DCTN (LD) e o complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD
(LC), com quantidades equivalentes a 1 mg/mL do fármaco, foram obtidos com
sucesso e com uma alta eficiência de encapsulação, mesmo após a liofilização,
confirmando a estabilidade dos lipossomas;
 LD e LC apresentaram-se estáveis após os testes de estabilidade a curto prazo e a
longo prazo, apresentando e mantendo as características físico-químicas desejáveis
para uso intravenoso, como tamanho de partícula, índice de polidispersão, pH e
potencial zeta;
 A complexação da t-DCTN com a ciclodextrina HPβCD não influenciou o efeito
burst, a velocidade de liberação da t-DCTN e nem a quantidade final de droga
liberada;
 O encapsulamento da t-DCTN e o seu complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD em
lipossomas potencializou a atividade antitumoral in vivo contra o Sarcoma-180 em
camundongos em comparação com a suspensão de t-DCTN. LD, por sua vez,
apresentou uma maior inibição tumoral em relação a LC;
111
 Na análise histopatológica dos tumores, áreas extensas de necrose e infiltrado
inflamatório crônico foram observadas no tumor dos camundongos do grupo tratado
com LD e LC , quando comparados com os grupos controle e tratado com
suspensão de t-DCTN. No entanto, uma maior área de necrose foi observada nos
tumores dos animais tratados com LD;
 O encapsulamento da t-DCTN e o seu complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD em
lipossomas diminuiu o efeito hepatotóxico da molécula;
 Uma diminuição crescente no número de plaquetas foi observada nos animais
tratados com a t-DCTN e com os lipossomas contendo a t-DCTN e o complexo tDCTN:HPβCD, porém não foi observada nenhuma toxicidade hematológica nos
animais tratados;
 O desenvolvimento das formulações lipossomais contendo a t-DCTN e o seu
complexo de inclusão t-DCTN:HPβCD consiste num importante avanço na
terapêutica deste fármaco, repercutindo em um impulso técnico-científico, podendo
ser uma alternativa em potencial no combate ao câncer.
6. PERSPECTIVAS
Novas perspectivas surgem no intuito de utilizar lipossomas contendo t-DCTN
acrescidos de moléculas sinalizadoras (sítio-específicas) e furtivas no combate ao câncer.
112
ANEXOS
113
ANEXO I- Carta de aprovação do comitê de ética para o estudo in vivo
114
ANEXO II- Resumos publicados em congressos
1. MORAIS, W.A. ; SALVIANO, T. L ; BATISTA, R. S. ; CARVALHO, G. G. ;
MACIEL, M.A.M. ; SANTOS-MAGALHÃES, N.S. . Validação de método
espectrofotométrico UV para a desidrocrotonina em complexo de inclusão com
hidroxipropil-beta-ciclodextrina. In: 32ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Química, 2009, Fortaleza. 32ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química,
2009. v. QA-034.
2. MORAIS, W.A. ; SALVIANO, T. L ; MACIEL, M.A.M. ; SANTOS-MAGALHÃES,
N.S.
.
CARACTERÍSTICAS
DE
SOLUBILIDADE
E
PARTIÇÃO
DA
DESIDROCROTONINA. In: I Workshop Internacional em Biotecnologia and II
Encontro Alpha-Valnatura, 2008, Recife. I Workshop Internacional em Biotecnologia
and II Encontro Alpha-Valnatura, 2008. v. 1. p. IND-09-IND-09.
3. MORAIS, W.A. ; SALVIANO, T. L ; MACIEL, M.A.M. ; SANTOS-MAGALHÃES,
N.S. . DEHYDROCROTONIN AND HYDROXYPROPYL-B-CYCLODEXTRIN
INCLUSION COMPLEX. In: In 37th Annual Meeting of SBBq, 2008, Águas de
Lindóia. 37th Annual Meeting of SBBq and XI Congress of the PABMB. São Paulo :
Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular, 2008. v. 37. p. 76-76.
4. MORAIS, W.A. ; SALVIANO, T. L ; PINTO, H. C. B ; MACIEL, M.A.M. ; SANTOSMAGALHÃES, N.S. . SOLUBILITY AND PARTITION COEFFICIENT OF
DEHYDROCROTONIN. In: I Simpósio Nacional em Diagnóstico e Terapêutica
Experimental e IV Jornada Científica do LIKA, 2008, Recife. I Simpósio Nacional em
Diagnóstico e Terapêutica Experimental e IV Jornada Científica do LIKA, 2008. v. 1. p.
C.6-C.6.
115
5. MORAIS, W.A. ; SALVIANO, T. L ; SILVA, D. M. A. ; MACIEL, M.A.M. ;
SANTOS-MAGALHÃES, N.S. . PREPARATION AND CHARACTERIZATION OF
DEHYDROCROTONIN:. In: I Simpósio Nacional em Diagnóstico e Terapêutica
Experimental e IV Jornada Científica do LIKA, 2008, Recife. I Simpósio Nacional em
Diagnóstico e Terapêutica Experimental e IV Jornada Científica do LIKA, 2008. v. 1. p.
C.2-C.2.
6. MORAIS, W.A. ; SALVIANO, T. L ; BATISTA, R. S. ; MACIEL, M.A.M. ; SANTOSMAGALHÃES, N.S. . VALIDATION OF UV-SPECTROSCOPIC METHOD FOR
DETERMINING. In: I Simpósio Nacional em Diagnóstico e Terapêutica Experimental e
IV Jornada Científica do LIKA, 2008, Recife. I Simpósio Nacional em Diagnóstico e
Terapêutica Experimental e IV Jornada Científica do LIKA, 2008. v. 1. p. C.16-C.16.
7. LAPENDA, T. L. S. ; MORAIS, W.A. ; SILVA, L. M. ; MACIEL, M.A.M. ; SANTOSMAGALHÃES, N.S. . The enhancement of complexation efficiency of dehydrocrotonin
in inclusion complexes with hydroxypropyl-β-cyclodextrin using a cosolvent. In: 7th
International Congress of Pharmaceutical Sciences, 2009, Ribeirão Preto. 7th
International Congress of Pharmaceutical Sciences, 2009.
8. SANTOS, M.H. ; LAPENDA, T.L.S. ; PINTO, H.C.B ; MORAIS, W.A. ; CARVALHO,
G.G. ; MACIEL, M.A.M.; SANTOS-MAGALHÃES, N.S. Influence of ethanol in the
complexation of trans-dehydrocrotonin with hydoxypropil-β-cyclodextrin. In: II
Simpósio Nacional em Diagnóstico e Terapêutica Experimental e V Jornada Científica
do LIKA, 2009, Recife. II Fórum brasileiro de genética em neuropsiquiatria, 2009. v. 1.